Pobierz dokument

Transkrypt

Pobierz dokument

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
05.12.2007 07847829.4
(19) PL
(11) PL/EP
(13)
(51)
2183599
T3
Int.Cl.
G01N 33/68 (2006.01)
C07K 14/47 (2006.01)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
09.11.2011 Europejski Biuletyn Patentowy 2011/45
EP 2183599 B1
C07K 16/18 (2006.01)
Tytuł wynalazku:
Wysoko specyficzny test immunologiczny i zestaw do oznaczania peptydów i białek o znaczeniu biologicznym
(30)
(43)
Pierwszeństwo:
02.08.2007 EP 07380227
Zgłoszenie ogłoszono:
12.05.2010 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/19
(45)
O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.04.2012 Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/04
(73)
Uprawniony z patentu:
Araclon Biotech, S.L., Zaragoza, ES
PL/EP 2183599 T3
(72)
Twórca(y) wynalazku:
J MANUEL SARASA BARRIO, Zaragoza, ES
(74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Rafał Witek
WTS Rzecznicy Patentowi
WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY
ul. R. Weigla 12
53-114 Wrocław
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
1
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
[0001] Wynalazek dotyczy dziedziny analiz immunologicznych, umożliwiających
wykrywanie peptydów i białek w próbkach, i zapewniających wyższą czułość niż testy
znane ze stanu techniki. Wynalazek dotyczy także zestawów, które dostarczają
składniki potrzebne do przeprowadzenia wspomnianych analiz immunologicznych.
TŁO WYNALAZKU
[0002] Choroba Alzheimera (AD) jest progresywną chorobą degeneracyjną
centralnego układu nerwowego, która chrakteryzuje się postępującą i nasilającą się
utratą pamięci, a następnie utratą kontroli nad funkcjami kończyn i ciała i ewentualną
śmiercią. Jest zdecydowanie najczęstszą przyczyną występowania demencji,
dotykającą 1 do 6% osób w wieku powyżej 65 lat i od 10 do 20% z grupy osób w
wieku ponad 80 lat.
[0003] AD jest odróżniana od innych rodzajów demencji na podstawie kilku
charakterystycznych objawów chorobowych, w tym stopniowego pojawiania się w
mózgu pacjentów płytek starczych, w przestrzeni pozakomórkowej między
neuronami. Płytki posiadają centralny rdzeń złogów amyloidowych, utworzony
głównie przez włókna składające się z peptydu o 40-42 aminokwasach, odnoszącego
się do peptydu β amyloidu (Aβ), otoczonego przez zdegenerowane komórki nerwowe
i glejowe. Peptyd ten powstaje z proteolitycznie zmodyfikowanego białka
prekursorowego, zwanego białkiem prekursorowym amyloidu β (βAPP). βAPP
występuje w organizmie w postaci różnych izoform pochodzących z alternatywnego
składania pierwotnego transkryptu genu kodującego βAPP. Izoformy te stanowią
głównie βAPP-695, βAPP-751 i βAPP-770, przy czym dane odnoszą się do liczby
aminokwasów. Gen βAPP występuje u ludzi w chromosomie 21, którego trisomia
(zespół Downa) powoduje nadekspresję białka i wczesne pojawienie się złogów
amyloidowych w mózgu pacjenta (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766).
βAPP jest białkiem transmembranowym, które może być przetwarzane przez różne
enzymy proteolityczne (sekretazy), co powoduje powstawanie różnych produktów.
Zazwyczaj, βAPP ulega cięciu przez sekretazę alfa w jego obszarze
pozakomórkowym, co generuje słabo rozpuszczalny, wydzielany fragment i krótszy
zakotwiczony w błonie fragment o nazwie C83, który jest następnie cięty przez γsekretazę do peptydu p3 (p340 lub p342) oraz peptydu 57 lub 59, które są następnie
degradowane przez inne proteazy. W wyniku trawienia βAPP przez β-sekretazę
powstaje rozpuszczalny, wydzielany fragment (sβAPP-β) i fragment C99, które mogą
być cięte przez γ-sekretazy, co daje peptyd amyloidowy Aβ i peptyd 57 lub 59
aminokwasowy zakotwiczony w błonie (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741766).
[0004] AD może być klasyfikowana na podstawie wieku, w którym wystąpiła, jako
wcześnie pojawiająca się (w wieku poniżej 60 lat) i późno pojawiająca się (w wieku
powyżej 60 lat), na podstawie wystąpienia autosomalnego dziedziczenia
dominującego, jako postać rodzinna AD lub sporadyczna AD. Wczesny początek
postaci rodzinnej AD może być związany ze znaną mutacją w genach kodujących
2
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
βAPP, presenilinę 1 i presenilinę 2 (znajdujących się odpowiednio na chromosomach
21, 14 i 1). Wspomniane klasyfikacje nie wykluczają się wzajemnie. Najczęstsze
postaci są późno pojawiającymi się postaciami sporadycznymi.
[0005] W praktyce klinicznej, rozpoznanie choroby przeprowadza się przy użyciu
kryteriów klinicznych, opartych na występowaniu typowych objawów klinicznych a
wykluczenie innych rodzajów demencji przy użyciu technik neuroobrazowania i
analizy krwi. Stosując te kryteria diagnostyczne, wiarygodność diagnostyczna jest
akceptowalna, choć według badań przeprowadzonych z wykonaniem autopsji
mózgu, grupa 10-20% pacjentów z rozpoznaną AD cierpiało na inne choroby.
Ponadto, obecnie stosowane metody diagnostyczne mogą być wykonywane tylko
wtedy, gdy proces neurodegeneracyjny jest tak zaawansowany, że pacjent cierpi na
demencję a uszkodzenie mózgu jest tak rozległe, że ogranicza to ilość środków
terapeutycznych. Ostateczna diagnoza wymaga badania patologicznego
wykonywanego post-mortem na tkance mózgowej.
[0006] Dlatego, istnieje potrzeba identyfikacji biomarkerów do wczesnego
rozpoznania AD, które są czułe i specyficzne, i które umożliwiają rozróżnienie
zaburzenia funkcji poznawczych związanych z wiekiem od zaburzeń związanych z
wczesnymi objawami tego procesu, jak również na odróżnienie zmian wynikających z
AD i z powodu innych chorób degeneracyjnych. Zgodnie z Growdon et al. (Neurobiol.
Aging, 1998, 19:109-116), idealny marker dla AD powinien spełniać następujące
wymagania:
•
•
•
•
•
Powinien wykrywać podstawową cechę neuropatologii
Powinien być zatwierdzony w neuropatologicznie potwierdzonych
przypadkach choroby
Powinien wykazywać czułość na poziomie co najmniej 80% w wykrywaniu AD
Powinien przejawiać specyficzność na poziomie co najmniej 80% w
rozróżnianiu AD od innych rodzajów demencji oraz
Powinien być wiarygodny i powtarzalny, nieinwazyjny, prosty do wykonania i
niedrogi.
[0007] W stanie techniki znane są metody diagnozowania AD poprzez wykrywanie
poziomu biomarkerów obecnych w mózgu lub w CSF (płynie mózgowo-rdzeniowym)
pacjentów. Scharakteryzowano różne biomarkery, które oznaczane są w CSF. CSF
odzwierciedla bezpośrednio skład przestrzeni zewnątrzkomórkowej centralnego
układu nerwowego, a tym samym zapewnia wyższe stężenia biomarkerów. Jednak,
CSF może być pobierany jedynie za pomocą punkcji lędźwiowej, która nie jest
rutynową metodą diagnostyczną łatwo akceptowaną przez pacjentów cierpiących na
demencję, nie mówiąc już u pacjentach z zaburzeniami pamięci. Istnieje więc
potrzeba zapewnienia biomarkerów AD, które mogą być wykryte w próbkach, które
można nieinwazyjnie pobierać z ciała pacjenta.
[0008] Odpowiednie biomarkery AD opisane w stanie techniki i możliwe do wykrycia
w osoczu obejmują (i) markery pochodzące z płytki amyloidu, (ii) autoprzeciwciała
przeciwko Aβ lub βAPP, (iii) markery zapalne, takie jak IL-6, jego receptor lub gp130,
białko C-reaktywne lub białko stresu oksydacyjnego (izoprostany), (iv) markery
metabolizmu lipidowego (apoE, oksysterole) oraz (v) markery choroby naczyń
3
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
(homocysteina, lipoproteina b Clq) (Scheuner D et al. (1996) Nature Med 2, 864870).
[0009] Jednakże, w świetle faktu, że Aβ ulega kumulacji w mózgu pacjentów z AD i
stanowi centralny element patogenezy AD, białko to zostało uznane za najbardziej
odpowiedniego kandydata na biomarkera AD. Jednak, korzystanie z Aβ w funkcji
biomarkera AD w osoczu stwarza problem wynikający z tego, że stężenia peptydów
Aβ (Aβ (1-40) oraz Aβ (1-42)) w surowicy są niezwykle niskie, tak że nie ma
dostępnych testów, które są wystarczająco czułe, aby umożliwić detekcję
wymienionych rodzajów peptydu.
[0010] Scheuner et al (Nature Med., 1996, 2:864-870) przeprowadził wstępne
badania mające na celu wykrycie, czy pozakomórkowe stężenia preseniliny 1,
preseniliny 2 lub βAPP były podwyższone u pacjentów z rodzin przenoszących
mutacje związane z postacią rodzinną AD. Mimo że podwyższony poziom Aβ 1-42
(43) stwierdzono w osoczu pochodzącym od osób z FAD-związanymi mutacjami PS1
(P <0,0001), PS2N1411 (P = 0,009), APPK670N. M671L (P <0,0001) i APPV7171 (jeden
pacjent), badania te nie zostały zatwierdzone do analizy sporadycznej postaci AD, w
której stężenie peptydów Aβ w surowicy jest znacznie niższe. Zestaw do oznaczania
stosowany
w
opisanych
tym
dokumencie
badaniach
był
testem
immunoenzymatycznym podwójnego wiązania („kanapkowym”) ELISA, wcześniej
opisanym przez Suzuki,N. et al. (Science, 1994, 264:1336-1340), w którym
wykorzystuje się przeciwciało wychwytujące i przeciwciało do detekcji sprzężone z
peroksydazą.
[0011] Przypuszcza się, że nie ma korelacji między poziomem Aβ a sporadyczną
postacią AD. W związku z tym, Tamaoka A et al. (J Neurol Sci., 1996, 141, 65-68)
dokonali pomiaru poziomu Aβ w osoczu pochodzącym od 28 pacjentów ze
sporadyczną postacią AD, 40 pacjentów cierpiących na inne procesy neurologiczne
związane z demencją i 40 osób zdrowych. Autorzy stwierdzili, że stężenia Aβ40 i
Aβ42 są podobne w grupie kontrolnej i u chorych na postać sporadyczną AD.
Podobne wyniki zostały uzyskane przez Kosaka et al. (Neurology, (1997) 48, 741745). Test wykorzystany przez Tamaoka i współpracowników został ponadto
scharakteryzowany w WO200722015, w odniesieniu do pomiaru Aβ1-40 w osoczu.
Test ten jest testem podwójnego wiązania ELISA, w którym peptydy Aβ40 i Aβ42 są
wychwytywane na stałym nośniku, przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 1A10
(mAB) i wykrywane za pomocą 14F1 mAb sprzężonego z peroksydazą. Test ten
zapewnia poziom czułości w zakresie wartości jednocyfrowych stężenia pg/ml.
[0012] Vanderstichele H et al. (Amyloid, 2000, 7, 245-258) określili poziom Aβ(1-42)
w CSF, osoczu i moczu dla 12 zdrowych osobników kontrolnych, 39 pacjentów
chorych na AD oraz 6 pacjentów cierpiących na otępienie z ciałami Lewy'ego, 10
pacjentów z innymi rodzajami demencji oraz 9 pacjentów z innymi patologiami
neurologicznymi niewykazującymi objawów demencji, jednak nie odnotowano żadnej
korelacji pomiędzy poziomem Aβ(1-42) a wynikami diagnozy, płcią lub wynikami
MMSE. We wspomnianych badaniach zastosowano test INNOTEST β-amyloidu (142), oparty na teście podwójnego wiązania ELISA, w którym Aβ(1-42) jest
wychwytywane na stałym nośniku za pomocą 21F12 mAb rozpoznającego Nkońcowy region Aβ(1-42) i przeprowadza się wykrywane z użyciem biotynylowanego
4
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
3D6 mAb, które rozpoznaje C-końcowy region Aβ(42) oraz streptawidyny sprzężonej
z HRP.
