pobierz

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 2, str. 315–324
PRACA ORYGINALNA – Original Article
ANNA WOLSKA1,3, BARBARA CEBULA-OBRZUT2,3, PIOTR SMOLEWSKI2,3,
TADEUSZ ROBAK1,3
Wpływ ligandów receptorów Toll-podobnych TLR7 i TLR9 na komórki
przewlekłej białaczki limfocytowej w hodowli in vitro
The influence of Toll-like receptors’ TLR7 and TLR9 ligands on the cells of chronic
lymphocytic leukemia in vitro
1
Klinika Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. Tadeusz Robak
2
Zakład Hematologii Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. Piotr Smolewski
3
Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im M. Kopernika w Łodzi
Dyrektor: Mgr Wojciech Szrajber
STRESZCZENIE
Komórki przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL) wykazują słabą immunogenność wobec immunokompetentnych
komórek układu odpornościowego. Powoduje to anergię układu odpornościowego i w konsekwencji akumulację komórek białaczkowych. Wykazano, iŜ komórki PBL wykazują ekspresję funkcjonalnych receptorów Toll-podobnych
(TLR) i odpowiadają na ligandy TLR. Wyniki dotychczas przeprowadzonych badań nie są jednak jednoznaczne
i wskazują na heterogenną odpowiedź komórek PBL w zakresie przeŜywalności i proliferacji. Wskazano natomiast
zdolność ligandów TLR do indukowania w komórkach PBL fenotypu komórek prezentujących antygen, co moŜe
mieć zastosowanie w terapii. W naszej pracy oceniliśmy wpływ imikwimodu i oligodeoksynukleotydów (ODN2006
i IRS954) na przeŜywalność i funkcjonalność komórek PBL w hodowli in vitro, pochodzących od dwudziestu wcześniej nieleczonych pacjentów. Po inkubacji z ODN2006 zaobserwowaliśmy dwa wzorce odpowiedzi komórek: znamienny statystycznie wzrost lub spadek Ŝywotności do 15% w porównaniu z samym medium, przy podobnych parametrach wyjściowych. Obserwowana heterogenność odpowiedzi na ODN2006 nie potwierdziła się w przypadku pozostałych badanych ligandów TLR. Zastosowanie IRS954 spowodowało istotne zmniejszenie Ŝywotności komórek
w całej grupie, nawet o 30% w najwyŜszym stęŜeniu w porównaniu z kontrolą. Natomiast odsetek komórek nekrotycznych po imikwimodzie był statystycznie istotnie wyŜszy we wszystkich zastosowanych stęŜeniach, nawet
o 42,8%. ODN2006 okazał się najsilniejszym induktorem ekspresji cząsteczek CD86, zwiększając ją ponad 3.5krotnie na komórkach PBL w porównaniu z próbą kontrolną. Ekspresja CD80 po zastosowaniu pozostałych ligandów
nie uległa zmianie lub nawet obniŜyła się, zwłaszcza po IRS954 w obu stęŜeniach. Niejednorodny efekt poszczególnych ligandów TLR na komórki PBL wskazuje na potrzebę prowadzenia dalszych badań w celu wyodrębnienia chorych mogących odnieść największą korzyść z zastosowanego leczenia.
SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa – Receptory Toll-podobne – Imidazochinoliny – Imikwimod
– Oligodeoksynukleotydy – ODN2006 – IRS954 – Cząsteczki ko-stymulujące.
SUMMARY
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells are poorly antigenic to cells of the host immune system. Therefore, during
the course of the disease, we observe anergy in the host immune cells and subsequent accumulation of malignant
cells. It has been shown that CLL cells express Toll-like receptors (TLR) and respond to TLR ligands. Several studies
have demonstrated heterogeneous responses in terms of survival and proliferation of CLL cells. Some TLR ligands
are capable of inducing a phenotype of antigen-presenting cells in CLL lymphocytes, which might be exploited in
therapy. In our study we assessed the influence of imiquimod, oligodeoxynucleotide ODN2006 and oligodeoxynucleotide IRS954 on the survival and function of CLL cells in vitro, from twenty CLL treatment-naïve patients. After
the incubation with ODN2006, we observed a dual pattern of response: a statistically significant increase or decrease
in survival up to 15%, compared to medium alone. The observed heterogeneity of the response to ODN2006 was not
316
A. WOLSKA i wsp.
mirrored by other studied TLR ligands. Incubation with IRS954 lead to a significant decrease in cell survival in the
whole study group, up to 30% at the highest concentration, compared to medium alone. Whereas, the percentage of
necrotic cells after imiquimod was significantly higher at all studied concentrations (by as much as 42.8%).
