LAB 6

POZYSKIWANIE PRODUKTÓW W BIORAFINERIACH
LABORATORIUM 6
WPŁYW STĘŻENIA KWASU W METODZIE OBRÓBKI WSTĘPNEJ BIOMASY
LIGNOCELULOZOWEJ NA EFEKTYWNOŚĆ HYDROLIZY
CELULOZY I HEMICELULOZY.
CEL ĆWICZENIA:
celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu stężenia katalizatora kwasowego na wydajność
hydrolizy surowca lignocelulozowego – rozkład celulozy oraz hemicelulozy.
SUROWIEC i ODCZYNNIKI
MATERIAŁY i APARATURA
Otręby pszenne
Kolby stożkowe 250 mL;
Kwas siarkowy(VI)/ kwas solny (0,1–1,0 M)
Wytrząsarka termostatowana z regulacją
temperatury i intensywnością mieszania;
Zasada sodowa (0,1–1,0 M)
Zestaw probówek plastikowych do
pobierania próbek i testu z odczynnikiem
różowym (poj. 10 mL);
Odczynnik DNS
Odczynnik różowy
WYMAGANE ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA
Zestaw probówek szklanych do testu
DNS (poj. 20 mL);
Fartuch
Okulary ochronne
Zlewki;
Rękawiczki lateksowe
Cylinder miarowy 100 mL;
Waga analityczna;
1. PRZYGOTOWANIE DO DOŚWIADCZENIA
- statyw z plastikowymi probówkami dla badania postępu reakcji ponumerowanymi
od 0 do 9 oraz dla próby kontrolnej od 0’ do 9’.
- do próbówek 0-9 należy dodać roztwór zasady w takim stężeniu (objętości) aby
zneutralizować kwas wykorzystany w reakcji.
- statyw z ponumerowanymi probówkami do testu z odczynnikiem różowym i DNS w
ilości takiej aby z każdej pobranej próbki możliwe było wykonanie dwóch powtórzeń.
Procedura na oznaczanie cukrów redukujących i glukozy podane są poniżej.
1

TEST DNS (analiza na obecność glukozy i innych cukrów redukujących)
Do 0,5 mL roztworu zawierającego glukozę o stężeniu 0,1 – 2,0 g/L dodać 1,5 mL odczynnika
DNS i próby wstawić na 5 min do 100 °C. Następnie próby ochłodzić, dodać 8 mL wody
destylowanej i po 25 min od wyciągnięcia z łaźni zmierzyć absorbancję przy 550 nm względem
próby kontrolnej. Do kontroli zamiast roztworu cukru dodaje się 0,5 mL wody, a następnie próbkę
tą traktuje się jak wszystkie pozostałe.
Równanie krzywej: Abs=0,634∙Cred[g/L] – 0,01