[0013] Fukomoto et al. (Arch. Neurol. 2003, 60, 958-964) przeprowadził badania nad
korelacją poziomu Aβ40 i Aβ42 w osoczu względem różnych klinicznych,
demograficznych i genetycznych zmiennych u 146 pacjentów z AD, 37 pacjentów z
łagodnymi zaburzeniami poznawczymi i 96 pacjentów z chorobą Parkinsona. Wyniki
pokazały, że istnieje znaczący wzrost poziomu skorelowany z wiekiem, ale nie ma
różnic w odniesieniu do rozpoznania, historii choroby rodziny, genotypu ApoE lub
leczenia za pomocą różnych leków, takich jak inhibitor acetylocholinesterazy lub
statyny. Pomiary wykonano przy użyciu testu podwójnego wiązania ELISA, przy
zastosowaniu mAb, które rozpoznaje sekwencję aminokwasową od 11 do 28 z Aβ
(BNT77) oraz mAb sprzężonych z HRP, które specyficznie rozpoznają Aβ40 i Aβ42
(BA27 oraz BC05 mAb).
[0014] Mehta et al. (Arch. Neurol. 57, 2000, 100-105) dokonali pomiaru poziomu
Aβ40 i Aβ42 w osoczu i w CSF u 78 pacjentów z AD oraz u 61 zdrowych osób
stanowiących grupę kontrolną i odnotowali, że poziom Aβ40 w osoczu jest wyższy u
pacjentów z AD, którzy posiadają allele ApoE4, niż w grupie kontrolnej nie
posiadającej wspomnianych alleli, oraz że poziom Aβ42 jest zbliżony u pacjentów z
AD i grupy kontrolnej, przy czym nie odnotowali żadnych różnic wynikających z płci
lub stanu psychicznego ocenianego za pomocą testu krótkiej skali oceny stanu
psychicznego (MMSE). Pomiary przeprowadzono stosując immunoenzymatyczny
test podwójnego wiązania ELISA, w którym wykorzystano jako przeciwciało
wychwytujące przeciw-Aβ mAb 6E10 oraz biotynylowane przeciwciało z surowicy
odpornościowej skierowane przeciwko peptydom i specyficzne wobec Aβ42 i Aβ40.
[0015] Mayeux, R. et al. (Ann Neurol. 1999, 46, 412-416) dokonali pomiaru poziomu
Aβ40 i Aβ42 w osoczu w badanej grupie (530) i 18 miesięcy później (307 pacjentów)
stosując ten sam test immunoenzymatyczny ELISA, jak Mehta et al. (Arch. Neurol.
57, 2000, 100-105). Odnotowano, że pacjenci, u których rozwinęła się AD posiadali
wyższy poziom Aβ42 niż osoby, u których podczas badania nie rozwinęła się AD.
Poziom Aβ42 ulegał obniżeniu po 3 latach od ustalenia diagnozy AD. Nie
zaobserwowano żadnych różnic pod względem fenotypu AD.
[0016] Lanz, T.A i Schacthter, J.B. (J. Neuroscience Methods, 2006, 157:71-81)
opisali kolorymetryczny i fluorescencyjny test podwójnego wiązania ELISA do
wykrywania całkowitej zawartości peptydów Aβ albo ilości poszczególnych peptydów
Aβ40 i Aβ42. Do wykrywania całkowitej zawartości peptydów Aβ zastosowano 6E10
mAb, wykorzystane do wychwytywania peptydów Aβ, a następnie detekcję
prowadzono z użyciem biotynylowanego 4G8 i albo sprzężonej z europem
streptawidyny albo HRP-streptawidyny. Do wykrywania ilości peptydów Aβ40 i Aβ42,
zastosowano 6E10 mAb jako przeciwciało wychwytujące i biotynylowane królicze
poliklonalne przeciwciała specyficzne wobec wspomnianych fragmentów, po czym
użyto sprzężoną z europem streptawidynę albo HRP-streptawidynę. Jednakże,
metoda ta pozwoliła na uzyskanie najniższego limitu detekcji na poziomie 10 pg/ml i
była używana jedynie do pomiaru Aβ w ekstrakcie z mózgu.
5
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
[0017] W WO200750359 opisano analizę immunologiczną do wykrywania postaci
multimerycznych Aβ42, które uczestniczą w wychwytywaniu pochodnych peptydów
Aβ42, z użyciem przeciwciał poliklonalnych specyficznych wobec wspomnianych
postaci multimerycznych i oznaczanie ilości związanych peptydów za pomocą mAb i
HRP-sprzężonego, przeciw-mysiego IgG. Jednak, powyższa analiza zapewnia
poziom detekcji rzędu 1000-3000 pM, co odpowiada 4000 pg/ml.
[0018] W WO0162801 przedstawiono test podwójnego wiązania ELISA do
oznaczania Aβ, w którym wykorzystano przeciwciało 3D6 mAb przeciw-N-końcowe
jako przeciwciało wychwytujące i do detekcji, mAb, które rozpoznawało aminokwasy
15 do 24 dojrzałego Aβ, ale powyższy test stosowano jedynie do pomiaru wartości
stężenia Aβ w zakresie 100 do 200 pg/mL.
[0019] W WO0315617 ujawniono test ELISA do pomiaru Aβ40 i Aβ42 w osoczu, w
którym wykorzystano przeciwciało rozpoznające aminokwasy 13 do 28 dojrzałych
peptydów Aβ, ale test ten daje możliwość wykrycia stężeń wspomnianych peptydów
jedynie w zakresie 250-400 pg/ml a zatem jest odpowiedni tylko do oznaczania
poziomu Aβ w osoczu w przypadku postaci rodzinnej AD.
[0020] W WO0246237 opisano test podwójnego wiązania ELISA do pomiaru
wszytkich rodzajów Aβ (Aβ40 i Aβ42) w homogenacie uzyskanym z mózgu, w którym
to teście zastosowano jako przeciwciało wychwytujące specyficzne mAb dla
aminokwasów 13 do 28 z Aβ42 oraz biotynylowane 3D6 mAb specyficzne dla Nkońcowego regionu peptydu Aβ42, po czym użyto streptawidyny sprzężonej z
peroksydazą. W dokumencie tym opisano ponadto test podwójnego wiązania ELISA
specyficzny wobec Aβ42, w którym wykorzystano jako przeciwciało wychwytujące
mAb 21F12 specyficzne wobec aminokwasów 33-42 z Aβ42 oraz biotynylowane 3D6
mAb jako przeciwciało do detekcji. Jednakże, powyższe testy pozwalały na
uzyskanie niższych poziomów czułości rzędu 50 ng/ml w analizie pomiaru
całkowitego Aβ i 125 mg/ml w teście pomiaru ukierunkowanym na Aβ42, co czyni
testy te nieużyteczne do oznaczania Aβ lub Aβ42 w osoczu lub w surowicy.
[0021] W W00413172 przedstawiono test podwójnego wiązania ELISA do pomiaru
β-amyloidu(1-42) w ekstraktach z mózgu w kwasie mrówkowym oraz w CSF z
wykorzystaniem mAb 3D6 jako przeciwciała do detekcji oraz przeciwciał
poliklonalnych specyficznych wobec różnych regionów dojrzałych peptydów Aβ,
zastosowanych jako przeciwciało wychwytujące.
[0022] Jednakże, wszystkie dotychczasowe testy oparte na analizie ELISA
posiadają niski poziom detekcji, mieszczący się w większości przypadków w zakresie
wartości jednocyfrowych pg/mL, który jest wystarczający do oznaczenia Aβ40 i Aβ42
w CSF, jak również do wykrycia wspomnianych cząsteczek w osoczu u pacjentów
cierpiących na postać rodzinną AD, ale nie jest odpowiedni do wykrywania Aβ42 w
osoczu u pacjentów cierpiących na postać sporadyczną AD, w przypadku której
stężenia Aβ42 w osoczu są dużo niższe. W szczególności, test INNOTEST β
amyloidu (1-42) wykazuje niski poziom detekcji 20 pg/ml, który pozwala na
oznaczenie Aβ42 w CSF, jak również na wykrycie wspomnianych cząsteczek w
osoczu u pacjentów cierpiących na postać rodzinną AD, ale nie jest odpowiedni do
wykrywania Aβ42 w osoczu u pacjentów cierpiących na postać sporadyczną AD, w
6
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
przypadku której stężenia Aβ42 w osoczu są dużo niższe. Użycie tego zestawu
polecane jest jedynie do oznaczania poziomu peptydu Aβ w CSF. Zalecenie to
zostało następnie sprawdzone w ostatnich badaniach z wykorzystaniem INNOTEST
testu β-amyloidu(1-42), w których wykazano, że poziom peptydu w CSF mieści się w
zakresie pomiędzy 100 a 1000 razy wyższym, niż w osoczu (Lewczuk, P et al. (2004)
Neurobiol. Aging 25, 273-281).
[0023] Innymi, handlowo dostępnymi zestawami są Biosource test β amyloidu (1-40)
oraz test β amyloidu (1-42). Zestawy te umożliwiają przeprowadzenie testu
podwójnego wiązania ELISA, w którym peptydy są wychwytywane na nośniku za
pomocą mAb skierowanego przeciwko regionowi końca aminowego dojrzałego
peptydu i wykrywane przy zastosowaniu króliczego przeciwciała poliklonalnego, które
reaguje z regionem C-końcowym dojrzałych β-peptydów i peroksydazą sprzężoną z
przeciw-króliczą IgG. Zestaw ten wykazuje czułość według danych producenta na
poziomie niższym niż 10 pg/ml, ale jest używany do wykrywania stężenia Aβ o
wartości pomiędzy 15,6 a 1000 pg/ml. Zestawy Biosource są zalecane przez
producentów do wykrywania peptydów Aβ w surowicy, CSF oraz kulturach
komórkowych. Jednak, średni poziom Aβ40 i Aβ42 w surowicy pochodzącej od
pacjentów z postacią sporadyczną AD leży poniżej dolnej granicy czułości testu,
zatem nie wydaje się możliwe, by można było wykorzystać je do pomiarów próbek
surowicy.
[0024] W kanadyjskim zgłoszeniu patentowym (CA2585148), odpowiadającym
międzynarodowemu zgloszeniu patentowemu WO200646644, opisano jedynie
analizę peptydu Aβ, pozwalającą na uzyskanie niższego poziomu detekcji 0.5 pg/mL.
Analiza przedstawiona w tym dokumencie jest analizą opartą na
elektrochemiluminiscenyjnym (ECL) teście podwójnego wiązania, w którym mAb
21F12 (które rozpoznaje aminokwasy 33-42 z Aβ42) jest sprzężone z kuleczkami
magnetycznymi, stosowanymi do wyłapywania peptydu Aβ42 w próbce zawierającej
Aβ42, a następnie kontaktowane z 3D6 mAb sprzężonym z kompleksem rutenu.
Ilość związanego przeciwciała 3D6 jest następnie wykrywana za pomocą
luminescencji emitowanej przez kompleks rutenu, po przyłożeniu energii elektrycznej.
Wykorzystując powyższą analizę, twórcy byli w stanie wykryć tak niski jak 0.5 pg/mL
poziom standardu Aβ42. Jednakże, gdy zastosowano taką samą analizę do
porównania poziomu Aβ42 w próbkach osocza pochodzących od pacjentów AD i od
zdrowych osób z grupy kontrolnej, nie zaobserwowano żadnych znaczących różnic
pomiędzy dwiema grupami badanych, co sprawiło, że twórcy stwierdzili, że ilość
nienaruszonej Aβ42 w surowicy jest bardzo niska na skutek degradacji i przeszli do
stosowania kompetytywnej analizy ELISA z użyciem 21F12 mAb, zapeniającej niższe
poziomy czułości w zakresie ng/mL.