ODN2006 appeared to have the strongest effect on the expression of CD86, increasing MFI more than 3.5-fold on
CLL cells, compared to medium alone. Expression of CD80 remained unchanged or decreased, especially after both
tested IRS954 concentrations. The observed distinct effect of TLR ligands on CLL cells imposes the need for further
studies, to choose patients that might benefit from systemic TLR therapy.
KEY WORDS: Chronic lymphocytic leukemia – Toll-like receptors – Imidazoquinolines – Imiquimod – Oligodeoxynucleotides – ODN2006 – IRS954 – Co-stimulatory molecules.
WSTĘP
Przewlekła białaczka limfocytowa (PBL) charakteryzuje się akumulacją nowotworowych limfocytów B, które wykazują na swojej powierzchni ekspresję antygenów CD19, CD23 i CD5. Dotychczas
uwaŜano, iŜ komórki te są „uśpione”, pozostając w fazie G0 lub wczesnej fazie G1 cyklu komórkowego. Niektórzy autorzy wskazują jednak, iŜ pewna pula nowotworowych limfocytów B wykazuje ekspresję markerów proliferacji, takich jak CD38, ZAP-70 czy Ki67 [1]. Messmer i wsp. [2] ocenili, iŜ
w ciągu doby dochodzi do powstania nawet 1 miliona komórek PBL. „Nowe” komórki PBL charakteryzują się aktywną proliferacją, a wśród komórek „uśpionych” dominują geny związane z apoptozą
oraz migracją. Główną rolę odgrywa tu receptor CXCR4, który pozwala komórkom PBL na powrót do
mikrośrodowiska guza (utkanie limfatyczne węzłów chłonnych lub szpiku kostnego), gdzie mogą
otrzymać sygnał umoŜliwiający im przeŜycie [3, 4]. Ponadto, udowodniono, iŜ komórki PBL mogą
reagować, podobnie jak zdrowe limfocyty B, na czynniki pochodzące od drobnoustrojów, poprzez m.in.
receptory Toll-podobne (TLR). Ekspresja tych receptorów jest róŜna w zaleŜności od zastosowanej
metody (biologia molekularna lub cytometria przepływowa). Niemniej jednak stwierdzono, iŜ komórki
PBL mogą odpowiadać na ligandy TLR in vitro, poprzez wzrost ekspresji cząsteczek ko-stymulujących,
proliferację lub apoptozę, w zaleŜności od zastosowanego ligandu, czasu trwania hodowli itp. [5, 6].
Ligandy TLR mogą okazać się skuteczne w terapii tej choroby. JednakŜe, dane na ten temat są nadal
niejednoznaczne. Istotne jest więc lepsze poznanie dynamiki odpowiedzi komórek PBL na ligandy
TLR.
W obecnej pracy ocenialiśmy odpowiedź komórek PBL na ligandy TLR7 (imikwimod) i TLR9
(oligodeoksynukleotydy ODN2006 i IRS954) w warunkach in vitro.
MATERIAŁY I METODY
Charakterystyka chorych
Materiał do badania stanowiła krew obwodowa uprzednio nieleczonych chorych na PBL, będących
pod opieką Poradni Hematologicznej i Kliniki Hematologii UM w Łodzi Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego im M. Kopernika w Łodzi. Badanie uzyskało akceptację Komisji Bioetycznej przy UM
w Łodzi. Pacjenci włączeni do badania nie prezentowali objawów infekcji w ciągu 4 tygodni przed
donacją próbki krwi, nie byli takŜe wcześniej leczeni przeciwbiałaczkowo. Kryteria diagnostyczne PBL
były zgodne ze standardami zaproponowanymi przes Chesona i wsp. [7].
Hodowle komórkowe
Komórki jednojądrowe uzyskiwano poprzez wirowanie pełnej krwi w gradiencie gęstości (Histopaque 1077; Sigma) przez 20 minut z przyspieszeniem 200 g. Uzyskany na granicy faz pierścień komórek jednojądrowych izolowano i płukano dwukrotnie w płynie RPMI-1640. Następnie zawieszano
Wpływ ligandów receptorów Toll-Podobnych TLR7 i TLR9
317
1×106 komórek jednojądrowych/dołek w kompletnym medium RPMI-1640 z dodatkiem 10% inaktywowanej płodowej surowicy cielęcej, 1,5 mM L-glutaminy, 100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny oraz badanych substancji. Komórki inkubowano przez 24 godziny w cieplarce w temp. 370C
w atmosferze wzbogaconej 5% CO2 o wilgotności 98%.
