Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
Transkrypt
Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Farmaceutyczny www.fpn.info.pl Cena 24,50 zł Przegląd Naukowy Miesięcznik PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH IC Value - Current 3.66 MNiSW 4 ROK VI (X) Nr 5/2009 (52) Scientific Review in Pharmacy Zastosowanie epigenetyki w terapii chorób człowieka Wpływ suszonego rozmarynu na peroksydację lipidów wybranych olejów jadalnych0 Chlorowcowe i siarkowe pochodne naturalnych zasad purynowych o aktywności przeciwnowotworowej i immunosupresyjnej Chromatograficzny rozdział i identyfikacja taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych w ich mieszaninie 0 Charakterystyka bakterii rodzaju Desulfovibrio z uwzględnieniem ich potencjalnie patogennego wpływu 0 na organizm człowieka i zwierząt oraz możliwości leczenia 0zakażeń wywołanych przez te mikroorganizmy Zawartość selenu w roślinnych surowcach leczniczych i jego relacje z wybranymi pierwiastkami Szlak RANKL/RANK/OPG w patogenezie chorób – nowe możliwości terapeutyczne Wrażliwość radiacyjna mikroorganizmów ISSN 1425-5073 Białko opiekuńcze GRP94 i jego rola w terapii nowotworów 1 Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk Farmaceutyczny Adres redakcji / Editorial Adress: Przegląd Naukowy Miesięcznik PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / Poland Tel. 500 722 219 Fax. 032/364-11-34 Mail: [email protected] Index Copernicus 3,66 MNiSW 4 Scientific Review in Pharmacy Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board Przewodniczący / Head: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec Członkowie / Members: Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary: Dr n. med. Robert D. Wojtyczka Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board: Dr n. farm. Paweł Olczyk Dr n. biol. Małgorzata Kępa Mgr Anna Szeremeta Mgr Agnieszka Jura – Półtorak Dr n. hum. Anna Kierczak Wydawca / Publisher: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego Adres Wydawcy / Publisher Adress: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Poland tel. (0-33) 817-28-79 fax (0-33) 817-36-31 Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.) Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Agnieszka Romańska Robert Cyganik [email protected] Nakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies Skład / Technical Editor: Jerzy Partyka Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education. Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja nie odpowiada. All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for advertisements and reader letters. Zdj. Zygmunt Wieczorek Szanowni Państwo, Koleżanki i Koledzy, Drodzy Czytelnicy Zgodnie z wcześniejszą zapowiedzią, przedstawiam garść informacji na temat Konferencji Europejskiego Stowarzyszenia Wydziałów Farmaceutycznych (EAFP), która odbyła się w Norwegii, w dniach 18 – 20 czerwca br. Konferencja, pod nazwą New issues in postgraduate / post-registration pharmacy education, dotycząca wszystkich aspektów szkolenia podyplomowego, jakie realizowane jest na europejskich Wydziałach Farmaceutycznych, zorganizowana została przez Wydział Farmaceutyczny Uniwersytetu w Oslo, w kooperacji z EAFP. Po raz pierwszy poświęcono tak wiele uwagi szkoleniu podyplomowemu, bowiem jak dotąd, przedmiotem corocznych Konferencji EAFP były kwestie dotyczące edukacji przeddyplomowej (Bologna first and second cycle), a szczególnie – nowych trendów w kształceniu przyszłych farmaceutów. Dotychczasowe skupianie uwagi na programie i sposobie realizacji studiów na kierunku farmacja uzasadnione było świadomością zmieniającej się roli współczesnego farmaceuty w systemie ochrony zdrowia, tj. aktywnym uczestnictwem w opiece nad pacjentem poprzez indywidualne podejście do chorego, identyfikację jego problemów lekowych czy ocenę bezpieczeństwa i skuteczności farmakoterapii. Nieustanny rozwój nauk farmaceutycznych wymaga jednak dalszej edukacji i specjalizacji, wykraczając poza zakres nauczania przeddyplomowego. Stąd tematyka tegorocznej Konferencji, nawiązującej do studiów III stopnia, wyrazem których w projekcie bolońskim są studia doktoranckie (Bologna third cycle), lecz także – do specjalizacji czy szkolenia ciągłego farmaceutów, określanego jako continuing education, continuing professional development, czy life long learning. Podczas obrad zwrócono także uwagę na znaczenie szkolenia podyplomowego w aspekcie potrzeb przemysłu farmaceutycznego. Polskimi doświadczeniami w zakresie przedstawionej tematyki dzielili się przedstawiciele czterech Wydziałów Farmaceutycznych, tj. Prof. Renata Jachowicz i Prof. Marek Cegła z Wydziału Farmaceutycznego w Krakowie, Prof. Kazimierz Głowniak z Wydziału Farmaceutycznego w Lublinie, Prof. Franciszek Główka z Wydziału Farmaceutycznego w Poznaniu i Prof. Krystyna Olczyk z Wydziału Farmaceutycznego w Sosnowcu. Ważnym i cennym dla Polskiej Farmacji wydarzeniem podczas tegorocznej Konferencji był wybór Pani Prof. Renaty Jachowicz do Komitetu Wykonawczego EAFP. Co ważne, Pani Profesor uzyskała największą ilość głosów. Nieskromnie dodam, że nasza czwór- ka miała w tym swój udział. Aktywne uczestnictwo Pani Profesor w corocznych Konferencjach – od początku ich zaistnienia, a także wysoka pozycja w międzynarodowych gremiach farmaceutycznych, przyczyniły się do tego sukcesu. Serdecznie gratulujemy! Szanowni Państwo. Mój pobyt na powyższej Konferencji stworzył także sposobność przedstawienia Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego uczestnikom tego Przedsięwzięcia. Wręczyłam Pani Profesor Karen Marie Ulshagen, Przewodniczącej Komitetu Organizacyjnego i Członkowi Komitetu Naukowego tegorocznej Konferencji, poprzedni numer naszego czasopisma, zawierający oryginalny Komunikat na temat nadchodzącego spotkania EAFP. Ponadto, uzyskałam zgodę trojga Profesorów na Ich dołączenie do naszej Konsultacyjnej Rady Naukowej. Są nimi Prof. Filiz Hincal z Uniwersytetu Hacettepe w Ankarze i wieloletni Członek Komitetu Wykonawczego EAFP, Prof. Benito Del Castillo Garcia – były Dziekan Wydziału Farmaceutycznego w Madrycie i poprzedni Prezydent EAFP, Prof. Vitalis Briedis – dziekan Wydziału Farmaceutycznego w Kownie. Dążąc konsekwentnie do nadania naszemu czasopismu międzynarodowego charakteru, zamieszczamy już w niniejszym numerze, opracowany przez Kolegium Redakcyjne Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego, anglojęzyczny Regulamin publikowania prac, a ponadto – zredagowaną w dwóch wersjach językowych treść tzw. stopki redakcyjnej oraz tytuły zawartych w numerze prac. Zachęcam Państwa do nadsyłania publikacji w wersji anglojęzycznej. Może powolutku uda nam się wspiąć na wyższy szczebelek w „drabinie” listy rankingowej MNiSW oraz IC? A może pomyślimy i o innych punktach? To przecież zależy tylko od nas! Szanowni Państwo, Drodzy Autorzy i Czytelnicy. Zapraszam serdecznie do lektury bieżącego numeru Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego. W numerze tym, obok naszych publikacji, znalazł się kolejny artykuł, zatytułowany A week worth gold!, rekomendowany przez Komitet Naukowy i Organizacyjny FIP, a to w związku z nadchodzącym Kongresem w Stambule, w dniach 3 – 8 września br. A tymczasem, życzę cudownych wakacji, pełni relaksu i wypoczynku. W chwilach wolnych od zajęć polecam Farmaceutyczny Przegląd Naukowy! Redaktor Naczelny Prof. dr hab. n. med. Krystyna Olczyk Farmaceutyczny Przegląd Naukowy Miesięcznik PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH Index Copernicus 3,66 MNiSW 4 Scientific Review in Pharmacy Nr 5 / 2009 Spis treści Zastosowanie epigenetyki w terapii chorób człowieka0000000000000000000000000000000000000000000 7 Epigenetic therapy in human diseases Wpływ suszonego rozmarynu na peroksydację lipidów wybranych olejów jadalnych00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 11 The effect of dried rosemary on lipids peroxydationof selected edible oils Chlorowcowe i siarkowe pochodne naturalnych zasad purynowych o aktywności przeciwnowotworowej i immunosupresyjnej0 000000000000000000000000000000000000 15 Chloro and thiopurine derivatives with anticancer 0 and immunosuppressive activity0 Chromatograficzny rozdział i identyfikacja taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych w ich mieszaninie 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 21 Chromatographic separation and identification of taurine-conjugates of selected bile acids in their mixture0 Charakterystyka bakterii rodzaju Desulfovibrio 0 z uwzględnieniem ich potencjalnie patogennego wpływu 0 na organizm człowieka i zwierząt oraz możliwości leczenia 0 zakażeń wywołanych przez te mikroorganizmy000000000000000000000000000000000000000000 0 Characteristics of the Desulfovibrio genus with regard to its potential pathogenic influence on human and animal body, and the possible treatment of infections caused by these microorganisms 26 Zawartość selenu w roślinnych surowcach leczniczych i jego relacje z wybranymi pierwiastkami0 00000000000000000000000000000000000000000000000000 33 Content of selenium in medicinal plant raw materials and its relation with selected elements Szlak RANKL/RANK/OPG w patogenezie chorób – nowe możliwości terapeutyczne0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 37 The RANKL/RANK/OPG pathway in pathogenesis of diseases 0 – new therapeutic possibilities Wrażliwość radiacyjna mikroorganizmów000000000000000000000000000000000000000000000000000 43 Radiosensitivity of microorganisms Białko opiekuńcze GRP94 i jego rola w terapii nowotworów0 Chaperon GRP94 and its role in anti-cancer therapy 47 Wydawnictwo Kwieciński poleca RECEPTURA DLA LEKARZY, STUDENTÓW MEDYCYNY I STOMATOLOGII Pod redakcją Przemysława Nowaka Zbigniewa S. Hermana Ryszarda Brusa 2005 Farm Przegl Nauk, 2009,5, 7-10 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Zastosowanie epigenetyki w terapii chorób człowieka Epigenetic therapy in human diseases Marta Palacz Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Kierownik Katedry: Prof. dr hab. J. Kowalski Streszczenie: Epigenetyka to nauka zajmująca się wyjaśnieniem fenomenu zmian fenotypowych niezależnych od zmian na poziomie genu. Mechanizmy epigenetyczne związane są przede wszystkim z metylacją DNA oraz acetylacją histonów prowadzącą do zmian w strukturze chromatyny. Dziedziczne zmiany spowodowane modyfikacjami epigenetycznymi mogą prowadzić do rozwoju wielu chorób, między innymi do transformacji nowotworowej, chorób psychicznych oraz chorób związanych z układem krążenia, stąd zainteresowanie farmakologii tymi mechanizmami i poszukiwanie leków mogących na nie wpływać. Pierwsza grupa leków to inhibitory metylotransferaz DNA, natomiast drugą stanowią inhibitory deacetylaz histonów. Obie wymienione grupy leków mają potencjalne znaczenie w leczeniu chorób nowotworowych. Abstract: The science of epigenetics describes mechanisms of phenotypic changes not connected with changes in DNA sequences. Epigenetic mechanisms include DNA methylation as well as chromatin and histone modification. Inherited epigenetic changes are responsible for various diseases development. Therefore pharmacology is interested in such kind of mechanisms and looking for the drugs that can influence them. The first group of the drugs constitute methylotransferases (DNMTs) inhibitors and the second one histone acetlotransferases ( HATs) inhibitors. Both mentioned groups can have the potential meaning for the treatment of tumor diseases. Key words: epigenetics, DNA methylation, histone acetylation Słowa kluczowe: epigenetyka, metylacja DNA, acetylacja histonów In the past few years a theory has arisen that genetic lessons alone can not explain the molecular mechanism of many diseases development. Epigenetic processes together with genetic one (changes in DNA sequence) - allow to a better understanding of malignant mechanisms [1,2]. Epigenetics try to answer the question why there are changes in phenotype when the genotype is identical. As opposed to sequence changes, epigenetic alternations are the result of endogenous mechanisms connected with genome information reading. Epigenetic changes which are inherited can be switched off during natural cell processes and / or by environmental factors. Epigenetics refer to the statement that every cell can inherit “something” more than DNA. A special kind of material such as Barr body or tumor tissues are demanded to observe and define epigenetic mechanisms [1,2,3]. Two basic epigenetic mechanisms can be distinguish: DNA methylation and histone acethylation, which both lead to the chromatin structure modifications [2]. DNA methylation DNA methylation is essential to correct gene expression in mammalian cell. The mechanism of DNA methylation requires CpG sites and leads to converting cytosine into 5-methylcytosine. Methyl group present in the gene promot- er inhibits transcription factors binding and in consequence DNA transcription. In practice it means the lack of gene product, the promoter of which has been methylated. This methylation mechanism is currently use in genes silencing processes necessary for organism development and cell differentiation. The same mechanism is responsible for gene imprinting [4]. CpG dinucleotides are unmethylated in 5’ regulatory area, but CpG islands in introns and repetitive DNA sequences are often methylated. In case of the lack of methylation in human genome, highly repetitive sequences are susceptible to mutations [5]. The enzymes responsible for methylation are DNA methylotransferases (DNMTs) [6]. One can distinguish 4 human DNMTs ( DNMT1 – methylation keeping; DNMT2, DNMT3a, DNMT3b – de novo methylation). Changes in the activity of DNMTs can be the cause of certain diseases such as atheriosclerosis [4], schizophrenia [9] and cancer [7]. Recently scientists took into special consideration the role of CpG island hypermathylation in the colon cancer development. It is well known fact that MLH1 promoter hypermethylation can cause colon carcinogenesis. On the other hand administration of inhibitors of DNA methylation significantly reduced tumor progression [7]. We can point at the three subgroups of DNMTs inhibitors (table I). The first one constitute nucleoside analogues, 7 Farm Przegl Nauk, 2009,5 Table I. Characteristics of DNMTs inhibitors DRUG AC – 5 azacitidine 5-Aza-2’deoxycytidine 5-fluoro-2’-deoxycytidine 5,6-dihydro-5-azacytidine Hydralazine procainamide EGCG Psammaplin A MD88 MG98 RG108 DAC - Decytabine Zebularine USE MDS – Myelodysplastic syndrome AML – Myeloid leukemia Haematological malignancies, cervical, non-small-cell lung cancer Cancer Ovarian cancer and lymphomas Cervical cancer Cancer Cancer Cancer Cancer Advanced/metastatic solid tumours Cancer MDS Myelodysplastic syndrome AML Myeloid leukemia Urinary bladder cancer DEVELOPMENT PHASE Phase II Phase I, II, III Phase I Phase I, II Phase I Preclinical Preclinical Preclinical Preclinical Phase I Preclinical Phase II preclinical * The basis of the source: Jacob Peedicayil, Epigenetic therapy - a new development in pharmacology; Indian J Med Res 123, January 2006, pp 17-24. especially cytosine. Such a DNMTs inhibitors are phosphorylated and then incorporated instead of cytosine into DNA during replication. Nucleoside analogues of cytosine are decitabine and 5- azacytidine. The last mentioned substance under the trade name of Vidaza is already use as a drug in myelodysplastic syndrome treatment [8]. A large limitation in using decitabine and 5- azacytidine as a drugs is necessity of parenteral administration as well as their myelotoxicity resulting in cytopenia. Moreover their mechanism of action depends on concentration and high therapeutical doses are needed to induce cytotoxicity effect. The new discovered DNMTs inhibitor, zebularine is less toxic and orally administered drug, which indicates highest stability as opposed to 5 -azacytidine [9,10,11]. Searching for nonmyelotoxic cytosine analogues has resulted in discovery of the second group of DNMTs inhibitors: non-nucleoside inhibitors. The members of this group are drugs such as procainamide, procaine or hydralazine [3,8,9]. To the third group of DNMTs inhibitors belong antisense oligonucleotides. Oligonucletides are short nucleotide sequences complementary to mRNAs, which gives the possibility of hybridization with them and in consequence inhibits translation. [3, 13]. As mention before DNMTs are also used in schizophrenia treatment. DNMT inhibitor doxorubicin can change the expression level of reelin and GAD67 – enzyme responsible for GABA synthesis. [8] As all three above mentioned DNMTs inhibitors groups have many side effects, an attempt to find the other way of DNMTs inhibition in human cell was made. Small interfering RNAs, noncoding sequences, can also apply to for gene expression. RNAs takes part in heterochromatin formation and is responsible for siRNA rise from dsRNA. This process, also known as posttranscriptional silencing, can cause transcription repression. Mutations in the structure of siRNA lead to dysfunction in chromosom segregation and centromeric heterochromatic instability. siRNA is 8 responsible for heterochromatin region – telomeres. siRNAs are responsible for few epigenetically silenced genes and are in the Phase II of clinical trials in the effectiveness in cancer therapy. We can distinguish DNMT1ASO for DNMT1 [2,11,12,13,14]. Interestingly DNMTs inhibitors are unexpected properties of antiarrhytmic. They can also stop methylation of cancer cell what gives potential usefulness in cancer therapy. EGCG - main polyphenol found in green tea reduces methylation activity is at present in phase I of clinical trials [11]. It worth to mention about psammaplins from marine sponge Pseudoceratina pupurea which has shown to inhibit both DNMT and histone deacetylase activity [8,14] . HISTONE MODYFICATION: The second epigenetic mechanism connected with chromatin structure alterations is histone modifications[15]. Human genetic material exists as a nucleoprotein complex – chromatin. Chromatin is built of fundamental units – nucleosomes. Nucleosom is the first level of chromatin structural organization. Each nucleosom includes histone octamer (core histones H2A, H2B, H3 and H4 which form dimmers) surrounded by 147 bp of DNA [14,15]. Wide variety of postranslational modifications of histones include lysine acetylation, lysine and arginine methylation, serine and threonine phosphorylation, lysine ubiquitination and sumoylation. Histone modifications may affect chromosome function through two mechanisms. One is connected with electrostatic charge of the histone and resulting in structural change in histones and their binding to DNA. The second one assumes that these modifications are binding sites for protein recognition modules (bromo- and chromodomains), that recognize acetylated or methylated lysines [16]. Histones can be modified by specific enzymes. In the last decade many such kind of enzymes have been found. They are