[0025] W EP 1 491 889 ujawniono: zestaw do detekcji docelowego polipeptydu
wybranego z grupy obejmującej A42 (Aβ42), A40 (Aβ40) i ich mieszaninę,
zawierający:
(i) pierwsze przeciwciało (przeciwciało wychwytujące) lub kombinację
przeciwciał rozpoznających docelowy polipeptyd (substancje wiążące, które są
przeciwcialami),
7
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
(ii) drugie przeciwciało (przeciwciało reporterowe) lub kombinację przeciwciał
rozpoznających inny obszar docelowego polipeptydu niż obszar
rozpoznawany przez pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał
(substancje wiążące, które są przeciwciałami),
(iii) odczynnik (taki jak, np. "inne przeciwciało (np. królicze przeciwciało)")
wykazujący powinowactwo do drugiego przeciwciała, przy czym odczynnik ten
jest sprzężony z pierwszym elementem pary wiążącej (przeciwciała
skierowane przeciwko króliczym, rozpoznające królicze przeciwciało) oraz
(iv) drugi element pary wiążącej, taki jak wykrywalny znacznik lub enzym
(fosfataza). W EP 1 491 889 ujawniono ponadto, że układ ten może także
obejmować substrat dla znacznika enzymatycznego.
[0026] Zatem, w dziedzinie istnieje potrzeba wprowadzenia udoskonalonej analizy
immunologicznej i zestawów do wykrywania peptydów Aβ-pochodnych, które
pozwolą na przezwyciężenie problemów związanych ze znanymi w stanie techniki
metodami i zestawami, w szczególności, które wykazują czułość wystarczającą do
wiarygodnego wykrycia peptydów Aβ w osoczu pacjentów cierpiących na postać
sporadyczną AD.
STRESZCZENIE WYNALAZKU
[0027] W pierwszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zestawu do wykrywania
docelowego polipeptydu, wybranego z grupy obejmującej Aβ42, Aβ40 oraz ich
mieszaninę, zawierającego
(i) pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał rozpoznających
wspomniany docelowy polipeptyd przy czym pierwsze przeciwciało
skierowane jest przeciwko epitopowi znajdującemu się w obszarze
aminowasów 1 do 16 Aβ40 oraz Aβ42, i pierwsze przeciwciało jest uprzednio
związane ze stałym nośnikiem,
(ii) drugie przeciwciało lub kombinację przeciwciał rozpoznających inny obszar
docelowego polipeptydu, niż obszar rozpoznawany przez pierwsze
przeciwciało lub kombinację przeciwciał,
(iii) odczynnik wykazujący powinowactwo względem drugiego przeciwciała,
przy czym wspomniany odczynnik jest sprzężony z pierwszym elementem
pary wiążącej oraz
(iv) drugi element pary wiążącej sprzężony ze znacznikiem fluorescencyjnym,
luminescencyjnym lub enzymatycznym,
w którym para wiążąca wybrana jest z grupy składającej się z:
haptenu i przeciwciała;
8
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
antygenu i przeciwciała;
biotyny i awidyny;
biotyny i streptawidyny;
analogu biotyny i awidyny;
analogu biotyny i streptawidyny;
cukru i lektyny;
enzymu i kofaktora;
kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego oraz
analogu kwasu nukleinowego i komplementarnego mu kwasu nukleinowego.
[0028] W drugim aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zestawu według wynalazku
do oznaczania lub wykrywania docelowego polipeptydu w próbce, jak również
służącego do diagnozy choroby neurodegeneracyjnej u pacjenta.
[0029] W trzecim aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oznaczania lub
wykrywania ilości docelowego polipeptydu wybranego z grupy zawierającej Aβ42,
Aβ40 i ich mieszaninę, w próbce, obejmujący następujące etapy
(i) wychwytywanie docelowego polipeptydu obecnego w próbce za pomocą
pierwszego przeciwciała lub kombinacji przeciwciał wiążących specyficznie
wspomniany docelowy polipeptyd, przy czym pierwsze przeciwciało
skierowane jest przeciwko epitopowi położonemu w obszarze aminokwasów 1
do 16 w Aβ40 oraz Aβ42, i pierwsze przeciwciało jest uprzednio
immobilizowane na stałym nośniku,
(ii) kontaktowanie kompleksu immunologicznego utworzonego w etapie (i) z
drugim przeciwciałem lub kombinacją przeciwciał rozpoznających obszar
docelowego polipeptydu, który jest różny od obszaru rozpoznawanego przez
pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał,
(iii) kontaktowanie kompleksu utworzonego w etapie (ii) z odczynnikiem
wykazującym powinowactwo względem drugiego przeciwciała i sprzężonego z
pierwszym elementem pary wiążącej,
(iv) kontaktowanie kompleksu utworzonego w etapie (iii) z drugim elementem
pary
wiążącej
sprzężonym
ze
znacznikiem
fluorescencyjnym,
luminescencyjnym lub enzymatycznym oraz
(v) wykrycie lub określenie aktywności lub ilości znacznika przyłączonego do
drugiego elementu pary wiążącej,
9
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
przy czym para wiążąca wybrana jest z grupy składającej się z:
biotyny i awidyny;
cukru i lektyny;
enzymu i kofaktora;
[0030] W czwartym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania
choroby degeneracyjnej u pacjenta, obejmującego określenie ilości Aβ40 lub Aβ42 w
próbce od pacjenta z wykorzystaniem sposobu według wynalazku i skorelowanie
wartości stężenia wspomnianego peptydu lub peptydów w próbce od wspomnianego
pacjenta w odniesieniu do stężenia wspomnianego peptydu lub peptydów w próbce
pochodzącej od zdrowego osobnika, z pojawieniem się choroby degeneracyjnej.
KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU
[0031] Na Figurze 1 przedstawiono krzywą standardową miareczkowania dla testu
podwójnego wiązania ELISA, w którym wartość absorbancji przy 450 nm
przedstawiono w funkcji znanych wartości stężenia standardowych preparatów Aβ40
(w pg/mL).
[0032] Na Figurze 2 przedstawiono krzywą standardową miareczkowania dla testu
podwójnego wiązania ELISA, w którym wartość absorbancji przy 450 nm
przedstawiono w funkcji znanych wartości stężenia standardowych preparatów Aβ42
(w pg/mL).
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
[0033] Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że zaskakująco, dzięki
zastosowaniu zestawu zawierającego składniki określone w zastrz. 1, możliwe jest
określenie poziomu Aβ40 i Aβ42 przy niskim poziomie detekcji, niższym niż 0.1
10
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
pg/ml. Zestaw ten pozwala na wiarygodne ilościowe oznaczenie wspomnianych
cząsteczek w każdej próbce od każdego osobnika, w szczególności, w osoczu
pobranym od osób, u których podejrzewa się występowanie postaci sporadycznej
AD, przy czym stężenie w osoczu jest tak niskie, że dotychczas nie było możliwe
dokonanie wiarygodnego pomiaru.
[0034] Zgodnie z powyższym, w pierwszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy
zestawu do wykrywania docelowego polipeptydu, wybranego z grupy obejmującej
Aβ42, Aβ40 oraz ich mieszaninę, zawierającego
biotyny i awidyny;
cukru i lektyny;
enzymu i kofaktora;
11
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
[0035] Nie wiążąc się z żadną konkretną teorią, uważa się, że zwiększona czułość
wynika z zastosowania odczynnika (iii), który umożliwia wzmocnienie sygnału
wytworzonego przez przeciwciało do detekcji.
[0036] Stosowane w niniejszym opisie określenie "Aβ42", dotyczy 42aminokwasowego peptydu, odpowiadającego aminowasom 672 do 713 (SEQ ID
NO:4), który powstaje w wyniku późniejszego cięcia proteolitycznego białka
prekursorowego amyloidu (SEQ ID NO:6) przeprowadzanego przez β- i γ-sekretazy.
[0037] Stosowane w niniejszym opisie określenie "Aβ40", dotyczy 40aminokwasowego peptydu, odpowiadającego aminowasom 672 do 711 (SEQ ID
NO:5), który powstaje w wyniku późniejszego cięcia proteolitycznego białka
prekursorowego amyloidu (SEQ ID NO:6) przeprowadzanego przez β- i γ-sekretazy.
[0038] W kontekście niniejszego wynalazku, pierwsze przeciwciało odnosi się do
"przeciwciała wychwytującego", co oznacza, że przeciwciało jest stosowane do
odnajdywania w próbce wszelkich molekularnych cząstek, z którymi specyficznie
wiąże się przeciwciało. Nie ma praktycznie żadnych ograniczeń co do rodzaju
przeciwciała, które może być stosowane jako przeciwciało wychwytujące, pod
warunkiem, że zawiera ono co najmniej jedno miejsce wiążące antygen specyficzne
dla Aβ40 i/lub Aβ42. Dlatego cząsteczki przeciwciał odpowiednie do stosowania jako
przeciwciała wychwytujące obejmują
•
•
•
•
•
Przeciwciała "nienaruszone", zawierające zmienny region wiążący antygen,
jak również domenę stałą łańcucha lekkiego (CL) oraz domeny stałe łańcucha
ciężkiego, CH1, CH2 i CH3,
Fragmenty "Fab" otrzymane w wyniku trawienia papainą nienaruszonego
przeciwciała, zawierające miejsce wiążące pojedynczy antygen CL oraz region
CH1,
Fragmenty "F(ab')2" uzyskane w wyniku trawienia pepsyną nienaruszonego
przeciwciała, zawierające dwa miejsca wiążące antygen,
Fragmenty "Fab'" zawierające domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą
domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego, posiadającą tylko jedno miejsce
wiążące antygen. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab kilkoma
resztami na końcu karboksylowym łańcucha ciężkiego domeny CH 1,
obejmującymi jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała,
"Fv" jest najmniejszym fragmentem przeciwciała, zawierającym pełne miejsce
rozpoznające i wiążące antygen. Region ten zawiera dimer jednego łańcucha
ciężkiego oraz jedną domenę zmienną łańcucha lekkiego w ścisłym,
niekowalencyjnym wiązaniu. Posiada on konfigurację, w której trzy
hiperzmienne regiony (CDR) każdej domeny zmiennej oddziaływają, by
określić miejsce wiążące antygen na powierzchni dimeru VH - VL. Łącznie,
sześć hiperzmiennych regionów nadaje specyficzność wiązaniu antygenu z
przeciwciałem. Jednkże, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv
zawierająca tylko trzy hiperzmienne regiony specyficzne wobec antygenu)
posiada zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, mimo że z niższym
powinowactwem niż całe miejsce wiążące.
12
PZ/1441/RW
•
•
•
EP 2 183 599 B1
Pojedynczołańcuchowe FV lub "scFv" fragmenty przeciwciała zawierają VL
oraz VH, domeny przeciwciała, przy czym domeny te występują w
pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Korzystnie, regiony VL i VH
połączone są poprzez łącznik polipeptydowy, który sprawia, że scFv może
przyjmować pożadaną strukturę dla wiązania antygenu.
"Diprzeciwciała" zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH)
połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) na tym samym łańcuchu
polipeptydowym (VH-VL), połączonym za pomocą łącznika peptydowego,
który jest zbyt krótki by umożliwić utworzenie par pomiędzy dwiema domenami
na tym samym łańcuchu. Wymusza to powstawanie par z komplementarnymi
domenami innego łańcucha i sprzyja tworzeniu kostruktu dimerycznej
cząsteczki o dwóch funkcjonalnych miejscach wiążących antygen.
"Przeciwciała bispecyficzne" (BAb) są pojedynczymi, diwalentnymi
przeciwciałami (lub ich immunoterapeutycznie skutecznymi fragmentami),
które posiadają dwa odmiennie wiążące, specyficzne miejsca antygenowe.
Dwa miejsca antygenowe mogą być sprzężone razem chemicznie lub za
pomocą znanych w stanie techniki metod inżynierii genetycznej.
[0039] Wszystkie powyższe fragmenty przeciwciał mogą być następnie
modyfikowane za pomocą konwencjonalnych technik znanych w dziedzinie, na
przykład, poprzez aminokwasowe delecj(ę)e, insercję(e), podstawienie(a), dodanie
(a) i/lub rekombinację (i/lub dowolne inną(e) modyfikację(e) (np. modyfikacje
posttranslacyjne i chemiczne, takie jak glikozylacja i fosforylacja) stosowane w
dziedzinie pojedynczo lub w kombinacji. Metody wprowadzania takich modyfikacji do
sekwencji DNA będącej podstawą sekwencji aminokwasowej łańcucha
immunoglobuliny są dobrze znane specjaliście w dziedzinie; patrz, np., Sambrook et
al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press,
wydanie 2-gie 1989 oraz wydanie 3-cie 2001.