Badane substancje
Syntetyczny oligodeoksynukleotyd ODN2006 (ODN; 5’-CGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’;
Genomed, Polska) o rdzeniu fosforotioestrowym, opornym na działanie nukleaz, rozpuszczono w medium hodowlanym i zastosowano w stęŜeniach 1, 2.5 i 5 µg/mL. Syntetyczny oligodeoksynukleotyd
IRS954 (IRS; 5'-TGCTCCTGGA-GGGGTTGT-3'; Genomed, Polska) takŜe o rdzeniu fosforotioestrowym rozpuszczono w medium hodowlanym. Do doświadczeń zastosowano stęŜenia 1 i 2 µg/mL. Imikwimod (IMI; Invivogen, USA) rozpuszczono w dołączonym rozpuszczalniku, a następnie w medium
hodowlanym. Do eksperymentów zastosowano stęŜenia 2, 5 i 10 µg/mL. Kontrolę stanowiły komórki
inkubowane bez dodanych substancji, w kompletnym medium hodowlanym RPMI-1640.
Ocena cytotoksyczności ligandów TLR oraz funkcjonalności receptorów TLR
Po 24 godzinnej inkubacji komórki płukano, a następnie badano za pomocą cytometrii przepływowej (Facs Calibur; Becton Dickinson, USA). Cytotoksyczność badanych substancji badano za pomocą
barwienia jodkiem propidyny (PI). Komórki martwe bramkowano jako dodatnie w zakresie fluorescencji jodku propidyny (PI+). W celu oceny funkcjonalności receptorów TLR, komórki inkubowano
z przeciwciałami sprzęŜonymi z fluorochromami (anty-CD19, –CD23, –CD5, –CD80, –CD86; BDBiosciences, USA).
Analiza statystyczna
Analizę statystyczną przeprowadzono przy uŜyciu oprogramowania STATISTICA v9.0. W celu
oceny róŜnic pomiędzy wynikami uzyskanymi w hodowlach z badanymi substancjami, a hodowlami
kontrolnymi zastosowano test par Wilcoxona. W celu oceny róŜnic pomiędzy podgrupami zastosowano
test U Manna-Whitneya. W obydwu testach róŜnice istotne statystycznie przyjmowano przy poziomie
istotności p<0.05.
WYNIKI
Oceniono próbki krwi pochodzące od 20 chorych na PBL. W badanej grupie było 7 kobiet i 13
męŜczyzn w wieku 42–73 lat (średnia wieku 56,4 lat; mediana 56,2 lat). Leukocytoza w dniu badania
wynosiła 14,3–242,3×109/L (średnia 82,6×109/L; mediana 43,1×109/L). U Ŝadnego z pacjentów nie
obserwowano autoimmunologicznych powikłań PBL (hemoglobina mediana 13,85g/dL; retikulocytoza
mediana 13‰; płytki mediana 145×109/L; LDH mediana 221U/L), ani objawów infekcji (na podstawie
badania fizykalnego).
Odsetek komórek PI+ po 24-godzinnej inkubacji z oligodeoksynukleotydem ODN2006 nie wykazywał róŜnic w Ŝadnym z zastosowanych stęŜeń w porównaniu z próbą kontrolną (Rycina 1). Natomiast
po zanalizowaniu indywidualnych danych okazało się, iŜ istnieją pewne róŜnice w reakcji komórek na
ODN2006. MoŜliwy był podział całej grupy na dwie podgrupy A i B (Tabela 1). W podgrupie A obserwowano zmniejszenie cytotoksyczności po kaŜdym badanym stęŜeniu ODN2006 (najwyŜszy spadek
po najwyŜszym stęŜeniu ODN2006, który wyniósł 42% w porównaniu z próbą kontrolną; p=0,005).
Podgrupa B charakteryzowała się natomiast wzrostem cytotoksyczności nawet o 83% przy stęŜeniu
ODN2006 10µg/mL w porównaniu z samym medium (odpowiednio 24,95% vs. 13,58% komórek PI+,
A. WOLSKA i wsp.
318
p=0,005). Obie podgrupy róŜniły się istotnie cytotoksycznością po ODN2006 we wszystkich stęŜeniach
(p=0,04, 0,055 i 0,003).