built of numerous units that together catalyze specific copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 reactions. Core histones are acetylated by histone acetylotransferases (HATs). The opposite effect – deacetylation is catalyzed by histone deacetylases (HDACs). One can distinguish three classes of HDACs. The first one included HDAC1, HDAC2, HDAC3 and HDAC8- present only in the nucleus. HDAC4-7, 9 and 10- able to move from cytoplasm to the nucleus- belong to the second group. The last group of HDAC is represented by SIRT enzymes [15,16]. HDAC inhibitors Histone acetylation is natural biological process lead to transcription activation. Histone acetylotransferase by binding acetyl group to the promoter of the gene, change chromatin structure into more decondensed, what allow interaction with transcription factors. Acetyl group is eliminated by histone deacetylases (HDACs) before chromatin condensation and genome silencing. The mechanism of HDAC inhibitors consist in progress of apoptotic pathways and inhibition of growth of tumor culture cells. We can point out four main groups of HDAC inhibitors: the short-chain fatty acids (valproic acid), hydroxyamic acids (suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA), epoksyketones (trapoxin) and benzamides (table II) [16,17]. SAHA as advanced candidate in cancer therapy. Interestingly, valproic acid (VPA) used in treating epilepsy and bipolar disorder has become a HDAC inhibitor [17]. VPA is also in clinical trials in myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome treatment. HDAC inhibitors are also used in neurodegenerative disease treatment as Huntington’s, Parkinson’s, Alzheimer’s diseases. Some clinical trials are conducted in ischemic stroke treatment. HDAC inhibitors as DNA methylotransferase inhibitors are also used in depression, anxiety disorders and schizophrenia treatment. Some last findings, essential for schizophrenia, indicate that the promoter of the gene reelin contain special sites for DNA methylation, HDAC and methylotransferase inhibitors. Also GABA synthesis is connected with optimal methylation [19, 20]. Interestingly, monotherapy of HDAC inhibitors is less effective than a mixed HDAC inhibitors therapy. Scientist try to create the mixed HDAC inhibitors with DNA methylotransferase inhibitors therapy. Sodium phenylbutyrate is combinated with 5AC and VPA is combined with decitabine in myeloid leukemia treatment [21,22,23]. DNMT together with HDAC inhibitor can stop angiogenesis and further metastasis in cancer development what was confirm by microarray analyze [24,25]. Epigenetics and environmental factors If we focus on epigenetic mechanism we shouldn’t forget about environmental factors and their influence on these processes. There is significant relationship between diet and malignances development. Some researches apply to Western – type diet and DNA methylation in colon cancer development [7] and antioxidant secure. Diet can influence on methylation during cancer development. Interesting are food and nutrients taking part in DNA synthesis and enzymes responsible for that process [4,7]. Diet as environmental factor can influence on epigenetical mechanisms. There is evidence that epigenetic changes, especially methylation, can be reversible by specific diet. Summary Epigenetics describe mechanisms of genes expression not connected with changes of DNA sequences. Until recently it was obvious that genotype changes lead to phenotypical modifications but a better knowledge of epigenetic mechanisms has cast an entirely different light on inheritance. Not only do we have genes code, but it is also possible that we have histone code and chromatin structure code Table II. Characteristics of HDACs inhibitors which are essential for gene expression. There are still DRUG USE DEVELOPMENTAL PHASE many epigenetic mechanisms Breast cancer Trichostatin A Preclinical which create a whole specOvarian cancer trum of possibilities for the Solid tumours SAHA Phase I, II scientists thus opening up new leukaemias ways for development within Leukaemias Phase I, II the field of genetics. depsipeptide Melanoma Preclinical Epigenetic mechanism deColon cancer Preclinical velopment opened new way apicidin Leukaemia Preclinical for drugs development. Some MS-275 Solid tumours Phase I of them are in the preclinical CI-994 Solid tumours Phase I and clinical drug trials. Most Trifluoromethyl ketones Cancer Preclinical of this trials are connected a-ketoamides Cancer Preclinical with various types of cancer, MDS Phase I Sodium phenylbutyrate hematological malignancies Leukemia and psychiatric disorders. The Phase I VPA Neuroectodermal tumor cells Phase II development of epigenetic Romidepsin Myeloid disorders Phase I mechanisms in cancer development has opened a new area Vorinostat Cutaneous T-cell Lymphoma Phase II for cancer therapy which tries * The basis of the source: Jacob Peedicayil, Epigenetic therapy - a new development in pharmacolto use histone deacatylase and ogy; Indian J Med Res 123, January 2006, pp 17-24. 9 Farm Przegl Nauk, 2009,5 DNA methylotransferase inhibitors [16, 17]. The biggest interest is in enzymes such as HATs, HDACs, DNMTs and histone methylotransferases [24,25]. Epigenetic therapy is a new way of treatment which will help to objective diagnose, optymalize doses and picking up the best pharmacological therapy. References: 1. Esteller M., Epigenetics in cancer. N Engl J Med 2008; 358:1148-59. 2. David Allis C., Jenuwein T., Reinberg D. : Epigenetics. Cold Spring Harbor Labolatory Press, New York, 2006. 3. Peedicayil J. : Epigenetic therapy – a new development in pharmacology. Indian J Med RES 2006; 123: 17-24. 4. Turunen P. M., Aavik E., Seppo Yla-Hertuala. Epigenetics and atheriosclerosis. Biochimica et Biophysica Acta 2009; 3: 1-6 5. Wei Dai i wsp. Methylation Linear Discriminant Analysis ( MLDA) for indentifying differentially methylated CpG island. BMC Bioinformatics 2008;9:337. 6. Levenson J. M. DNA ( Cytosine -5) Methyltransferase Inhibitors: A Potential Therapeutic Agent for Schizophrenia. Mol Pharmacology 2007;71: 635-637. 7. Nystrom M., Mutanen M. Diet and epigenetics in colon cancer. World Journal of Gastroenterology 2009; 21: 257-263. 8. Brueckner B., Lyko F. DNA methyltransferase inhibitors: old and new drugs for an epigenetic cancer therapy. Trends in Pharmacological Science2004;11: 551-554. 9. Levenson J. M. DNA ( Cytosine -5) Methyltransferase Inhibitors: A Potential Therapeutic Agent for Schizophrenia. Mol Pharmacology 2007;71: 635-637. 10.Laird W. P. Cancer epigenetics. Human Mol. Genetics 2005; 14: 65-76. 11.Yoo C.B., Cheng J.C., Jones P.A. Zebularine: a new drug for epigenetic therapy. Biochemical Society Transacions 2004; 32: 910-912. Adres do korespondencji: Marta Palacz Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Katedra i Zakład Genetyki Medycznej ul. Ostrogórska 30 41-200 Sosnowiec [email protected] 10 12.Altucci L. i wsp: Acute myeloid leukemia: Therapeutic impact of epigenetic drugs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2005;37: 1752-1762. 13..Robert i wsp: DNMTis required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. Nat. Genet. 2003; 33:61-65. 14. Griffiths E. I wsp. DNA Methylotransferase and Histone Deacetylase Inhibitors in the Treatment of Myelodysplasic Syndroms. Semin Hematol. 2008; 45: 23-30. 15.Annemieke I wsp: Hisotne deacetylases ( HDACs): characetrisation of the classical HDAC family. Biochem. J. 2003; 370: 737-749. 16. Vasquero, A. et. al. The Constantly Changing Face of Chromatin. Science of Aging Knowledge Environment. 2003; 17. Karagiannis T., Harikrishnan K., El-Osta A. The Epigenetic Modifier, Valproic Acid, Enhances Radiation Sensitivity. Epigenetics 2006; 6: 131-137. 18. Mariadason J.M. HDACs and HDAC inhibitors in colon cancer. Epigenetics 2008; 3:28-37. 19. Peedicayil J. Epigenetic biomarkers in psychiatric disorders. British Journal of Pharmacology 2008; 155: 795-796. 20. Abel T., Zukin S. Epigenetic targets od HDAC inhibition in neurodegenerative and psychiatric disorders. Curr Opin Pharmacol. 2008; 8: 57-64. 21. Lujambio A., Esteller M.: How epiegentics can explain human metastasis. Cell Cycle2009; 2: 377-382. 22. Hellebrekers D. i wsp. : Identyfication of epigenetically silenced genes in tumor endothelial cells. Cancer Res 2007;67: 4138-4148. 23. Dinant C., Houtsmuller A., Vermeulen W. Chromatin strucure and DNA damage repair. Epigenetics & Chromatin 2008; 1. 24.Marks P.A., Jiang X. Histone deacetylase Inhibitors in Programmmed Cell Death and Cancer Therapy. Cell Cyckle 2005; 4: 549-551. 25. Dong C. i wsp. DNA Methylation and Atheriosclerosis. The Journal of Nutrition 2002; 2: 2406- 2409. Farm Przegl Nauk, 2009,5, 11-14 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Wpływ suszonego rozmarynu na peroksydację lipidów wybranych olejów jadalnych The effect of dried rosemary on lipids peroxydation of selected edible oils Ewa Kurzeja, Małgorzata Stec, Katarzyna Pawłowska-Góral, Izabela Maciejewska-Paszek, Monika Pawlik Katedra i Zakład Żywności i Żywienia, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Kierownik: M. Wardas Streszczenie: Oleje roślinne są często wzbogacane substancjami egzogennymi, mającymi na celu zwiększenie ich trwałości i zapobiegającymi utlenianiu. Ponieważ liczne badania dowodzą wielu niekorzystnych działań syntetycznych antyoksydantów, coraz więcej uwagi poświęca się badaniom surowców roślinnych, których składniki wykazują właściwości przeciwutleniające. Celem pracy była próba oceny wpływu suszonego ziela rozmarynu na szybkość starzenia się oleju rzepakowego i słonecznikowego w warunkach przechowywania i w wyniku działania wysokiej temperatury. Oznaczano wartości czterech parametrów, będących wskaźnikami świeżości olejów: liczbę kwasową (LK), liczbę nadtlenkową (LN), liczbę anizydynową (LA) oraz stężenie dialdehydu malonowego (MDA). Badania wykazały, że suszony rozmaryn w oleju rzepakowym i słonecznikowym nasila hydrolizę tłuszczów do wolnych kwasów tłuszczowych oraz przyspiesza ich utlenianie do nadtlenków, natomiast hamuje, szczególnie podczas przechowywania w temperaturze pokojowej oraz podczas krótkotrwałego ogrzewania, etap peroksydacji, w którym z nadtlenków powstają aldehydy. Abstract: Plant oils are frequntly enriched with exogenous substances, whose aim is to enhance their durability and prevent their oxidation. Since numerous studies reveal many unfavourable effects of synthetic antioxidants, more and more attention is focused on plant raw materials, whose components exhibit antioxidant properties. The aim of the study was the evaluation of the effect of rosemary dried herd upon the rate of aging of sunflower and rape oil in storage conditions and exposure to high temperature. The velues of four parameters which were the indices of oils’freshness were determined: acid value (LK), peroxide value (LN), anisidine value (LA) and concentration of malonic dialdehyde (MDA). Studies showed, that dried rosemary in rape and sunflower oil intensifies fats hydrolysis to free fatty acids and accalerates their oxidation to peroxides, whereas it inhibits peroxidation stage, particularly at room temperature, storage and short-term heating, in which aldehydes are formed from peroxides. Key worlds: rosemary, lipids peroxidation, edible oils Słowa kluczowe: rozmaryn, per oksydacja lipidów, oleje roślinne Wstęp Wobec nasilających się w krajach rozwiniętych chorób cywilizacyjnych, takich jak cukrzyca czy miażdżyca i towarzyszącej im otyłości, zaleca się ograniczenie spożywania węglowodanów i tłuszczów zwierzęcych. Do przygotowywania potraw powinny być więc stosowane oleje roślinne. Prozdrowotne właściwości olejów roślinnych wynikają głównie z faktu, że zawierają one nienasycone kwasy tłuszczowe [1]. Kwasy te mogą jednak ulegać utlenianiu, w wyniku czego maleje ich wartość odżywcza, a w dodatku powstają szkodliwe nadtlenki, aldehydy, ketony i produkty ich kondensacji [2,3]. Warunki sprzyjające tym niekorzystnym zmianom to ogrzewanie olejów, a więc proces smażenia na olejach potraw oraz nieprawidłowe przechowywanie olejów. Ponadto, pod- czas smażenia czy duszenia potraw na oleju często dodaje się różnych przypraw, w celu podniesienia walorów smakowych. Przyprawą taką może być rozmaryn, nadający potrawie charakterystyczny smak i zapach. Działanie wielu przypraw, w tym również rozmarynu, uznawane jest za korzystne nie tylko z uwagi na modyfikację smaku i zapachu, ale również z uwagi na domniemane właściwości antyoksydacyjne [4,5,6]. Istotne wydaje się jednak badanie czy właściwości te rozmaryn zachowuje w wyższej temperaturze podczas smażenia potraw oraz czy nie wywiera dodatkowych efektów w odniesieniu do wartości odżywczej i właściwości olejów. Celem pracy była próba oceny wpływu suszonego ziela rozmarynu na szybkość starzenia się oleju rzepakowego i słonecznikowego w warunkach przechowywania i w wyniku działania wysokiej temperatury. 11 Farm Przegl Nauk, 2009,5 Materiał i metody Materiałem badanym były powszechnie dostępne w handlu, dwa rodzaje jadalnych olejów roślinnych: olej słonecznikowy „Brölio” (rafinowany i wzbogacony witaminą E) oraz olej rzepakowy „Floriol” (rafinowany, z pierwszego tłoczenia). W celu oceny wpływu suszonego ziela rozmarynu na peroksydację lipidów w badanych olejach, oznaczenia przeprowadzono w olejach bez dodatku suchego rozmarynu oraz z jego dodatkiem. Do badań wykorzystano przyprawę „Rozmaryn”, firmy Kamis – Przyprawy S.A., którą dodawano w ilości 5g przyprawy na 495g oleju, otrzymując stężenie 1% (w/w). Zarówno oleje użyte w badaniach, jak i przyprawa były w okresie przydatności do spożycia. Oznaczano liczbę kwasową [7], nadtlenkową [8], anizydynową [9] i stężenie dialdehydu malonowego [10] w olejach po 30 dniach przechowywania w temperaturze pokojowej bez dostępu światła oraz w olejach po poddaniu go obróbce termicznej w temp. 178±2ºC w chwili osiągnięcia tej temperatury, jak i po 15., 30. i 60. minutach ogrzewania. W olejach bez rozmarynu oznaczenia wykonano również bezpośrednio po otwarciu opakowania. Wyniki i ich omówienie Wartości liczby kwasowej, nadtlenkowej i anizydynowej oznaczonej bezpośrednio po otwarciu opakowań z badanymi olejami nie przekraczały dopuszczalnych norm; niskie były również wartości stężenia dialdehydu malonowego: Po otwarciu opakowania Po 30-dniowym przechowywaniu w temp. pokojowej Po osiągnięciu temp. 178 ±2°C Po 15 minutach ogrzewania w temp. 178 ±2°C Po 30 minutach ogrzewania w temp. 178 ±2°C Po 60 minutach ogrzewania w temp. 178 ±2°C LK 0,103 ± 0,003 0,114 ±0,012 0,109 ±0,004 0,117 ±0,001 0,126 ±0,001 0,131 ±0,003 Bez dodatku rozmarynu LN LA MDA 2,15 1,92 0,43 ± 0,103 ± 0,064 ± 0,016 3,24 2,23 0,65 ±0,099 ±0,035 ±0,013 4,44 4,16 5,66 ±0,007 ±0,064 ±0,306 3,27 10,29 13,74 ±0,141 ±0,021 ±0,322 2,91 14,89 13,95 ±0,177 ±0,092 ±0,777 8,40 32,35 20,09 ±0,049 ±0,495 ±0,133 Tabela I. Średnie wartości liczby kwasowej (LK), w oleju rzepakowym Po otwarciu opakowania Po 30-dniowym przechowywaniu w temp. pokojowej Po osiągnięciu temp. 178 ±2°C Po 15 minutach ogrzewania w temp. 178 ±2°C Po 30 minutach ogrzewania w temp. 178 ±2°C Po 60 minutach ogrzewania w temp. 178 ±2°C LK 0,160 ±0,005 0,163 ±0,004 0,164 ±0,004 0,204 ±0,005 0,181 ±0,004 0,192 ±0,007 0,43 [μmol/dm3] dla oleju rzepakowego (Tabela I) i 0,67 [μmol/dm3] dla oleju słonecznikowego (Tabela II). 30-dniowe przechowywanie w temperaturze pokojowej spowodowało niewielki wzrost liczby kwasowej zarówno w olejach z dodatkiem, jak i bez dodatku rozmarynu. Podgrzewanie do temperatury 178±2°C i dalsze ogrzewanie przez 15, 30 i 60 minut powodowało dalszy, niewielki wzrost wartości LK. Zaobserwowano, że wartości liczby kwasowej dla oleju rzepakowego (Tabela I) we wszystkich wariantach oznaczeń były niższe niż dla oleju słonecznikowego (Tabela II), a dodatek rozmarynu do obu badanych olejów nieznacznie ją zwiększał. W żadnym przypadku jednak nie została przekroczona wartość 0,4, uznana za normę LK dla olejów rafinowanych. Podczas 30-dniowego przechowywania badanych olejów w temperaturze pokojowej wzrosła wartość liczby nadtlenkowej. Dla oleju słonecznikowego bez dodatku rozmarynu LN wynosiła 9,125 i była większa niż LN dla tego samego oleju z dodatkiem rozmarynu (Tabela II). Dla oleju rzepakowego bez dodatku rozmarynu liczba ta wynosiła 3,24 a dla oleju z dodatkiem rozmarynu 6,79 (Tabela I). Różnice wartości LN po 30 dniach przechowywania olejów bez dodatku rozmarynu były większe dla oleju słonecznikowego, niż rzepakowego. W wyniku ogrzania do temperatury 178±2°C olejów z dodatkiem i bez dodatku przyprawy liczba nadtlenkowa dla oleju rzepakowego wzrastała, a dla oleju słonecznikowego zmniejszała się. Ogrzewanie 15, 30 i 60 minut oleju słonecznikowego zarówno z dodatkiem, jak i bez dodatku przyprawy spowodowało spadek wartości LN LK 0,156 ±0,008 0,153 ±0,004 0,142 ±0,004 0,159 ±0,004 0,167 ±0,008 Z dodatkiem rozmarynu LN LA 6,79 ±0,141 6,82 ±0,092 6,75 ±0,042 9,55 ±0,163 16,32 ±0,057 1,65 ±0,028 3,5 ±0,141 9,48 ±0,042 13,23 ±0,064 47,02 ±0,141 MDA 0,42 ±0,019 3,48 ±0,118 10,19 ±0,048 10,68 ±0,259 14,49 ±0,117 nadtlenkowej (LN), anizydynowej (LA) oraz stężenia MDA [μmol/dm3] Bez dodatku rozmarynu LN LA 2,43 2,32 ±0,035 ±0,099 9,12 2,73 ±0,021 ±0,040 7,69 9,37 ±0,078 ±0,471 2,67 37,05 ±0,057 ±0,213 2,76 45,15 ±0,049 ±0,216 2,74 65,90 ±0,184 ±0,283 MDA 0,67 ±0,013 0,89 ±0,009 1,40 ±0,042 1,84 ±0,045 1,95 ±0,076 3,11 ±0,077 LK 0,208 ±0,004 0,212 ±0,001 0,213 ±0,007 0,215 ±0,004 0,257 ±0,004 Z dodatkiem rozmarynu LN LA 8,85 ±0,205 5,04 ±0,460 3,12 ±0,240 3,23 ±0,035 3,94 ±0,156 3,20 ±0,141 21,33 ±0,424 56,55 ±0,495 81,85 ±0,495 97,65 ±0,636 MDA 0,92 ±0,05 1,68 ±0,032 1,45 ±0,032 1,68 ±0,048 3,47 ±0,059 Tabela II. Średnie wartości liczby kwasowej (LK), nadtlenkowej (LN), anizydynowej (LA) oraz stężenia MDA [μmol/dm3] w oleju słonecznikowym 12 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 wraz z wydłużaniem się czasu ogrzewania. Dla oleju rzepakowego z dodatkiem rozmarynu już po 15 minutach ogrzewania LN wzrastała, osiągając maksymalną wartość 16,32 po 60-minutowym ogrzewaniu (Tabela I). W oleju rzepakowym bez rozmarynu znaczny wzrost wartości LN nastąpił dopiero po ogrzewaniu przez 60 minut. W wyniku 30-dniowego przechowywania olejów w temperaturze pokojowej, nastąpił bardzo niewielki wzrost liczby anizydynowej w każdej z próbek oleju słonecznikowego oraz w oleju rzepakowym bez dodatku rozmarynu. Dla oleju rzepakowego z dodatkiem rozmarynu, LA była niższa w porównaniu z olejem bez dodatku. W wyniku ogrzania oleju rzepakowego do temperatury 178±2°C, wartość liczby anizydynowej wzrosła nieznacznie w porównaniu z olejem nieogrzewanym, zarówno w oleju bez dodatku, jak i z dodatkiem rozmarynu. Dla oleju z dodatkiem przyprawy wartość LA była jednak nieco niższa. Podobną zależność zaobserwowano po 15 i 30 minutach ogrzewania, kiedy to dodatek rozmarynu powodował zmniejszenie liczby anizydynowej. Najwyższe wartości LA zaobserwowano po 60 minutach ogrzewania, wyższe