[0040] Przeciwciała odpowiednie do zastosowania jako przeciwciała wychwytujące
obejmują zarówno przeciwciała poliklonalne, jak i monoklonalne. W celu wytworzenia
przeciwciał poliklonalnych różne organizmy gospodarza, włączając kozy, króliki,
szczury, myszy, wielbłądy, dromadery, lamy, ludzi, ptaki i inne, mogą być
immunizowane poprzez zaszczepienie peptydem odpowiadającym fragmentowi
Aβ40 lub Aβ42, posiadającym właściwości immunogenne. Zależnie od gatunku
gospodarza, w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej mogą być
zastosowane różne adiuwanty. Takie adiuwanty obejmują, ale bez ograniczeń,
adiuwant Freunda, żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, oraz substancje
powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, polianiony, peptydy, emulsje olejowe,
KLH oraz dinitrofenol. Spośród adiuwantów stosowanych u ludzi szczególnie
korzystne są BCG (Bacilli Calmette-Guerin) oraz Corynebacterium parvum. Jeżeli
antygen jest peptydem, może być korzystne sprzężenie go z białkiem, które jest
immunogenne w gatunkach poddawanych immunizacji. Na przykład, antygen może
być sprzężony z hemocyjaniną morskiego mięczaka (Keyhole Limpet Hemocyanin
KLH), błękitnym nośnikiem „Blue Carrier” (hemocyjaniną wyizolowaną z Concholepas
concholepas), tyroglobuliną wołową lub inhibitorem trypsyny sojowej, za pomocą
czynnika bifunkcjonalnego lub tworzącego pochodne, np., ester maleimidobenzylowy
sulfoimidu kwasu bursztynowego (konjugacja poprzez reszty cysteiny), N-
13
PZ/1441/RW
hydroksyimid kwasu bursztynowego
bezwodnik bursztynianowy lub SOCl2.
EP 2 183 599 B1
(poprzez
reszty
lizyny),
glutaraldehyd,
[0041] Do produkcji przeciwciał monoklonalnych mogą być zastosowane techniki
konwencjonalne. Na przykład, przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymane
dzięki zastosowaniu metody hybrydoma, opisanej po raz pierwszy przez Kohler et al.,
Nature, 256:495 (1975), za pomocą procedury opisanej szczegółowo w rozdziale
11.4 do 11.11 Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons Inc; wydanie zbindowane, 2003). Alternatywnie, przeciwciała
monoklonalne mogą zostać wyizolowane z użyciem procedur rekombinowanego
DNA z fagowej biblioteki przeciwciał utworzonej za pomocą technik opisanych w
McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clacksoii et al., Nature, 352:624-628
(1991) oraz Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) opisali izolację,
odpowiednio, mysich i ludzkich przeciwciał przy zastosowaniu bibliotek fagowych. W
kolejnych publikacjach opisano strategie otrzymywania bardzo dużych bibliotek
fagowych poprzez produkcję ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (rzędu
nM) metodą tasowania łańcuchów (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)),
jak również za pomocą infekcji kombinatorycznej i rekombinacji in vivo (Waterhouse
et al., Nucl. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Zatem, techniki te są możliwymi
alternatywami tradycyjnych technik z wykorzystaniem hybrydoma przeciwciał
monoklonalnych do izolacji przeciwciał monoklonalnych.
[0042] Przeciwciała poliklonalne mogą być stosowane bezpośrednio jako surowica
odpornościowa uzyskana od immunizowanych gospodarzy po pobraniu krwi i
usunięciu skrzepu fibrynowego. Przeciwciała monoklonalne można stosować
bezpośrednio jako supernatant z kultury hybrydoma lub płynu wodobrzusza po
implantacji hybrydoma w jamie otrzewnej odpowiedniego gospodarza. Alternatywnie,
cząsteczki immunoglobulin, poliklonalne albo monoklonalne, mogą być oczyszczane
przed ich użyciem za pomocą konwencjonalnych środków, takich jak oczyszczanie z
wykorzystaniem powinowactwa z zastosowaniem peptydów pochodzących z Aβ40
lub Aβ42, oczyszczanie w żelu w warunkach niedenaturujących, HPLC lub RPHPLC, sączenie molekularne, oczyszczanie na kolumnie z białkiem A, lub dowolna
kombinacja tych technik.
[0043] W korzystnej realizacji, przeciwciała wychwytujące rozpoznają obszar
wspólny dla Aβ40 i Aβ42, co umożliwia jednoczesne wychwycenie obu rodzajów za
pomocą jednego typu przeciwciał. W zasadzie, dowolne przeciwciało swoiste wobec
obszaru wspólnego dla sekwencji zarówno Aβ40, jak i Aβ42 może być zastosowane
jako przeciwciało wychwytujące. Korzystne epitopy, które mogą celem przeciwciał
wychwytujących obejmują epitopy zlokalizowane w obszarze aminokwasów od 1 do
16, 1 do 17, 13 do 28, 15 do 24, 1 do 5 i 1 do 11 z Aβ40 lub Aβ42. W bardziej
korzystnej realizacji, przeciwciało wychwytujące jest skierowane przeciwko obszarowi
w Aβ40 lub Aβ42, który różni się od regionu C-końcowego. W wariancie jeszcze
bardziej korzystnym, przeciwciało wychwytujące jest skierowane przeciwko
obszarowi epitopowi w regionie N-końcowym peptydów Aβ40 i Aβ42. W jeszcze
bardziej korzystnej realizacji, przeciwciało wychwytujące jest przeciwciałem
monoklonalnym. W wariancie jeszcze bardziej korzystnym, przeciwciało
wychwytujące rozpoznaje region odpowiadający aminokwasom 1-16 peptydów Aβ.
W jeszcze bardziej korzystnej realizacji, przeciwciałem monoklonalnym stosowanym
14
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
jako przeciwciało wychwytujące jest 6E10 mAb, jak opisano w Kim, K.S.
(Neuroscience Res. Comm. 1988, 2:121-130).
[0044] Drugi element zestawu według wynalazku odpowiada przeciwciału lub
kombinacji przeciwciał, które rozpoznają inny region docelowego polipeptydu, niż
region rozpoznawany przez pierwsze przeciwciało lub kombinację przeciwciał. W
kontekście niniejszego wynalazku, drugie przeciwciało będzie dalej nazywane
"przeciwciałem do detekcji", ponieważ przeciwciało to będzie wykorzystywane do
wykrywania ilości antygenu, który został zatrzymany przez przeciwciało
wychwytujące.
[0045] Podobnie jak w przypadku przeciwciała wychwytującego, praktycznie nie ma
ograniczeń co do rodzaju przeciwciała, które może być stosowane jako przeciwciało
do detekcji. Jednak, dla specjalisty w dziedzinie jest wiadome, że przeciwciało do
detekcji (i) musi wiązać z regionem antygenu, który nie jest objęty przez przeciwciało
wychwytujące oraz (ii) musi zawierać nie tylko miejsce wiązania antygenu, ale
również dodatkowy region lub regiony, które mogą być specyficznie wykryte przez
odczynnik wykazujący wysokie powinowactwo wiązania względem wspomnianego
przeciwciała, tak aby umożliwić wykrycie przeciwciała, które jest związane z
antygenem wychwyconym przez przeciwciało wychwytujące. Korzystnie,
wspomniane dodatkowe regiony, które mogą być specyficznie wiązane przez
wspomniany odczynnik odpowiadają regionowi stałemu cząsteczki immunoglobuliny.
[0046] Odpowiednie przeciwciała do detekcji obejmują nienaruszone przeciwciała,
fragmenty Fab, F(ab')2, Fab' oraz Fv, pojedynczołańcuchowe przeciwciała FV,
diprzeciwciała, podwójnie swoiste przeciwciała i tym podobne, przy czym związki te
odpowiadają uprzednio przedstawionym definicjom. Podobnie jak w przypadku
przeciwciała wychwytującego, przeciwciało do detekcji może być poliklonalne lub
monoklonalne, natywne lub zmodyfikowane posttranslacyjnie i czyste lub
wzbogacone w cząsteczki wiążące antygen, przy zastosowaniu tych samych
procedur, jak opisane dla przeciwciał wychwytujących. Dla specjalisty w dziedzinie
jest wiadome, że w celu użycia przeciwciała do detekcji, należy je rozcieńczyć do
odpowiedniego poziomu stężenia roboczego i wspomniane rozcieńczenie może być
rutynowo ustalone dla każdej partii przeciwciał. Ponadto, będzie to oczywiste, że
odpowiednie rozcieńczenie robocze będzie różne w zależności od tego czy użyta jest
surowica odpornościowa czy raczej oczyszczona frakcja IgG. Typowe rozcieńczenia
wynoszą 1/1000, 1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1/7000, 1/8000, 1/9000,
1/10000 i tym podobne.
[0047] W korzystnej realizacji, przeciwciała do detekcji obejmują dowolne
przeciwciało poliklonalne wybrane z grupy zawierającej
(i) przeciwciało poliklonalne uzyskane przeciwko peptydowi odpowiadającemu
C-końcowemu regionowi peptydu Aβ42, które wiąże się specyficznie z Aβ42,
bez zajścia żadnej istotnej reakcji krzyżowej z Aβ40 lub Aβ43
(ii) przeciwciało poliklonalne uzyskane przeciwko peptydowi odpowiadającemu
C-końcowemu regionowi peptydu Aβ40, które wiąże się specyficznie z Aβ40
15
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
bez zajścia żadnej istotnej reakcji krzyżowej z Aβ42, Aβ39, Aβ38, Aβ41 lub
Aβ43
(iii) przeciwciało, które rozpoznaje jednocześnie C-końcowy region obu Aβ40 i
Aβ42 lub
(iv) kombinacja przeciwciał wymienionych w punkcie (i) oraz (ii).
[0048] W jeszcze bardziej korzystnej realizacji, peptyd odpowiadający Ckońcowemu regionowi peptydu Aβ42 użyty do otrzymania przeciwciała swoistego
wobec Aβ42 jest peptydem zdefiniowanym w SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:2. W
innej, korzystnej realizacji, peptyd odpowiadający C-końcowemu regionowi peptydu
Aβ40 użyty do otrzymania przeciwciała swoistego wobec Aβ40 jest peptydem
zdefiniowanym w SEQ ID NO:3. Przeciwciała swoiste względem Aβ40 i Aβ42 oraz
spsosoby ich otrzymywania zostały szczegółowo opisane w WO2004024770 oraz
WO2004098631, włączonych tytułem referencji.
[0049] Dla specjalisty w dziedzinie będzie zrozumiałe, że metoda może być użyta do
wykrywania Aβ40 i Aβ42 lub obu tych rodzajów jednocześnie, w zależności od
zastosowanych w metodzie rodzajów przeciwciał wychwytujących i przeciwciał do
detekcji.
[0050] W celu wykrycia lub specyficznego określenia Aβ40, przeciwciało
wychwytujące może być przeciwciałem, które rozpoznaje N-końcowy region Aβ40 (a
także Aβ42, gdyż oba peptydy mają identyczne regiony N-końcowe) oraz
przeciwciało do detekcji może być przeciwciałem, które specyficznie rozpoznaje
region C-końcowy Aβ40, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ42. Alternatywnie,
Aβ40 może zostać specyficznie wykryte za pomocą przeciwciała wychwytującego,
które rozpoznaje region C-końcowy Aβ40, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z
Aβ42 i przeciwciało do detekcji może być przeciwciałem, które rozpoznaje region
Aβ40, który jest wspólny dla obu Aβ40 i Aβ42, korzystnie region N-końcowy
Aβ42/Aβ40.
[0051] W celu wykrycia lub specyficznego określenia Aβ42, przeciwciało
wychwytujące może być przeciwciałem, które rozpoznaje N-końcowy region Aβ42 (a
także Aβ40, gdyż oba peptydy mają identyczne regiony N-końcowe) oraz
przeciwciało do detekcji może być przeciwciałem, które specyficznie rozpoznaje
region C-końcowy Aβ42, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ40. Alternatywnie,
Aβ42 może zostać specyficznie wykryte za pomocą przeciwciała wychwytującego,
które rozpoznaje region C-końcowy Aβ42 i przeciwciało do detekcji może być
przeciwciałem, które rozpoznaje region Aβ42, który jest wspólny dla obu Aβ42 i
Aβ40.