Oznaczanie stężenia glukozy testem enzymatycznym.
Zasada metody. Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu
glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Ten ostatni reaguje w obecności
peroksydazy z kwasem hydrobenzoesowym (HBA) i 4-aminoantypiryną (AAP) tworząc
czerwony barwnik chinonoiminę, którego intensywność zabarwienia mierzona przy długości
fali 500 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce.
Glukoza + O2 + H2O Oksydaza glukozowa
H2O2 + HBA + AAP Peroksydaza
kwas glukonowy +H2O2
chinonoimina + 4 H2O
Odczynniki: Odczynnik I (składniki aktywne: oksydaza glukozowa, peroksydaza, AAP,
HBA, bufor fosforanowy), stabilizowany standard glukozy.
Z odpowiednio rozcieńczonej próbki pobrać 10 μl do 1 ml odczynnika zawierającego
oksydazę glukozową (Glukoza OXY DST, Alpha Diagnostics), inkubować przez 5 min w
37oC, a następnie mierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm.
Równanie krzywej: Abs=0,371∙Cgluk [g/L] – 0,109
2. WYKONANIE DOŚWIADCZENIA
1. Kolba do reakcji – surowiec + r-ór kwasu
2. Kolba kontrolna – surowiec + woda
Kwaśna hydroliza surowca lignocelulozowego:
 Do kolb 250 mL zawierającej 5 g otrębów pszennych zwilżonych 20 mL wody należy
dodać 100 mL kwasu siarkowego(VI) o stężeniu podanym przed prowadzącego w
zakresie 0,1-1,0 M.
2
 Start procesu rozpoczyna się w momencie dodania kwasu (należy włączyć stoper).
Natychmiast po wlaniu kwasu pobrać próbkę 1,0 mL (próbka w czasie t=0 min) i
zneutralizować ją roztworem zasady.
 Włączyć wytrząsanie. Hydrolizę należy prowadzić w temperaturze 60 °C przez 60-120
minut z intensywnością mieszania 100-200 obr/min.
 Próbki należy pobierać w 0, 4, 8, 12, 16, 20, 40, 60, 90 (120) min i neutralizować
zasadą, za każdym razem wyłączając wytrząsanie na czas pobierania.
 Analogicznie należy postępować z kolbą kontrolną z tym, że pobrane próbki nie
należy neutralizować zasadą, czyli w momencie dodania wody, należy pobrać próbkę
zerową (~1,5 mL), następnie próbki pobierać w 0, 4, 8, 12, 16, 20, 40, 60, 90 (120)
min.
 Wszystkie próbki należy odwirować 6000 rpm przez 10 min i supernatant
wykorzystać do oznaczeń – DNS i odczynnik różowy.
 Po zakończeniu reakcji otręby oddzielić od fazy ciekłej na sitku i przemywać wodą
destylowaną porcjami 3 x 100 mL.
 Przemyte otręby przenieść na zważoną szalkę Petriego i wysuszyć do stałej masy w
temp. 70 °C przez około dobę i zważyć.
3. OPRACOWANIE WYNIKÓW:
KOLBA Z REAKCJĄ
t
[min]
V
próbki
[mL]
V
NaOH
[mL]
R
Test
DNS
Abs1
Test
DNS
Abs2
R
Stężenie
cukrów
redukujących,
Cred [g/L]
3
Test odczynnik
różowy
Abs1
Test odczynnik
różowy
Abs2
R
Stężenie
glukozy,
Cgluk
[g/L]
R- rozcieńczenie;
KOLBA KONTROLNA
t
[min]
V
próbki
[mL]
V
NaOH
[mL]
R
Test
DNS
Abs1
Test
DNS
Abs2
R
Stężenie
cukrów
redukujących,
CredK [g/L]
Test odczynnik
różowy
Abs1
Test odczynnik
różowy
Abs2
R
Stężenie
glukozy,
CglukK
[g/L]
R- rozcieńczenie;
CredK, CglukK [g/L] należy policzyć z krzywych wzorcowych wykonanych na pierwszych zajęciach uwzględniając
rozcieńczenie próbki.
1. Uwzględnić ilość cukrów pochodzących z kolby kontrolnej CredK i CglukK. Stężenie
cukrów pochodzące z reakcji hydrolizy:
Stężenie rzeczywiste wszystkich cukrów redukujących: Crz,red = Cred - CredK [g/L]
Stężenie rzeczywiste glukozy: Crz,gluk = Cgluk – CglukK [g/L]
2. Przedstawić przebieg reakcji hydrolizy na wykresie Crz,red = f(t) i Crz,gluk = f(t) i
wyznaczyć maksymalną szybkość reakcji uwalniania cukrów redukujących i glukozy;
3. Dla użytych stężeń kwasu siarkowego(VI) porównać szybkość reakcji hydrolizy
składników zawartych w surowcu. Należy przyjąć, że celuloza jest jedynym
składnikiem dającym cząsteczki glukozy, natomiast hydroliza hemicelulozy uwalnia
wszystkie pozostałe cukry redukujące.
Stąd, stężenie oznaczone za pomocą odczynnika różowego będzie odpowiadało
hydrolizie wyłącznie celulozy, a różnica Crz,red - Crz,gluk będzie odpowiadała stężeniu
cukrów budujących hemicelulozę.
4. Na podstawie masy [g] (wysuszonej i zważonej) próbki po hydrolizie należy obliczyć
i określić efektywność hydrolizy kwasowej:
(mpoczątkowa – mkońcowa)/ mpoczątkowa *100%
4