jednak dla oleju rzepakowego z rozmarynem niż dla tego samego oleju bez dodatku przyprawy (Tabela I). W przypadku oleju słonecznikowego zależność wartości liczby anizydynowej w miarę wydłużania czasu ogrzewania wzrastała. Taką tendencję wykazywał zarówno olej słonecznikowy bez, jak i z dodatkiem rozmarynu. Od momentu osiągnięcia przez oleje temperatury 178±2°C do końca ogrzewania, wartość LA dla oleju słonecznikowego bez dodatków wahała się w granicach od 9,37 do 65,9, natomiast dla oleju z dodatkiem przyprawy od 21,33 do 97,65 (Tabela II). Liczby te były dużo wyższe w porównaniu z oznaczeniami dla oleju rzepakowego w tych samych punktach pomiarowych i przekroczyły swoją dopuszczalną normę wartości LA. W wyniku miesięcznego przechowywania w temperaturze pokojowej oleju rzepakowego bez dodatku przyprawy, stężenie MDA uległo niewielkiemu wzrostowi, natomiast w oleju z dodatkiem przyprawy było zbliżone do stężenia po otwarciu opakowania. W przypadku oleju słonecznikowego przechowywanie spowodowało niewielki wzrost stężenia MDA w oleju bez dodatku i z dodatkiem rozmarynu. Ogrzanie do temp. 178±2°C i dalsze ogrzewanie w tej temperaturze oleju rzepakowego w spowodowało wzrost stężenia diladehydu malonowego w oleju bez i z dodatkiem rozmarynu, w porównaniu z olejami nieogrzewanymi. Wartość stężenia była wówczas mniejsza dla oleju wzbogacanego rozmarynem i wynosiła 3,47 [μmol/dm3], podczas gdy w oleju bez dodatku stężenie wzrosło do wartości 5,66 [μmol /dm3] (Tabela I). Po 15, 30 i 60 minutach ogrzewania w tej temperaturze nastąpił znaczny wzrost stężenia MDA w obu próbkach oleju rzepakowego: do wartości 20,09 [μmol/dm3] dla oleju bez dodatku oraz 14,49 [μmol/dm3] dla oleju z dodatkiem przyprawy (Tabela I). Wartości stężenia dialdehydu malonowego były niższe dla oleju z dodatkiem rozmarynu. Wydłużanie czasu ogrzewania oleju słonecznikowego, powodowało stopniowy wzrost stężenia MDA dla oleju bez dodatku rozmarynu, które przyjmowało wartości 1,40 [μmol/dm3], po podgrzaniu do temperatury 178±2°C i 3,11 [μmol/dm3] po 60 minutach ogrzewania (Tabela II). W przypadku oleju z rozmarynem ogrzanie spowodowało wzrost stężenia MDA do wartości 1,68 [μmol/dm3], a 60 -minutowe ogrzewanie do 3,47 [μmol/dm3] (Tabela II). Po 15 i 30 minutach ogrzewania wartości stężenia MDA były niższe dla oleju z dodatkiem rozmarynu, niż dla oleju bez dodatku przyprawy. Dyskusja Uzyskane wyniki potwierdziły powszechną opinię dotyczącą faktu, iż dostęp powietrza do olejów (otwarty pojemnik) oraz światło pogarszają jakość olejów, ponieważ nasila się hydroliza zawartych w nich tłuszczów, proces utleniania kwasów tłuszczowych oraz powstawanie nadtlenków, a w efekcie również powstawanie aldehydów, w tym dialdehydu malonowego (MDA). Również proces ogrzewania do temperatury 178±2°C sprzyjał zachodzeniu niekorzystnych zmian. Zmiany te nasilały się w miarę wydłużania czasu ogrzewania. Najdłuższy przyjęty w pracy czas ogrzewania wynosił 60 minut. W przypadku smażenia potraw czas ten nie jest aż tak długi, lecz dla przeprowadzonego w niniejszej pracy eksperymentu z ogrzewaniem olejów, tak długi czas był niezbędny, w celu ewidentnego wykazania wpływu długości czasu ogrzewania na zachodzące zmiany. Zastosowane w przeprowadzonym eksperymencie warunki ogrzewania, tj. długość ogrzewania i temperatura, pozwoliły ustalić, że w oleju rzepakowym zachodzące niekorzystne zmiany są nieco łagodniejsze niż w oleju słonecznikowym, stąd sugestia, że z dwu przebadanych olejów do smażenia bardziej przydatny jest olej rzepakowy niż słonecznikowy. Olej słonecznikowy powinien być zatem spożywany na surowo, jako dodatek do sałatek, sosów, czy sporządzania majonezów. Rozmaryn w obu olejach nasilał hydrolizę, dowodem czego był niewielki wzrost liczby kwasowej. Niewielki wzrost liczby kwasowej nie ujmuje wartości olejom pod warunkiem, że nie będą one narażone na proces peroksydacji kwasów tłuszczowych. Fakt, iż rozmaryn, nasilając w niewielkim stopniu hydrolizę tłuszczów, przyspieszał powstawanie nadtlenków (w różnym nasileniu w stosunku do badanych olejów), należy uznać za niekorzystny. Być może wynikało to ze stosunkowo wysokiego stężenia rozmarynu w badanych olejach - nie wykluczone, że w praktyce kulinarnej stężenie to jest nieco niższe. Za niezwykle pozytywny efekt działania rozmarynu należy uznać fakt, że mimo stymulowania procesu powstawania nadtlenków, hamował proces powstawania aldehydów, dowodem czego była zawartość oznaczonego dialdehydu malonowego. Zahamowanie powstawania aldehydów, a zapewne i ketonów wskazuje, iż w olejach tych prawdopodobnie nie dochodzi do tworzenia szkodliwych dla zdrowia produktów polimeryzacji. Dlatego też zarejestrowane w niniejszej pracy efekty działania rozmarynu podczas ogrzewania olejów, należy uznać za korzystne. Wnioski 1. Rozmaryn w oleju rzepakowym i słonecznikowym nieznacznie nasila hydrolizę tłuszczów do wolnych kwasów tłuszczowych oraz przyspiesza ich utlenianie do nadtlenków, hamuje natomiast szczególnie w niskiej temperaturze oraz podczas krótkotrwałego ogrzewania, proces peroksydacji, w którym z nadtlenków powstają aldehydy. 13 Farm Przegl Nauk, 2009,5 2. Niższe wartości LK i LA podczas ogrzewania oleju rzepakowego w porównaniu z olejem słonecznikowym sugerują, że olej pozyskiwany z nasion rzepaku jest bardziej odpowiedni do smażenia. Piśmiennictwo 1. Okuyama H., Yamada K., Miyazawa D., Yasui Y., Ohara N.: Dietary lipids impacts on healthy ageing. Lipids. 2007; 42(9): 821-835. 2. Guillén M.D., Goicoechea E.: Toxic oxygenated alpha,beta-unsaturated aldehydes and their study in foods: a review. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2008 48(2): 119-136. 3. Muik B., Lendl B., Molina-Díaz A., Ayora-Cañada M.J.: Direct monitoring of lipid oxidation in edible oils by Fourier transform Raman spectroscopy. Chem. Phys. Lipids 2005; 134(2): 173-182. 4. Bhale S.D., Xu Z., Prinyawiwatkul W., King J. M., Godber J. S.: Oregano and rosemary extracts inhibit oxidation of long-chain n-3 fatty acids in menhaden oil. J. Food Sci., 2007; 72(9): 504-508. 5. Grzegorczyk I., Kuźma Ł., Wysokińska H.: Związki o właściwościach przeciwutleniających w roślinach z rodzaju Salvia. Bromat. Chem. Toksykol., 2004; 37(3): 209-216. 6. Moreno S., Schever T., Romano C.S., Vojnov A.A.: Antioxidant and antimicrobial acticities of rosemary exctracts linked to their polyphenol composition. Free Radic. Res., 2006; 40(2): 223–231. 7. Polska Norma PN-EN ISO 660: 2005. 8. Polska Norma PN- ISO 3960: 1996. 9. Polska Norma PN-EN ISO 6885: 2001. 10.Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner H.: Chemistry and biology of 4-hydroxynonenal, malondialdehyd and related aldehydes. Free Radic. Biol. Med., 1991; 11: 81-128. Adres do korespondencji: Dr n. med. Ewa Kurzeja, Katedra i Zakład Żywności i Żywienia Wydz. Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach; 41-200 Sosnowiec, ul. Jedności 8; tel. 032/3641172 e-mail: [email protected] 14 Farm Przegl Nauk, 2009,5, 15-20 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Chlorowcowe i siarkowe pochodne naturalnych zasad purynowych o aktywności przeciwnowotworowej i immunosupresyjnej Chloro and thiopurine derivatives with anticancer and immunosuppressive activity Alicja Kowalska Katedra i Zakład Chemii Organicznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Sosnowiec Streszczenie Abstract Syntetyczne pochodne puryny zawierające atom chlorowca lub siarki są lekami od dawna wykorzystywanymi w farmakoterapii. 6-Merkaptopuryna jako pierwsza tiopuryna została wprowadzona w 1963 roku do chemioterapii przeciwnowotworowej u dzieci. Stosowane obecnie w lecznictwie pochodne: 6-merkaptopuryna (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), azatiopryna (AZA), fludarabina i kladrybina stanowią grupę antymetabolitów naturalnych zasad purynowych - adeniny, guaniny i hipoksantyny. Mechanizm ich działania polega głównie na wbudowywaniu się do łańcucha DNA i RNA w postaci nukleozydów oraz na blokowaniu biosyntezy puryn de novo. Istnieją również doniesienia o możliwości indukowania przez nukleozydowe analogi puryn procesu apoptozy jak i hamowania angiogenezy tkanek nowotworowych. Są lekami swoistymi dla fazy S cyklu komórkowego przy czym kladrybina działa dodatkowo w fazie G0. Związki te stają się biologicznie aktywne po przekształceniu w organizmie do rybonukleotydów przy udziale takich enzymów, jak: HGPRT, IMPD, GMPS, IPP. Azatiopryna jest prolekiem, który ulega w wątrobie nieenzymatycznej przemianie do 6-MP i pochodnej metylonitroimidazolu przy udziale S-metylotransferazy glutationu. 6-MP, 6-TG, fludarabina i kladrybina wykorzystywane są głównie w chemioterapii przeciwnowotworowej, głównie w białaczkach szpikowych i limfoblastycznych, azatiopryna natomiast stosowana jest przede wszystkim jako lek immunosupresyjny w transplantologii oraz leczeniu chorób o podłożu autoimmunologicznym. The synthetic chloro and thiopurine derivatives are the drugs widely used in pharmacotherapy for many years. In 1963 6-mercaptopurine as the first thiopurine was introduced into cancer chemotherapy in children. From this group of purine derivatives, 6-mercaptopurine (6-MP), 6-thioguanine (6-TG), azathioprine (AZA), fludarabine and cladrybine are the drugs available today in therapy. All this compounds are the natural purine (adenine, guanine and hypoxanthine) antimetabolites. They are metabolically activated to ribonycleotides by a multienzymatic process (HGPRT, IMPD, GMPS, IPP). The mechanism of the drugs biological activity is complex and may involve modulation of cellular metabolism in several ways. The first pathway it is incorporation active nucleotides into replicating nucleic acids and the second one is action as pseudofeedback inhibitor of de novo purine nucleotide synthesis. They are the drugs acting in the S phase of cell cycle, cladrybine acts in the G0 phase as well. Azathioprine is a prodrug, which is metabolized to 6-MP through the elimination of the methylnitroimidazole by a chemical nucleophile such as glutathione. Glutathione S-methyltransferase is the enzyme catalyzing the conjugation of glutathione with the imidazole moiety. 6-MP, 6-TG, fludarabine and cladrybine have been used mainly in the antitumor therapy, in lymphoblastic and myeloid leukemia. AZA is used as an immunomodulator in different disciplines: transplantology, dermatology, hematology and in the rheumatologic or inflammatory bowel diseases. Słowa kluczowe: antymetabolity purynowe, mechanizm działania, zastosowanie kliniczne Syntetyczne pochodne puryn zawierające w swej strukturze atomy chlorowca lub siarki są lekami od dawna wykorzystywanymi w farmakoterapii. 6-Merkaptopuryna jako pierwsza tiopuryna znalazła zastosowanie w leczeniu ostrej białaczki szpikowej i limfoblastycznej i do chwili obecnej jest jednym z najbardziej efektywnych leków używanych w leczeniu dziecięcej białaczki limfoblastycznej [1,2]. Key words: purine antimetabolites, mechanism of action, clinical indications Do odkrycia merkaptopuryny w 1951 roku doprowadziły badania George’a Hitchings’a i Gertrudy Elion, którzy w amerykańskich laboratoriach firmy Wellcome Burroughs przetestowali około 100 różnych pochodnych purynowych, wykorzystując bakterie Lactobacillus casei jako mikroorganizm testowy [2,3].G. Hitchings [4] opierając się na teorii antymetabolitów założył, że jeśli kwasy nukleinowe 15 Farm Przegl Nauk, 2009,5 są niezbędne do funkcjonowania każdej żywej komórki, istnieje możliwość zatrzymania wzrostu szybko dzielących się komórek (bakterii, pierwotniaków, komórek nowotworowych) związkami będącymi antagonistami zasad purynowych wchodzących w skład tych kwasów. Niewielkie zmiany chemiczne dokonane w obrębie cząsteczki naturalnie występującej puryny mogłyby spowodować, że analog będzie na tyle podobny do substratu, iż możliwe będzie jego oddziaływanie z receptorem. Ostateczne zastąpienie atomu tlenu atomem siarki w pozycji 6 hipoksantyny i guaniny doprowadziło do otrzymania antymetabolitów purynowych: 6-merkaptopuryny i 6-tioguaniny. Po pomyślnych testach na liniach komórkowych białaczki L1210 i zwierzętach [5] oraz pierwszych klinicznych badaniach, w których uzyskano wydłużenie czasu przeżycia oraz remisję u chorych na białaczkę [3] 6-merkaptopuryna została w 1963 roku zatwierdzona przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków do stosowania w lecznictwie [2]. Wprowadzenie chemioterapii do leczenia nowotworów u dzieci było ogromnym postępem w tej dziedzinie. 1. Metabolizm i mechanizm działania Wśród siarkowych pochodnych puryn, obecnie stosowanych w lecznictwie, znajdują się takie leki, jak: 6-merkaptopuryna (6-MP), 6-tioguanina (6-TG) (Ryc.1) i azatiopryna (AZA) (Ryc.2), do chlorowcopochodnych natomiast zalicza się: fludarabinę (Ryc.3) i kladrybinę (Ryc.4) [1]. Wszystkie te leki stanowią grupę antymetabolitów naturalnych zasad purynowych: adeniny, guaniny i hipoksantyny. Mechanizm ich działania jest złożony. Z jednej strony jako „fałszywe” zasady są wbudowywane w postaci nukleotydów do łańcucha DNA i RNA zaburzając transkrypcję i replikację kwasów nukleinowych, z drugiej natomiast blokują biosyntezę puryn de novo [6,7]. Antymetabolity są lekami swoistymi fazowo, działają w fazie S cyklu komórkowego, czyli w fazie aktywnej syntezy DNA następującej po zakończeniu fazy G1 [8,9]. Kladrybina dodatkowo działa także na populację dzielących się limfocytów i monocytów w fazie spoczynkowej (G0) cyklu komórkowego [1]. Przyjmuje się, że głównym mechanizmem uszkadzającym komórki w fazie Go jest proces apoptozy. Kladrybina indukując apoptozę w limfocytach powoduje zmniejszenie się populacji limfocytów CD4 i CD8 [1,8,9]. W ciągu ostatnich lat pojawiły się nowe teorie dotyczące mechanizmu działania siarkowych analogów puryn. Okazało się, że 6-TG może też działać jako molekuła antyangiogenna. Angiogeneza, czyli proces tworzenia się naczyń krwionośnych odgrywa podstawową rolę w powstawaniu i wzroście niektórych nowotworów. In vitro 6-TG hamuje proliferację komórek endotelium wyzwalaną przez czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) i czynnik proliferacyjny dla śródbłonka (VEGF) oraz opóźnia naprawę mechanicznie uszkodzonych komórek endotelium. 6-Tioguanina hamuje zatem różne etapy angiogenezy [10]. Biotransformacja 6-MP i 6-TG może odbywać się dwiema drogami - anaboliczną i kataboliczną. Przemiany anaboliczne polegają na aktywacji 6-MP i 6-TG przez enzym fosfo- 16 rybozylotransferazę hipoksantynowo-guaninową (HGPRT) i powstaniu początkowo monofosforanowych nukleotydów, a następnie pochodnych trifosforanowych w reakcji katalizowanej przez enzym inozyno-5’-fosforanopirofosforylazę (IPP) [7,11] (Ryc.5). Nukleotyd tioinozyno-5’-monofosforanowy (6-TIMP) powstający z merkaptopuryny, w dalszym etapie w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę inozyno-monofosforanową (IMPD) jest utleniany w pozycji C2 pierścienia purynowego do nukleotydu tioksantozyno-monofosforanowego (TXMP). Ten ostatni z kolei ulega przekształceniu do 6-tioguanozyno5’-monofosforanu (TGMP) w energozależnej reakcji katalizowanej przez syntetazę guanozyno-monofosforanową (GMPS). W przeciwieństwie do merkaptopuryny, tioguanina ulega bezpośredniej przemianie do nukleotydu TGMP w jednoetapowej reakcji katalizowanej przez enzym HGPRT. 6-Tioguanozyno-5’-monofosforan (TGMP) jest dalej metabolizowany przez kinazy i reduktazy do deoksy-6-tioguanozyno-5’-trifosforanu [7,11,12], który może być wbudowany do DNA. Metabolizm kataboliczny 6-MP i 6-TG zachodzi z udziałem metylotransferazy tiopurynowej (TPMT), oksydazy ksantynowej (XO) oraz oksydazy aldehydowej (AO), konkurujących z enzymem HGPRT i prowadzi do powstania kwasu 6-tiomoczowego i 6-metylotiomoczowego [7]. Proces ten zachodzi bardzo intensywnie już w czasie pierwszego przejścia cytostatyku przez wątrobę i w związku z tym jego biodostępność jest bardzo mała. Oksydaza ksantynowa jest blokowana przez allopurinol, co prowadzi do hamowania biotransformacji merkaptopuryny i wydłuża jej biologiczny okres półtrwania [9]. Ważnym etapem biotransformacji 6-MP i 6-TG jest powstawanie metylowych pochodnych zachodzące przy udziale enzymu metylotransferazy tiopurynowej (TPMT), której poziom waha się w szerokich granicach ze względu na genetyczny polimorfizm, warunkujący powstawanie nieaktywnych form enzymów. Około 10% ludzi rasy białej jest nosicielami polimorficznego genu TPMT warunkującego bardzo niski poziom aktywności tego enzymu. Pacjenci o takim genotypie leczeni standardową dawką 6-MP będą doświadczać głębokiej mielosupresji z towarzyszącym wysokim poziomem 6-tioguanozyny (TGN) w krwinkach czerwonych [7,11,13]. Zachowanie wysokiego poziomu TGN przy obniżonej aktywności enzymu TPMT sugeruje, że 6-MP wykazuje cytotoksyczny efekt poprzez mechanizmy niezależne od produkcji TGN, np. poprzez hamowanie syntezy puryn de novo przez S-metylotioinozyno-5’-monofosforan (MeTIMP) [7]. Dla 6-MP i 6-TG istnieją różnice w syntezie S-metylowych pochodnych, w inkorporacji nukleotydów tioguaninowych do DNA i w hamowaniu syntezy puryn de novo. W przypadku 6-TG aktywacja TPMT prowadzi do niewielkiego wzrostu cytotoksycznej wrażliwości, w wyniku czego można zaobserwować wzrost efektywności inkorporacji TGN do DNA. Zatem mechanizm cytotoksycznego działania 6-TG zależy głównie od wbudowywania TGN do DNA. S-Metylotioguanozyno-5’-monofosforan (MeTGMP) jest słabym inhibitorem syntezy puryn de novo [7]. Biotransformacja merkaptopuryny zachodzi głównie w wątrobie i prawdopodobnie w błonie śluzowej przewodu pokarmowego. Merkaptopuryna przenika łatwo przez bło- copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 ny komórkowe i jest aktywowana przez system cytochromu P-450 do reaktywnego metabolitu, który wiąże się z białkami tkanek. W trakcie tego procesu dochodzi do powstania rodników tiopurynowych ulegających dimeryzacji z wytworzeniem symetrycznego disulfidu bis (6,6’-dipurynowego) [14], który może być dalej utleniany do kwasu puryno-6sulfenowego [14,15] lub ulegać reakcji dysproporcjonowania z wytworzeniem 6-MP i kwasu puryno-6-sulfinowego [14,16]. Badania in vitro z użyciem znakowanego [8-14C] kwasu puryno-6-sulfinowwego potwierdzają możliwość jego wiązania z białkami poprzez tworzenie mostków disulfidowych z grupami tiolowymi protein, co może tłumaczyć hepatotoksyczny efekt działania 6-MP [15]. Azatiopryna (AZA) jako prekursor merkaptopuryny jest metabolizowana w wątrobie i nerkach do 6-MP i pochodnej 1-metylo-4-nitroimidazolu w reakcji, w której uczestniczy S-transferaza glutationu (GSTs) [17] (Ryc.6). Reakcja ta polega na nukleofilowym ataku grup tiolowych różnych związków na pozycję 5 pierścienia imidazolowego, przy czym proces ten zachodzi głównie w krwinkach czerwonych zawierających glutation i inne związki o strukturze tiolowej [17]. Dochodzi do obniżenia poziomu glutationu (GSH) w hepatocytach, co prowadzi do dysfunkcji mitochondriów, spadku poziomu ATP i w konsekwencji do śmierci komórki przez nekrozę. Procesowi temu zapobiegają silne antyoksydanty, glicyna oraz związki blokujące przepuszczalność błony mitochondrialnej [18,19]. Ludzka S-transferaza glutationu (GSTs) jest kodowana przez 17 genów, przy czym w uwalnianiu 6-MP z azatiopryny uczestniczą trzy różne izoenzymy GSTs: A1-1, A2-2 i M1-1 [20]. Efekt immunosupresyjnego działania azatiopryny zależy od synergistycznego współwystępowania relatywnie słabego cytostatycznego efektu niskiej dawki 6-MP i efektu wywieranego przez wysoce reaktywne pochodne imidazolu: S-podstawione 1-metylo-4-nitro-5-tioimidazole oraz aminoimidazole [17]. Azatiopryna wywiera niespecyficzny efekt na komórki układu immunologicznego. Metabolity purynowe hamują proliferację aktywnych mitotycznie limfocytów, a sama AZA posiada selektywny wpływ na limfocyty T oraz nieznaczny na limfocyty B. Efektem działania AZA jest inhibicja funkcji cytotoksycznych limfocytów T poprzez blokowanie białka CD28 oraz modulacyjny wpływ na syntezę związanego z guanozynotrifosforanem (GTP) białka Rac1 [21]. Fludarabina jest analogiem nukleozydu adeniny opornym na działanie deaminazy adenozynowej. Stosowana w postaci monofosforanu ulega szybko defosforylacji do 2-fluoroadenozyny i w tej postaci jest wchłaniana przez komórki. Następnie ulega wewnątrzkomórkowej przemianie do aktywnego 5’-trifosforanu w reakcji katalizowanej przez kinazę deoksycytydynową. Trifosforan fludarabiny jako czynny metabolit hamuje reduktazę rybonykleotydową, polimerazę, primazę i ligazę DNA, czego efektem jest zablokowanie syntezy DNA w komórce. Ponadto następuje częściowe zahamowanie polimerazy II RNA i w konsekwencji zmniejszenie syntezy białek. Procesy te prowadzą do zahamowania wzrostu komórek [1,9]. Kladrybina jest syntetyczną pochodną deoksyadenozyny różniącą się od niej obecnością atomu chloru w pozycji C2 pierścienia purynowego. Wewnątrz komórki ulega fos- forylowaniu przy udziale kinazy deoksycytydynowej początkowo od mono a następnie trifosforanu. Wywiera wybiórcze cytotoksyczne działanie w stosunku do komórek o względnie dużym stosunku kinazy deoksycytydynowej do deoksynukleotydazy, czyli prawidłowych i nowotworowych limfocytów i monocytów. Kladrybina nie tylko hamuje aktywność enzymów, takich jak reduktaza rybonukleotydowa czy polimerazy DNA, ale także jak wszystkie antymetabolity ulega wbudowaniu do łańcucha DNA w miejsce deoksyadenozyny powodując pęknięcie helisy DNA. Komórki zawierające duże ilości deoksynukleotydów są niezdolne do naprawy pojedynczych łańcuchów DNA. Uszkodzone końce DNA aktywują polimerazę, w rezultacie czego dochodzi do zubożenia puli komórkowego NAD, zahamowania syntezy ATP i ostatecznie zaburzenia metabolizmu, zaburzenia procesów energetycznych komórki i jej śmierci. Wodróżnieniuodinnychanalogówpurynowych,kladrybinadziała zarówno na populację limfocytów i monocytów proliferujących, jak i pozostających w fazie spoczynkowej (G0) cyklu komórkowego [1,8,9]. 