Obserwacje nad osłonowym wpływem DNA czerwiu pszczelego na

Borgis
*Magdalena Wyszyńska1, Jerzy Stojko2, Dorota Romaniuk3, Marcin Kasprzak3,
Piotr Brukiewicz3, Mirosław Partyka3, Ewa Szaflarska-Stojko3, Agata Kabała-Dzik1,
Robert Kubina1, Barbara Stawiarska-Pięta1
Obserwacje nad osłonowym wpływem DNA czerwiu
pszczelego na obraz morfologiczny płodu szczura
po narażeniu matek na tetrachlorek węgla
Katedra i Zakład Patologii, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Kierownik Katedry i Zakładu: dr hab. n. med. Barbara Stawiarska-Pięta
2
Zakład Higieny, Bioanalizy i Badania Środowiska, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. Jerzy Stojko
3
Polska Fundacja Apiterapii, Katowice
Prezes Fundacji: prof. dr hab. n. farm. Artur Stojko
1
OBSERVATION OF A PROTECTIVE EFFECT
OF BEE LARVAE DNA BASED
ON THE MORPHOLOGICAL PRESENTATION
OF A RAT FOETUS AFTER MATERNAL EXPOSURE
TO CARBON TETRACHLORIDE
SUMMARY
The aim of this work was to analyse the protective influence of
the DNA from bee larvae towards rat foetus exposed to toxic
actions of carbon tetrachloride.
Foetuses originating from rat females, receiving intraperitoneally
carbon tetrachloride, showed massive intraperitoneal hemorrhages, characteristics of venostasis and focal necrosis of liver
parenchyma. Hemodynamic disturbances were visibly decreased
upon the influence of the DNA extract from bee larvae.
DNA extract from bee larvae shows protective action towards
rat foetus exposed to carbon tetrachloride, causing significant
weakening of the embryotoxin action. Additionally, the tested
extract does not cause any changes in the physiological outcome
of the pregnancy.
KEY WORDS: BEE LARVAE – PROTECTIVE EFFECT – RAT
FOETUS – EXPOSURE TO CARBON TETRACHLORIDE
– EMBRYOTOXICITY
Wstęp
Produkty pszczele dzięki zawartości związków pochodzenia roślinnego i zwierzęcego wykazują dużą
aktywność biologiczną w stosunku do organizmu
człowieka. Mają m.in. udokumentowane działanie
przeciwdrobnoustrojowe, odnawiające, znieczulające
oraz detoksykacyjne. Wykazują także zdolność stymulowania metabolizmu komórkowego i układowego
oraz układu immunologicznego. Oprócz wartości
odżywczych wykazują działanie biotyczne w stosunku
do organizmu człowieka. Powyższe właściwości wyni-
Postępy Fitoterapii 2/2014
kają ze składu chemicznego tych związków. Zawierają
one szereg aminokwasów, biopierwiastków, kwasów
nukleinowych, węglowodanów, enzymów i kwasów
organicznych (1-4).
Jednym z głównych kierunków obecnie prowadzonych badań naukowych jest szeroko pojęta ochrona
rozwijającego się w łonie matki płodu narażonego na
związki toksyczne.
Duży postęp cywilizacji niesie ze sobą narastające
niebezpieczeństwo niekorzystnego wpływu środowiska
na organizm człowieka. Dotyczy to w równym stopniu
czynników fizycznych, zanieczyszczeń środowiskowych
oraz powszechnego stosowania różnorodnych związków chemicznych, w tym preparatów leczniczych,
których liczba i dostępność stale wzrasta. Podejście
do ich stosowania jest szczególnie istotne dla kobiet
w wieku rozrodczym, bowiem każdy lek lub narażenie
na toksyny środowiskowe niesie za sobą potencjalne zagrożenie dla zdolności rozrodczych, przebiegu
ciąży oraz zdrowia rozwijającego się płodu. Materiał genetyczny zarodka i płodu na skutek działania
ksenobiotyków może ulec uszkodzeniu pod postacią
różnorodnych mutacji, czego następstwem jest wystąpienie aberracji chromosomalnych i wad rozwojowych.
Z kolei matka w okresie ciąży wykazuje zmniejszoną
aktywność enzymów mikrosomalnych wątroby, przez
co jest bardziej podatna na zatrucia (5).