Tabela 1. Odsetek komórek PI+ w podgrupach A i B
Table 1. Percentage of PI+ cells in subgroups A and B
Podgrupa A n=10
22,74
13,77
16,47
13,07
22,49
23,01
26,74
27,18
30,39
Kontrola
ODN 1
ODN 2.5
ODN 5
IRS 1
IRS 2
IMI 2
IMI 5
IMI 10
Podgrupa B n=10
13,58
23,17
23,69
24,95
14,87
18,43
19,26
18,40
19,40
Wartość p
0.075
0.042
0.055
0.003
0.228
0.833
0.757
0.143
0.252
Cytotoksyczność obserwowana po inkubacji z oligodeoksynukleotydem IRS954 wzrosła w całej
grupie o 5,84% przy stęŜeniu 1µg/mL (p=0,048) i 19,16% przy stęŜeniu dwukrotnie wyŜszym
(p=0,093; Ryc. 1). W podgrupie B znamienny był wzrost odsetka komórek PI+ po IRS w stęŜeniu
1µg/mL (p=0,027). RóŜnice w cytotoksyczności pomiędzy podgrupami nie były znamienne po Ŝadnym
z uŜytych stęŜeń IRS954 (Tabela 1).
Tabela 2. Charakterystyka pacjentów w Podgrupach A i B. Mediana wartości (zakres)
Table 2. Characteristics of patients in subgroups A and B. Median values (range)
Płeć K/M
Wiek (lata)
Leukocytoza (x109/L)
Limfocytoza (x109/L)
Hemoglobina (g/dL)
Płytki krwi (x109/L)
LDH (U/L)
CD38+/CD19+ (%)
ZAP70+/CD19+ (%)
Cytogenetyka FISH
Del11q22
Del13q14
Del17p13
Tri12
Podgrupa A n=10
4/6
52.6 (42.5 – 71.6)
70.8 (14.35 – 242.3)
61.9 (8.8 – 231.6)
12.9 (8.9 – 14.7)
123 (87 – 217)
255 (163 – 298)
1.27 (0.2 – 39)
1.9 (0.01 – 2.12)
1
4
1
3
Podgrupa B n=10
3/7
56.2 (46.2 – 73.4)
31.6 (21.3 – 170.6)
26.3 (16.7 – 163.3)
14.4 (6.2 – 16.2)
163 (78 – 218)
218 (208 – 539)
1.13 (0.3 – 5.16)
0.65 (0.12 – 1.2)
2
7
1
0
Wartość p
0.74
0.58
0.69
0.69
0.48
0.58
1.0
0.93
0.8
0.73
0.26
1.0
0.26
Odsetek komórek PI+ po 24-godzinnej inkubacji z imikwimodem był statystycznie istotnie wyŜszy
w porównaniu do próby kontrolnej we wszystkich zastosowanych stęŜeniach. NajwyŜszą cytotoksyczność obserwowano po hodowli ze stęŜeniem IMI równym 10µg/mL i była ona o 40,8% wyŜsza niŜ
w próbie kontrolnej z kompletnym medium (p=0,013; Ryc. 1). W podgrupie A najwyŜszy wzrost cytotoksyczności po IMI wyniósł 33,6% w porównaniu z medium (p=0,14). W podgrupie B przeŜywalność
komórek PBL po kaŜdym z badanych stęŜeń IMI była statystycznie istotnie niŜsza w porównaniu
z próbą kontrolną, nawet o 42,8% po najwyŜszym stęŜeniu IMI (p=0,018). Nie zaobserwowano róŜnic
w odpowiedzi na IMI pomiędzy podgrupami (Tabela 1).
Wpływ ligandów receptorów Toll-Podobnych TLR7 i TLR9
x
x
319
x
#
Ryc. 1. Odsetek komórek PI+ po 24-godzinnej inkubacji z oligodeoksynukleotydem ODN2006 (stęŜenia 1, 2.5 i 5µg/mL) i
IRS954 (stęŜenia 1 i 2µg/mL) oraz imikwimodem IMI (stęŜenia 2, 5 i 10µg/mL). X – oznacza istotność statystyczną p<0.05,
# – oznacza istotność statystyczną p<0.01 w porównaniu z kontrolą
Fig. 1. Percentage of PI+ cells after 24-hour culture with oligodeoxynucleotides ODN2006 (at 1, 2.5 and 5µg/mL) and IRS954
(at 1 and 2µg/mL), and imiquimod IMI (at 2, 5 and 10µg/mL). X – indicates statistical significance of p<0.05, # – indicates
statistical significance of p<0.01, compared to medium alone
X
X
#
X
Ryc. 2. Iloraz MFI dla CD86 po 24-godzinnej hodowli z badanymi ligandami TLR w stosunku do próby kontrolnej dla populacji komórek jednojądrowych (PBMC) i komórek PBL (PBL). X – oznacza istotność statystyczną p<0.05, # – oznacza istotność statystyczną p<0.01 w porównaniu z próbą kontrolną
Fig. 2. MFI ratio for CD86 after 24-hour culture with TLR ligands, compared to the control sample in PBMCs and CLL cells.