2. Zastosowanie kliniczne Ryc. 1. R = H Merkaptopuryna 0 R = NH2 Tioguanina 6-Merkaptopuryna (Ryc.1) stosowana jest głównie w leczeniu ostrych białaczek: szpikowej i limfoblastycznej, w zaostrzeniu blastycznym przewlekłej białaczki szpikowej, a także w połączeniu z innymi lekami dla podtrzymania remisji ostrej białaczki limfoblastycznej [1,12,13]. Często wykorzystuje się ją do leczenia białaczek u dzieci, u których stanowi jeden z najbardziej efektywnych leków [11,12,22]. W Polsce zarejestrowana jest pod nazwą Mercaptopurinum (Vis, PL) [1]. Lekiem stosowanym w onkologii jest także 6-tioguaniana (Ryc.1), która obecnie jest głównie wykorzystywana (podobnie jak merkaptopuryna) do leczenia białaczek w fazie ostrej, a także w połączeniu z innymi lekami w chemioterapii nowotworów o charakterze przewlekłym np. w konsolidacji i podtrzymywaniu remisji ostrej i przewlekłej białaczki szpikowej, a także ostrej białaczki limfoblastycznej [1,12,23]. Dostępna jest w postaci preparatów: Lanvis (GlaxoSmithkline, GB) i Thioguanin-GSK (GlaxoSmithkline, D) [1]. Zarówno 6-MP jak i 6-TG stosuje się również w leczeniu chorób o podłożu immunologicznym np. w chorobie Crohn’a, wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego, łącznie z kortykosteroidami w wirusowym zapaleniu wątroby, w dermatologii w leczeniu liszaja, łuszczycy, twardziny, guzkowatego zapalenia tętnic czy złuszczającego zapalenia skóry [6,23,24]. 17 Farm Przegl Nauk, 2009,5 Ryc. 2. Azatiopryna Ryc. 3. Fludarabina Ryc. 4. Kladrybina Objawy niepożądane, które towarzyszą stosowaniu 6-merkaptopuryny i 6-tioguaniny wiążą się przede wszystkim z przyjmowaniem dużych dawek cytostatyków. Należą do nich zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego: nudności, wymioty, biegunka, zapalenie jamy ustnej, owrzodzenie błony śluzowej jelit, hepatotoksyczność oraz uszkodzenie szpiku [8,25,26]. Azatioprynę (Ryc. 2) stosuje się wyłącznie jako lek immunosupresyjny w transplantologii narządów i tkanek oraz w chorobach o podłożu autoimmunologicznym: chorobie Werlhofa, ciężkim reumatoidalnym zapaleniu stawów, przewlekłym czynnym zapaleniu wątroby, autoimmunologicznej niedorkwistości hemolitycznej, sklerodermii, nieropnym zapaleniu skóry, tkanki podskórnej i mięśni, guzkowatym zapaleniu okołotętniczym, zespole nerczycowym, rozsianym liszaju rumieniowatym, pęcherzycy zwyczajnej czy przewlekłej samoistnej plamicy małopłytkowej opornej na leczenie. Azatioprynę najczęściej stosuje się w połączeniu z innymi lekami, zwykle kortykosteroidami lub w połączeniu z zabiegami zmniejszającymi odpowiedź immunologiczną [23,25-31]. Azatiopryna jest obecnie dostępna w postaci następujących preparatów: AzathioprinRatiopharm (Ratiopharm, D), Azamedac (Medac, D), Azathioprine (Vis, PL), Imuran (GlaxoSmithkline, GB), Imurek (GlaxoSmithkline, CH), Imurel (GlaxoSmithkline, F), Zytrim (Mercle, D) [1]. Objawy niepożądane występujące przy stosowaniu azatiopryny często wynikają z reakcji nadwrażliwości na ten lek. Należą do nich zaburzenia rytmu serca, obniżenie ciśnienia tętniczego, zawroty głowy, złe samopoczucie, gorączka, bóle mięśni, stawów (prawdopodobnie spowodowane obecnością pierścienia imidazolowego w cząsteczce azatiopryny) oraz zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego podobnie jak w przypadku stosowania merkaptopuryny. Ponadto mogą wystąpić megalobastyczne zmiany w szpiku (niekokrwistość megaloblastyczna, erytroblastopenia, leukopemia, granulocytopenia, limfocytopenia), a u biorców przeszczepów zwiększona podatność na zakażenia wirusowe, bakteryjne i grzybicze [18,28,30,31]. Ryc. 5. Enzymatyczna aktywacja 6-merkaptopuryny i 6-tioguaniny 0 HGPRT-fosforybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa IMPD-dehydrogenaza inozyno-monofosforanowa GMPS-syntetaza guanozyno-monofosforanowa IPP-inozyno-5'-fosforanopirofosforylaza 6-TIMP-tioinozyno-5'-monofosforan TXMP-tioksantozyno-monofosforan 18 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Ryc. 6. Metabolizm azatiopryny 0 GSH-glutation GSTs-S-transferaza glutationu Chlorowcowe pochodne puryn – fludarabina i kladrybina są typowymi chemioterapeutykami. Fludarabinę (Ryc.3) stosuje się w leczeniu przewlekłej białaczki limfatycznej typu B-komórkowego, chłoniaków nieziarniczych, ostrej białaczki szpikowej i limfoblastycznej, białaczki prolimfocytowej i włochatokomórkowej [1,8,9]. Zarejestrowana jest pod nazwą Fludara (Schering, GB,D, Berlex, USA) [1]. Kladrybina (Ryc.4) ma podobne zastosowanie w leczeniu białaczek włochatokomórkowych w każdym stadium choroby, przewlekłych białaczek limfatycznych opornych na leczenie innymi cytostatykami, chłoniaków nieziarniczych o małym stopniu złośliwości oraz ostrych białaczek szpikowych w skojarzeniu z innymi cytostatykami. Jest dostępna w postaci następujących preparatów: Biodribin (IBA, PL), Leustat (Janssen-Cilag, GB), Leustatin (Ortho Biotech, USA), Litak (Lipomed, D) [1]. Przy stosowaniu fludarabiny lub kladrybiny najczęstszym objawem ubocznym jest mielotoksyczność (leukopenia, trombocytopenia, neutropenia), zaburzenia czynności przewodu pokarmowego oraz neurotoksyczność (bóle i zawroty głowy, bezsenność, parestezje, zaburzenia widzenia wywołane zapaleniem nerwów wzrokowych). Ponadto fludarabinę cechuje pulmotoksyczność (może wywołać duszności, kaszel i śródmiąższowe zapalenie płuc), natomiast w czasie leczenia kladrybiną może wystąpić uszkodzenie nerek, zakażenia bakteryjne i grzybicze oraz wysypki skórne [1,9]. Dokonany przegląd stosowanych obecnie w lecznictwie antymetabolitów purynowych z grupy chlorowco i tiopuryn wskazuje na duże znaczenie tych związków w chemioterapii nowotworowej, jak również na coraz szersze ich wykorzystanie jako immunosupresorów. Duży zasięg występowania chorób nowotworowych w dzisiejszym społeczeństwie oraz niedoskonałość stosowanych metod leczenia stanowi wyzwanie zarówno dla lekarzy jak i chemików w zakresie syntezy nowych leków oraz badań dotyczących mechanizmu działania już stosowanych. Piśmiennictwo: 1. Podlewski J. K., Chwalibogowska-Podlewska A.; Leki współczesnej terapii; Split Trading Sp. z o.o.; Warszawa; 2007/2008. 2. Elion G.B.; The purine path to chemotherapy; Science, 1989; 244: 41-47. 3. Farber S.; Summary of experience with 6-MP; Ann. NY Acad. Sci.; 1954; 60: 412- 414. 4. Hitchings G. H., Elion G. B.; The chemistry and biochemistry of purine analogs; Ann. NY Acad. Sci.; 1954; 60: 195-199. 5. Burchenol J. H., Ellison R. R., Murphy M. L.; Clinical studies on 6-mercaptopurine; Ann. NY Acad. Sci.; 1954; 60: 359-368. 6. Bökkerink J. P. et al.; 6-Mercaptopurine: cytotoxicity and biochemical pharmacology in human malignant T-lymphoblasts; Biochem. Pharmacol.; 1993; 45: 1455-1463. 7. Coulthard S. A. et al.; The effect of thiopurine methyltransferase expression on sensitivity to thiopurine drugs; Mol. Pharmacol.; 2002; 62: 102-109. 8. Kostowski W., Herman Z. S.; Farmakologia; PZWL; Tom II, Warszawa; 2003, 418-422. 9. Orzechowska-Juzwenko K.; Zarys chemioterapii nowotworów; Volumed; Wrocław; 2000, 33-39. 10.Presta M., Belleri M., Vacca A., Ribatti D.; Antiangiogenic activity of the purine analog 6-thioguanine; Leukemia; 2002; 16: 1490-1499. 11.Evans W. E. et al.; Altered mercaptopurine metabolism, toxic effects, and dosage requirement in a thiopurine methyltransferase deficient child with acute lymphocytic leukemia; J. Pediatr.; 1991; 119: 985-989. 12.Adamson P. C., Poplack D. G., Balis F. M.; The cytotoxicity of thioguanine vs mercaptopurine in acute lymphoblastic leukemia; Leukemia Res.; 1994; 18: 805-810. 13.Lennard L., Lilleyman J. S.; Individualizing therapy with 6-mercaptopurine and 6-thioguanine related to the thiopurine methyltransferase genetic polymorphism; Ther. Drug Monit.; 1996; 18: 328-334. 14.Goyal R. N., Rastogi A., Sangal A.; Electro oxidation of 6-mercaptopurine riboside with special emphasis on the stability of the dimer in aqueous solutions; New J. Chem.; 2001; 25: 545-550. 15.Abraham R. T., Benson L. M., Jardine I.; Synthesis and pH-dependent stability of purine-6-sulfenic acid, a putative reactive metabolite of 6-thiopurine; J. Med. Chem.; 1983; 26: 1523-1526. 19 Farm Przegl Nauk, 2009,5 16.Pawełczyk E., Zając M., Majewski W., Majewska B.; Kinetyka rozkładu leków: XCIII Model kinetyki rozkładu 6-merkaptopuryny (6-MP) w środowisku zasadowym; Acta Polon.Pharm.: 1988; 45: 259-265. 17.Hoffmann M. et al.; Mechanism of activation of an immunosuppresive drug: azathioprine. Quantum chemical study on the reaction of azathioprine with cysteine; J. Am. Chem. Soc.; 2001; 123: 6404-6409. 18.Lee A. U., Farrell G. C.; Mechanism of azathioprine induced injury to hepatocytes: roles of glutathione depletion and mitochondrial injury; J. Hepatol.; 2001; 35: 756-764. 19.Menor C. et al.; Azathioprine acts upon rat hepatocyte mitochondria and stress-activated protein kinases leading to necrosis: protective role of N-acetyl-L-cysteine; J. Pharmacol. Exp. Ther.; 2004; 311: 668-676. 20.Eklund B. I., Moberg M., Bergquist J., Mannervik B.; Divergent activities of human glutathione transferases in the bioactivation of azathioprine; Mol. Pharmacol.; 2006; 70: 747-754. 21.Tiede I. et al.; CD28-dependent Rac1 activation is the molecular target of azathioprine in primary human CD4+T lymphocytes; J. Clin. Invest.; 2003; 111: 11331145. 22.Paneta J. C., Evans W. E., Cheok M. H.; Mechanistic mathematical modeling of mercaptopurine effects on cell cycle of human acute lymphoblastic leukaemia cells; Br. J. Cancer; 2006; 94: 93-100. Adres do korespondencji: Alicja Kowalska, tel. 0323641602, e-mail: [email protected] 20 23.Duley J. A., Florin T. H.; Thiopurine therapies: problems, complexities, and progress with monitoring thioguanine nukleotides; Ther. Drug Monit.; 2005; 27; 547-654. 24.Bonaz B. et al.; Thioguanine in patients with Crohn’s disease intolerant or resista; Aliment. Pharmacol. Ther.; 2003; 18: 401-408. 25.Chojnacki J., Wichan P.; Tło patogenetyczne i zasady leczenia zachowawczego przewlekłych nieswoistych zapaleń jelit; Pediatria współ.; 2004; 6: 441-447. 26.Cara C. J. et al.; Reviewing the mechanism of action of thiopurine drugs towards a new paradigm in clinical practice; Med. Sci. Monit.; 2004; 10: 247-257. 27.Siegel C. A., Sands B. E.; Practical management of inflamatory bowel disease patients taking immunomodulators; Aliment. Pharmacol. Ther.; 2005; 22: 1-12. 28.Chang J.; A review on the management of Crohn’s disease; U.S.Pharmacist; 2007; 32: 18-33. 29.Cuffari C., Hunts S., Bayless T. M.; Enhanced bioavailability of azathioprine compared to 6-mercaptopurine therapy in correlation with treatment efficacy; Aliment. Pharmacol. Ther.; 2000; 14: 1009-1014. 30.Anstey A. V., Wakelin S., Reynolds N. J.; Guidelines for prescribing azathioprine in dermatology; Br. J. Dermatol.; 2004; 151: 1123-1132. 31.Arnott I. D., Watts D., Satsangi J.; Azathioprine and anti-TNF alpha therapies in Crohn’s disease: a review of pharmacology, clinical efficacy and safety; Pharmacol. Res.; 2003; 47: 1-10. Farm Przegl Nauk, 2009,5, 21-25 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Chromatograficzny rozdział i identyfikacja taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych w ich mieszaninie* Chromatographic separation and identification of taurine-conjugates of selected bile acids in their mixture Małgorzata Dołowy Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Ogólnej i Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Sosnowiec Kierownik Katedry: prof. dr hab. n. chem. Alina Pyka Streszczenie Celem pracy było zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej w normalnym i odwróconym układzie faz (NP-TLC i RP-TLC) do rozdziału i identyfikacji taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych, takich jak: kwas taurocholowy (TCA), taurodeoksycholowy (TDCA), taurochenodeoksycholowy (TCDCA) i taurolitocholowy (TLCA) w ich mieszaninie. Do oceny rozdziału trzech par badanych kwasów żółciowych tj. TCA/TDCA, TDCA/ TCDCA i TCDCA/TLCA użyto współczynniki rozdziału ∆RF i RS. Wykazano, że NP-TLC i RP-TLC są przydatne do rozdziału tylko dwóch par kwasów żółciowych z ich mieszaniny: TCA/TDCA i TCDC/TLCA. Problem stanowi separacja kwasu TDCA od TCDCA. Para ta nie rozdzieliła się w żadnych z zastosowanych warunków chromatograficznych. Stwierdzono, że trudności w separacji pary kwasów TDCA/TCDCA wynikają z podobieństwa ich retencji chromatograficznej. Abstract The aim of this paper was to apply a thin-layer chromatography in normal and reversed phase system (NP-TLC and RP-TLC) to separate and identify a mixture of selected taurine- conjugates bile acids such as: taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA) and taurolithocholic acid (TLCA). The estimation of resolution of three investigated pairs of bile acids was carried out on the basis of the separation factors values ∆RF and RS. It was showed that, the NPTLC and RP-TLC methods are useful for separation of two of three examined bile acids of their mixture: TCA/TDCA and TCDCA/TLCA. The biggest problem in bile acids separation is resolution of TDCA from TCDCA. This pair didn’t separate under all applied chromatographic conditions. It was stated that the problems in TDCA/TCDCA separation arise from similarities of their chromatographic retention. słowa kluczowe: kwasy żółciowe, rozdział kwasów żółciowych, analiza kwasów żółciowych, TLC key words: bile acids, separation of bile acids, analysis of bile acids, TLC Wstęp Kwasy żółciowe to pochodne steroidowe, czyli zawierające w swojej strukturze charakterystyczny dla steroidów układ 1,2-cyklopentanoperhydrofenantrenu składający się z czterech nasyconych, skondensowanych pierścieni, w tym trzech pierścieni sześciowęglowych i jednego pięciowęglowego. W żółci człowieka kwasy te występują w postaci wolnej oraz sprzężonej, tj. są połączone wiązaniem amidowym poprzez grupę karboksylową z glicyną (H2N-CH2-COOH) lub z tauryną (H2N-CH2-CH2-SO3H) – rys. 1. Kwasy żółciowe różnią się ilością grup OH i C=O. W zależności od ilości grup hydroksylowych (OH) obecnych w cząsteczce kwasu żółciowego, związki te dzieli się na [1-3]: • pochodne monohydroksylowe np. kwas litocholowy • pochodne dihydroksylowe np. chenodeoksycholowy, ursodeoksycholowy i deoksycholowy • pochodne trihydroksylowe np. kwas cholowy. Pod wpływem enzymów bakterii jelitowych, których wzrost jest objawem pętli zastoinowej, glicyna lub tauryna, mogą ulegać odszczepieniu od cząsteczek kwasów żółciowych do wolnych kwasów lub może dojść do dehydroksylacji czyli zamianie trihydroksylowych kwasów żółciowych do monohydroksylowych. U osób z kamicą żółciową oraz w przypadku marskości wątroby (tj. uszkodzenia miąższu wątroby) całkowita pula kwasów żółciowych w surowicy krwi zwiększa się w porównaniu do zdrowych osobników [3]. *Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach z umowy KNW-2-023/09 21 Farm Przegl Nauk, 2009,5 kwasów żółciowych w ich mieszaninie, tj. kwasu taurocholowego (TCA), kwasu taurodeoksycholowego (TDCA), kwasu taurochenodeoksycholowego (TCDCA) oraz kwasu taurolitocholowego (TLCA). Materiały Rys. 1. S 0 truktura chemiczna kwasów żółciowych [2] Dlatego bardzo ważna i istotna dla celów diagnostyki schorzeń wątroby i dróg żółciowych byłaby możliwość rozdziału mieszaniny kwasów żółciowych na poszczególne frakcje tzn. wolne kwasy, kwasy połączone z glicyną i tauryną oraz ich identyfikacja i ilościowe oznaczenia w surowicy czy żółci. Wśród metod stosowanych do rozdziału i oznaczania kwasów żółciowych w materiale biologicznym (surowica krwi, mocz i kał) stosuje się następujące metody analityczne [4,5]: • chromatografia cienkowarstwowa (TLC) • chromatografia gazowa (GC) • wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) • elektroforeza kapilarna (CE) • metody enzymatyczne i immunoenzymatyczne. Budowa kwasów żółciowych wskazująca na obecność słabych ugrupowań chromoforowych absorbujących promieniowanie przy długości fali około 200 nm sprawia, że spektrofotometryczne oznaczanie kwasów żółciowych bez wcześniejszej ich derywatyzacji do bardziej czułych na działanie światła pochodnych jest niemożliwe [5]. W standardowej diagnostyce laboratoryjnej do oznaczania całkowitej puli kwasów żółciowych w surowicy krwi stosuje się metodę