Stosunkowo nowym kierunkiem farmakoterapii,
z racji rozwoju technik biologii molekularnej, jest
terapia genowa i możliwość wykorzystania czystego
DNA. Całkowita eliminacja defektu genetycznego
może nastąpić w wyniku korekty błędu w łańcuchu
DNA w komórkach rozrodczych lub najpóźniej we
wczesnym okresie zarodkowym. Znaczący rozwój
71
Magdalena Wyszyńska i wsp.
technik biotechnologii daje możliwości poszukiwania
nowych surowców pochodzenia biogennego działających na poziomie molekularnym, bez wywoływania
efektów ubocznych. Duże zainteresowanie dotyczy
materiału genetycznego czerwiu pszczelego (DNA
młodych postaci pszczół robotnic i trutni). Analiza
właściwości ekstraktów z czerwiu pszczelego wskazuje
na nowe możliwości badań ze względu na możliwość
zastosowania DNA w nowoczesnej terapii. Szczególnie ze względu na rosnące w ostatnich latach zainteresowanie niekonwencjonalnymi metodami leczenia,
zwłaszcza opartymi na związkach pochodzenia roślinnego oraz produktach pszczelich (1-4, 6).
Tetrachlorek węgla jest silną toksyną o znanym
i udokumentowanym działaniu. Od lat stosowany jest
przez badaczy wielu dziedzin w badaniach eksperymentalnych jako modelowy związek hepatotoksyczny
i embriotoksyczny. Działanie to wynika z biotransformacji tego związku, która zachodzi głównie w wątrobie
oraz ściśle wiąże się z toksycznym działaniem jego metabolitów, którymi są wolne rodniki trichlorometylowy
i trichlorometyloperoksylowy. Tworzą one wiązania
kowalencyjne z funkcjonalnie istotnymi komórkowymi
makrocząsteczkami, takimi jak kwasy nukleinowe,
białka, lipidy, osłabiając decydujące procesy ich metabolizmu (5, 7-9).
Niebezpieczne jest też narażenie na tetrachlorek węgla w aspekcie rozrodu. U samców wywołuje on trwałą
niepłodność, na skutek dużej kumulacji toksycznych
metabolitów w jądrach, a u ciężarnych samic łatwo
przechodzi barierę łożyskową i powoduje liczne wady
rozwojowe płodu, dotyczące szczególnie układu naczyniowego, a także zaburzenia organogenezy (8-12).
Materiał i metody
Materiał doświadczalny stanowiło 50 ciężarnych
samic szczurów szczepu Wistar. Dobór zwierząt determinowany był ich dojrzałością płciową i fizyczną
oraz przydatnością do rozrodu hodowlanego. Szczury
o wadze 170 ± 20 g osiągały wiek około 80-100 dni.
Przedmiotem badań było DNA z czerwiu pszczelego, otrzymane w wyniku izolacji opartej na ekstrakcji
fenolowo-chloroformowej. Badany apiterapeutyk podawany był dootrzewnowo w 3 dniu trwania ciąży. Celem
sprawdzenia jego osłonowych właściwości wykorzystano
związek o sprawdzonym działaniu embriotoksycznym
– tetrachlorek węgla, który podawano samicom dootrzewnowo w 4, 10 i 14 dniu trwania ciąży.
Ciężarne samice podzielono na trzy podstawowe
grupy – kontrolną K oraz dwie grupy doświadczalne:
D1 i D2.
W grupie kontrolnej K, składającej się z 30 samic,
wydzielono 3 podgrupy po 10 samic:
72
–– K1 – ciężarne samice, u których przebieg ciąży nie
był zakłócany;
–– K2 – ciężarne samice, którym podano dootrzewnowo 50 µg DNA z czerwiu pszczelego jednorazowo
w 3 dniu trwania ciąży;
–– K3 – ciężarne samice otrzymujące sól fizjologiczną
w iniekcji dootrzewnowej w 4, 10 i 14 dniu trwania
ciąży, aby ocenić wpływ tej ingerencji na przebieg
ciąży.
Grupa doświadczalna D1 składała się z 10 samic
otrzymujących dootrzewnowo tetrachlorek węgla
w dawce 5 mg/kg m.c. w 4, 10 i 14 dniu trwania ciąży.
Grupę doświadczalną D2 stanowiło 10 samic otrzymujących dootrzewnowo tetrachlorek węgla w dawce
5 mg/kg m.c. w 4, 10 i 14 dniu trwania ciąży oraz
DNA czerwiu pszczelego w ilości 50 µg jednorazowo
w trzecim dniu trwania ciąży.
