VetExpert IBDV Ab ELISA

Test ELISA do wykrywania przeciwciał zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusza
VetExpert IBDV Ab ELISA
•
Zasada działania testu
Zakaźne zapalenie torby Fabrycjusz (IBD), inaczej choroba Gumboro, jest chorobą wirusową zazwyczaj atakującą młode kurczęta pomiędzy 3 a 6 tygodniem życia, którego
źródłem zakażenia jest zanieczyszczona pasza i woda. Głównym narządem atakowanym przez IBDV jest torba Fabrycjusza, organ ten pełni ważną funkcję w rozwoju
układu immunologicznego młodych kurcząt. Zakażenie serotypem 1 IBDV powoduje
wystąpienie formy klinicznej choroby u kurcząt poniżej 10 tygodnia życia, natomiast
u starszych ptaków zazwyczaj brak jest objawów klinicznych. Serotyp 2 IBDV jest szeroko rozpowszechniony u indyków i czasem u kur i kaczek. W praktyce, rozpoznanie
może być sygnalizowane przez nagłe wystąpienie śmiertelności kurcząt pomiędzy 2 a
8 tygodniem życia, obecności charakterystycznych zmian torebki Fabrycjusza i towarzyszącym temu krwawym wybroczynom w mięśniach piersi i ud chorych ptaków.
VetExpert IBDV Ab ELISA jest pośrednim testem immunoenzymatycznym przeznaczonym do jakościowego wykrywania przeciwciał zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusz w kurzej surowicy. Test VetExpert IBDV Ab ELISA zawiera mikropłytkę, której
studzienki opłaszczone są antygenem IBDV. Podczas pierwszej inkubacji obecne w
badanej próbce przeciwciała IBDV wiążą się z antygenem w studzience. Po tej inkubacji, niezwiązany materiał usunięto poprzez odessanie i wypłukanie. Następnie
dodany koniugat HRP tworzy kompleks z przeciwciałami IBDV. Ponownie niezwiązany
materiał usunięto poprzez odessanie i wypłukanie, kolejno dodano roztwór substratu. Aktywność pozostałego w studzience enzymu będzie wprost proporcjonalna do
stężenia anty-IBDV w próbkach i można ją zmierzyć poprzez inkubację fazy stałej z
roztworem substratu. Reakcja jest zatrzymywana przez dodanie roztworu hamującego, a uzyskany wynik należy odczytać kolorymetrycznie za pomocą spektrofotometru
przy długości fali 450 nm i referencyjnej 620 nm.
W teście zastosowano specjalnie dobrane antygeny IBDV jako materiał wychwytujący.
Umożliwiają one VetExpert IBDV Ab ELISA, z wysokim stopniem dokładności, na identyfikację przeciwciał zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusza w próbkach.
•Zawartość (480 studzienek/zestaw)
W skład zestawu VetExpert IBDV Ab ELISA wchodzą następujące elementy do wykonania testu.
1) 5 mikropłytek opłaszczonych IBDV (96 studzienek/płytka) ułożonych w dwanaście
pasków 1x8.
2) Negatywna surowica kontrolna: 1 fiolka (4 ml) zwykłej surowicy kurzej SPF zachowanej w buforze fosforanowym ze stabilizatorem białkowym. Proclin 300 (0.05%)
dodany jako środek konserwujący.
3) Pozytywna surowica kontrolna: 1 fiolka (4 ml) anty-IBDV dodatniej surowicy kurzej zachowanej w buforze fosforanowym ze stabilizatorem białkowym. Proclin
300 (0.05%) dodany jako środek konserwujący.
4) Rozcieńczalnik do próbek: 2 butelki (250 ml) buforu fosforanowego. Proclin 300
(0.01%) dodany jako środek konserwujący.
5) Roztwór płuczący (skoncentrowany 20x): 1 butelka (250 ml) PBS-Tween 20. Proclin 300 (0.05%) dodany jako środek konserwujący.
6) Koniugat: 1 butelka (80 ml) przeciwciał króliczych anty-kurzych IgY – HRP. Proclin
300 (0.05%) dodany jako środek konserwujący.
7) Substrat TMB: 1 butelka (60 ml) roztworu tetrametylobenzydyny (TMB) z buforem
cytrynianowo-fosforanowym: PRZECHOWYWAĆ W CIEMNYM OTOCZENIU.