enzymatyczną. W metodzie tej wykorzystuje się katalityczne utlenianie kwasów żółciowych przy użyciu swoistego dla nich enzymu – dehydrogenazy 3α-hydroksysteroidowej. Barwny produkt tej reakcji oznacza się spektrofotometrycznie, a jego stężenie jest proporcjonalne do poziomu kwasów żółciowych w surowicy krwi ludzkiej. Metoda ta jest prosta w wykonaniu i obarczona małymi błędami analitycznymi, co sprawia, że znalazła szerokie zastosowanie w analizie chorób wątroby i dróg żółciowych [4,5]. Powyższa praca jest kontynuacją chromatograficznych badań kwasów żółciowych w modelowej mieszaninie odpowiadającej składowi żółci ludzkiej. Poprzednie prace pozwoliły na opracowanie optymalnych warunków chromatograficznych (techniką TLC) do rozdziału i identyfikacji wolnych i związanych z glicyną kwasów żółciowych [6-12]. Ponadto chromatograficzno – densytometryczna metoda okazała się również przydatna do ilościowego oznaczania wolnych kwasów żółciowych po wstępnym ich rozdziale z mieszaniny [9]. W prezentowanej pracy podjęto próbę chromatograficznego rozdziału i identyfikacji taurynowych połączeń 22 Do badań użyto metanolowe roztwory następujących kwasów żółciowych: TCA, TDCA TCDCA i TLCA (Sigma- Aldrich, USA) o stężeniu 5µg/µl oraz ich mieszaninę zawierającą 5 µg każdego kwasu w 1 µl. Składniki faz ruchomych to: n -heksan (POCh, Gliwice), octan etylu (POCh, Gliwice), kwas octowy (99,5%, POCh, Gliwice), metanol (POCh, Gliwice), chloroform (POCh, Gliwice), izooktan (POCh, Gliwice), n- butanol (POCh, Gliwice) oraz woda destylowana (Zakład Chemii Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny ŚUM, Sosnowiec). W celu wizualizacji plamek badanych kwasów zastosowano około 95% H2SO4 (POCh, Gliwice). Wodny roztwór CuSO4 × 5H2O (POCh, Gliwice) użyto do impregnacji płytek chromatograficznych stosowanych w badaniach. W pracy użyto płytki chromatograficzne do chromatografii w normalnym układzie faz (NP –TLC) produkcji E. Merck o numerach: Art. 1.05715, Art. 1.05554 i Art. 1.05553 oraz płytki do chromatografii w odwróconym układzie faz (RP – TLC) o numerze Art. 1.05559. Metodyka badań Rozdział mieszaniny kwasów żółciowych techniką NP –TLC ( rozwijanie jednokierunkowe) Zastosowano płytki aluminiowe pokryte żelem krzemionkowym 60F254 i 60 (E. Merck, Art. 1.05554 i Art. 1.05553) oraz szklane Art. 1.05715 o wymiarach 10cm×10cm. Na zaktywowane w temp. 120oC płytki nanoszono 10 µl mieszaniny badanych kwasów i 3µl roztworu standardowego kwasu TCA, TDCA, TCDCA i TLCA. Płytki rozwijano na wysokość 9 cm w klasycznej komorze chromatograficznej 20cm×20cm (Camag, Szwajcaria) przy użyciu 50 ml fazy ruchomej: • n- heksan –octan etylu –kwas octowy w następujących stosunkach objętościowych: 25:20:8 i 22:22:5 (v/v/v) • chloroform –metanol-kwas octowy w stosunkach objętościowych: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5, 45:0:5, 40:5:5 i 37,5:13,5:1,55 (v/v/v). Impregnacji płytek chromatograficznych dokonywano poprzez ich zanurzenie na 30 sekund w wodnym roztworze CuSO4 o stężeniu 5% i następnie wysuszenie w temp. 18±1oC przez 24 h. W celu uwidocznienia plamek analizowanych kwasów płytki spryskiwano 10% roztworem H2SO4 i ogrzewano je przez 20 minut w temp. 120oC. Rozdział mieszaniny kwasów żółciowych techniką 2D –TLC ( rozwijanie dwukierunkowe) W przypadku rozwijania dwukierunkowego użyto płytki chromatograficzne Art. 1.05715 wymiarach 10cm×10cm oraz mieszaninę izooktan –octan etylu- kwas octowy copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 w stosunku objętościowym 5:4:1 (v/v/v) jako fazę ruchomą w I- szym kierunku rozwijania. Natomiast mieszaninę: chloroform- woda-kwas octowy- n- butanol w stosunku objętościowym 2:1:1:16 (v/v/v/v) zastosowano w II kierunku rozwijania prostopadłym do pierwszego. Na płytki nanoszono tylko 10 µl mieszaniny kwasów w obu etapach rozwijania dwukierunkowego. Każdorazowo użyto 50 ml fazy ruchomej. Chromatogramy rozwijano na wysokość 9 cm. Po wysuszeniu, w celu wizualizacji plamek badanych związków, chromatogramy spryskiwano 10% wodnym roztworem H2SO4 i ogrzewano przez 20 minut w temp. 120oC. Rozdział mieszaniny kwasów żółciowych techniką RP –TLC (rozwijanie jednokierunkowe) W badaniach zastosowano płytki aluminiowe RP-18F254 (Art. 1.05559) o wymiarach 10cm×10cm. Mieszaninę metanol-kwas octowy- woda w ilości 50 ml użyto jako fazę ruchomą w następujących stosunkach objętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 35:5:0, 25:5:20, 25:20:8, 22:22:5 i 25:20:5 (v/v/v). Chromatogramy rozwijano w komorze firmy Camag na wysokość 9 cm. Na płytki nanoszono 10 µl mieszaniny i 3 µl roztworów badanych kwasów. Wizualizacji plamek badanych kwasów dokonywano za pomocą 10% H2SO4. Ocena rozdziału taurynowych połączeń badanych kwasów żółciowych Efekt rozdziału badanej mieszaniny oceniano za pomocą wartości współczynników rozdziału tj. ∆RF i RS [6] obliczonych na podstawie otrzymanych chromatogramów wg wzorów: ∆RF=RF2 – RF1 (1) gdzie: RF1 i RF2 są wartości RF dwóch sąsiadujących ze sobą plamek na chromatogramie, a RF2> RF1. a Rs = 2x – b (2) a- odległość pomiędzy środkami dwóch sąsiadujących plamek [cm] b- suma szerokości obu plamek w kierunku rozwijania [cm] Wyniki i omówienie wyników Prezentowana praca miała na celu opracowanie optymalnych warunków chromatograficznych pozwalających na całkowity rozdział i identyfikację taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych, tj. kwasu TCA, TDCA, TCDCA i TLCA. Badania przeprowadzono techniką chromatografii cienkowarstwowej w normalnym układzie faz (NP-TLC) przy użyciu mieszaniny n- heksan– octan etylu– kwas octowy w następujących stosunkach objętościowych: 25:20:8 i 22:22:5 oraz chloroform –metanol- kwas octowy w stosunku objętościowym: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5, 45:0:5, 40:5:5, 37,5:13,5:1,55 (v/v/v) jako fazy ruchomej. Mieszaninę kwasów TCA+ TDCA+ TCDCA+ TLCA roz- dzielano na płytkach chromatograficznych pokrytych żelem krzemionkowym 60F254 i 60 produkcji E. Merck (Art. 1.05554, Art. 1.05715 i Art. 1.05553). Rozdział mieszaniny badanych kwasów oceniano na podstawie wartości współczynników rozdziału: ∆RF i RS wyznaczonych dla trzech par badanych kwasów żółciowych tj. TCA/TDCA, TDCA/ TCDCA i TCDCA/TLCA w zastosowanych warunkach chromatograficznych. Za kryterium całkowitego rozdziału każdej z par badanych kwasów żółciowych przyjęto wartości ∆RF≥0.05 i RS>1 [6,7]. Z przeprowadzonych badań rozdziału mieszaniny kwasów techniką NP -TLC z użyciem fazy ruchomej chloroform –metanol- kwas octowy w różnym stosunku objętościowym wynika, że żadne z zastosowanych warunków chromatograficznych nie pozwalają na całkowity rozdział wszystkich trzech par badanych kwasów. Użyte płytki chromatograficzne (Art. 1.05554, Art. 1.05715 i Art. 1.05553) i mieszanina chloroform –metanol- kwas octowy w stosunkach objętościowych: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5 i 37,5:13,5:1,55 (v/v/v) pozwoliły na rozdział tylko dwóch spośród trzech par badanych kwasów żółciowych tj. TCA/TDCA i TCDCA/TLCA, dla których otrzymano ∆RF≥0.05 i RS>1. Modyfikacja zastosowanych płytek chromatograficznych za pomocą 5% wodnego roztworu CuSO4×5H2O nieznacznie tylko polepszyła rozdział pary kwasów TDCA i TCDCA. Natomiast stosowane płytki i mieszanina chloroform –metanol- kwas octowy w stosunku objętościowym 45:5:5 (v/v/v) pozwalają na rozdział tylko jednej pary badanych kwasów TCDCA/TLCA. Zupełnie nie przydatna do rozdziału badanej mieszaniny kwasów okazała się również faza ruchoma: chloroform –metanol-kwas octowy 40:0:5 (v/v/v) oraz n- heksan –octan etylu –kwas octowy w obu zastosowanych stosunkach objętościowych tj. 25:20:8 i 22:22:5 (v/v/v). Dla tych warunków chromatograficznych brak jest rozdziału żadnej z par kwasów (∆RF dla wszystkich par kwasów wynosi 0). Przykładowy chromatogram otrzymany techniką NP-TLC przedstawiono na rys. 2. Sugerując się wynikami wcześniejszych badań nad wolnymi i sprzężonymi z glicyną kwasami żółciowymi, w kolejnym etapie przeprowadzono rozwijanie dwukierunkowe omawianej mieszaniny taurynowych połączeń kwasów żółciowych, czyli techniką 2D- TLC. W tym celu zastosowano płytki chromatograficzne Art. 1.05715 i mieszaninę izooktan –octan etylu-kwas octowy w stosunku objętościowym 5:4:1 (v/v/v) jako fazę ruchomą w pierwszym kierunku rozwijania. Natomiast w drugim kierunku rozwijania (prostopadłym do pierwszego) użyto fazę ruchomą chloroform –woda-kwas octowy- n- butanol w stosunku objętościowym TLCA TDCA + TCDCA TCA Rys. 2. R 0 ozdział mieszaniny taurynowych połączeń kwasów żółciowych (M) na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym 60F254 (E. Merck, Art. 1.05715) rozwijanych przy użyciu fazy ruchomej: chloroform -metanol –kwas octowy w stosunku objętościowym: 35:10:5 (v/v/v). 23 Farm Przegl Nauk, 2009,5 2:1:1:16 (v/v/v/v). Niestety, tak jak w przypadku rozwijania jednokierunkowego, rozdziałowi uległy dwie pary kwasów TCA i TDCA oraz TCDCA i TLCA. Brak natomiast jest rozdziału kwasu TDCA od TCDCA. Oprócz techniki chromatograficznej w normalnym układzie faz, do rozdziału mieszaniny kwasów zastosowano płytki chromatograficzne RP-18F254 (E. Merck, Art. 1.05559) czyli z odwróconym układem faz. Mieszaninę: metanolkwas octowy- woda w następujących stosunkach objętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 35:5:0, 25:5:20, 25:20:8, 22:22:5 i 25:20:5 (v/v/v) użyto jako fazy ruchome. Ocenę rozdziału trzech par badanych kwasów żółciowych dokonywano na podstawie wartości współczynników rozdziału: ∆RF i RS. Za najbardziej optymalne fazy ruchome tj. pozwalające na rozdział tylko dwóch par badanych kwasów żółciowych TCA/TDCA i TCDCA/TLCA uznano mieszaninę: metanol-kwas octowy-woda w stosunkach ob- jętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 25:5:20 i 25:20:8. Natomiast żadna z zastosowanych faz ruchomych nie pozwoliła na całkowity rozdział wszystkich trzech par badanych kwasów techniką RP- TLC. Problem, podobnie jak w przypadku rozdziału w normalnym układzie faz, stanowiła separacja kwasu TDCA od TCDCA. Dla tej pary kwasów bez względu na zastosowane warunki chromatograficzne uzyskiwano parametry chromatograficznego rozdziału poza kryterium rozdziału tj. ∆RF<0.05 i RS<1. W celu uzasadnienia przyczyny trudności w uzyskaniu całkowitego rozdziału kwasu taurodeoksycholowego (TDCA) od taurochenodeoksycholowego (TCDCA) techniką NP-TLC i RP-TLC otrzymane obiema technikami chromatograficznymi współczynniki retencji chromatograficznej (RF) omawianych kwasów, czyli TDCA i TCDCA porównano za pomocą analizy skupień (rys. 3 i 4). Zaprezentowane na poniższych rysunkach dendrogramy dowodzą, że przyczyną trudności w separacji kwasu TDCA i TCDCA jest niewątpliwie duże podobieństwo w wartościach RF obu kwasów otrzymane metodą chromatografii cienkowarstwowej NP-TLC i RP-TLC (na prezentowanych w pracy dendrogramach te dwa kwasy tworzą wyraźne skupienie). Wnioski Rys. 3. D 0 endrogram podobieństwa rozdziału taurynowych połączeń kwasów żółciowych techniką NP- TLC na płytkach szklanych pokrytych żelem krzemionkowym 60F254 (E. Merck, Art. 1.05715) przy użyciu fazy ruchomej: chloroform -metanol –kwas octowy w stosunkach objętościowych: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5, 45:0:5, 40:5:5, 37,5:13,5:1,55 (v/v/v). Przeprowadzone badania pozwoliły sformułować następujące wnioski: • chromatografia cienkowarstwowa w normalnym i odwróconym układzie faz (NP-TLC i RP-TLC) może być przydatna do rozdziału wybranych taurynowych połączeń kwasów żółciowych z ich mieszaniny, • największe trudności w rozdziale mieszaniny kwasów żółciowych związanych z tauryną techniką chromatografii cienkowarstwowej obserwuje się w przypadku separacji kwasu taurodeoksycholowego od taurochenodeoksycholowego, • zarówno modyfikacja powierzchni płytek chromatograficznych za pomocą CuSO4, jak i rozwijanie dwukierunkowe nie poprawiają znacząco efektu rozdziału kwasu taurodeoksycholowego od taurochenodeoksycholowego (TDCA od TCDCA), • techniki chemometryczne, do których należy analiza skupień są pomocne w ocenie separacji mieszaniny taurynowych połączeń kwasów żółciowych, • chromatografia cienkowarstwowa (TLC) może znaleźć praktyczne zastosowanie w analityce wybranych kwasów żółciowych obecnych w żółci ludzkiej. Piśmiennictwo Rys. 4. 0Dendrogram podobieństwa rozdziału taurynowych połączeń kwasów żółciowych techniką RP- TLC na płytkach aluminiowych RP-18F254 (E. Merck, Art. 1.05559) przy użyciu mieszaniny: metanol-kwas octowy- woda w stosunkach objętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 35:5:0, 25:5:20, 25:20:8, 22:22:5 i 25:20:5 (v/v/v) jako fazy ruchomej. 24 1. Gumińska M. Zarys biochemii ogólnej dla studentów farmacji i analityki medycznej. Wydaw. Uniwersytetu Jagiellońskiego Kraków 1998. 2. Radziwon A.I., Zarzycki P. K. Budowa, biosynteza oraz zastosowanie kwasów żółciowych jako leków. Farm. Pol. 2004; T. 60(18): 869-873. 3. Orłowski W. Nauka o chorobach wewnętrznych. T. VI. Wydaw. PZWL Warszawa 1988. 4. Lorenc J. Kliniczne aspekty metabolizmu kwasów żółciowych. Diagn. Lab. 1996; 32: 285-295. copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 5. Scalia S. Bile acids separation. J. Chromatogr. B. 1985; 671: 299-317. 6. Pyka A., Dołowy M. Separation of selected bile acids by TLC. III. Separation on various stationary phases. J. Liq. Chromatogr. & Rel. Technol. 2004; 27(16): 2613-2623. 7. Pyka A., Dołowy M. Separation of selected bile acids by TLC. VII. Separation by reversed partition HPTLC. J. Liq. Chromatogr. & Rel. Technol. 2005; 28(10): 1573-1581. 8. Pyka A., Dołowy M. Separation of selected bile acids by TLC. II. One dimensional and two-dimensional TLC. J. Liq. Chromatogr. & Rel. Technol. 2004; 27(13): 2031-2038. 9. Dołowy M., Bat. B., Niestrój A. Application of NP-TLC with densitometric detection for separation and quantitative analysis of unconjugated bile acids presented in human bile. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2009; 32 (1): 144-153. 10.Dołowy M. Badanie tożsamości kwasu ursodeoksycholowego w wybranych preparatach farmaceutycznych techniką NP- TLC. Farm. Pol. 2008; T.64 (17): 753758. 11.Dołowy M. Rozdział mieszaniny wybranych kwasów żółciowych techniką TLC na płytkach aluminiowych pokrytych mieszaniną żelu krzemionkowego 60 i ziemi okrzemkowej F254 impregnowanych kationami Cu[II], Ni [II], Fe[II] oraz Mn[II]. Farm. Przegląd. Nauk. 2008; 2: 34-37. 12.Dołowy M. Chromatograficzna analiza jakościowa taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych. Aktualne problemy chemii analitycznej. 3 Seminarium Naukowe. Wydaw. Górnośląskie Towarzystwo Przyjaciół Nauk im. W. Roździeńskiego. Katowice 2009: 19. Adres do korespondencji: Małgorzata Dołowy Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Ogólnej i Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec, e-mail: [email protected] 25 Farm Przegl Nauk, 2009,5, 26-32 Charakterystyka bakterii rodzaju Desulfovibrio z uwzględnieniem ich potencjalnie patogennego wpływu na organizm człowieka i zwierząt oraz możliwości leczenia zakażeń wywołanych przez te mikroorganizmy Characteristics of the Desulfovibrio genus with regard to its potential pathogenic influence on human and animal body, and the possible treatment of infections caused by these microorganisms Joanna Szczerba, Arkadiusz Gruchlik, Zofia Dzierżewicz Katedra i Zakład Biofarmacji, Śląski Uniwersytet Medyczny Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Kierownik Katedry: Prof. Dr hab. Zofia Dzierżewicz Streszczenie Bakterie redukujące siarczany (BRS) należą do zróżnicowanej pod względem morfologii, aktywności metabolicznej oraz wymagań odżywczych grupy beztlenowych mikroorganizmów charakteryzujących się zdolnością przeprowadzania procesu dysymilacyjnej redukcji związków siarki. Izoluje się je z tak odmiennych środowisk, jak np. jelito grube ssaków oraz z gleb i wód naturalnych. Przez wiele lat BRS traktowano jako mikroorganizmy środowiskowe, obecnie uważa się, że stanowią integralny składnik flory fizjologicznej jelita grubego, a ostatnio w piśmiennictwie naukowym pojawiły się doniesienia o ich obecności w jamie ustnej. Spośród BRS rodzaj Desulfovibrio jest najlepiej poznanym i opisanym rodzajem ze względu na powszechność jego izolacji z organizmu ludzkiego oraz potencjalnie patogenny wpływ na człowieka oraz zwierzęta. Rodzaj ten należy do podjednostki delta typu Proteobacteria, a gatunki wchodzące w jego skład zaliczane są do bakterii Gram-ujemnych, beztlenowych, charakteryzujących się powolnym wzrostem w warunkach in vitro. Ze względu na toksyczność siarkowodoru wydzielanego przez bakterie rodzaju Desulfovibrio możemy domniemywać o ich szkodliwym wpływie na organizm człowieka. Należy więc zastanowić się nad możliwością i zasadnością stosowania chemioterapeutyków zwalczających te bakterie. Liczba publikacji uwzględniająca sposób zwalczania infekcji bakterii Desulfovibrio jest uboga, a poza tym jest wiele rozbieżności w tym zakresie, jakkolwiek wielu autorów wskazuje imipenem oraz metranidazol jako chemioterapeutyki skuteczne w zwalczaniu bakterii Desulfovibrio. Słowa kluczowe: bakterie redukujące siarczany (BRS), rodzaj Desulfovibrio, siarkowodór, patogen, metranidazol, imipenem 26 Summary Sulphate-reducing bacteria (SRB) belong to the heterogeneous group of anaerobic microorganisms which differ in their morphology, metabolic activity and nutrients requirements. They share ability to dissimilate sulphur reducing. These bacteria have been isolated from such different sources as the digestive tract of mammalians and the soil and aquatic habitats. SRB for many years were consider as a environmental microorganisms, currently are known that they common occur in the large bowel, as well as, in the human oral cavity. Bacteria of Desulfovibrio genus are the best known and the most thoroughly studied among the SRB for the regard of common isolation from human body and possible pathological influence on the human and animal organisms. The Desulfovibrio bacteria belong to the delta subdivision of Proteobacteria and the species of this genus are the Gram negative, anaerobic, characterized by slow multiplication. The toxicity of hydrogen sulphide and possibility of harmful influence on the human organism of Desulfovibrio genus suggest that it is worth consider the ability and the purposefulness of treatment infections caused by these bacteria. There is a lot of discrepancies in rare literature concerning of control of Desulfovibrio infections, but many authors suggest the therapy with imipenem or metronidazole. Key words: sulphate reducing bacteria (SRB), Desulfovibrio genus, hydrogen sulfide, pathogen, metronidazole, imipenem copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Bakterie redukujące siarczany – ogólna charakterystyka z uwzględnieniem miejsca ich występowania Bakterie redukujące siarczany (BRS) to duża i zróżnicowana grupa beztlenowych mikroorganizmów, których cechą wspólną jest zdolność dysymilacyjnej redukcji związków siarki. Do grupy tych bakterii zaliczamy