W 21 dniu ciąży, dzień przed planowanym rozwiązaniem, zwierzęta usypiano. Do oceny histopatologicznej pobierano płody, które utrwalono w płynie
Bouina; następnie zatapiano w parafinie, a z otrzymanych bloczków parafinowych wykonano preparaty
histopatologiczne, które były barwione rutynowo hematoksyliną i eozyną.
Wyniki
W obrazie mikroskopowym płodów pochodzących
od samic, którym nie zakłócano przebiegu ciąży, nie
stwierdzono zmian patologicznych. U jednego płodu
zaobserwowano ogniskowe wylewy krwawe w jamie
otrzewnej. W grupie kontrolnej K2 u badanych płodów stwierdzono prawidłową morfologię narządów
wewnętrznych. W dwóch przypadkach odnotowano
obecność płynu przesiękowego w jamie otrzewnej,
natomiast u jednego z płodów ogniska przekrwienia
miąższu wątroby. Z kolei w podgrupie kontrolnej K3
u dwóch płodów zaobserwowano rozluźnienie histostruktury miąższu wątroby, natomiast u jednego płodu
widoczne były cechy zaburzeń w krążeniu pod postacią
przekrwienia wątroby oraz rozluźnienie struktury
przyczepów sieciowych i krezkowych.
W podgrupie kontrolnej, w której zastosowano
ekstrakt DNA czerwiu pszczelego, nie stwierdzono
u płodów zmian patologicznych. Pojedyncze przypadki
rozpoznania płynu przesiękowego w jamie otrzewnej
oraz ogniskowe przekrwienie miąższu wątroby, nie
wpłynęły na interpretację uzyskanych wyników badań
histopatologicznych. Wyniki uzyskane w pozostałych
podgrupach kontrolnych wskazują, że warunki hodowlane, w jakich został przeprowadzony eksperyment,
nie wpływają na przebieg fizjologicznej ciąży oraz nie
wywierają negatywnego działania na wewnątrzmaciczny rozwój płodu.
Postępy Fitoterapii 2/2014
Obserwacje nad osłonowym wpływem DNA czerwiu pszczelego na obraz morfologiczny płodu szczura po narażeniu matek...
Mikrofotografie zamieszczone na rycinach 1-3
przedstawiają obrazy mikroskopowe płodów grup
kontrolnych.
Zastosowanie tetrachlorku węgla w grupie doświadczalnej D1 spowodowało rozwój szeregu zaburzeń
Ryc. 1. Grupa kontrolna K. Prawidłowy obraz histologiczny
skóry płodu. Barwienie H-E. Pow. mikr. 100 x.
morfologicznych w obrębie narządów wewnętrznych
płodów, przemawiających za ich dysfunkcją czynnościową. Charakterystyczną zmianą obserwowaną
w obrazach histopatologicznych wszystkich płodów,
były masywne krwiaki w jamie otrzewnej (ryc. 4).
Ponadto u jednego płodu tej podgrupy stwierdzono
masywne przesięki w jamie otrzewnej i opłucnej.
W wątrobach badanych zwierząt ujawniono także
przekrwienie z cechami zastoju żylnego (ryc. 5) oraz
ogniskową martwicę hepatocytów.
U płodów wywodzących się z grupy doświadczalnej
D2, w której ciężarnym samicom podawano tetrachlorek węgla oraz ekstrakt DNA czerwiu pszczelego,
stwierdzono ograniczone wylewy krwawe oraz płyn
przesiękowy w jamie otrzewnej (ryc. 6). Struktura przyczepów sieciowych i krezki była prawidłowa,
z kolei naczynia krwionośne były poszerzone i przepełnione krwią. W obrębie miąższu wątroby stwierdzono rozluźnienie histostruktury, natomiast u jednego
płodu zaobserwowano przekrwienie (ryc. 7).
Ryc. 2. Grupa kontrolna K. Wątroba płodu. Obraz prawidłowy.
Barwienie H-E. Pow. mikr. 100 x.
Ryc. 4. Grupa doświadczalna D1. Masywny wylew krwi do jamy
otrzewnej. Barwienie H-E. Pow. mikr. 100 x.
Ryc. 3. Grupa kontrolna K. Prawidłowy obraz mikroskopowy
jamy otrzewnej. Widoczne przekroje przez jelita oraz naczynia
przyczepów krezkowych. Niewielka ilość płynu surowiczego.