8) Roztwór hamujący: 1 butelka (80 ml) 1N kwasu siarkowego. Gotowy do użycia.
9) Samoprzylepna nakładka uszczelniająca: 10 EA.
10)Instrukcja użycia.
Producent: BioNote, Inc.
2-9 Seogu-dong
Hwaseong-si
Gyeonggi-do
Republic of Korea 445-170
inserty_IBDV Ab_20130617.indd 1
•
Środki ostrożności
W celu uzyskania wiarygodnych wyników należy ściśle przestrzegać poniższych zasad:
1) Do stosowania tylko w diagnostyce in vitro.
2) Nie stosować zamiennie odczynników pochodzących z różnych serii. Nie należy
mieszać, aby nie uzyskać błędnych wyników.
3) Nie należy wystawiać substratu TMB na działanie silnego światła lub jakiegokolwiek czynnika utleniającego. Używać do substratu TMB jednorazowych naczyń
plastikowych.
4) Wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze 2~8°C, przed użyciem ogrzać do temperatury otoczenia (18~25°C), po użyciu ponownie schłodzić
do 2~8°C.
5) Należy zachować ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu elementów zestawu.
6) Stosować rękawice jednorazowego użytku w trakcie obchodzenia się z potencjalnie
zakaźnym materiałem oraz w trakcie wykonywania testu.
7) Należy obchodzić się ostrożnie z substratem TMB i roztworem hamującym. Unikać
kontaktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. W sytuacji wypadku przemyć starannie pod bieżącą wodą.
•
Pobranie próbek i przechowywanie
Przygotowanie surowicy:
1) Krew należy pobrać za pomocą jednorazowej strzykawki i dodać do probówki (bez
antykoagulantu).
2) Pobraną krew pozostawić w temperaturze otoczenia przez 30 minut w celu koagulacji a następnie oddzielić surowicę poprzez wirowanie.
3) Surowica powinna być przechowywana w temperaturze 2~8°C do 2 tygodni. W
przypadku dłuższego przechowywania (1rok) należy zamrozić w temperaturze
-20°C.
8) Przykryć mikropłytkę samoprzylepną nakładką uszczelniającą i inkubować w temperaturze otoczenia (18~25°C) przez 30 minut.
9) Wypłukać studzienki 5 razy używając 350 µl rozcieńczonego roztworu płuczącego.
Odessać cały płyn ze studzienek.
10)Dodać 100 µl substratu do każdej studzienki.
11)Inkubować studzienki w temperaturze otoczenia (18~25°C) przez 15 minut.
12)Dodać 100 µl roztworu hamującego do każdej studzienki.
13)Odczytać gęstość optyczną (OD) studzienek przy użyciu spektrofotometru bichromatycznego o długości fali 450 nm i referencyjnej 620 nm. Odczyt musi zostać
ukończony w przeciągu 30 minut od zakończenia testu.
1) Walidacja testu
[Surowica]
1. Jeżeli OD próbki badanej jest mniejsze niż średnie OD kontroli negatywnej
(NC), S/P może być interpretowane jako 0.
2. Średnia kontroli pozytywnej minus średnia kontroli negatywnej musi być
większa lub równa 0.25.
3. Średnia kontroli negatywnej musi być mniejsza lub równa 0.15.
4. Wartości OD powinny być zgodne z powyższą specyfikacją. Jeśli określone
wymagania nie są spełnione, badanie należy powtórzyć postępując zgodnie
z procedurą wykonania.
2) Obliczanie wyników
1. Obliczanie średniego OD kontroli negatywnej (NCx):
OD NCx =
2.
•
Wykonanie testu
1) Przygotować płytkę dla dwóch studzienek negatywnej surowicy kontrolnej, dwóch
studzienek pozytywnej surowicy kontrolnej oraz niezbędnych studzienek dla próbek badanych.
2) Rozcieńczyć 1: 500 próbkę surowicy w rozcieńczalniku do próbek, np. 2 µl próbki +
1000 µl rozcieńczalnika do próbek.
¤ Nie rozcieńczać kontroli negatywnej i pozytywnej.
3) Dodać 100 µl surowic kontrolnych i rozcieńczonych próbek badanych do każdej
studzienki.