rodzaje: Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfomicrobium, Desulfobacterium, Desulfomonas, Desulfobulbus, Dfesulfococcus, Desulfonema i Desulfosarcin, Thermodesulfobacterium (ryc. 1), różniące się morfologią, aktywnością metaboliczną, środowiskiem bytowania oraz zdolnością do wykorzystywania różnych źródeł węgla [1]. Różnice te wynikają z charakteru zasiedlanych nisz przez poszczególne rodzaje. BRS izolowane są z bardzo różnych środowisk począwszy od jelita grubego ssaków [2], aż po miejsca pozbawione dostępu tlenu w obrębie gleby, błota [3], osadów przybrzeżnych i morskich [4, 5, 6] oraz osadów przy ujściach rzek [7]. Mikroorganizmy te występują również w wodach rzecznych oraz morskich [8], a także mułach ściekowych [9], bagnach i moczarach [10]. W organizmach żywych obecność BRS odnotowuje się nie tylko w jelicie grubym człowieka [11, 12], ale także w jelicie grubym kotów [13], chomików, fretek [14], myszy [15], a nawet chrząszczy [16]. Rola BRS w środowisku naturalnym jest dobrze poznana i scharakteryzowana, natomiast ich funkcja w ekosystemie jelita grubego pozostaje nadal niewyjaśniona. Ponadto, w literaturze pojawiają się coraz częściej doniesienia o obecności tych bakterii w materiale klinicznym różnego pochodzenia. Spośród BRS rodzaj Desulfovibrio jest najlepiej poznanym i opisanym ze względu na powszechność jego izolacji z organizmu ludzkiego i zwierzęcego [1, 2, 17]. Celem niniejszego opracowania jest zwrócenie uwagi na możliwość szkodliwego wpływu mikroorganizmów rodzaju Desulfovibrio na organizm człowieka, a także na sposoby eradykacji tych mikroorganizmów. większości tych mikroorganizmów. Desulfovibrio spp. rosną stosunkowo wolno, w warunkach in vitro, kolonie pojawiają się w przeciągu 4-7 dni od posiewu na powierzchni agaru. Trudno je zidentyfikować i łatwo je przeoczyć w kulturach mieszanych. Komórki bakterii Desulfovibrio występują zwykle pojedynczo, ale w pewnych stadiach wzrostu mogą tworzyć formy łańcuchów złożonych od dwóch do kilku komórek [23]. Najczęściej mają zakrzywiony lub przecinkowaty kształt z polarnie wyrastającą wicią bez osłonki [24, 25]. Charakteryzują się obecnością desulfowirydyny, niezdolnością do wytwarzania spor [26] oraz dużą ruchliwością [23]. Długość komórek waha się w granicach 2-4 µm, a średnica 0.75-1.0 µm [27]. Potencjał patogenny rodzaju Desulfovibrio W 1974 roku Moore i wsp. [28] oraz Beerens i Romond [29] opisali przypadki obecności BRS w jelicie grubym człowieka, gdzie Desulfovibrio desulfuricans był gatunkiem dominującym. Od początku lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku zaczęło się pojawiać coraz więcej doniesień dotyczących obecności bakterii Desulfovibrio w jelicie grubym [11, 30], a występowanie siarczków w kale oraz siarkowodoru w gazach jelitowych zaczęto łączyć z zależnym od Desulfovibrio procesem dysymilacyjnej redukcji siarczanów. Na podstawie dotychczas opublikowanych prac trudno jest jednoznacznie orzec o konsekwencjach aktywności metabolicznej bakterii rodzaju Desulfovibrio w jelicie grubym, jednak główny produkt dysymilacyjnej redukcji siarczanów to jony S2-, które w postaci siarkowodoru H2S są wysoce toksyczne dla organizmów żywych. W środowisku wodnym tworzą trudno rozpuszczalne sole z jonami metali ciężkich, nierzadko o budowie krystalicznej, mogące mechanicznie drażnić śluzówkę jelita. Ponadto H2S może zaburzać metabolizm komórek nabłonkowych jelita grubego, hamując β-oksydację kwasu n-masłowego, będącego ich podstawowym źródłem ener- Cechy charakterystyczne rodzaju Desulfovibrio Rodzaj Desulfovibrio należy do podjednostki delta typu Proteobacteria [18, 19] do którego zalicza się około 30 gatunków, między innymi: D. desulfuricans, D. vulgaris, D. salexigens, D. africanus, D. gigas, D. baculatus, D. sapovorans, D. baarsii, D. thermophilus, D. fairfieldensis, D. gabonensis, D. piger, D. profundus, D. aosterae, D. burkinensis, D. longus, D. orale oraz D. aespoeensis [2]. Bakterie rodzaju Desulfovibrio zaliczane są do beztlenowych, Gram-ujemnych bakterii, charakteryzujących się zdolnością przeżycia przy krótkotrwałej ekspozycji na tlen [20]. Cypionka [21] oraz Morgensen i wsp. [22] twierdzą nawet, iż niektóre gatunki są zdolne redukować tlen, jakkolwiek, w czystych kulturach pierwiastek ten hamuje lub uniemożliwia wzrost Ryc. 1. Zależności filogenetyczne bakterii redukujących siarczany (BRS) oparte na analizie sekwencji genu 16S rRNA ([23]; w modyfikacji własnej). 27 Farm Przegl Nauk, 2009,5 gii [31, 32]. Konsekwencją tego procesu jest zahamowanie syntezy lipidów, mucyny oraz upośledzenie mechanizmów detoksykacyjnych, co pośrednio może odgrywać istotna rolę w inicjacji i prolongacji stanów zapalnych w obrębie jelita grubego [32]. Gibson i wsp. [30] wykazali, iż rodzaj Desulfovibrio stanowi około 66% całej populacji BRS u osób zdrowych i około 92 % u osób z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy. Na podstawie swoich badań wysunęli hipotezę, iż bakterie tego rodzaju mogą brać udział w etiopatologii wrzodziejącego zapalenia jelita grubego i choroby Crohna. Również Loubinox i wsp. [36] stwierdzili, iż liczebność gatunku Desulfovibrio piger była znacząco większa (55%) wśród pacjentów cierpiących na wrzodziejące zapalenie okrężnicy w porównaniu do osób zdrowych (12%). Natomiast Pitcher i wsp. [32] nie odnotowali istotnych różnic w liczebności BRS zasiedlających jelito grube pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy oraz jelito osobników zdrowych. Ci sami autorzy sugerują, iż potencjał patogenny może zależeć od szczepu oraz jego aktywności metabolicznej. Wykazali, że wśród pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego dominują szybko rosnące szczepy Desulfovibrio desulfuricans. Zinkovich i Beech [34] również uważają, że udział BRS we wrzodziejącym zapaleniu okrężnicy może mieć związek z fizjologicznymi różnicami pomiędzy szczepami należącymi do tego samego gatunku. Nadal nie wiadomo czy BRS są bezpośrednią przyczyną schorzeń jelita grubego czy przyczyniają się do ich chronicznego przebiegu [37]. Wyjaśnienie roli jaką BRS pełnią w okrężnicy jest niezmiernie ważne, ze względu na fakt, iż choroby jelita grubego zajmują jedno z czołowych miejsc wśród dolegliwości związanych z układem pokarmowym, szczególnie w krajach wysokorozwiniętych. Jelito grube nie jest jedynym miejscem bytowania BRS w ciele człowieka, bakterie te izoluje się także z materiału klinicznego różnego pochodzenia. Porschen i Chan [35] wyizolowali bakterie rodzaju Desulfovibrio z dróg żółciowych pacjenta z posocznicą. Lozniewski i wsp. [36] opisał przypadek izolacji gatunku rodzaju Desulfovibrio z ropnia mózgu, a Tee i wsp. [26] z ropnia wątroby (ryc. 2). BRS wyosobniono również z ropni jamy brzusznej [1] oraz wyrostka robaczkowego z przewlekłym stanem zapalnym [37] (ryc. 2). Stosunkowo często odnotowywane są przypadki bakteriemii wywołane zakażeniami Desulfovibrio, najczęściej z powodu obecności we krwi gatunku D. fairfieldensis [17, 27, 38, 39]. Goldstein i wsp. [2] stwierdzili przypadek bakteriemii u człowieka, a Shukla i Reed [25] u psa, wywołany przez D. desulfuricans. W piśmiennictwie pojawia się coraz więcej doniesień o obecności BRS w jamie ustnej człowieka [40-47]. Lotne związki siarki (siarkowodór, siarczek dimetylu, merkaptan metylu) wydzielane przez BRS mogą być przyczyną nieświeżego oddechu, co jest głównym objawem halitozy [44]. Bardzo prawdopodobne jest również, iż BRS mogą należeć do czynników etiologicznych w chorobach przyzębia, a zwłaszcza parodontozie [42, 43, 46-50]. Boopathy i wsp. [42] u osób z zaawansowaną parodontozą, z tkanek poddziąsłowych, wyizolowali czystą kulturę bakterii rodzaju Desulfovibrio. Również Lagendijk i wsp. [46] wyodrębnili 10 różnych szczepów BRS od osób cierpiących na tą chorobę. Loubinoux 28 Ryc. 2. Miejsca izolacji bakterii Desulfovibrio z organizmu ludzkiego z podaniem dat publikacji, które ukazały się w bazie PubMed i wsp. [44] uzyskali osiem różnych izolatów BRS z kieszonek przydziąsłowych od pięciu z siedmiu badanych pacjentów. Wyizolowane szczepy zaliczono do Desulfovibrio fairfirldensis, które wraz z Desulfomicrobium orale są najczęściej izolowanymi BRS od osób cierpiących z powodu parodontozy. Lagendjik i wsp. [50] oraz Vianna i wsp. [47] zaobserwowali korelację pomiędzy ilością BRS, a krwawiącymi kieszonkami dziąsłowymi z kątowym ubytkiem kości, jak również głębokością samych kieszonek. Zmniejszenie krwawienia oraz redukcję głębokości kieszonek zaobserwowano po eliminacji BRS [48]. Reasumując, bakterie rodzaju Desulfovibrio możemy rozpatrywać jako potencjalne patogeny, a zwłaszcza gatunki ,takie jak: D. piger, D. fairfieldensis oraz D. desulfuricans [1, 2, 17, 33]. Według Schoenborn i wsp. [24] mogą one należeć do tzw. oportunistycznych patogenów, dla których najważniejszym czynnikiem umożliwiającym im przetrwanie w zainfekowanych tkankach jest ich względna tolerancja na tlen. Warto także podkreślić, że udział BRS w infekcjach jest nadal niedoszacowany z powodu powolnego wzrostu kolonii tych bakterii w hodowlach in vitro oraz trudnej ich identyfikacji. Dalsze badania mające na celu cenę roli tych mikroorganizmów w różnego rodzaju infekcjach są konieczne, a coraz prężniej rozwijająca się biologia molekularna stwarza możliwość łatwej, szybkiej i wiarygodnej ich identyfikacji. Lipopolisacharydy jako jeden z czynników wirulencji bakterii Desulfovibrio Integralnym składnikiem błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych, w tym również rodzaju Desulfovibrio, jest kompleks lipopolisacharydowy (LPS) zwany także endotok- copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 syną. LPS jest immunogenem stymulującym uwalnianie cytokin, chemokin, cząsteczek adhezyjnych oraz reaktywnych form tlenu przez komórki układu odpornościowego. Wysokie stężenia LPS-ów oddziaływują negatywnie na organizm człowieka. Mogą indukować procesy zapalne, powodować hiperglikemię, hipotensję, odczyn Schwartzmana, nekrozę komórek szpiku kostnego, leukopenię czy leukocytozę, a po przedostaniu się do krwi wstrząs septyczny [51]. Stosunkowo niewiele wiadomo o wpływie endotoksyn bakterii Desulfovibrio na organizm człowieka i zwierząt. Dzierżewicz i wsp. [51] wykazali obniżenie aktywności metabolicznej oraz zahamowanie wzrostu komórek fibroblastów linii V-79 izolowanej od chomika chińskiego pod wpływem LPS-ów bakterii D. desulfuricans. Dłuższa inkubacja prowadziła do apoptozy tych fibroblastów, zatem lipopolisacharydy BRS mogą oddziaływać na wewnątrzkomórkowe procesy związane z odnową i proliferacją komórek. Węglarz i wsp. [52, 53] udokumentowali wpływ LPS-ów D. desulfuricans na zwiększoną sekrecję IL-6 oraz IL-8 w transformowanych komórkach nabłonkowych linii Caco-2. Ponieważ istnieje wyraźny związek pomiędzy zjadliwością bakterii, a budową ich lipopolisacharydów, określenie struktury endotoksyn bakterii Desulfovibrio pomogłoby uzupełnić wiedzę o ich wpływie na organizm ludzki. Integralną częścią lipopolisacharydów jest lipid A. Aktywność biologiczna endotoksyn zależy w bardzo dużym stopniu od konformacji tego lipidu, a zwłaszcza rozmieszczenia reszt kwasów tłuszczowych w jego obrębie. Nie bez znaczenia jest także struktura regionu rdzeniowego oraz łańcucha O-swoistego. Mutanty pozbawione łańcucha O-swoistego cechuje mniejsza patogenność w stosunku do posiadających go tzw. form gładkich. Istnieje niewiele publikacji dotyczących struktury LPS-ów bakterii Desulfovibrio. Gaylarde i Beech [54] odkryli, że w skład lipidu A wchodzi kwas heptadecenowy, oktadec-8-enowy, oktadec-9-enowy, oktadec-10-enowy, ejkozenowy, tetrakozenowy, a łańcuch O-swoisty tworzą: ramnoza, glukoza, galaktoa, mannoza i ryboza. Lodowska i wsp. [55] wykryli podobne cukry prócz rybozy w łańcuchu O-swoistym LPS-u D. desulfuricans, przy czym, największy udział procentowy przypadał dla galaktozy i ramnozy. Według Lodowskiej i wsp. [55] ryboza wykryta przez Gaylarde i Beech [54] pochodziła najprawdopodobniej z zanieczyszczeń LPS-ów kwasami nukleinowymi. Lodowska i wsp. [56], wykazali obecność kwasu 2-keto-3-deoksyoktonowego (KDO), cząsteczki która łączy lipid A z łańcuchem O-swoistym, który na podstawie swoich badań wykluczyli Gaylarde i Beech [54]. Wychodząc z założenia, iż KDO jest niestabilny i ulega rozkładowi podczas procesu derywatyzacji, Lodowska i wsp. [56] ocenili jego zawartość metodą spektrofotometryczną, potwierdzając otrzymany wynik dodatkowo chromatografią gazową. W każdym z badanych LPS-ów obecny był KDO, przy czym endotoksyny różnych izolatów różniły się jego zawartością (w zakresie od 0,48% do 2,86% suchej masy lipopolisacharydu). Autorzy uważają również, że badane endotoksyny różnią się liczbą podjednostek cukrowych budujących łańcuchy O-swoiste, co zostało potwierdzone elektroforetycznie [51]. Warto także podkreślić, iż wrażliwość na antybiotyki bakterii Gram-ujemnych jest skorelowana z długością łańcucha O-swoistego endotoksyny. Możliwości leczenia zakażeń wywołanych przez bakterie Desulfovibrio Bakterie z rodzaju Desulfovibrio można zaliczyć do tzw. bakterii oportunistycznych, które podczas spadku odporności mogą być przyczyną powstawania stanów zapalnych lub bakteriemii. Ponadto udowodniono ich niekorzystny wpływ na funkcjonowanie komórek nabłonkowych jelita [2, 17, 26, 36, 38, 39]. Ze względu na wydzielenie przez Desulfovibrio spp. toksycznych związków siarki, w tym przede wszystkim siarkowodoru, możemy wnioskować, iż bakterie te mogą mieć niekorzystny wpływ na zdrowie człowieka, a zwłaszcza ich zwiększona populacja w jelicie grubym i w jamie ustnej. W związku z tym, warto zastanowić się nad możliwością i zasadnością stosowania chemioterapeutyków zwalczających te bakterie lub ograniczających ich rozwój. Jednym z podstawowych leków stosowanych w chorobach zapalnych jelita, takich jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego czy choroba Crohna jest należąca do proleków sulfasalazyna (SAS). Po dostaniu się do jelita, dzięki aktywności bytujących tam bakterii, dochodzi do redukcji wiązania azowego w obrębie SAS. Produktami tej reakcji są kwas 5-aminosalicylowy (5-ASA) i sulfapirydyna (SP). West i wsp. [58] oraz Pitcher i wsp. [32] zaobserwowali, iż 5-ASA hamował syntezę siarkowodoru w okrężnicy. Efekt ten prawdopodobnie nie był związany z zahamowaniem wzrostu i proliferacji BRS, a jedynie z zahamowaniem ich zdolności do redukcji nieorganicznych związków siarki [32]. Zmniejszenie wydzielania siarkowodoru o prawie 90% zaobserwowano przy stężeniach 1mM i 5mM sulfasalazyny oraz przy 20mM stężeniu jej metabolitu 5-ASA [59]. Szczepy Desulfovibrio desulfuricans izolowane z przewodu pokarmowego człowieka okazały się wrażliwe na SAS oraz kwas 5-aminosalicylowy. Badane izolaty różniły się stopniem wrażliwości na wspomniane terapeutyki. SAS skuteczniej hamowała podziały bakterii niż 5-ASA. Sulfapirydyna natomiast nie wykazywała żadnego negatywnego działania w stosunku do badanych szczepów D. desulfuricans [60]. Stosunkowo mało wiadomo na temat wrażliwości bakterii rodzaju Desulfovibrio na powszechnie stosowane leki przeciwdrobnoustrojowe. Generalnie leczenie infekcji wywołanych przez bakterie beztlenowe jest niezwykle trudne. Aminoglikozydy, połączenie trimetoprimu z sulfametoksazolem, większość chinolonów oraz monobaktamów słabo oddziałuje na bakterie anaerobowe [61]. W związku z pojawiającymi się publikacjami o szkodliwym wpływie bakterii Desulfovibrio na organizm człowieka zaczęto badać te drobnoustroje pod kontem ich wrażliwości na antybiotyki, aby ustalić możliwości ich zwalczania. Szczepy D. fairfieldensis okazały się wrażliwe na imipenem, metrodidazol [17, 62], ciprofloksacynę, chloramfenikol oraz klindamycynę [2], natomiast penicylina G, piperacylina oraz cefoksytyna nie miały żadnego wpływu na te bakterie [17]. Zbadano również wrażliwość większości szczepów jelitowych z gatunku D. desulfuricans na powszechnie stosowane chemioterapeutyki. Dzierżewicz i wsp. [57] zaobserwowali oporność wszystkich badanych izolatów na penicylinę, cefoksytynę, klindamycynę, metronida- 29 Farm Przegl Nauk, 2009,5 zol, erytromycynę, rifampicynę oraz teicoplanin. Większość z nich była wrażliwa na tikarcylinę, mezlocylinę, piperacylinę, cefoperazon, chloramfenikol, ampicylinę, cefotaksim i moksalaktam, a tylko niektóre na amoksycylinę, cefamandol, cefotetan, ceftyzoksym, tetracyklinę oraz wankomycynę. Ponadto odnotowano, iż doksycyklina daje dobre efekty w zwalczaniu infekcji wywołanych przez bakterie rodzaju Desulfovibrio [2, 25], natomiast są one oporne na kolistynę [1]. Według Warren’a i wsp. [1] opornośc na kolistynę jest cechą charakterystyczną dla Desulfovibrio i pozwala łatwo go odróżnić od fenotypowo podobnych rodzajów, takich jak: Campylobacter czy Bilophila. Z uwagi na problem, jakim jest szybko rosnąca oporność bakterii na antybiotyki, zaleca się rozsądne i przemyślane ich stosowanie. Bakterie Desulfovibrio niejednokrotnie były jedyną przyczyną powstawania stanów zapalnych lub bakteriemii u ludzi i zwierząt [1, 2, 20, 28, 29, 30, 41, 42] w związku z czym w pewnych wypadkach, jeśli grożą poważne konsekwencje kliniczne wydaje się uzasadnione ich zwalczanie przy użyciu antybiotyków. Piśmiennictwo: 1. Warren Y.A., Citron D.M., Merriam C.V., Goldstein E.J.: Biochemical differentiation and comparison of Desulfovibrio species and other phenotypically similar genera. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 4041-4045. 2. Goldstein E.J.C., Citron D.M., Peraino V.A., Cross S.A.: Desulfovibrio desulfuricans bacteremia and review of human Desulfovibrio infections. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 2752-2754. 3. Postgate J.R.: The sulphate reducing bacteria. Cambridge Univ. Press. 1984. 4. Haouari O., Fardeau M.L., Casalot L., Tholozan J.L., Hamdi M., Ollivier B.: Isolation of sulfate-reducing bacteria from Tunisian marine sediments and description of Desulfovibrio bizertensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006; 56: 2909-2913. 5. Bottcher M., Hespenheide B., Brumsack H.J., Bosselmann K.: Stable isotope biogeochemistry of the sulfur cycle in modern marine sediments: I. Seasonal dynamics in temperate intertidal sandy surface sediment. Isotopes Environ. Health Stud. 2004; 40: 267-283. 6. Perez-Jimenez J.R., Kerkhof L.J.: Phylogeography of sulfate-reducing bacteria among disturbed sediments disclosed by analysis of the dissimilatory sulfite reductase genes (dsrAB). Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71: 1004-1011. 7. Boyle A., Phelps C.D., Young L.Y.: Isolation from estaurine sediments of Desulfovibrio strain which can grow on lactate coupled to the reductive dehalogenation of 2,4,6-tribromophenol. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65: 1133-1140. 8. Nercessian O., Bienvenu N., Moreira D., Prieur D., Jeanthon C.: Diversity of functional genes of methanogens, methanotrophs and sulfate reducers in deep-sea hydrothermal environments. Environ. Microbiol. 2005; 7: 118-132. 9. Campbell L.L., Postgate, J.R. : Classification of the spore forming sulfate-reducing bacteria. Bac. Rev. 1965; 29: 359-363. 