[0052] W celu wykrycia lub jednoczesnego określenia Aβ42 i Aβ40, przeciwciało
wychwytujące może być przeciwciałem, które rozpoznaje N-końcowy region wspólny
dla Aβ42 i Aβ40 a przeciwciało do detekcji może stanowić kombinację przynajmniej
dwóch przeciwciał, przy czym pierwsze przeciwciało specyficznie rozpoznaje region
C-końcowy Aβ42, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ40 a drugie przeciwciało
16
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
specyficznie rozpoznaje region C-końcowy Aβ40, bez wchodzenia w reakcję
krzyżową z Aβ42. Alternatywnie, przeciwciało wychwytujące może być
przeciwciałem, które rozpoznaje region N-końcowy wspólny dla Aβ42 i Aβ40 a
przeciwciało do detekcji może być przeciwciałem, które rozpoznaje region Ckońcowy obu Aβ40 i Aβ42. Alternatywnie, Aβ42 i Aβ40 mogą zostać jednocześnie
wykryte z użyciem jako przeciwciała wychwytującego mieszaniny co najmniej dwóch
przeciwciał obejmującej pierwsze przeciwciało, specyficznie rozpoznające region Ckońcowy Aβ42, bez wchodzenia w reakcję krzyżową z Aβ40 i drugie przeciwciało,
które specyficznie rozpoznaje region C-końcowy Aβ40, bez wchodzenia w reakcję
krzyżową z Aβ42 oraz przeciwciała do detekcji, które rozpoznaje region N-końcowy
wspólny dla obu Aβ42 i Aβ40. Alternatywnie, Aβ42 i Aβ40 mogą zostać jednocześnie
wykryte z użyciem jako przeciwciała wychwytującego przeciwciała, które rozpoznaje
region C-końcowy obu i Aβ42 a przeciwciało do detekcji rozpoznaje region Nkoncowy wspólny dla obu Aβ42 i Aβ40.
[0053] W korzystnej realizacji, pierwsze i/lub drugie przeciwciało lub kombinacja
przeciwciał jest oczyszczana poprzez powinowactwo z użyciem polipeptydu
zawierającego sekwencję polipeptydu zastosowanego do ich otrzymywania.
[0054] Trzeci element zestawu odpowiada odczynnikowi, który wykazuje
powinowactwo względem przeciwciała do detekcji i który jest sprzężony z pierwszym
elementem pary wiążącej. Odczynnik wiążący przeciwciało może niekowalencyjnie
wiązać się z określonym typem (-ami), szczególną(-ymi) klasą (-ami) i/lub określoną
(-ymi) podklasą(-ami) przeciwciała lub fragmentów przeciwciała. Alternatywnie,
odczynnik wiążący przeciwciało może niekowalencyjnie wiązać się z przeciwciałem
swoistym dla określonego antygenu. W pewnych realizacjach, odczynnik wiążący
przeciwciało wiąże się niekowalencyjnie z regionem Fc lub regionem F(ab)
przeciwciała do detekcji. Korzystne odczynniki wiążące przeciwciało obejmują białko
A, białko G, białko V, białko L, przeciwciało przeciwko Fc lub fragment wiążący
przeciwciało i receptor Fc (FcR) lub jego fragment wiążący przeciwciało.
Nieograniczające przykłady przeciwciał, które mogą być związane niekowalencyjnie z
przeciwciałem do detekcji obejmują przeciwciała monoklonalne, przeciwciała
poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne, przeciwciała ludzkie, humanizowane
przeciwciała, chimeryczne przeciwciała, przeciwciała o pojedynczej domenie,
przeciwciała pojedyńczołańcuchowe Fv (scFv), fragmenty Fab, fragmenty F(ab'),
połączone wiązaniem disiarczkowym Fv (sdFv), przeciwciała wewnątrzkomórkowe i
antyidiotypowe (anty-ID) oraz fragmenty wiążące epitop któregokolwiek z
powyższych. Nieograniczające przykłady receptorów Fc obejmują FcγRI, FcγRIIA,
FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIAα, FcγRIIIB, FcεRIα, FcεRIξ oraz FcγRIIIAξ.
[0055] Czwarty element zestawu według wynalazku odpowiada drugiemu
elementowi pary wiążącej, sprzężonemu ze znacznikiem fluorescencyjnym,
17
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
biotyny i awidyny;
cukru i lektyny;
enzymu i kofaktora;
[0056] Należy rozumieć, że określenie "pierwszy" i "drugi" element pary wiążącej
jest względne i że każdy z powyższych elementów może być postrzegany jako
pierwszy lub drugi element pary wiążącej. W korzystnej realizacji, pierwszym
elementem pary wiążącej jest biotyna lub jej funkcjonalnie równoważny wariant a
drugim elementem pary wiążącej jest awidyna, streptawidyna lub jej funkcjonalnie
równoważny wariant.
[0057] W korzystnej realizacji, drugim elementem pary wiążącej jest streptawidyna.
[0058] Odpowiednie wykrywalne znaczniki obejmują, bez ograniczenia, jednostki
fluorescencyjne (np., fluoresceinę, rodaminę, fikoerytrynę, kumarynę, oksazynę,
rezorufinę, cyjaninę i ich pochodne), jednostki luminescencyjne (np., nanocząstki
Qdot™ dostarczane przez Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA). W przypadku,
gdy wykrywalny znacznik jest enzymem, enzym ten musi posiadać zdolność
wytwarzania wykrywalnego sygnału, na przykład, po dodaniu aktywatora, substratu,
czynnika amplifikującego i tym podobnych. Enzymy odpowiednie do zastosowania
jako wykrywalne znaczniki w niniejszym wynalazku i odpowiadające im substraty
obejmują:
•
Alkaliczną fosfatazę:
○ Substraty chromogenne: substraty oparte na fosforanie p-nitrofenylu
(p-NPP), fosforanie 5-bromo-4-chloro-3-indolilu/nitroblue tetrazolium
(BCIP/NPT), Fast-Red/fosforan naftol-AS-TS
○ Substraty fluorogenne: fosforan 4-metyloumbeliferylu (4-MUP), 2-(5'chloro-2'-fosforyloksyfenylo)-6-chloro-4-(3H)-chinazolinonu (CPPCQ),
difosforan 3,6-fluoresceiny (3,6-FDP), Fast Blue BB, Fast Red TR, lub
sole diazoniowe Fast Red Violet LB
•
Peroksydazy:
18
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
○ Substraty chromogenne oparte na kwasie 2,2-azynobis(3etylobenzotiazolino-6-sulfonowym) (ABTS), o-fenylenodiaminie (OPT),
3,3',5,5'-tetrametylobenzydynie (TMB), o-dianizydynie, kwasie 5aminosalicylowym, kwasie 3-dimetyloaminobenzoesowym (DMAB) oraz
3-metylo-2-benzotiazolinohydrazonie
(MBTH),
3-amino-9etylokarbazolu (AEC)- i tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny
(DAB).
○ Substraty fluorogenne: kwas 4-hydroksy-3-metoksyfenylooctowy,
zredukowane fenoksazyny oraz zredukowane benzotiazyny, włączając
czerwony odczynnik Amplex®, Amplex UltraRed oraz zredukowane
dihydroksanteny.
•
Glikozydazy:
○ Substraty chromogenne: o-nitrofenylo-β-D-galaktozyd (o-NPG), pnitrofenylo-β-D-galaktozyd oraz 4- metyloumbelifenylo-β-D-galaktozyd
(MUG) dla β-D-galaktozydazy.
○ Substraty fluorogenne: β-D-galaktopiranozyd rezorufiny, digalaktozyd
fluoresceiny (FDG), diglukuronid fluoresceiny, β-D-galaktopiranozyd 4metyloumbeliferylu, β-D-galaktopiranozyd karboksyumbeliferylu oraz
fluorowane β-D-galaktopiranozydy kumaryny.
•
Oksydoreduktazy (lucyferaza):
○ Substraty luminiscencyjne: lucyferyna.
[0059] W korzystnej realizacji, wykrywalnym znacznikiem jest peroksydaza
chrzanowa a odczynnikiem do detekcji jest TMB.
[0060] W korzystnej realizacji, zestaw zawiera ponadto stały nośnik. Stosowany w
niniejszym opisie termin "nośnik" lub "powierzchnia" odnosi się do fazy stałej, która
jest porowata lub gładka, materiałem nierozpuszczalnym w wodzie, o dowolnym z
wielu możliwych kształtów, takich jak pasek, pręt, cząstka, w tym cząstki lateksowe,
cząstki magnetyczne, mikrocząstki, koraliki, membrany, płytki ze studzienkami do
mikromiareczkowania i probówki plastikowe. W zasadzie, każdy materiał jest
odpowiedni do zastosowania jako stały nośnik pod warunkiem, że jest w stanie
związać wystarczającą ilość przeciwciała wychwytującego. Tak więc, wyboru
materiału fazy stałej dokonuje się w oparciu o pożądane cechy przeprowadzanej
analizy. Materiały odpowiednie do zastosowania jako stały nośnik obejmują materiały
polimerowe, szczególnie materiały celulozowe i materiały pochodzące z celulozy,
takie jak papier zawierający włókna papieru, np. filtr papierowy, bibuła
chromatograficzna, papier z włókna szklanego itp., syntetyczne lub zmodyfikowane
naturalnie występujące polimery, takie jak nitroceluloza, octan celulozy, chlorek
poliwinylu, poliakryloamid, usieciowany dekstran, agaroza, poliakrylan, polietylen,
polipropylen, poli(4-metylobuten), polistyren, polimetakrylan, poli(tereftalan etylenu),
nylon, maślan winylu), itp.; albo używany pojedynczo albo w połączeniu z innymi
19
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
materiałami; szkło, takie jak np, szkło dostępne jako szkło biologiczne, ceramika,
metale, i tym podobne. Korzystne są nieusieciowane polimery styrenu i
karboksylowany styren lub styren funkcjonalizowany innymi aktywnymi grupami,
takimi jak grupa aminowa, hydroksylowa, halogenowa i tym podobne. W niektórych
przypadkach będą zastosowane kopolimery styrenów podstawionych dienami, takie
jak butadien.
[0061] Stały nośnik i przeciwciało wychwytujące może być dostarczone oddzielnie w
zestawie lub, alternatywnie, nośnik może być dostarczony w postaci już wstępnie
pokrytej warstwą przeciwciała wychwytującego. W tym przypadku, po związaniu
przeciwciała wychwytującego, nośnik może być potraktowany roztworem blokującym.
Jeżeli nośnik jest wstępnie pokryty, korzystne jest, by nośnik został potraktowany
stężonym roztworem trehalozy i pozostawiony do wyschnięcia, w tym przypadku
sucha trehaloza tworzy halo na nośniku. Wspomniane nośniki zawierające suchą
trehalozę są wyjątkowo stabilne i mogą być przechowywane przez okres do dwóch
lat, gdy są przechowywane w temp. 4 °C, w ciemno ści.
[0062] Dodatkowe składniki zestawu mogą obejmować:
•
•
•
•
•
•
•
•
Środki do pobrania od pacjenta próbki do analizy.
Bufory i roztwory konieczne do przygotowania krzywych standardowych dla
peptydów docelowych.
Bufory i roztwory do przemywania i blokowania nośnika stałego podczas
analizy
Bufory i roztwory do pokrywania nośnika stałego przeciwciałem pokrywającym
Odczynniki do rozwijania koloru lub sygnału fluorogennego dla wykrywalnego
znacznika.
Odczynniki do zatrzymywania powstawania barwnego lub fluorogennego
produktu dla wykrywalnego znacznika (np. 1N H2SO4)
Środki do utrzymywania peptydu w postaci rozfałdowanej (np. stężony
chlorowodorek guanidyny).
Próbka zawierająca roztwór wyjściowy peptydów Aβ40 lub Aβ42 lub ich
kombinację.
[0063] W korzystnej realizacji, przeciwciało wychwytujące jest immobilizowane na
stałym nośniku. Immobilizacja może mieć miejsce przed związaniem docelowego
peptydu, który ma być wykryty lub po tym jak peptyd/białko jest związane przez
przeciwciało wychwytujące. W każdym przypadku, gdy stosuje się stały nośnik,
korzystne jest zablokowanie nadmiaru miejsc wiążących białka na nośniku przed
dodaniem próbki zawierającej docelowy polipeptyd, który będzie oznaczany.