4) Przykryć mikropłytkę samoprzylepną nakładką uszczelniającą i dokładnie wymieszać w mieszadle wibracyjnym. Mieszanie jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych rezultatów.
5) Inkubować studzienki w temperaturze otoczenia (18~25°C) przez 30 minut.
6) Wypłukać studzienki 5 razy używając 350 µl rozcieńczonego roztworu płuczącego.
Odessać cały płyn ze studzienek.
7) Dodać 100 µl koniugatu do każdej studzienki.
Importer na Europę Środkowo-Wschodnią
Vet Planet Sp. z o.o.
Biuro Handlowe
ul. Elżbiety Drużbackiej 7/3, 01-622 Warszawa
tel. +48 662 216 773
1) Test VetExpert IBV Ab ELISA należy przechowywać w temperaturze 2~8°C.
Niniejszy zestaw pozostaje stabilny do terminu ważności wydrukowanego na
opakowaniu oraz na etykiecie każdego materiału / odczynnika.
2) Stabilność przygotowanych odczynników.
Materiał /
odczynnik
Stan
Przechowywanie
Stabilność
Rozcieńczony
roztwór płuczący
Przygotowany
temp. otoczenia
(18~25°C)
1 tydzień
•
Opakowanie:
480 testów/zestaw
•
Precyzja
Precyzję pomiarów określono wykonując 10 powtórzeń dwóch próbek kontrolnych:
surowicy negatywnej i surowicy pozytywnej. Współczynnik zmienności CV (%) wartości ujemnych i dodatnich kontroli mieścił się w przedziale 10%.
NC1 + NC2
2
Obliczanie średniego OD kontroli pozytywnej (PCx):
OD PCx =
3.
Niedodanie materiału badanego w trakcie procedury wykonania testu może
spowodować uzyskanie wyniku fałszywie ujemnego. W przypadku podejrzenia klinicznej infekcji, należy rozważyć powtórne wykonanie testu.
• Przechowywanie i stabilność
• Interpretacja wyniku
•
Przygotowanie odczynników
1) Przed użyciem wszystkie odczynniki należy ogrzać do temperatury otoczenia
(18~25°C).
2) Roztwór płuczący (skoncentrowany 20x): przed użyciem skoncentrowany roztwór
płuczący należy rozcieńczyć w proporcji 1:19 z wodą destylowaną/dejonizowaną,
np. 50 ml roztworu płuczącego dodać do 950 ml wody destylowanej i dobrze wymieszać. W przypadku obecności nierozpuszczonych kryształków, roztwór należy
ponownie zawiesić poprzez podgrzanie przez kilka minut w temperaturze 37°C.
5.
PC1 + PC2
2
Kryteria oparte na formule:
S/P =
ODsample – ODNCx
ODPCx – ODNCx
3) Wynik dodatni:
Jeżeli wartość S/P jest większa lub równa 0.2 próbka jest traktowana jako pozytywna dla przeciwciał IBDV.
4) Wynik ujemny:
Jeżeli wartość S/P jest mniejsza niż 0.2 próbka jest traktowana jako negatywna
dla przeciwciał IBDV.
• Ograniczenia i zakłócenia
1) Podczas wykonywania testu należy ściśle przestrzegać procedury wykonania
testu, zachować środki ostrożności i odpowiednio zinterpretować wyniki niniejszego testu.
2) Próbki
1. Próbki zawierające azydek sodu nie mają wpływu na wynik testu.
2. Próbki surowic inaktywowane termicznie (1 godzina w 56°C) nie wpływają
ujemnie na test.
3. Antykoagulanty takie jak heparyna, EDTA i cytrynian nie mają wpływu na
wynik testu.
4. Próbki hemolityczne należy przed wykorzystaniem poddać odwirowaniu
celem uniknięcia zakłóceń składników komórkowych.
Podmiot odpowiedzialny
Vet Planet Sp z o.o.
ul. Staszica 20A/3
05-092 Łomianki
tel. +48 662 204 328
www.vetexpert.pl
13-06-17 22:29
Infectious Bursal Disease Antibody ELISA
VetExpert IBDV Ab ELISA
•
Explanation of the Test
Infectious Bursal Disease (IBD), or Gumboro Disease, is a viral disease usually affecting young chickens 3 to 6 weeks old, and transmitted by contaminated feed and
water. Bursa of Fabricious is the main target organ of IBDV, which is an important organ
for young chickens as an immune development. IBDV serotype 1 causes clinical disease
in chickens younger than 10 weeks, with older chickens usually showing no clinical
signs. IBDV serotype 2 is widespread in turkeys and is sometimes found in chickens
and ducks. In practice, a diagnosis can be indicated by the sudden onset of mortality in
chickens between 2 and 8 weeks of age, and the presence of distinctive lesions in the
Bursa of Fabricious and accompanying blood spots in the musculature of the breast and
thigh of affected chickens.