X – indicates statistical significance of p<0.05, # – indicates statistical significance of p<0.01, compared to medium alone
320
A. WOLSKA i wsp.
x
#
x
x
x
Ryc. 3. Iloraz MFI dla CD80 po 24-godzinnej hodowli z badanymi ligandami TLR w stosunku do próby kontrolnej dla populacji komórek jednojądrowych (PBMC) i komórek PBL (PBL). X – oznacza istotność statystyczną p<0.05, # – oznacza istotność statystyczną p<0.01 w porównaniu z próbą kontrolną
Fig. 3. MFI ratio for CD80 after 24-hour culture with TLR ligands, compared to the control sample in PBMCs and CLL cells.
X – indicates statistical significance of p<0.05, # – indicates statistical significance of p<0.01, compared to medium alon
Ryc. 4. Iloraz MFI dla CD86 po 24-godzinnej hodowli z badanymi ligandami TLR w stosunku do próby kontrolnej dla populacji komórek PBL z podziałem na podgrupy A i B
Fig. 4. MFI ratio for CD86 after 24-hour culture with TLR ligands, compared to the control sample in CLL cells, divided into
subgroups A and B
Wpływ ligandów receptorów Toll-Podobnych TLR7 i TLR9
321
W kolejnym etapie ocenialiśmy funkcjonalność receptorów TLR po 24-godzinnej inkubacji z badanymi ligandami w zakresie ich zdolności do pobudzania komórek PBL do ekspresji cząsteczek kostymulujących (CD86, CD80). W tym celu zmierzono średnią intensywność świecenia (MFI) dla poszczególnych przeciwciał monoklonalnych w populacji komórek jednojądrowych (PBMC), oraz na
komórkach PBL (CD19+/CD23+/CD5+). Wyniki przedstawiono jako iloraz MFI po zastosowanym
ligandzie TLR do MFI dla danego przeciwciała w próbie kontrolnej. Zaobserwowano wyraźny wzrost
intensywności świecenia dla CD86 w populacji komórek jednojądrowych PBMC i PBL dla wszystkich
badanych stęŜeń ODN2006, istotny zwłaszcza po ODN 1 i ODN 5 (dla PBMC odpowiednio p=0,003
i p=0,005, dla PBL odpowiednio p=0,012 i p=0,015). Pozostałe ligandy TLR nie wpłynęły na ekspresję
CD86 ani na PBMC, ani na komórkach PBL (Rycina 2). Ekspresja CD80 pozostała bez zmian lub nawet uległa obniŜeniu – zwłaszcza po IRS 1 i IRS 2 o 30% w stosunku do próby kontrolnej w grupie
komórek PBMC (odpowiednio – p=0,004 i p=0,017).
RównieŜ po inkubacji z IMI obserwowano spadek ekspresji CD80 we wszystkich stęŜeniach. Dla
stęŜenia IMI 10 spadek intensywności świecenia CD80 na PBMC wyniósł prawie 30% w porównaniu
z próbą kontrolną (p=0,02). Podobne zmiany MFI obserwowano dla CD80 na komórkach PBL po hodowli z IRS 1 (0,017) i IRS 2 (p=0,08; Rycina 3). Przeanalizowaliśmy równieŜ uzyskane dane w obu
podgrupach. Nie zaobserwowaliśmy róŜnic w odpowiedzi na ligandy TLR pomiędzy grupami. Jedyną
róŜnicę moŜna zauwaŜyć dla MFI CD86 w grupie komórek PBL, gdzie w podgrupie B MFI po wszystkich stęŜeniach ODN jest od 2,56 do 3,73 razy większe niŜ MFI próby kontrolnej i jest najwyŜsze dla
ODN 1 (p=0,043). Podczas gdy najwyŜszy wzrost MFI dla CD86 w podgrupie A wyniósł 1,7 razy i nie
osiągnął istotności statystycznej (Rycina 4). Ze względu na obserwowane róŜnice porównaliśmy pacjentów obu podgrup pod względem dostępnych danych biochemicznych. Charakterystykę obydwu
podgrup przedstawiono w Tabeli 2. Pacjenci obu podgrup nie róŜnili się istotnie pod względem parametrów laboratoryjnych i czynników prognostycznych.