Korzystnie, blokowanie lub gaszenie miejsc wiążących peptyd na nośniku
przeprowadza się stosując ten sam bufor, który używany jest do przemywania
kompleksów powstałych po każdej reakcji wiązania (np. 50 mM Tris-HCl, pH 8, PBS
lub TBS opcjonalnie, zawierający Tween 20) uzupełniony związkiem
makrocząsteczkowym (np. albuminą surowicy wołowej, odtłuszczonym mlekiem w
proszku, odczynnikiem blokującym w technice Western, kazeiną, laktoalbuminą,
owoalbuminą), w stężeniach od około 0,05% do 10%, korzystnie 1 do 5%, bardziej
korzystnie około 3%. Jeżeli nośnik zawierający unieruchomione przeciwciało
wychwytujące musi być przechowywany przez pewien czas, korzystne jest, by nośnik
20
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
ten został potraktowany stężonym roztworem trehalozy i pozostawiony do
wyschnięcia, w tym przypadku sucha trehaloza tworzy halo na nośniku. Takie nośniki
zawierające suchą trehalozę są wyjątkowo stabilne i mogą być przechowywane do
dwóch lat, gdy jest przechowywane są w temperaturze 4 °C, w ciemno ści.
[0064] Zestawy według wynalazku pozwalają na wykrycie lub oznaczenie z dużą
czułością polipeptydów, które są specyficznie rozpoznawane przez pierwszy i drugi
składnik przeciwciałowy zestawu. Tak więc, w dalszym aspekcie wynalazek dotyczy
zastosowania zestawu według wynalazku do wykrywania białka lub białka w próbce.
W korzystnej realizacji, zestaw służy do wykrywania peptydu wybranego z grupy
Aβ40 i Aβ42 i ich kombinacji w próbce.
[0065] "Próbka", zgodnie ze znaczeniem według wynalazku, zawiera dowolną
próbkę z hodowli tkankowej, osocza, surowicy, śliny, nasienia, plwociny, płynu
mózgowo-rdzeniowego (CSF), łez, śluzu, potu, mleka, estraktu z mózgu i tym
podobne. W korzystnej realizacji, próbka jest próbką osocza.
[0066] Ze względu na zdolność zestawu według wynalazku umożliwiającą
oznaczanie z wysoką czułością stężenia Aβ40 i Aβ42 w każdej próbce, może być on
użyty do diagnozowania dowolnej choroby, w której następuje zmiana stężenia
któregokolwiek ze wspomnianych dwóch peptydów w dowolnym płynie komórkowym
lub tkankowym, w szczególności, chorób degeneracyjnych, a zwłaszcza, chorób
neurodegeneracyjnych. Nieograniczające przykłady chorób degeneracyjnych, które
mogą być zdiagnozowane na podstawie pojawienia się zmian w poziomie Aβ40 lub
Aβ42 obejmują:
•
•
•
•
•
•
Zaburzenia zwyrodnieniowe kości, takie jak osteopenia, osteoporoza,
rozmięknienie kości, osteomyeloma, osteodystrofia, choroba Pageta,
nieprawidłowa osteogeneza, stwardnienie kości, aplastyczne zaburzenia
kości, humoralny szpiczak przy hyperkalcemii, szpiczak mnogi i ścieńczenie
warstwy korowej kości następujące po przerzutach.
choroby degeneracyjne chrząstki, takie jak zespół Gorhama-Stouta; choroby
artretyczne, choroba zwyrodnieniowa stawów, reumatoidalne zapalenie
stawów, łuszczycowe zapalenie stawów; choroba reumatoidalna; choroba
związana z kruchością kości.
choroby degeneracyjne mięśni, takie jak dystrofia mięśni, zanik mięśni,
choroba zastoinowa niewydolności oddechowej, zespół utraty mięśni,
sarkopenia, wyniszczenie.
choroby degeneracyjne serca obejmujące śmierć komórek serca z powodu
niedokrwienia, śmierć komórek tkanek i narządów z powodu odrzucenia
przeszczepu, utratę słuchu z powodu autotoksyczności.
zaburzenia zwyrodnieniowe siatkówki, takie jak barwnikowe zwyrodnienie
siatkówki
choroby degeneracyjne układu nerwowego, takie jak choroba Aleksandra,
choroba Alpera, choroba Alzheimera, stwardnienie zanikowe boczne, ataksja
z telangiektazją, choroba Battena, gąbczasta encefalopatia bydła (BSE),
choroba Canavana, zespół Cockayna, zwyrodnienie korowe, choroba
Creutzfeldta-Jakoba, choroba Huntingtona, otępienie związane z HIV, choroba
Kennedy'ego, choroba Krabbe, otępienie ciała Lewiego, choroba Machado-
21
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
Josepha (ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 3), stwardnienie rozsiane,
atrofia układowa, neuroborelioza, choroba Parkinsona, choroba PelizaeusaMerzbachera, choroba Picka, pierwotne stwardnienie boczne, choroba
Prionowa, choroba Refsuma, choroba Sandhoffa, choroba Schildera,
schizofrenia, choroba Spielmeyera-Vogt-Sjögren-Battena (znana również jako
choroba Battena), ataksja rdzeniowomóżdżkowa, rdzeniowy zanik mięśni,
choroba Steele-Richardsona-Olszewskiiego, wiąd rdzenia. W korzystnej
realizacji, chorobą neurodegeneracyjną diagnozowaną za pomocą zestawu
według wynalazku jest choroba Alzheimera.
[0067] Należy podkreślić, że parametr, który może być wymagany do podjęcia
decyzji o wystąpieniu ewentualnej choroby, jest nie tylko bezwzględnym stężeniem
Aβ40 i Aβ42, ale również parametrem uzyskanym z kombinacji wspomnianych
wartości, takim jak stosunek Aβ40/Aβ42 lub Aβ42/Aβ40, odsetkiem Aβ42 i Aβ40 w
stosunku do całkowitej ilości peptydów Aβ lub wynikiem dodania stężeń Aβ42 i Aβ40.
[0068] W korzystnej realizacji, choroba, która może być diagnozowana jest chorobą
Alzheimera, bardziej szczegółowo, postacią sporadyczną AD, w oparciu o pojawienie
się w próbce pacjentów z AD niższych stężeń peptydów Aβ40 i/lub Aβ42, w
porównaniu z ilościami wspomnianego peptydu lub peptydów w próbce biologicznej
pochodzącej z tego samego źródła, ale uzyskanej od zdrowego osobnika.
[0069] W użyciu, zestaw według wynalazku pozwala na przeprowadzenie metody
pięcioetapowej wykrywania ilości docelowego polipeptydu, wybranego z grupy Aβ42 i
Aβ40 i ich kombinacji w próbce. Wspomniana metoda, która jest kolejnym
przedmiotem niniejszego wynalazku obejmuje etapy
(i) wychwycenia docelowego polipeptydu obecnego w próbce za pomocą
(ii) kontaktowania kompleksu immunologicznego utworzonego w etapie (i) z
(iii) kontaktowania kompleksu utworzonego w etapie (ii) z odczynnikiem
(iv) kontaktowania kompleksu utworzonego w etapie (iii) z drugim elementem
pary
wiążącej
sprzężonym
ze
znacznikiem
fluorescencyjnym,
(v) wykrycia lub określenia aktywności lub ilości znacznika przyłączonego do
22
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
przy czym element pary wiążącej wybrany jest z grupy
- pierwszy element: hapten lub antygen/drugi element: przeciwciało;
- pierwszy element: biotyna lub analog biotyny/drugi element: awidyna lub
streptawidyna;
- pierwszy element: cukier/drugi element: lektyna;
- pierwszy element: enzym/drugi element: kofaktor; oraz
- pierwszy element: kwas nukleinowy lub analog kwasu nukleinowego/drugi
element: komplementarny kwas nukleinowy.
[0070] W korzystnej realizacji, wykrywane
nieoligomerycznym wspomnianego peptydu,
monomerycznym Aβ40 lub Aβ42.
peptydy, odpowiadają
bardziej korzystnie,
formom
formom
[0071] Odczynniki używane w poszczególnych etapach metody zostały szczegółowo
opisane powyżej.
[0072] W pierwszym etapie sposobu według wynalazku, próbka zawierająca peptydy
Aβ40 i/lub Aβ42 kontaktowana jest z pierwszym przeciwciałem, tak by utworzyć
pierwszy kompleks immunologiczny.
[0073] Po pierwszym etapie wiązania, kompleksy mogą być przemywane w celu
usunięcia nadmiaru białka/peptydu występującego w oryginalnej próbce, które nie
zostało związane przez przeciwciało wychwytujące. Korzystne bufory przemywające,
które mogą być użyte w kontekście niniejszego wynalazku obejmują dowolny bufor o
pH zbliżonym do fizjologicznego (np. 50 mM Tris-HCl), ewentualnie obejmujący sole
(np. 150 mM NaCl) i opcjonalnie zawierający niskie stężenia detergentu (np. 0.05%
Tween-20).
[0074]
W drugim etapie, kompleksy utworzone między przeciwciałem
wychwytującym a peptydem Aβ lub peptydami w próbce są następnie kontaktowane
z drugim przeciwciałem, aby utworzyć "kanapkowy" kompleks immunologiczny.
[0075] Po zakończeniu drugiego etapu, kompleks immunologiczny może być
przepłukany w celu wyeliminowania nieswoistych wiązań przeciwciała, przy
zastosowaniu zasadniczo tych samych buforów oraz procedur, jak opisane powyżej.
[0076] W trzecim etapie, sposób według wynalazku polega na kontaktowaniu
kompleksów utworzonych pomiędzy wychwyconym peptydem lub peptydami a
przeciwciałem do detekcji, z odczynnikiem, który wykazuje powinowactwo względem
przeciwciała do detekcji, i który jest sprzężony z pierwszym elementem pary
wiążącej.
[0077] W czwartym etapie, sposób według wynalazku polega na kontaktowaniu
kompleksów utworzonych pomiędzy odczynnikiem wiążącym przeciwciało a
23
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
przeciwciałem do detekcji, z drugim elementem pary wiążącej, który jest sprzężony z
wykrywalnym znacznikiem.
[0078] W piątym etapie sposobu według wynalazku, sposób polega na detekcji
wykrywalnego znacznika. W piątym etapie sposobu według wynalazku, sposób
polega na na detekcji wykrywalnego znacznika. Należy rozumieć, że detekcja i/lub
ilościowe oznaczanie wykrywalnego znacznika zależy od rodzaju znacznika i metody
te są znane w technice. Kiedy nienaruszony substrat lub wykrywalny znacznik
zawiera składnik luminescencyjny lub barwnik, wykrywanie może przebiegać na
podstawie obserwacji wzrokowej na transiluminatorze UV, lub za pomocą systemu
wykrywania zawierającego urządzenie oparte na UV i sprzężone z kamerą (CCD),
laserowego skaneru do żelu, systemu wykrywania opatego na ksenonowej kamerze
CCD, aparatu Polaroid w połączeniu z transiluminatorem UV, jak i wielu innych
urządzeń służących do wykrywania luminescencji. Kiedy wykrywalny znacznik jest
enzymem, piąty etap sposobu według wynalazku polega na wystawieniu kompleksu
immunologicznego znakowanego znacznikiem (np., wychwyconego peptydu,
przeciwciała do detekcji i odczynnika znakowanego wykrywalnym znacznikiem) na
działanie aktywatorów, substratów lub czynników aplifikujących enzymu używanego
jako wykrywalny znacznik. Dobrze znane wykrywalne znaczniki, zdolne do
wytworzenia
wykrywalnego
sygnału
obejmują
przeciwciała
znakowane
enzymatycznie. Przykładowe enzymy znajdujące w tym celu zastosowanie obejmują
peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną i glikozydazy, w tym betagalaktozydazę, ß-glukozydazę i β-glukuronidazę. Przykładowo, odczynnik, który
specyficznie wiąże się z przeciwciałem do detekcji może być znakowany
peroksydazą chrzanową. Po utworzeniu kompleksu jednostka wychwytująca –
przeciwciało do detekcji - odczynnik, wykrywanie może przebiegać przy użyciu
jednego z wielu znanych substratów dla tego enzymu stosowanych jako wykrywalne
znaczniki.