Barwienie H-E. Pow. mikr. 100 x.
Ryc. 5. Grupa doświadczalna D1. Cechy zastoju żylnego
w wątrobie płodowej. Barwienie H-E. Pow. mikr. 100 x.
Postępy Fitoterapii 2/2014
73
Magdalena Wyszyńska i wsp.
Ryc. 6. Grupa doświadczalna D2. Ograniczony wylew krwawy
oraz niewielka ilość płynu przesiękowego w jamie otrzewnej.
Barwienie H-E. Pow. mikr. 100 x.
Ryc. 7. Grupa doświadczalna D2. Ogniskowe przekrwienie
miąższu wątroby płodu. Barwienie H-E. Pow. mikr. 100 x.
Dyskusja
Materiał genetyczny pszczół oraz ich larw jest wygodnym, łatwym do pozyskania materiałem do badań.
Genomowe DNA zostało zsekwencjonowane i dobrze
poznane. Interesującym odkryciem było odnalezienie
w nim kopii sekwencji DNA mitochondrialnego, kodujących jednostki oksydazy cytochromowej i dehydrogenazy
NADH (6, 13). Sugeruje to możliwość oddziaływania na
procesy detoksykacyjne ustroju. Stąd celowym stała się
próba zastosowania materiału genetycznego larw pszczół,
jako czynnika zapobiegającego lub znoszącego niepożądane działanie toksyn, w tym niektórych leków.
W przeprowadzonym doświadczeniu, w podgrupach kontrolnych, w których zastosowano badany
biopreparat DNA czerwiu pszczelego, nie stwierdzono
znaczących zmian patologicznych u płodów. Pozwala
to na stwierdzenie, że badany apiterapeutyk nie wpływa na przebieg fizjologicznej ciąży oraz nie wywiera
74
negatywnego działania na wewnątrzmaciczny rozwój
płodu. Wybrany związek (tetrachlorek węgla) o działaniu embriotoksycznym wywiera na organizm matki
i płodu wielokierunkowe działanie (14-15).
Ocena histopatologiczna płodów szczurzych dostarczyła wielu informacji na temat oddziaływania badanych
substancji na rozwój płodu oraz obraz morfologiczny
jego narządów wewnętrznych. Badania doświadczalne
nad osłonowym wpływem wybranych apiterapeutyków w stosunku do płodu narażonego na działanie
substancji embriotoksycznych były dokonywane do tej
pory w innym aspekcie (10, 16). Analizowano dane
pochodzące z oględzin zewnętrznych ciała płodów, mikrosekcji, pomiarów morfometrycznych, z oceny ilości
punktów kostnienia oraz parametrów hodowlanych.
Uzyskane w przeprowadzonych badaniach wyniki są
podobne do uzyskanych przez Rzepecką-Stojko (12),
która podjęła się przeprowadzenia oceny bezpośredniego wpływu związków toksycznych na płód za pomocą
badań histopatologicznych. Zastosowany przez nią
tetrachlorek węgla spowodował rozwój szeregu zaburzeń morfologicznych, przemawiających za ich dysfunkcją czynnościową. Tetrachlorek węgla jest związkiem
o silnych właściwościach embriotoksycznych. Brittebo
i Brandt (15) udokumentowali fakt deponowania tej
toksyny w drogach rodnych gryzoni. Ma to bezpośredni,
negatywny wpływ na procesy rozrodcze oraz stopień
dojrzałości i rozwój płodu, na skutek obniżenia poziomu tlenu w błonie śluzowej dróg rodnych.
W przeprowadzonym badaniu histopatologicznym
płodów stwierdzono masywne wylewy krwawe do
jamy otrzewnej, cechy zastoju żylnego oraz ogniskową
martwicę miąższu wątroby. Mając na uwadze fakt
narażenia ciężarnej samicy na toksyczne działanie
tetrachlorku węgla, w przypadku uszkodzenia wątroby, dochodzi do upośledzenia jej funkcji detoksykacyjnej, a tym samym do braku właściwej ochrony
płodu i nasilenia działania embriotoksycznego tego
związku. Fakt obniżenia poziomu tlenu w drogach
rodnych samicy pod wpływem tetrachlorku węgla
powoduje niedotlenienie płodu i potęguje opisywane
zaburzenia. Pod wpływem ekstraktu DNA czerwiu
pszczelego zaobserwowano wyraźne ograniczenie
zaburzeń hemodynamicznych, wskazujące na jego
działanie ochronne.