DYSKUSJA
PBL to choroba, w której obserwuje się wieloletnie przeŜycia wolne od objawów choroby, często
pomimo niezastosowania leczenia. Niestety, z biegiem czasu zwykle dochodzi do progresji i utraty
kontroli układu immunologicznego nad proliferacją nowotworowych limfocytów B. Komórki PBL, jak
w przypadku innych nowotworów, wykazują słabą immunogenność w stosunku do kompetentnych
komórek układu odpornościowego gospodarza. W ostatnich latach duŜy nacisk kładzie się na rozwój
terapii ingerujących w mechanizmy immunologiczne np. immunoterapia (przeciwciała monoklonalne),
która jednak nie pozwala na trwałe wyleczenie choroby. DuŜym zainteresowaniem cieszą się TLR.
NaleŜą one do rodziny receptorów rozpoznających konserwatywne cząstki drobnoustrojów (Pattern
Recognition Receptors). Stymulacja TLR prowadzi do uruchomienia odpowiedzi zapalnej poprzez aktywację komórek i produkcję cytokin. Końcowym efektem takiej reakcji jest eliminacja drobnoustroju
i apoptoza aktywowanych komórek.
Ekspresja TLR na komórkach PBL była badana zarówno na poziomie molekularnym (mRNA), jak
i białkowym [5, 6]. Istnieją jednak kontrowersje na temat rodzaju TLR prezentowanych przez komórki
PBL, prawdopodobnie wynikające z róŜnic w stosowanych metodach. Okazało się natomiast, iŜ nowotworowe limfocyty B odpowiadają na ligandy TLR. W naszym badaniu ocenialiśmy cytotoksyczny
wpływ ligandów TLR7 i TLR9, oraz ich zdolność do indukowania ekspresji cząsteczek ko-stymulujących na komórkach PBL in vitro. Oba te zjawiska mogą przyczynić się do skutecznej eliminacji
komórek PBL.
TLR7 odpowiada na jednoniciowe RNA lub grupę małych syntetycznych cząsteczek, do których
naleŜy imikwimod (IMI; pochodna imidazochinolin). IMI stymuluje produkcję cytokin prozapalnych,
a zwłaszcza interferonu i jest stosowany w postaci miejscowej w terapii nowotworów skóry. Oprócz
322
A. WOLSKA i wsp.
nasilania reakcji zapalnej, IMI indukuje równieŜ ekspresję Bcl-2 w podatnych komórkach nowotworowych [8]. JednakŜe, dane na temat jego aktywności w PBL są niejednoznaczne. Spaner i wsp. [9]
przedstawili silne właściwości przeciwnowotworowe IMI u pacjenta z naciekami PBL w skórze, a ponadto stwierdzili zwiększenie ekspresji cząsteczek ko-stymulujących na krąŜących komórkach PBL.
W innym badaniu z tego ośrodka wykazano, iŜ komórki PBL stymulowane S28690 (agonista TLR7),
stosowanym w stęŜeniu 0.1µg/mL, proliferują, stają się komórkami prezentującymi antygen i są zdolne
aktywować limfocyty T [10]. W innym badaniu stosowano S28690 w stęŜeniu 1µg/mL pojedynczo lub
w skojarzeniu z interleukiną 2 i forbolem, po których zaobserwowano wzrost ekspresji cząsteczek kostymulujących m.in. CD80 i CD86 [11]. W badaniu Grandjenette i wsp. [5] nie zaobserwowano wpływu IMI na ekspresję CD80 ani CD86 [5]. Ponadto, imikwimod w stęŜeniu 2µg/mL chronił komórki
PBL przed spontaniczną apoptozą i dopiero powyŜej 5µg/mL działał proapoptotycznie. W naszym badaniu IMI wywołał efekt cytotoksyczny w kaŜdym z zastosowanych stęŜeń. NajwyŜszą cytotoksyczność obserwowaliśmy po 24-godzinnej inkubacji z IMI 10µg/mL i była ona o 40% wyŜsza niŜ w próbie
kontrolnej, co jednak wynosi znacznie mniej niŜ wyniki uzyskane przez Grandjenette. Podobnie nie
wykazaliśmy oczekiwanego wzrostu ekspresji CD80 ani CD86 po inkubacji z IMI. Przeciwnie, CD86
pozostało niezmienione, a CD80 uległo nawet obniŜeniu o ok. 30% na komórkach PBL w podgrupie B
w porównaniu z kontrolą. Trudno jest porównywać efekty róŜnych ligandów. Być moŜe stęŜenia uŜyte
w naszym badaniu, podobnie jak w badaniu Grandjenette, były zbyt wysokie.