30 10.Edgcomb V.P., Mc Donald J.H., Devereux R., Smith D.W.: Estimation of bacterial cell numbers in humic acid-rich salt marsh sediments with probes directed to 16S ribosomal DNA. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65: 1516-1523. 11.Gibson G.R., Macfarlane G.T., Cumming J.H.: Occurrence of sulphate–reducing bacteria in human faeces and the relationship of dissimilatory sulphate reduction to methanogenesis in the large gut. J. Appl. Bacteriol. 1988; 65: 103 – 111. 12.Dzierżewicz Z., Cwalina B., Gawlik B., Wilczok T., Gonciarz Z.: Isolation and evaluation of susceptibility to sulphasalazine of Desulfovibrio desulfuricans strains from the human digestive tract. Acta Microbiol. Pol. 1997; 46: 175 – 187. 13.Inness V.L., McCartney A.L., Khoo C., Gross K.L., Gibson G.R.: Molecular characterisation of the gut microflora of healthy and inflammatory bowel disease cats using fluorescence in situ hybridisation with special reference to Desulfovibrio spp.: J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 2007; 91: 48-53. 14.Fox J.G., Dewhirst F.E., Fraser G.J., Paster B.J., Shames B., Murphy J.C.: Intracellular Campylobacter – like organism from ferrets and hamsters with proliferative bowel disease is a Desulfovibrio sp. J. Clin. Microbiol. 1994; 32: 1229 – 1237. 15.Deplancke B., Hristova K. R., Oakley H. A., McCracken V. J., Aminov R., Mackie R.I., Gaskons H. R.: Molecular ecological analysis of the succesion and diversity of sulfate–reducing bacteria in the mouse gastrointestinal tract. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 66: 2166 – 2174. 16.Droge S., Limper U., Emtiazi F., Schonig I., Pavlus N., Drzyzga O., Fischer U., Konig H.: In vitro and in vivo sulfate reduction in the contents of the termite Mastotermes darwiniensis and the rose-chafer Pachnoda marginata. J. Gen. Appl. Microbiol. 2005; 51: 57-64. 17.Loubinoux J., Mory F., Pereira I. A. C., La Faou A. E.: Bacteremia caused by a strain of Desulfovibrio related to the previsionally named Desulfovibrio fairfieldensis. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 931-934. 18.Ito T., Nielsen J.L., Okabe S., Watanabe Y., Nielsen P.H.: Phylogenetic identification and substrate uptake patterns of sulfate-reducing bacteria inhabiting an oxic-anoxic sewer biofilm determined by combinating microautoradiography and fluorescent in situ hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 2002; 68: 356- 364. 19.Devereux R., Delaney M., Widdel F., Stahl D.A.: Genus and group-specific hybridization probes for determinative and environmental studies of sulphate-reducing bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 1992; 15 : 601-609. 20.Lobo S.A., Melo A.M., Carita J.N., Teixeira M., Saraiva L.M.: The anaerobe Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 grows at nearly atmospheric oxygen levels. FEBS Lett. 2007; 6: 433-436. 21.Cypionka H.: Oxygen respiration by desulfovibrio species. Annu. Rev. Microbiol. 2000; 54: 827-848. 22.Morgensen G.L., Kjeldsen K.U., Ingvorsen K.: Desulfovibrio aerotolerans sp. nov., an oxygen tolerant sulphate-reducing bacterium isolated from activated sludge. Anaerobe. 2005; 11: 339-349. copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 23.Feio M.J., Beech I.B., Carepo M., Lopes J.M., Cheung C.W.S., Franco R., Guezennec J., Smith J.R., Mitchell J.I., Moura J.J. G., Lino A.R.: Isolation and characterisation of novel sulphate–reducing bacterium of the Desulfovibrio genus. Anaerobe. 1998; 4: 117 – 130. 24.Schoenborn L., Abdollahi H., Tee W., Dyall-Smith M., Janssen P.H.: A member of delta subgroup of Proteobacteria from a pyogenic liver abscess is a typical sulfate reducer of the genus Desulfovibrio. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 787 – 790. 25.Shukla S.K., Reed K.D.: Desulfovibrio desulfuricans bacteremia in a dog. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 1701 – 1702. 26.Tee W., Dyall–Smith M., Woods W., Eisen D.: Probable new species of Desulfovibrio isolated from a pyogenic liver abscess. J. Clin. Microbiol. 1996; 34: 1760–1764. 27.McDougall R., Robson J., Peterson D., Tee W.: Bacteremia caused by a recently described novel Desulfovibrio species. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 1805 – 1808. 28.Moore W.E.C., Holdeman L.V.: Human fecal flora: the normal flora of 20 Japanese-Hawaiians. Appl. Microbiol. 1974; 27: 961-979. 29.Beerens H., Romond C.: Sulfate-reducing bacteria in human feces. Amer. J. Clin. Nutr. 1977; 30: 1770 – 1776. 30.Gibson G.R., Cumming J.H, Macfarlane G.T.: Growth and activities of sulphate reducing bacteria in gut contents of healthy subjects and patients with ulcerative colitis. FEMS Microbiol. Ecol. 1991; 86: 103 – 112. 31.Ohge H., Furne J.K., Springfield J., Rothenberger D.A., Madoff R.D., Levitt M.D.: Association between fecal hydrogen sulfide production and pouchitis. Dis. Colon Rectum. 2005; 48: 469-475. 32.Pitcher M.C.L., Beatty E.R., Cummings J.H.: The contribution of sulphate reducing bacteria and 5–aminosalicylic acid to faecal sulphide in patients with ulcerative colitis. Gut. 2000; 46: 64 – 72. 33.Loubinoux J., Bronowicki J-P., Pereira I.A.C., Mougenel J-L., Le Faou A.E.: Sulfate-reducing bacteria in human feces and their association with inflammatory bowel diseases. FEMS Microbiol. Ecol. 2002; 40: 107-112. 34.Zinkovich V. i Beech I.B.: Screening of sulfate-reducing bacteria in colonoscopy samples from healthy and colitic human gut mucosa. FEMS Microbiol. Ecol. 2000; 34: 147-155. 35.Porschen R.K., Chan P.: Anaerobic vibrio–like organisms cultured from blood: Desulfovibrio desulfuricans and Succinivibrio species. J. Clin. Microbiol. 1977; 5: 444 – 447. 36.Lozniewski A., Maurer P., Schuhmacher H., Carlier J.P., Mory F.: First isolation of Desulfovibrio sp. as part of a polymicrobial infection from a brain abscess. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1999; 18: 602-603. 37.Baron E. J., Bennion R., Thompson J., Strong C., Summanen P., McTeagne M., Finegold S. M.: A microbiological comparison between acute and complicated appendicitis. Clin. Infect. Dis. 1992; 14: 227 – 231. 38.Pimentel J.D., Chan R.C.: Desulfovibrio fairfieldensis bacteremia associated with choledocholithiasis and endoscopic retrograde cholangiopancreatography. J. Clin. Microbiol. 2007; 45: 2747-2750. 39. Urata T., Kikuchi M., Hino T., Yoda Y., Tamai K., Ko- daira Y., Hitomi S.: Bacteremia caused by Desulfovibrio fairfieldensis. J. Infect. Chemother. 2008; 14: 368-370. 40.Willis C.L. Gibson G.R., Allison C., MacFarlane S., Holt J.S.: Growth, incidence and activities of dissimilatory sulfate-reducing bacteria in the human oral cavity. FEMS Microbiol. Lett. 1995; 129: 267-272. 41.Van der Hoeven J.S., van den Kieboom C.W., Schaeken M.J.: Sulfate-reducing bacteria in the periodontal pocket. Oral. Microbiol. Immunol. 1995; 10: 288-290. 42.Boopathy R., Robichaux M., LaFont D., Howell M.: Activity of sulfate-reducing bacteria in human periodontal pocket. Can. J. Microbiol. 2002; 48: 1099-1103. 43.Langendijk P.S., Kulik E.M., Sandmeier H., Meyer J., Van der Hoeven J.S.: Isolation of Desulfomicrobium orale sp nov and Desulfovibrio strain NY682, oral sulfate–reducing bactera involved in human peridontal disease. Intern. J. Sys. Evol. Microbiol. 2001; 51 : 1035 – 1044. 44.Loubinoux J., Bisson-Boutelliez C., Miller N., Le Faou A.E.: Isolation of the provisionally named Desulfovibrio fairfieldensis from human periodontal pockets. Oral Microbiol. Immunol. 2002; 17: 321-323. 45.Robichaux M., Howell M., Boopathy R.: Growth and activities of sulfate-reducing and methanogenic bacteria in human oral cavity. Curr Microbiol. 2003; 47: 12-16. 46.Langendijk P.S., Grimm W.D., van der Hoeven J.S.: Sulfate-reducing bacteria in relation with other potential periodontal pathogens. J. Clin. Periodontol. 2001; 28: 1151-1157. 47.Vianna M.E., Holtgraewe S., Seyfarth I., Conrads G., Horz H.P.: Quantitative analysis of three hydrogenotrophic Microbial Groups, methanogenic archea, Sulfatereducing bacteria and acetogenic bacteria within plaque biofolms associated with human periodontal disease. J. Bacteriol. 2008; 190: 3779-3785. 48.Langendijk P.S., Hanssen J.T.J., van der Hoeven J.S.: Decrease of sulfate-reducing bacteria after initial periodontal treatment. J. Dent. Res. 2001; 80: 1637-1642. 49.Grimm W.D., Cichon P., van der Hoeven J.S., Langendijk P.S., Smith F., Worley M.G., Schmitz I., Offenbacher S.: The influence of sulfate-reducing bacteria colonization of 2 different bioresorbable barrier membranes for GTR. An 18-month case-controlled microbiologic and clinical study. Int. J. Periodontics Restorative Dent. 2000; 20: 91-99. 50.Langendijk P.S., Hanssen J.T.J., van der Hoeven J.S.: Sulfate-reducing bacteria in association with human periodontitis. J.Clin. Periodontol. 2000; 27:943-950. 51.Dzierżewicz Z., Orchel A., Komarska-Szostak J., Wawszczyk J., Węglarz L., Szczerba J., Wilczok T.: Biological activity of endotoxins isolated from Desulfovibrio desulfuricans. Ann. Acad. Med. Siles. 2005; 59: 9-16. 52.Węglarz L., Dzierżewicz Z., Skop B., Orchel A., Parfiniewicz B., Wiśniowska B., Światkowska L., Wilczok T.: Desulfovibrio desulfuricans lipopolysaccharides induce endothelial cell IL-6 and IL-8 secretion and E-selectin and VCAM-1 expression. Cell Mol. Biol. Lett. 2003; 8: 991-1003. 31 Farm Przegl Nauk, 2009,5 53.Węglarz L., Wawszczyk J., Orchel A., Jaworska-Kik M., Dzierżewicz Z.: Phytic acid modulates in vitro IL-8 and IL-6 release from colonic epithelial cells stimulated with LPS and IL-1 beta. Dig. Dis. Sci. 2007; 52: 93-102. 54.Gaylarde C.C., Beech I.B.: Short communication: Lipopolysaccharide composition of Desulfovibrio cell wall. World J. Microb. Biot. 1996; 12:113-114. 55.Lodowska J., Wolny D., Jaworska-Kik M., Węglarz L., Dzierżewicz Z., Wilczok T.: Composition of the polysaccharide component of the endotoxin from the intestinal strain of Desulfovibrio desulfuricans. Ann. Pol. Chem. Soc. 2003; 2: 299-303. 56. Lodowska J., Wolny D., Jaworska-Kik M., Dzierżewicz Z., Węglarz L.: Interstinal diversity of 2-keto-3deoxyoctonate content in lipopolysaccharides of Desulfovibrio desulfuricans. Pol. J. Microb. 2009; 1 (in press). 57.Dzierżewicz Z., Cwalina B., Jaworska-Kik M., Węglarz L., Wilczok T.: Susceptibility to antybiotics and biochemical properties of Desulfovibrio desulfuricans strains. Acta Pol. Pharm.–Drug Res. 2001; 58: 439-444. Adres do korespondencji: Dr Joanna Szczerba Katedra i Zakład Biofarmacji ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec e-mail: [email protected] 32 58.West B., Lendrum R., Walker G.: Effect of sulphasalazine (salazopyrin) on fecal flora in patients with inflammatory bowel disease. Gut. 1974; 15: 900-905. 59.Edmond L.M., Hopkins M.J., Magee E.A., Cummings J.H.: The effect of 5-aminosalicylic acid-containing drugs on sulfide production by sulfate-reducing and amino acid-fermenting bacteria. Inflamm. Bowel Dis. 2003; 9: 10-17. 60.Dzierżewicz Z., Cwalina B., Węglarz L., Wiśniowska B., Szczerba J.: Susceptibility of Desulfovibrio desulfuricans intestinal strains to sulfasalazine and its biotransformation products. Med. Sci. Monit. 2004; 10: 185-190. 61.Finegold S.M., Wexler H.M.: Present studies of therapy for anaerobic infections. Clin. Infect. Dis. 1996; 23 (suppl. 1): 9-14. 62.Lozniewski A., Labia R., Haristoy X., Mory F.: Antimicrobial susceptibilities of clinical Desulfovibrio isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 2001; 45: 2933-2935. Farm Przegl Nauk, 2009,5, 33-36 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Zawartość selenu w roślinnych surowcach leczniczych i jego relacje z wybranymi pierwiastkami Content of selenium in medicinal plant raw materials and its relation with selected elements Beata Ulewicz-Magulska, Marek Wesołowski Katedra i Zakład Chemii Analitycznej, Gdański Uniwersytet Medyczny Kierownik Katedry i Zakładu: Prof. dr hab. Marek Wesołowski Streszczenie Nieustające zainteresowanie roślinami leczniczymi jako potencjalnymi lekami wspomagającymi powoduje, że określenie w nich rodzaju i zawartości biogennych pierwiastków jest zagadnieniem ważnym i wciąż aktualnym. Z tego względu celem pracy było rozpoznanie poziomu selenu w roślinnych surowcach leczniczych z uwzględnieniem wpływu gatunku oraz organu rośliny na poziom tego pierwiastka. Istotne było także określenie relacji pomiędzy zawartością selenu a wybranymi biopierwiastkami – miedzią, manganem, cynkiem i żelazem. W wyniku przeprowadzonych analiz 148 roślinnych surowców leczniczych (ziół, liści, kwiatów, korzeni oraz owoców i nasion), pochodzących od 44 gatunków roślin stwierdzono, że ilość selenu w surowcach roślinnych waha się w graniach od kilku do kilkunastu lub kilkudziesięciu nanogramów w gramie suchej masy surowca. Zidentyfikowano kilka surowców, w których poziom selenu przekroczył 100 ng/g. Biorąc pod uwagę średnią zawartość selenu w poszczególnych grupach surowców stwierdzono, że najwięcej zawierały go owoce i nasiona, a następnie zioła, liście, kwiaty i korzenie. Porównując średnią zawartość oznaczanych pierwiastków w badanych surowcach stwierdzono, że w przypadku manganu, cynku i żelaza najbogatsze ich źródło stanowią liście i zioła, najuboższe zaś owoce i nasiona. Najwyższe średnie stężenie miedzi stwierdzono w kwiatach, natomiast zioła i liście charakteryzowały się niższą średnią zawartością tego pierwiastka. Analiza korelacji wskazała na istnienie kilku par pierwiastków, które korelują w największym stopniu, tj. Cu-Zn i Fe-Zn w owocach i nasionach, Mn-Zn w ziołach, FeCu w liściach oraz ujemną korelację Se-Cu w korzeniach. Z kolei analiza głównych składowych (PCA) i analiza skupień (CA) umożliwiły identyfikację surowców roślinnych o zbliżonym składzie pierwiastkowym. Skupienia tworzą często surowce pochodzące z tego samego gatunku rośliny leczniczej, a także surowce pochodzące od gatunków roślin należących do tej samej rodziny, jak np. liść jeżyny i maliny. Summary The elemental composition of medicinal plants is now very often an object of study. Because drugs of plant origin or herbal species are now commonly used, they can been additional source of macro- and microelements in everyday diet. The purpose of this study was to determine the content and distribution of selenium in commercial plant raw materials used in medicine. Very important matter was also to evaluate the relationship between levels of selenium and copper, manganese, zinc and iron. As the results of analysis of 148 samples of medicinal raw plant materials (herbs, leaves, flowers, roots as well as fruits and seeds), originating from 44 plant species, it was shown, that the concentration of selenium in majority of samples was determined in the range from several to several tens of ng/g of dry plant weight. The raw materials in which the content of selenium was above 100 ng/g were identified. Comparing the average selenium level in individual groups of plant materials it was possible to notice, that the highest amounts of this element contained fruits and seeds, next herbs, leaves, flowers and roots. Comparing the average concentration of studied elements it was found, that leaves and herbs contained the highest amounts of manganese, zinc and iron, whereas in fruits and seeds the lowest content of these elements was detected. In the case of copper, the highest average concentration of this element, in flowers was determined. The amounts of copper detected in herbs and leave, were the lowest in comparison with the other group of plant materials. Statistically significant correlations between the following pairs of metals: Cu-Zn, Fe-Zn in fruits and seeds, Mn-Zn in herbs, FeCu in leaves, were found. The negative linear correlations between Se-Cu in roots, Se-Mn in fruits and seeds, were observed. Principal Component Analysis (PCA) and Cluster Analysis (CA) were applied for interpretation of the results. It was found, that raw materials originating from the same medicinal plant species and from species which belong to the same taxonomic family are frequently characterized by very similar elemental composition (Rubi idaei Folium, Rubi fruticosi Folium). Słowa kluczowe: selen, miedź, mangan, cynk, żelazo, roślinne surowce lecznicze, analiza głównych składowych, analiza skupień Key words: selenium, copper, manganese, zinc, iron, medicinal plant raw materials, principal component analysis, cluster analysis 33 Farm Przegl Nauk, 2009,5 Wprowadzenie Materiały i metody Rośliny lecznicze, tzw. „zioła” są stosowane w celach Materiał do badań składał się z 148 roślinnych surowmedycznych od setek lat na całym świecie. Mimo olbrzy- ców leczniczych, takich jak zioła, liście, kwiaty, korzenie miego tempa rozwoju nauki, a wraz nią wprowadzenia wielu oraz owoce i nasiona, pochodzących od 44 gatunków roślin. nowych leków syntetycznych, tradycyjnie stosowane rośli- Analizowano surowce lecznicze uzyskano z firm: Herbapol ny lecznicze w postaci ziół, mieszanek i tabletek ziołowych (Bydgoszcz, Kraków, Lublin i Łódź), Kawon (Gostyń), Bocieszą się niesłabnącą popularnością [1]. guccy (Kraków), Flos (Mokrsko), Herbalux (Warszawa), Wymagania jakościowe stawiane surowcom zielarskim Herbalux-Bis (Warszawa) i Elanda (Rozprza). Badany mazebrane są w Polskich Normach i Normach Zakładowych, teriał roślinny zmineralizowano za pomocą energii mikrozgodnie z wymogami Farmakopei Polskiej. Obejmują one falowej, stosując mineralizator mikrofalowy UniCleverTM parametry jakościowe cech organoleptycznych surowca, BM-1z, Plazmatronika, Wrocław oraz stężony kwas azotozawartość substancji biologicznie czynnych, zawartość do- wy(V). mieszek oraz zanieczyszczeń, w tym zanieczyszczeń pozoSelen oznaczono metodą spektrofluorymetryczną, stostałościami nawozów sztucznych [1-3]. sując spektrometr Luminescence LS 50B, Perkin Elmer. W warunkach naturalnych obserwuje się duże zróżnico- W oznaczeniach wykorzystano barwną reakcję selenu(IV) wanie w zawartości makro- i mikroelementów w zależności z 2,3-diaminonaftalenem (DAN). W wyniku tej reakcji od gatunku, a nawet odmiany rośliny. Może ono wynikać tworzy się 4,5-benzopiazoselenol, dla którego wykonano z zanieczyszczenia środowiska, właściwości i typu gleby, pomiar spektrofluorymetryczny przy fali wzbudzenia o dłuwarunków agro-klimatycznych, jak również jest związane gości 377 nm i emisji 522 nm. Ponieważ DAN wiąże się z określoną częścią rośliny oraz jej stadium rozwojowym specyficznie z selenem na +4 stopniu utlenienia, konieczna [4, 5]. Z kolei znajomość rozmieszczenia pierwiastków była ilościowa redukcja selenu w mineralizatach przeprowaw różnych gatunkach roślin może okazać się bardzo przydatna dzona przy użyciu stężonego kwasu solnego. w poszukiwaniu naturalnych źródeł mikro- i makroelePierwiastki metaliczne w badanym materiale roślinnym mentów potrzebnych organizmowi człowieka w codzien- po mineralizacji mikrofalowej oznaczono metodą absorpnej diecie [2]. cyjnej spektrometrii atomowej, wykorzystując atomizację Dokonując przeglądu piśmiennictwa z ostatnich lat płomieniową (F-AAS). można zauważyć istotny wzrost zainteresowania selenem, Precyzję i odzysk użytych do oznaczeń metod sprawwynikający ze stwierdzenia jego ważnych funkcji fizjolo- dzono przy użyciu materiału referencyjnego Virginia Tabacgicznych, a także z faktu, że zarówno nadmiar jak i niedo- co Leaves (CTA-VTL-2, LGC Promochem) dla selenu, Tea bór tego mikroelementu niekorzystnie wpływa na organizm Leaves (INCT-TL-1, LGC Promochem) dla miedzi i cynku człowieka [6-9]. Podstawowym źródłem łatwo przyswajal- oraz Tomato Leaves (1573a, NIST) dla manganu i żelaza. nego selenu dla człowieka jest pożywienie, zarówno pocho- Średni odzysk dla selenu wyniósł 75,4 %, natomiast dla medzenia roślinnego, jak i zwierzęcego. Zawartość selenu tali od 99,4 % do 117,2 %. w wielu produktach żywnościowych została określona, pozostaje natomiast problem rozpoznania zawartości selenu Wyniki i dyskusja w roślinach i pozyskiwanych z nich surowcach leczniczych W wyniku przeprowadzonych oznaczeń stwierdzono, że [6, 10, 11]. Z uwagi na nieustające zainteresowanie roślinami ilość selenu w surowcach roślinnych waha się w graniach leczniczymi jako potencjalnymi lekami wspomagający- od kilku do kilkunastu lub kilkudziesięciu nanogramów mi, określenie w nich rodzaju i zawartości biogennych w gramie suchej masy surowca. Stwierdzono także występierwiastków jest zagadnieniem ważnym i wciąż aktual- powanie kilku surowców, w których poziom selenu przekronym. Z tego względu zasadniczym celem pracy było oznaczenie za- 240 wartości selenu oraz miedzi, man- 220 ganu, cynku i żelaza w dostępnych 200 w Polsce roślinnych surowcach 180 160 leczniczych oraz określenie wpły- 140 wu organu rośliny, z którego suro- 120 wiec został pozyskany, na poziom 100 80 oznaczanych pierwiastków. Istotne 60 było także porównanie zawartości M ediana 40 oznaczanych pierwiastków w su25%-75% 20 rowcach pochodzących od tego saZakres nieodstających 0 mego gatunku rośliny, pozyskanych -20 Odstające Zioła Kwiaty Owoce z różnych zakładów zielarskich, Ekstremalne Liście Korzenie jak również określenie relacji pomiędzy zawartością analizowanych Ryc. 1. Zawartość selenu w poszczególnych grupach surowców leczniczych. W obliczeniach pierwiastków w badanych grupach nie uwzględniono jednej próbki liścia podbiału z uwagi na skrajnie wysoką zawartość selenu w tym surowcu (623,80 ng/g s.m. surowca) surowców. 