The VetExpert IBDV Ab ELISA is a indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay for
the qualitative detection of Infectious bursal disease antibody in chicken serum. The
VetExpert IBDV Ab ELISA contains a microplate, which is pre-coated with IBDV antigen
on the well. During first incubation, if antibodies present in the test sample, IBDV antibodies bind to the antigens in the well. Following this incubation, all unbound materials are removed by aspiration and washing. HRP conjugate added subsequently forms
a complex with the IBDV antibodies. Unbound materials are removed by aspiration
and washing before the addition of a substrate solution. The residual enzyme activity
found in the well will thus be directly proportional to the anti‐ IBDV concentration in
specimens and evidenced by incubating the solid‐phase with a substrate solution. The
reaction is stopped by addition of the stopping solution and colorimetric reading will
be performed by using a spectrophotometer at 450 nm with reference wavelength at
620 nm.
The specially selected IBDV antigens are used as a capture material in test. These enable the VetExpert IBDV Ab ELISA to identify to Infectious bursal disease antibodies in
specimens, with a high degree of accuracy.
• Materials Provided (480Tests/Kit)
VetExpert IBDV Ab ELISA contains following items to perform the assay.
1) 5 Microplate coated IBDV (96wells/plate) configured in twelve 1x8 strips.
2) Negative control serum: 1 vial (4ml/vial) of normal SPF chicken serum preserved
in phosphate buffer with protein stabilizer. Proclin 300 (0.05%) is added as a preservative.
3) Positive control serum: 1 vial (4ml/vial) of anti-IBDV positive chicken serum preserved in phosphate buffer with protein stabilizer. Proclin 300 (0.05%) is added
as a preservative.
4) Sample diluent: 2 bottles (250ml) of phosphate buffer. Proclin 300 (0.01%) is
added as a preservative.
5) Washing solution (20X concentrated): 1 bottle (250ml/bottle) of PBS-Tween 20.
Proclin 300 (0.05%) is added as a preservative.
6) Enzyme conjugate: 1 bottle (80ml/bottle) of rabbit anti chicken IgY-HRP. Proclin
300 (0.05%) is added as a preservative.
7) TMB Substrate: 1 bottle (60ml/bottle) of tetramethyl-benzidine (TMB) with
citrate-phosphate buffer: STORE IN THE DARK.
8) Stop solution: 1 bottle (80ml/bottle) of 1N sulfuric acid. Ready to use.
9) Adhesive plate sealer: 10 EA
10)Instructions for use.
• Precautions
3) Do not expose TMB substrate to strong light or any oxidizing agents, Handle all TMB
substrate with disposable plastic ware.
4) Store all reagents at 2~8°C bring to room temperature prior to use and return to
2~8°C following use.
5) Care should be taken to prevent contamination of kit components.
6) Use disposable gloves while handling potentially infectious material and performing the assay.
7) TMB Substrate and stopping solution should be handled with care. Avoid contact
with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident, rinse thoroughly with
running water.
• Specimen Collection and Storage
[Preparation of serum]
1) Blood should be collected with a disposable syringe and added to a serum collection
tube (no anticoagulant).
2) Collected blood should be left at room temperature for 30 minutes to coagulate and
separate serum by centrifugation.
3) Serum should be stored at 2~8°C for up to 2 weeks. For longer storage(1 year),
freeze at or below - 20°C.
•
Reagent preparation
1) Allow all reagents to come to room temperature (18~25°C) before use.
2) Washing solution (20X concentrated): The concentrated washing solution must be
diluted 1 : 19 with distilled/deionized water before use. i.e. add 50ml of Washing
solution to 950ml of distilled water and mix well. If dissolved crystals are present,
resuspend the solution by warming the bottle at 37°C for a few minutes.