TLR9 odpowiada na oligodeoksynukleotydy naturalne pochodzenia bakteryjnego oraz syntetyczne,
co stwarza moŜliwość modyfikowania ich struktury i aktywności. W obecnym badaniu wykorzystaliśmy oligodeoksynukleotyd ODN2006. NaleŜy on do grupy agonistów TLR9 typu B, co oznacza, Ŝe
silnie aktywuje limfocyty B do prezentacji antygenów, proliferacji i następczej apoptozy. Komórki PBL
mają w podobny sposób odpowiadać na stymulację agonistami TLR9. W pracy Decker i wsp. [12] obserwowano aktywację komórek PBL po 72 godzinach hodowli, które namnaŜały się i jednocześnie stały
się komórkami prezentującymi antygen dla allogenicznych limfocytów T, zwłaszcza po skojarzeniu
ODN z przeciwciałami anty-CD40. Ostatnia reakcja zaleŜała od wzmoŜonej ekspresji CD80 i CD86.
Z drugiej jednak strony, stymulowane komórki PBL obniŜyły ekspresję CD95. Prawdopodobnie wzrost
proliferacji komórek PBL nie był korzystnym efektem działania ODN z powodu ich upośledzonej zdolności do spontanicznej apoptozy. Natomiast, Liang i wsp. [13] zademonstrowali zmniejszenie Ŝywotności komórek PBL do 50% juŜ po 12 godzinach stymulacji ODN w stęŜeniu 3µg/mL i znaczący wzrost
ekspresji zwłaszcza CD86 do 4,5 razy po ODN2006 w stęŜeniu 5µg/mL. W badaniu Jahrsdorfer i wsp.
[14] komórki PBL ulegały apoptozie po 7 dniach stymulacji ODN i charakteryzowały się wzrostem
ekspresji CD95 w zakresie stęŜeń ODN2006 od 0.6 do 10µg/mL. Komórki PBL ulegające apoptozie
pochodziły od pacjentów z del13q14 jako jedyną aberracją. W innych przypadkach wpływ ODN był
heterogenny. W naszym badaniu stosowaliśmy podobne stęŜenia ODN2006 i 24-godzinny czas inkubacji. Obserwowana Ŝywotność nie spadła tak dramatycznie, jak w badaniu Liang i wsp. [13]. Ponadto
wyniki nie były jednorodne w całej grupie (wzrost bądź spadek Ŝywotności po ODN2006 w porównaniu z próbą kontrolną) i stąd nasza propozycja podziału grupy w zaleŜności od obserwowanej Ŝywotności komórek PBL po ODN2006. Podział ten okazał się równieŜ prawdziwy w stosunku do badanej ekspresji CD86 na komórkach PBL, gdzie w podgrupie, w której obserwowano zmniejszenie Ŝywotności,
zmierzono najwyŜszą ekspresję CD86 (wzrost ponad 3,5-krotny). Takie zjawisko byłoby bardzo poŜądane. Komórki PBL zwiększałyby ekspresję cząsteczek ko-stymulujących, a jednocześnie ulegałyby
apoptozie. W tej podgrupie, podobnie jak u Jahrsdorfer i wsp., najczęściej obserwowaną aberracją była
del13q14 (7 na 10 aberracji w porównaniu z 4 w drugiej podgrupie), jednak nie była to róŜnica istotna
statystycznie.
Po raz pierwszy w PBL zastosowaliśmy syntetyczny oligodeoksynukleotyd IRS954 o właściwościach hamujących na TLR7 i TLR9 na komórki PBL. W piśmiennictwie jest badany jako potencjalnie
skuteczny w terapii tocznia układowego, gdzie powoduje zmniejszenie reakcji zapalnej i poprawę parametrów biochemicznych na modelu mysim [15, 16]. Przesłanką do zastosowania go w naszym bada-
Wpływ ligandów receptorów Toll-Podobnych TLR7 i TLR9
323
niu jest obserwowana proliferacja komórek PBL w odpowiedzi na agonistów TLR7 i TLR9, która
moŜe być zjawiskiem niekorzystnym in vivo i promować rozwój nowotworu, zwłaszcza u niektórych
chorych. Niestety nie wykazaliśmy dramatycznego wzrostu cytotoksyczności w całej grupie badanej,
a zwłaszcza w podgrupie komórek PBL, które wykazywały wyŜszą Ŝywotność po ODN2006. Spadek
Ŝywotności w całej grupie wyniósł od 5,8% do nieco ponad 19% przy najwyŜszym stęŜeniu IRS954
w porównaniu z próbą kontrolną. IRS954 nie wpłynął, bądź nawet zmniejszył ekspresję cząsteczek kostymulujących zarówno na komórkach PBMC, jak i PBL.