[0079] W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozy chorób
neurodegeneracyjnych, który obejmuje pomiar poziomu Aβ40 i/lub Aβ42 w próbce
pobranej od podmiotu podejrzanego o przenoszenie wspomnianej choroby i
korelację stężenia jednego i/lub obu peptydów w próbce wspomnianego podmiotu w
odniesieniu do stężenia wspomnianego peptydu lub peptydów w próbce pochodzącej
od zdrowego osobnika, z pojawieniem się zaburzeń neurodegeneracyjnych.
[0080] W korzystnej realizacji, chorobą neurodegeneracyjną jest choroba
Alzheimera, przy czym jeżeli ilość peptydów Aβ40, Aβ42 lub ich kombinacji we
wspomnianej próbce jest niższa niż ilość wspomnianego peptydu lub peptydów w
próbce od zdrowego człowieka, wskazuje to, że podmiot cierpi na chorobę
Alzheimera. Korzystnie, oznaczenie wykonuje się w osoczu lub surowicy.
[0081] Korzystnie, przeprowadza się poszczególne etapy sposobu stosując
równoległe, badane próbki, i szereg próbek o rosnącym i znanym stężeniu związku,
który ma zostać oznaczony. Jeśli Aβ40 i/lub Aβ42 mają zostać oznaczone, konieczne
jest przygotowanie przy zastosowaniu wzrastających stężeń, krzywej standardowej
dla każdego peptydu. Krzywa standardowa służy podwójnemu celowi (i) ustaleniu
zakresu stężeń, w którym sygnał wzrasta liniowo wraz ze stężeniem docelowego
peptydu oraz (ii) oznaczenie stężenia peptydów w badanej próbce na podstawie
24
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
interpolacji sygnału otrzymywanego z badanej próbki na krzywej w celu uzyskania
wartości stężenia. Ze względu na wysoką czułość testu według wynalazku, korzystne
stężenia badanych próbek wynoszą, np. 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 i 200 pg/ml.
Należy podkreślić, że stężenia próbek wykorzystywanych do uzyskania krzywej
standardowej będą różne dla każdego testowanego substratu. Jednak, ustalenie
liniowego zakresu testu może być łatwo uzyskane przez specjalistę w dziedzinie, za
pomocą konwencjonalnych środków. W związku z większymi ilościami peptydów
Aβ42 i Aβ40 w próbkach CSF, a także w próbkach surowicy pacjentów z postacią
rodzinną AD, w porównaniu z wynikami dla surowicy chorych z postacią sporadyczną
AD, korzystne jest, gdy w zestawie według wynalazku do określania peptydów Aβ w
próbkach CSF lub surowicy od pacjentów z postacią rodzinną AD, stosuje się takie
rozcieńczenia, by końcowe stężenia Aβ40/Aβ42 mieściły się w zakresie liniowej
zależności testu.
[0082] Poniższe przykłady przedstawiono wyłącznie w celu ilustracyjnym i nie
powinny być w żadnym stopniu rozumiane jako ograniczające zakres wynalazku.
PRZYKŁADY
PRZYKŁAD 1
Kolorymetryczny test podwójnego wiązania ELISA z amplifikacją z użyciem
układu biotyny-streptawidyny
[0083] W celu zwiększenia czułości, sygnał może być wzmacniany za pomocą
układu biotyny-streptawidyny. Płytkę pokryto przeciwciałem wychwytującym - 6E10
mAb, które rozpoznaje aminokwasy 1-17 w obu peptydach amyloidu Aβ40 oraz
Aβ42. Otrzymano powłokę o stężeniu 5 µg/ml w 100 mM buforu
węglano/wodorowęglanowego, pH = 9,6, którą pozostawiono na noc w 4 °C. Płytk ę
następnie blokowano stosując 300 µl roztworu blokującego (50 mM Tris-HCl, pH 8,
0,2% Tween-20, 0,5% BSA) przez 3 h, w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem lub
przez 2 h, w 37 °C. W razie potrzeby, płytki mog ą być traktowane po blokowaniu, 100
µl z 50 mM roztworu Tris-HCl o pH 8, zawierającego 20 mg/ml trehalozy. Płytki
pozostawiono do odparowania, aż do pojawienia się białego, charakterystycznego
halo z trehalozy. Tak otrzymane płytki mogą być przechowywane w 4 °C, przykryte
folią aluminiową i pozostają stabilne przez dwa lata.
[0084] Próbki do krzywej standardowej zostały przygotowane z 200 pg/ml roztworu
wyjściowego peptydów Aβ40 i Aβ42 na płytkach pokrytych 6E10 mAb i
potraktowanych trehalozą. Z roztworów tych, otrzymano seryjne rozcieńczenia 1:2 w
SDB, wykonane tak, by uzyskać stężenia 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 oraz 3,125
µg/ml. Dodano 100 µl każdej rozcieńczonej lub nierozcieńczonej próbki w SDB
(1/1.000.000) i inkubowano przez noc w 4°C (lub prz ez 2 h w 37°C).
[0085] Przeciwciało do detekcji (poliklonalne przeciwciało uzyskane przeciwko
peptydowi odpowiadającemu regionowi C-końcowemu peptydu Aβ42 lub poliklonalne
przeciwciało uzyskane przeciwko peptydowi odpowiadającemu regionowi C-
25
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
końcowemu peptydu Aβ40, w zależności czy wykrywano Aβ42 czy Aβ40) dodano
rozcieńczone w SDB. 100 µl każdej próby nałożono do każdej studzienki, a
następnie inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej.
[0086] Następnie, 100 µl rozcieńczenia 1/5000 w SDB znakowanego biotyną
przeciw-króliczego przeciwciała IgG (SIGMA) dodano i inkubowano przez 1 h w
temperaturze pokojowej, z wytrząsaniem. Następnie, do każdej studzienki dodano
100 µl rozcieńczenia 1/4000 w SDB sprzężonej z HRP streptawidyny (z SIGMA) i
inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej.
[0087] W celu rozwinięcia reakcji na płytce, zastosowano 100 µl chromogennego
substratu TMB (ZEU Inmunotec). Dodano TMB i inkubowano w ciemności przez 1530 minut. W celu zatrzymania reakcji, dodano do każdej studzienki, jako roztwór
zatrzymujący, 50 µl 1N H2SO4. Absorbancję odczytywano przy 450 nm w czytniku
płytek Synergy HT (BioTek Instruments).
[0088] Pomiędzy kolejnymi etapami płytkę przemywano stosując automatyczne
płukanie płytek (Elx50 Bio Tek Instruments), zaprogramowane na 5 przemycie płytki
na każdym etapie. Roztwór płuczący zawierał 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,05% Tween20 oraz 150 mM NaCl (przefiltrowane przed użyciem).
PRZYKŁAD 2
Analiza fluorescencyjna w teście podwójnego wiązania ELISA
[0089] Płytkę pokryto 6E10 w buforze wodorowęglanowym (5 µg/ml) przez noc w
4°C. Nast ępnie, płytkę blokowano przez 3 h w temperaturze pokojowej z
wytrząsaniem (300 µl/studzienkę). Na płytki dodano następnie próbki testowe i do
krzywej standardowej i inkubowano przez noc w 4°C. Do każdej studzienki dodano
rozcieńczenie 1/4000 przeciwciała do detekcji (anty-Aβ40 lub anty-Aβ42 surowicze) i
inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Dodano seryjne
rozcieńczenia anty-przeciwciała sprzężonego z FITC (rozcieńczenia 1/1000, 1/5000,
1/10000) i inkubowano przez 1h w temperaturze pokojowej, w ciemności. Do pomiaru
fluorescencji zastosowano falę wzbudzenia o długości 485 nm i falę emisji o długości
528.
[0090] Alternatywnie, analizę przeprowadzono stosując substrat fluorescencyjny
Quanta-Blu (PIERCE), zwiększający czułość testu ELISA. Maksymalna długość fali
wzbudzenia wynosiła 325 nm a maksymalna długość emisji 420 nm. Detekcja może
być uzyskana w zakresie fali wzbudzenia 315-340 nm i zakresie emisji 370-470 nm.
Roztwór roboczy QuantaBlu przygotowano mieszając 9 części roztworu substratu
QuantaBlu z 1 częścią stabilnego roztworu peroksydazy QuantaBlu (roztwór stabilny
przez 24 h w temperaturze pokojowej). Możliwa jest inkubacja od 1,5 minuty do 90
minut w temperaturze pokojowej i odczytanie zatrzymania reakcji lub
przeprowadzenie reakcji bez zatrzymania (powstaje niebieski kolor).
[0091] Płytkę pokryto 6E10 mAb w buforze wodorowęglanowym (5 µg/ml) przez noc
w 4°C, a nast ępnie blokowano przez 3h w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem
26
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
(300 µl/studzienkę). Następnie przygotowano różne krzywe standardowe, stosując
następujące stężenia peptydów Aβ42 i Aβ40:
•
•
•
•
•
•
1000, 500, 250, 125, 62.5, 31, 25 oraz 15.65 pg/mL
200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 oraz 3.125 µg/mL
25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78 oraz 0.39 pg/mL
10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 oraz 0.156 pg/mL
5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156 oraz 0.078 pg/mL
1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 oraz 0.0156 pg/mL
[0092] Dodano przeciwciało do detekcji (przeciw-Aβ40 lub anty-Aβ42 surowicze)
(rozcieńczenie 1/4000) i inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej z
wytrząsaniem. Następnie dodano sprzężone z HRP przeciw-królicze IgG 1/1000 i
inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. W celu rozwinięcia
reakcji zastosowano 100µl roztworu roboczego Quanta-Blue, a następnie
inkubowano przez 30', 60' i 90' w temperaturze pokojowej, w ciemności.
Fluorescencję odczytywano (Fala wzbudzenia: 360/40 nm; Emisja: 460/40 nm) po
30', 60' i 90', bez zatrzymywania reakcji lub zatrzymując reakcję roztworem
zatrzymującym „STOP”.
PRZYKŁAD 3
Otrzymywanie krzywych standardowych dla Aβ40 i Aβ42
[0093] W celu uzyskania krzywej standardowej dla Aβ40, próbkę uzyskano z
liofilizatu ludzkiego Aβ40, w stężeniu 10 µg/mL. Z roztworu wyjściowego
otrzymywano próbki zawierające następujące stężenia (w pg/mL): 25,000 pg/ml,
2,500 pg/ml, 25 pg/ml, 12.5pg/ml, 6.25 pg/ml, 3.125 pg/ml, 1.56 pg/ml, 0.78 pg/ml.
Próbki otrzymywano z dodatkiem 1 mM inhibitora proteazy AEBSF. Próbki poddano
następnie procedurze zgodnie ze sposobem zdefiniowanym w poprzednich
przykładach. Wyniki przedstawiono na figurze 1.
[0094] W celu uzyskania krzywej standardowej dla Aβ42, próbkę uzyskano z
liofilizatu ludzkiego Aβ42, w stężeniu 10 µg/mL. Z roztworu wyjściowego
otrzymywano próbki zawierające następujące stężenia (w pg/mL): 25,000 pg/ml,
2,500 pg/ml, 25 pg/ml, 12.5pg/ml, 6.25 pg/ml, 3.125 pg/ml, 1.56 pg/ml, 0.78 pg/ml.
Próbki otrzymywano z dodatkiem 1 mM inhibitora proteazy AEBSF. Próbki poddano
następnie procedurze zgodnie ze sposobem zdefiniowanym w poprzednich
przykładach. Wyniki przedstawiono na figurze 2.
PRZYKŁAD 4
Korelacja pomiędzy diagnozą AD a poziomem Aβ40/Aβ42
[0095] Poziom Aβ40 oraz Aβ42 określano stosując test „kanapkowy” ELISA opisany
w poprzednich przykładach w próbkach osocza pochodzących z grupy kontrolnej
oraz z grupy pacjentów ze zdiagnozowaną chorobą AD, za pomocą oceny punktowej
testu „Minimental State Examination” (MMSE) przy wartości granicznej 24. Stężenia
wyrażono w pg/mL, dla Aβ40 oraz Aβ42 przedstawiono w Tabeli 1.