•
Procedure of the Test
1) Prepare the plate for two wells of negative control serum, two wells of positive
control serum, and necessary testing sample wells.
2) Dilute the serum sample to 1:500 with sample diluent.
Ex) Sample 2ul + Sample diluents 1000ul
¤ Do not dilute the Negative, Positive control.
3) Add the 100 μℓ of control sera and testing diluted samples to each well.
4) Cover the microplate with adhesive plate sealer and mix well on vibrating mixer.
Mixing is very important to get the reproducible results.
5) Incubate the wells at 18~25°C(Room Temperature) for 30 minutes.
6) Wash the wells at 5 times with 350 μℓ of diluted washing solution. Aspirate all liquid from the wells completely.
7) Add 100 μℓ of enzyme conjugate to each well.
8)Cover the microplate with adhesive plate sealer and incubate the wells at
18~25°C(Room Temperature) for 30 minutes.
9) Wash the wells 5 times with 350 μℓ of diluted washing solution. Aspirate all liquid
from the wells completely.
10)Add 100 μℓ of substrate solution to each well.
11)Incubate the wells for 15minutes at room temperature (18~25°C).
12)Add 100 μℓ of stopping solution to each well.
13)Read the absorbance of the wells with a bichromatic spectrophotometer at 450 nm
with reference wavelength of 620 nm. Reading must be completed within 30 minutes from the end of assay.
In order to obtain reproducible results, the following rules must be observed:
1) For in vitro diagnostic use only.
2) The components from different serials are not interchangeable. Do not mix or substrate so as not to get wrong results.
Producent: BioNote, Inc.
2-9 Seogu-dong
Hwaseong-si
Gyeonggi-do
Republic of Korea 445-170
inserty_IBDV Ab_20130617.indd 2
Importer na Europę Środkowo-Wschodnią
Vet Planet Sp. z o.o.
Biuro Handlowe
ul. Elżbiety Drużbackiej 7/3, 01-622 Warszawa
tel. +48 662 216 773
•
Interpretation of the Test
1) Test validation
[Serum]
(1) If the OD450 of a test sample is lower than the mean OD450 negative, the S/P ratio
can be interpreted as 0.
(2) The positive control mean minus the negative control mean must be higher
than or equal to 0.25.
(3) The negative control mean must be lower than or equal to 0.15.
(4) The OD value should be met with above specification. If the specified requirement are not met, the test must be repeated following proper test procedures.
2) Results calculation
(1) Calculation of NC mean (NCx): (NC1 +NC2)/2
(2) Calculation of PC mean (PCx): (PC1+PC2)/2
(3) Criteria: The criteria is based on following formula.
S/P ratio = (OD450 sample – OD450 NCx)/ (OD450 PCx – OD450 NCx)
3)Positive
If the S/P ratio is higher than or equal to 0.2, the sample is regarded as positive for
IBDV antibodies.
4)Negative
If the S/P ratio is lower than 0.2, the sample is regarded as negative for IBDV antibodies.
•
Limitations and Interferences
1) The test procedure, precautions and interpretation of results sections for this test
kit must be followed closely when testing.
2)Samples
(1) Samples containing sodium azide do not affect the test results.
(2) Heat-inactivated sera samples (1 hour at 56°C) do not impair the test.
(3) Anticoagulants such as heparin, EDTA, and citrate do not affect the test results.
(4) Haemolytic samples should be centrifuged before use to avoid interference by
cellular constituents.
(5) Failure to add specimen in the procedure can result in a false negative result.
Repeating test should be considered if there is clinical suspicion of infection.
•
Storage and stability
1) The VetExpert IBDV Ab ELISA kit should be stored at 2~8°C. This test kit is stable
through the expiration date printed on the package and on the label of each material / reagent as unopened state.
2) Stability of prepared reagents.
Material/
Reagent
Diluted washing
solution
State
Storage
Stability
prepared
Room temp
(18~25°C).
1 weeks
•
Packaging Unit :
480Tests/kit
•
Precision
Within-run and between-run precisions have been determined by testing 10 replicates of two specimens: a negative serum, a positive serum. The C.V(%) of negative ,
positive values were within 10% of the time.
Podmiot odpowiedzialny
Vet Planet Sp z o.o.
ul. Staszica 20A/3
05-092 Łomianki
tel. +48 662 204 328
www.vetexpert.pl
13-06-17 22:29