Wnioski
Ekstrakt DNA z czerwiu pszczelego wykazuje działanie osłaniające w stosunku do płodu szczura narażonego na działanie tetrachlorku węgla, powodując
znaczne osłabienie działania embriotoksyny.
Badany ekstrakt nie powodował zmian w przebiegu
fizjologicznej ciąży.
Postępy Fitoterapii 2/2014
Obserwacje nad osłonowym wpływem DNA czerwiu pszczelego na obraz morfologiczny płodu szczura po narażeniu matek...
Piśmiennictwo
1. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Produkty pszczół w medycynie. Wyd. Apis, Lublin 2007. 2. Stojko A. Leczenie produktami
pszczelimi (apiterapia). [W:] Janicki K, Rewerski W. Medycyna naturalna. PZWL Warszawa, 2001; 105-13. 3. Vamanu E, Vamanu A,
Popa O i wsp. The antioxidant effect of a functional product based
on probiotic biomass, pollen and honey. J Anim Sci Biotechnol
2010; 43(1):331-6. 4. Nakajima Y, Tsuruma K, Shimazawa M i wsp.
Comparison of bee products based on assays of antioxidant capacity. BMC Complement Altern Med 2009; (9):4. 5. Chmielnicka-Kopaczyk M. Teratogenny wpływ leków na rozwój zarodka i płodu.
[W:] Słomko Z, Brębowicz G, Gadzinowski J. Leki w medycynie
perinatalnej. Ośr Wyd Nauk, Poznań 1999; 19-27. 6. Weaver DB,
Anzola JM, Evans JD i wsp. Computational and transcriptional
evidence for microRNAs in the honey bee genome. Genome Biol
2007; 8(6): R97. 7. Boll M, Weber LW, Becker E i wsp. Mechanism
of carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity. Hepatocellular
damage by reactive carbon tetrachloride metabolites. Z Naturforsh (C) 2001; 56:649-59. 8. Liu Y, Bartlett MG, White CA
i wsp. Presystemic elimination of trichloroethylene in rats following environmentally relevant oral exposures. Drug Metab Dispos
2009; 37(10):1994-8. 9. Lee KM, Muralidhara S, White CA i wsp.
otrzymano/received: 03.01.2014
zaakceptowano/accepted: 14.01.2014
Postępy Fitoterapii 2/2014
Mechanisms of the dose-dependent kinetics of trichloroethylene:
oral bolus dosing of rats. Toxicol Appl Pharmacol 2000; 164(1):5564. 10. Góras-Hetmańczyk L, Szaflarska-Stojko E, Stojko R i wsp.
Obserwacje doświadczalne nad osłonowym działaniem Sepolu P
w stosunku do płodu narażonego na związki embriotoksyczne.
Tetrachlorek węgla. Ann Acad Med Siles 2002; (52-53):11-19.
11. Stocker A, Schramel P, Kettrup A i wsp. Trace and mineral elements in royal jelly and homeostatic effect. J Trace Elem Med Biol
2005; 19(2-3):183-9. 12. Rzepecka-Stojko A. Zastosowanie standaryzowanych obnóży pszczelich w działaniu osłonowym w modelowym badaniu embriotoksyczności. Rozprawa doktorska, Śląska
Akademia Medyczna, Sosnowiec 1996. 13. Behura SK. Analysis of
nuclear copies of mitochondrial sequences in honey bee (Apis mellifera) genome. Mol Biol Evol 2007; 24(7):1492-505. 14. Fritz H,
Giese K. Eramation of the teratogenic potencial of chemicals in
the rat. Pharmacol 1990; 40(1):1-27. 15. Brittebo EB, Brandt I.
Metabolic activation of carbon tetrachloride by the cervico-vaginal epithelium in rodents. Pharmacol Toxicol 1998; 65:336-42.
16. Góras-Hetmańczyk L, Szaflarska-Stojko E, Kabała-Dzik A.
Obserwacje doświadczalne nad osłonowym działaniem Sepolu P
w stosunku do płodu narażonego na związki embriotoksyczne. 38
Nauk Konf Pszczel, Puławy 2001, 113-114.
Adres/address:
*dr n. med. Magdalena Wyszyńska
Katedra i Zakład Patologii
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Ostrogórska 30, 41-200 Sosnowiec
e-mail: [email protected]
75