27
PZ/1441/RW
Zdrowi
EP 2 183 599 B1
AB40
Tabela 1
AB42 AB40/AB42 AB42/AB40 AB40+AB42 % AB40 % AB42
LSA
31.2 160.1
0.19
5.13
191.30
16.31
83.69
CPB
93.41 159.4
0.591
1.71
252.80
36.95
63.05
CFA
730.5 893.6
0.82
1.22
1624.10
44.98
55.02
VCL
145.0 329.6
0.44
2.27
474.60
30.55
69.45
21.94
0.05
449.70
95.64
4.36
FLA
430.11
19.6
ILS-7
102.9
34.2
0.33
137.05
75.08
24.92
MPG-8
57.0
59.2
1.04
116.17
49.07
50.93
PLA-17
29.6
8.7
0.30
38.27
77.21
22.79
ARL-24
34.0
25.8
0.76
59.82
56.89
43.11
BGM-28
23.4
7.4
0.32
30.77
75.95
24.05
AD
AB40
1.32
AB42 AB40/AB42 AB42/AB40 AB40+AB42 % AB40 % AB42
BEG
12.0
5.96
83.50
14.37
85.63
CPG
74.3 136.7
0.54
1.84
211.00
35.21
64.79
VAC
26.7
34.7
0.77
1.30
61.40
43.49
56.51
MTF
55.6 141.7
0.39
2.55
197.30
28.18
71.82
CPG
34.2
28.0
1.22
0.82
62.24
54.95
45.05
MVA-5
17.2
21.9
0.79
1.27
39.05
43.99
56.01
16.6
0.82
1.22
30.18
45.10
54.90
JGS-40
71.5
PTG-35
37.3
24.8
1.50
0.66
62.11
60.07
39.93
CBC-30
11.6
6.1
1.90
0.53
17.63
65.51
34.49
JHC-2
25.4
23.4
1.09
0.92
48.84
52.07
47.93
[0096] Obliczono wartości średnie i wyniki przedstawiono w Tabeli 2
Tabela 2
Zdrowi
Pacjenci AD
Aβ40 (pg/mL)
167,70
30,78
Aβ42 (pg/mL)
169,75
50,53
28
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
LISTA SEKWENCJI
[0097]
<110> ARACLON BIOTECH S.L.
<120> WYSOKO SPECYFICZNY TEST IMMUNOLOGICZNY I ZESTAW DO
OZNACZANIA PEPTYDÓW I BIAŁEK O ZNACZENIU BIOLOGICZNYM
<130> P3158EP00
<160> 6
<170> PatentIn wersja 3.4
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Peptyd wykorzystany do otrzymania poliklonalnego przeciwciała
swoistego wobec Abeta42
<400> 1
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<220>
<400> 2
29
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<220>
<400> 3
<210> 4
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 40
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
30
PZ/1441/RW
<210> 6
<211> 770
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
EP 2 183 599 B1
31
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
32
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
33
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
34
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
35
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
36
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
37
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
Zastrzeżenia patentowe
1. Zestaw do wykrywania docelowego polipeptydu wybranego z grupy obejmującej
Aβ42, Aβ40 i ich mieszaninę, zawierający
biotyny i awidyny;
cukru i lektyny;
enzymu i kofaktora;
2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że jest traktowany stężonym
roztworem trehalozy i pozostawiony do wysuszenia.
38
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
3. Zestaw według dowolnego z zastrz. od 1 do 2, znamienny tym, że ponadto
zawiera próbkę zawierającą peptydy Aβ40 i/lub Aβ42.
4. Zestaw według zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że jeżeli drugi element pary
wiążącej sprzężony jest ze znacznikiem enzymatycznym, to zestaw zawiera
ponadto substrat, który może ulegać konwersji w wyniku działania
wspomnianego enzymu, do wykrywalnego produktu.
5. Zastosowanie zestawu określonego w dowolnym z zastrz. od 1 do 4 do
oznaczania lub wykrywania polipeptydu w próbce, znamienne tym, że
docelowy, oznaczany lub wykrywany polipeptyd wybrany jest z grupy
obejmującej Aβ40, Aβ42 lub ich mieszaninę.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że próbka należy do grupy
obejmującej krew, osocze, surowicę lub CSF.
7. Zastosowanie zestawu określonego w zastrz od 1 do 6 do diagnozy choroby
degeneracyjnej u pacjenta.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że chorobą degeneracyjną
jest choroba neurodegeneracyjna.
9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że chorobą degeneracyjną
jest choroba Alzheimera.
10. Sposób oznaczania i wykrywania ilości docelowego polipeptydu wybranego z
grupy zawierającej Aβ42, Aβ40 i ich mieszaninę w próbce obejmujący
następujące etapy
(i) wychwytywanie docelowego polipeptydu obecnego w próbce za pomocą
(ii) kontaktowanie kompleksu immunologicznego utworzonego w etapie (i) z
(iii) kontaktowanie kompleksu utworzonego w etapie (ii) z odczynnikiem
(iv) kontaktowanie kompleksu utworzonego w etapie (iii) z drugim elementem
pary
wiążącej
sprzężonym
ze
znacznikiem
fluorescencyjnym,
(v) wykrycie lub określenie aktywności lub ilości znacznika przyłączonego do
39
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
biotyny i awidyny;
cukru i lektyny;
enzymu i kofaktora;
11. Zestaw według dowolnego z zastrz. od 1 do 4 lub sposób według zastrz. 10,
znamienny tym, pierwszym przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne.
znamienny tym, że monoklonalnym przeciwciałem wychwytującym jest 6E10 mAb.
znamienny tym, że drugie przeciwciało jest przeciwciałem wybranym z grupy
obejmującej
(i) przeciwciało poliklonalne uzyskane przeciwko peptydowi odpowiadającemu
regionowi C-końcowemu peptydu Aβ42, wiążące się specyficznie z Aβ42 bez
wchodzenia w żadne istotne reakcje poprzeczne z Aβ40
(ii) przeciwciało poliklonalne uzyskane przeciwko peptydowi odpowiadającemu
regionowi C-końcowemu peptydu Aβ40, wiążące się specyficznie z Aβ40 bez
wchodzenia w żadne istotne reakcje poprzeczne z Aβ42
(iii) przeciwciało, które rozpoznaje jednocześnie region C-końcowy zarówno
Aβ40, jak i Aβ42 oraz
(iv) kombinację przeciwciał z punktu (i) oraz (ii).
znamienny tym, że region C-końca peptydu Aβ42 zastosowanego do przygotowania
drugiego przeciwciała jest peptydem wybranym z grupy obejmującej SEQ ID NO:1,
SEQ ID NO:2 lub tym, że region C-końca peptydu Aβ40 zastosowanego do
przygotowania drugiego przeciwciała jest peptydem wybranym z grupy obejmującej
SEQ ID NO:3.
40
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
15. Zestaw według dowolnego z zastrz. od 1 do 4 lub sposób według dowolnego z
zastrz. od 13 do 14, znamienny tym, że pierwsze i/lub drugie przeciwciało
oczyszczane jest metodą powinowactwa za pomocą polipeptydu obejmującego
sekwencję polipeptydu zastosowanego do ich otrzymywania.
zastrz. od 13 do 14, znamienny tym, że odczynnik wykazujący powinowactwo do
drugiego przeciwciała wybrany jest z grupy obejmującej przeciwciało skierowane
przeciwko IgG, białko A lub białko G lub wariant będący ich funkcjonalnym
odpowiednikiem.
zastrz. od 13 do 16, znamienny tym, że wspomnianym pierwszym elementem pary
wiążącej jest biotyna.
znamienny tym, że drugim elementem pary wiążącej jest awidyna, streptawidyna lub
wariant będący ich funkcjonalnym odpowiednikiem.
zastrz. od 10 do 18, znamienny tym, że próbka biologiczna wybrana jest z grupy
obejmującej krew, surowicę, osocze i CSF.
20. Sposób diagnozowania choroby degeneracyjnej u pacjenta znamienny tym, że
obejmuje określenie ilości Aβ40 lub Aβ42 w próbce od pacjenta z wykorzystaniem
sposobu określonego w dowolnym z zastrz. od 10 do 19 i skorelowanie stężenia
jednego lub obu peptydów w próbce od wspomnianego pacjenta w odniesieniu do
stężenia wspomnianego peptydu lub peptydów w próbce pochodzącej od zdrowego
osobnika, z pojawieniem się choroby degeneracyjnej.
21. Sposób według zastrz 20, znamienny tym, że chorobą degeneracyjną jest
choroba neurodegeneracyjna.
22. Sposób według zastrz 21, znamienny tym, że chorobą neurodegeneracyjną jest
choroba Alzheimera i tym, że ilość peptydów Aβ40 i/lub Aβ42 we wspomnianych
próbkach niższa niż ilość wspomnianego peptydu lub peptydów w próbce
biologicznej tego samego pochodzenia, uzyskanej od zdrowego osobnika wskazuje
na to, że pacjent cierpi na chorobę Alzheimera.
23. Sposób według dowolnego z zastrz. od 20 do 22, znamienny tym, że próbka, w
które wykrywa się Aβ40 i/lub Aβ42 jest próbką osocza lub surowicy.
41
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
Figura 1
42
EP 2 183 599 B1
Absorbancja
PZ/1441/RW
Figura 2
43
PZ/1441/RW
EP 2 183 599 B1
ODSYŁACZE CYTOWANE W OPISIE PATENTOWYM
Poniższa lista odsyłaczy cytowanych przez zgłaszającego, załączona jest tylko dla
wygody czytelnika. Lista ta nie stanowi części europejskiego dokumentu
patentowego. Chociaż bardzo uważnie zestawiano odsyłacze, nie można wykluczyć
błędów lub pominięć i pod tym względem EPO zrzeka się wszelkiej
odpowiedzialności.
Dokumenty patentowe cytowane w niniejszym opisie
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
WO 200722015 A [0011]
WO 200750359 A [0017]
WO 0162801 A [0018]
WO 0315617 A [0019]
WO 0246237 A [0020]
WO 0413172 A [0021]
CA 2585148 [0024]
WO 200646644 A [0024]
EP 1491889 A [0025] [0025]
WO 2004024770 A [0048]
WO 2004098631 A [0048]
Literatura niepatentowa cytowana w niniejszym opisie
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
SELKOE D.J. Physiol. Rev., 2001, vol. 81, 741-766 [0003]
GROWDON et al.Neurobiol. Aging, 1998, vol. 19, 109-116 [0006]
SCHEUNER D et al.Nature Med, 1996, vol. 2, 864-870 [0008]
SCHEUNER et al.Nature Med., 1996, vol. 2, 864-870 [0010]
SUZUKI,N. et al.Science, 1994, vol. 264, 1336-1340 [0010]
TAMAOKA A et al.J Neurol Sci., 1996, vol. 141, 65-68 [0011]
KOSAKA et al.Neurology, 1997, vol. 48, 741-745 [0011]
VANDERSTICHELE H et al. Amyloid, 2000, vol. 7, 245-258 [0012]
FUKOMOTO. Arch. Neurol., 2003, vol. 60, 958-964 [0013]
MEHTA et al. Arch. Neurol., 2000, vol. 57, 100-105 [0014] [0015]
MAYEUX, R. et al. Ann Neurol., 1999, vol. 46, 412-416 [0015]
LANZ, T.A; SCHACTHTER, J.B. J. Neuroscience Methods, 2006, vol. 157,
71-81 [0016]
LEWCZUK, P et al.Neurobiol. Aging, 2004, vol. 25, 273-281 [0022]
SAMBROOK et al.Molecular Cloning: A Laboratory ManualCold Spring
Harbor Laboratory Press1989 [0039]
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2001 [0039]
44
PZ/1441/RW
•
•
•
•
•
•
•
•
EP 2 183 599 B1
KOHLER et al.Nature, 1975, vol. 256, 495 [0041]
AUSUBEL, F.M. et al.Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley &
Sons Inc, 2003 [0041]
MCCAFFERTY et al.Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0041]
CLACKSOII et al.Nature, 1991, vol. 352, 624-628 [0041]
MARKS et al.J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581-597 [0041]
MARKS et al.Bio/Technology, 1992, vol. 10, 779-783 [0041]
WATERHOUSE et al.Nucl. Acids. Res., 1993, vol. 21, 2265-2266 [0041]
KIM, K.S.Neuroscience Res. Comm., 1988, vol. 2, 121-130 [0043]

Pobierz dokument

Transkrypt

Podobne dokumenty

Przeciwciała monoklonalne w diagnostyce

Wykaz badań wykonywanych w laboratorium.