Podsumowując, uzyskane przez nas wyniki potwierdzają zdolność komórek przewlekłej białaczki
limfocytowej do reagowania na ligandy TLR7 i TLR9, a zwłaszcza ODN2006. Wskazują jednakŜe na
konieczność prowadzenia dalszych badań ze względu na ich heterogenny wpływ na komórki PBL.
ODN2006 czy imikwimod moŜe okazać się skuteczny w terapii PBL, pod warunkiem wyodrębnienia
odpowiedniej grupy chorych. Nadal jednak niepoznane są kryteria takiego doboru.
Praca finansowana z Grantu promotorskiego MNiSW nr 507-11-360.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Calissano C, Damle RN, Hayes G i wsp. In vivo intraclonal and interclonal kinetic heterogeneity in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2009; 114(23): 4832-4842.
Messmer BT, Messmer D, Allen SL i wsp. In vivo measurements document the dynamic cellular kinetics of chronic lymphocytic leukemia B cells. J Clin Invest 2005; 115(3): 755-764.
Damle RN, Temburni S, Calissano C, i wsp. CD38 expression labels an activated subset within chronic lymphocytic
leukemia clones enriched in proliferating B cells. Blood 2007; 110: 3352–3359.
Calissano C, Damle RN, Yan XJ, i wsp. Multi-parameter phenotypic analysis of members of chronic lymphocytic leukemia clones identifies distinct proliferative and resting/re-Entry compartments with discrete gene expression profiles.
Blood 2009; 114.
Grandjenette C, Kennel A, Faure GC, Béné MC, Feugier P. Expression of functional toll-like receptors by B-chronic
lymphocytic leukemia cells. Haematologica 2007; 92(9):1279-1281.
Muzio M, Scielzo C, Bertilaccio MT, Frenquelli M, Ghia P, Caligaris-Cappio F. Expression and function of toll like receptors in chronic lymphocytic leukaemia cells. Br J Haematol 2009; 144(4): 507-516.
Cheson BD, Bennett JM, Grever M, i wsp. National Cancer Institute sponsored working group guidelines for chronic
lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 1996; 87: 4990-4997.
Schön MP, Schön M. TLR7 and TLR8 as targets in cancer therapy. Oncogene 2008; 27(2): 190-9.
Spaner DE, Miller RL, Mena J, Grossman L, Sorrenti V, Shi Y. Regression of lymphomatous skin deposits in a chronic
lymphocytic leukemia patient treated with the Toll-like receptor-7/8 agonist, imiquimod. Leuk Lymphoma 2005; 46(6):
935-939.
Spaner DE, Shi Y, White D i wsp. Immunomodulatory effects of Toll-like receptor-7 activation on chronic lymphocytic
leukemia cells. Leukemia 2006; 20(2): 286-295.
Tomic J, White D, Shi Y i wsp. Sensitization of IL-2 signaling through TLR-7 enhances B lymphoma cell immunogenicity. J Immunol 2006; 176(6): 3830-3839.
Decker T, Schneller F, Sparwasser T i wsp. Immunostimulatory CpG-oligonucleotides cause proliferation, cytokine production, and an immunogenic phenotype in chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood 2000; 95(3): 999-1006.
Liang X, Moseman EA, Farrar MA i wsp. Toll-like receptor 9 signaling by CpG-B oligodeoxynucleotides induces an
apoptotic pathway in human chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood 2010; 115(24): 5041-5052.
Jahrsdörfer B, Wooldridge JE, Blackwell SE i wsp. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides induce apoptosis of B cell
chronic lymphocytic leukemia cells. J Leukoc Biol 2005; 77(3): 378-387.
Pawar RD, Ramanjaneyulu A, Kulkarni OP, Lech M, Segerer S, Anders HJ. Inhibition of Toll-like receptor-7 (TLR-7) or
TLR-7 plus TLR-9 attenuates glomerulonephritis and lung injury in experimental lupus. J Am Soc Nephrol 2007; 18(6):
1721-1731.
324
A. WOLSKA i wsp.
16. Barrat FJ, Meeker T, Chan JH, Guiducci C, Coffman RL. Treatment of lupus-prone mice with a dual inhibitor of TLR7
and TLR9 leads to reduction of autoantibody production and amelioration of disease symptoms. Eur J Immunol 2007;
37(12): 3582-3586.
Praca wpłynęła do Redakcji 20.06.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 29.06.2011 r.
Adres do korespondencji:
Klinika Hematologii UM w Łodzi
Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika
Ul. Ciołkowskiego 2
93-510 Łódź