34 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 czył 100 ng/g, tj. liść podbiału (w czterech analizowanych surowcach oznaczono selen w ilości, odpowiednio 623,80; 201,77; 142,53 i 108,42 ng/g), korzeń cykorii podróżnik (analizowano dwa surowce zawierające 152,89 i 130,93 ng Se/g próbki) oraz ziele skrzypu zawierające 133,74 ng Se/g s.m. surowca. Wysokie stężenie selenu oznaczono także w zielu majeranku i owocu głogu. Zawartość selenu w poszczególnych grupach surowców jest do siebie zbliżona, po wyłączeniu próbek o skrajnie wysokim stężeniu selenu, które występowały w każdej grupie surowców, z wyjątkiem kwiatów. Biorąc pod uwagę średnie stężenie selenu w kolejnych grupach surowców roślinnych, z wyłączeniem tylko jednej próbki o niezwykle wysokiej zawartości selenu, można uszeregować je w następującej kolejności: owoce i nasiona, zioła i liście, kwiaty oraz korzenie. Zilustrowano to na Rys. 1. Największą średnią zawartością selenu w badanych surowcach charakteryzują się owoce i nasiona (32,08 ng/g). Wśród nich wysokie stężenie selenu stwierdzono w owocu głogu pochodzącym z firmy Herbapol (Bydgoszcz). Wynosi ono 76,88 ng/g i jest wyższe w porównaniu z wartościami dla pozostałych próbek tego surowca. Wysoką zawartość selenu prezentują także nasiona lnu 68,32 ng/g i 50,00 ng/g. Bogatym źródłem selenu są również zioła (średnia zawartość 22,93 ng/g). W grupie tej wysokie stężenie selenu wykryto w zielu skrzypu (Kawon, Gostyń), wynoszące 133,74 ng/g. Wysoką zawartość selenu prezentują także próbki ziela majeranku, 63,04 ng/g i 86,16 ng/g. Istotnym źródłem selenu są także próbki ziela macierzanki o zawartości odpowiednio 44,91; 39,40 i 47,85 ng/g. Rozpatrując zawartość selenu w grupie liści można stwierdzić, że w przypadku większości próbek stężenie oznaczanego pierwiastka waha się w granicach od 15 do 25 ng/g suchej masy surowca przy wartości średniej rzędu 21,92 ng/g. W grupie tej występuje próbka o najwyższej zawartości selenu wśród wszystkich oznaczanych surowców leczniczych, jest nią liść podbiału (Kawon, Gostyń). Zawiera on 623,80 ng Se/g s.m., przy czym ilość tego pierwiastka w pozostałych próbkach tego samego surowca jest już niższa. Porównując stężenie selenu w surowcach pochodzących od tego samego gatunku rośliny leczniczej, ale uzyskanych z różnych zakładów zielarskich, zaobserwowano zróżnicowanie w zawartości oznaczanego pierwiastka w zależności od producenta, czego przykładem jest ziele majeranku i krwawnika. Stwierdzono także różnice w zawartości selenu w obrębie próbek pochodzących od tego samego producenta. Zauważono ponadto, że próbki surowców pochodzących z zakładu zielarskiego Kawon (Gostyń) charakteryzują się wyższą zawartością selenu w porównaniu z surowcami pochodzącymi z firmy Boguccy (Kraków) i Herbapol (Bydgoszcz). Rozpatrując zawartość miedzi w analizowanych surowcach leczniczych stwierdzono, że waha się ona w granicach od kilku do kilkunastu µg w gramie suchej masy surowca. Najwyższą średnią zawartością miedzi wśród badanych surowców charakteryzują się kwiaty, 11,37 µg/g s.m. surowca, następnie korzenie, owoce i nasiona oraz zioła, a najmniejszą jego ilość zawierają liście 7,05 µg/g. Przeprowadzone oznaczenia wykazały, że w porów- naniu z pozostałymi pierwiastkami, zawartość manganu w badanych próbkach jest wysoka. Ilość tego pierwiastka w kolejnych grupach surowców jest różna i wykazuje duże zróżnicowanie w zawartości w obrębie danej grupy. Najzasobniejsze w mangan są liście (137,26 µg/g s.m.), bogatym źródłem tego pierwiastka są również zioła (97,46 µg/g s.m.). Stwierdzono ponadto, że korzenie, owoce i nasiona stanowią ubogie źródło manganu. Analiza wyników oznaczeń cynku w badanych surowcach roślinnych wykazała, że zawartość tego pierwiastka oscyluje w granicach od kilku do kilkunastu lub kilkudziesięciu µg w gramie suchej masy surowca, jak również, że poza nielicznymi wyjątkami, jego ilość w ziołach (44,82 µg/g) i liściach (41,61 µg/g) jest średnio o połowę wyższa niż w pozostałych surowcach. Interesujące pod względem zawartości cynku są również korzenie. Pomimo tego, że średni poziom oznaczanego mikroelementu w korzeniach wynosi 29,18 µg/g, wykryto duży rozrzut w zawartości cynku w poszczególnych surowcach. Podobnie jak w przypadku manganu, najmniej cynku zawierają kwiaty, owoce i nasiona. Zawartość żelaza w badanym materiale kształtuje się na poziomie od 101,30 µg/g s.m. w owocach i nasionach do 451,43 µg/g s.m. w liściach. Oprócz liści, duże ilości żelaza wykryto także w korzeniach (447,27 µg/g s.m.). Owoce i nasiona, podobnie jak w przypadku manganu i cynku, stanowią najuboższe źródło omawianego pierwiastka. Zastosowanie analizy korelacji pozwoliło stwierdzić występowanie wprost i odwrotnie proporcjonalnych zależności między oznaczanymi pierwiastkami, określanych jako dodatnie i ujemne korelacje. W grupie ziół zanotowano dodatnią korelację pomiędzy Cu i Mn, Fe i Cu oraz Mn i Zn. Wśród liści stwierdzono trzy korelacje dodatnie i jedną ujemną. Dodatnie korelacje występowały pomiędzy parami pierwiastków Mn-Zn i Fe-Zn, natomiast korelację o wysokiej wartości współczynnika r reprezentowała para Fe-Cu. Ujemna korelacja występowała natomiast w parze Fe-Mn. W grupie kwiatów i korzeni zaobserwowano korelacje dodatnie w parach Mn-Zn (kwiaty) i Fe-Cu (korzenie). Ponadto w analizowanej grupie owoców i nasion zanotowano bardzo wysoką korelację pomiędzy Cu i Zn, wysoką między Fe i Zn oraz korelację o niskiej wartości współczynnika r w parze pierwiastków Fe-Cu. Dwie ujemne korelacje stwierdzono w parach Se-Cu (korzenie) oraz Se-Mn (owoce i nasiona). Zastosowanie technik eksploracji danych – analizy głównych składowych oraz analizy skupień pozwoliło na wyodrębnienie surowców o zbliżonym składzie pierwiastkowym. Stwierdzono, że skupienia tworzą często surowce pochodzące z tego samego gatunku rośliny leczniczej oraz surowce pochodzące z gatunków roślin należących do tej samej rodziny botanicznej, np. liść maliny i jeżyny. Analizę skupień zastosowano również do analizy relacji między pierwiastkami w poszczególnych grupach roślinnych surowców leczniczych. Interpretacja wyników obliczeń przeprowadzonych techniką analizy skupień dowiodła, że można je potraktować jako uzupełnienie i potwierdzenie wyników analizy korelacji. Skupienia utworzone na najniższym poziomie wiązań opisywały często pary pierwiastków o wysokiej wartości współczynnika korelacji. 35 Farm Przegl Nauk, 2009,5 Podsumowanie Piśmiennictwo Przeprowadzone badania dostarczyły cennych danych odnośnie zawartości selenu w stosowanych w lecznictwie roślinnych surowcach leczniczych. Z uwagi na niski poziom tego biopierwiastka w materiale roślinnym oraz pracochłonną procedurę analityczną, w literaturze naukowej odczuwa się brak szerszych opracowań na temat rozmieszczenia selenu w materiale roślinnym. Badania uzupełniły również wiedzę o zawartości wybranych biopierwiastków (miedź, mangan, cynk, żelazo), w dostępnych w Polsce surowcach, pochodzących od tych samych oraz różnych gatunków roślin leczniczych. Istotnym elementem pracy jest ponadto określenie wpływu organu rośliny, z którego surowiec został pozyskany na poziom oznaczanego pierwiastka, i w związku z tym identyfikacja surowców leczniczych oraz grup surowców szczególnie bogatych w selen i oznaczane mikroelementy. Ważnym elementem badań jest również identyfikacja wzajemnych relacji pomiędzy zawartością analizowanych pierwiastków. Pełną interpretację uzyskanych danych zapewniły wielowymiarowe metody analizy statystycznej (analiza głównych składowych i analiza skupień), umożliwiając optymalizację danych pomiarowych oraz identyfikację niezależnych źródeł zmienności w zawartości selenu i pierwiastków metalicznych w badanych surowcach. 1. Kalny P. i wsp., Determination of selected microelements in polish herbs and their infusions, Sci. Total Environ., 2007, 381, 99-104 2. Leśniewicz A. i wsp., Macro- and micro-nutrients and their bioavailability in polish herbal medicaments, Food Chem., 2006, 99, 670-679 3. Kordana T., Wymagania jakościowe stawiane surowcom zielarskim przez przemysł, Wiad. Ziel., 2002, 12, 1-3 4. Ražic S. i wsp., Determination of metal content in some herbal drugs - Empirical and chemometric approach, Talanta, 2005, 67, 233-239 5. Smrkolj P., Stibilj V., Determination of selenium in vegetables by hydride generation atomic fluorescence spectrometry, Anal. Chim. Acta, 2004, 512, 11-17 6. Ferri T., Favero G., Frasconi, M., Selenium speciation in foods: preliminary results on potatoes, Microchem. J., 2007, 85, 222-227 7. Pappa E.C., Pappas A.C., Surai P.F., Selenium content in selected foods from the Greek market and estimation of the daily intake, Sci. Total Environ., 2006, 372, 100-108 8. Pezzarossa B. i wsp., Absorption of selenium by Lactuca sativa as affected by carboxymethylcellulose, Chemosphere, 2007, 67, 322-329 9. Reid M.E. i wsp., A report of high-dose selenium supplementation: response and toxicities, J. Trace Elem. Med. Biol., 2004, 18, 69-74 10.Mazej D. i wsp., Determination of selenium species in plant leaves by HPLC-UV-HG-AFS, Talanta, 2006, 68, 558-568 11.Smrkolj P. i wsp., Selenium content in selected Slovenian foodstuffs and estimated daily intakes of selenium, Food Chem., 2005, 90, 691-697 Adres do korespondencji: Marek Wesołowski Al. Gen. J. Hallera 107, 80-416 Gdańsk tel. 058-349-31-20 e-mail: [email protected] 36 Farm Przegl Nauk, 2009,5, 37-42 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Szlak RANKL/RANK/OPG w patogenezie chorób – nowe możliwości terapeutyczne The RANKL/RANK/OPG pathway in pathogenesis of diseases – new therapeutic possibilities Maria Pytlik, Dorota Bolek, Igor Rymkiewicz Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny Kierownik Katedry: dr hab. n. farm. Maria Pytlik Streszczenie W procesie przebudowy kości istnieje ścisła koordynacja między osteoblastami a osteoklastami. Odkrycie liganda receptorowego aktywatora czynnika jądrowego κB (RANKL) wyjaśnia regulowany przez osteoblasty mechanizm różnicowania, dojrzewania i funkcjonowania osteoklastów. Ligand RANKL aktywuje specyficzny receptor RANK zlokalizowany na preosteoklastach. Oddziaływanie RANKL-RANK pobudza wiele zstępujących szlaków sygnałowych niezbędnych do rozwoju osteoklastów. Efekty działania RANKL są fizjologicznie równoważone przez rozpuszczalny receptor pułapkowy – osteoprotegerynę (OPG). Zmiany w obrębie szlaku RANKL/RANK/OPG stwierdzono np. w osteoporozie pomenopauzalnej, reumatoidalnym zapaleniu stawów, nowotworach kości, chorobie Pageta i chorobach naczyń krwionośnych. Wprowadzenie nowych leków oddziałujących na szlak RANKL/RANK/OPG może potencjalnie zrewolucjonizować leczenie wielu chorób przebiegających z utratą kości. OPG otrzymana metodami inżynierii genetycznej jest potencjalnym inhibitorem resorpcji kostnej w organizmie człowieka. Denozumab jest w pełni ludzkim monoklonalnym przeciwciałem blokującym RANKL. Badania kliniczne wykazały, że zmniejsza on przebudowę kości i zwiększa gęstość mineralną u pacjentów. Słowa kluczowe: osteoklasty, osteoblasty, RANK, ligand RANK, osteoprotegeryna, denozumab Badania naukowe ostatnich lat wykazały, że szlak RANKL/RANK/OPG uczestniczy w patogenezie chorób układu kostnego i innych schorzeń. Kość jest tkanką dynamiczną, w której nieustannie zachodzą procesy przebudowy (remodelacji), obejmujące resorpcję i kościotworzenie. Głównym celem remodelacji jest dostosowanie budowy kości do obciążeń mechanicznych, zapewnienie homeostazy wapniowej oraz naprawa Abstract There is a close cooperation in bone remodeling between osteoblasts and osteoclasts. The discovery of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) elucidates the mechanism of osteoclast differentiation, maturation and function regulated by osteoblasts. RANKL activates its specific receptor RANK, located on preosteoclasts. RANKL-RANK interaction activates a variety of downstream signaling pathways required for osteoclast development. The effects of RANKL are physiologically counterbalanced by the soluble decoy receptor osteoprotegerin (OPG). Alterations of the RANKL/ RANK/OPG system have been shown for example in postmenopausal osteoporosis, rheumatoid arthritis, skeletal malignancies, Paget′s disease and vascular diseases. Introduction of novel drugs that target RANKL/RANK/ OPG pathway could potentially revolutionize the treatment of many diseases associated with bone loss. OPG has been genetically engineered and in human subjects is a potent inhibitor of bone resorption. Denosumab is a fully human monoclonal antibody that inhibits RANK. Clinical trials demonstrated denosumab to decrease bone turnover and increase bone mineral density (BMD) in treated patients. Key words: osteoclasts, osteoblasts, Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B (RANK), RANK-Ligand, osteoprotegerin, denosumab mikrouszkodzeń [1,2,3,4]. Procesy przebudowy kości zachodzą podczas całego życia człowieka, a ich intensywność i przebieg zależą od wieku. W okresie od urodzenia do pełnej dojrzałości dominuje modelacja, w której kościotworzenie i resorpcja zachodzą na różnych powierzchniach kości, powodując ich wzrost na długość i szerokość. U osób dorosłych w wieku 30-35 lat procesy resorpcji i kościotworzenia pozostają w stanie równowagi. W dalszym 37 Farm Przegl Nauk, 2009,5 okresie życia w procesach przebudowy następuje intensyfikacja resorpcji z utratą masy kostnej [4]. W procesach przebudowy kości istnieje ścisła koordynacja pomiędzy osteoblastami (komórki kościotwórcze) a osteoklastami (komórki kościogubne). Osteoblasty powstają z mezenchymalnych komórek macierzystych zrębu, natomiast osteoklasty są wielojądrzastymi komórkami wywodzącymi się z jednojądrowych hematopoetycznych prekursorów szpiku linii monocytowo-makrofagowej [2,3]. Na komórkach prekursorowych osteoklastów występują transbłonowe receptory RANK (ang. receptor activator of nuclear factor κB), służące do aktywacji czynnika jądrowego κB, który przekazuje do jądra sygnał uruchamiający kaskadę ekspresji genowych powodujących różnicowanie preosteoklastów w osteoklasty (ryc.1.) [4]. RANK występuje także na powierzchni limfocytów T i B, komórek dendrytycznych i fibroblastów [5]. Należy do nadrodziny receptorów TNFR (ang. tumor necrosis factor receptors). Receptory RANK są pobudzane przez RANKL (RANK ligand) wydzielany przez osteoblasty i komórki zrębu. RANKL jest kluczowym czynnikiem formowania i aktywacji osteoklastów oraz hamowania ich apoptozy. Jest to białko transbłonowe należące do nadrodziny czynników TNF [1,2,3]. Występuje w trzech aktywnych biologicznie izoformach. RANKL1 (RANKL) i RANKL2 różnią się długością domeny śródbłonowej, natomiast RANKL3 jest formą rozpuszczalną (sRANKL), pozbawioną tej domeny [3]. Poza układem kostnym obecność RANKL wykazano również w limfocytach T i komórkach dendrytycznych [1]. Osteoblasty i komórki zrębu wydzielają także rozpuszczalne białko osteoprotegerynę (OPG). Hamuje ona różnicowanie, dojrzewanie i aktywność osteoklastów oraz indukuje ich apoptozę poprzez wiązanie i inaktywację RANKL, stanowiąc dla niego receptor „pułapkowy”. OPG należy do nadrodziny receptorów TNFR, podobnie jak RANK. OPG jest wydzielana także przez inne tkanki: wątrobę, nerki, tarczycę, płuca, serce [1,5]. Połączenie RANKL z receptorem RANK wyzwala kaskadę reakcji, aktywujących zstępujące szlaki sygnałowe w preosteoklastach. Kaskadę reakcji zapoczątkowuje aktywacja czynnika jądrowego NFκB, który jest czynnikiem transkrypcyjnym o budowie heterodimeru. NFκB występuje w cytoplazmie w formie nieaktywnej, w wyniku związania z inhibitorem IκB. Aktywacja NFκB pobudza kompleks kinazy inhibitora i na skutek fosorylacji, ubikwitynylacji (unieczynnieniu przez przyłączenie białka ubikwityny) i degradacji IκB traci swój hamujący wpływ na NFκB [5,6]. Łącznie z aktywacją NFκB następuje rekrutacja białek adaptacyjnych, tj. TRAFs (ang. tumor necrosis factor receptor associated factors) i c-Src. TRAFs są białkami cytoplazmatycznymi wiążącymi się z wewnątrzkomórkowymi domenami różnych receptorów z nadrodziny TNFR. Istotną funkcję w osteoklastogenezie pełni TRAF-6. c-Src jest cytoplazmatyczną kinazą tyrozynową, odgrywającą kluczową rolę w aktywacji antyapoptotycznej kinazy serynowo-treoninowej Akt/ PKB, podczas której TRAF-6 podnosi aktywność kinazową c-Src. Kinaza c-Src bierze także udział w funk- 38 cjonowaniu osteoklastów zależnych od integryn (białka uczestniczące w adhezji osteoklasta do kostnej matriks) [3,5]. W szlaku sygnalizacji RANK odkryto również istotną rolę białka adaptacyjnego Gab-2 (ang. Grb 2associated binder) [5]. W obecności białek adaptacyjnych następuje uruchomienie szlaków sygnałowych z udziałem NFκB oraz JNK/c-fos/c-jun, niezbędnych do formowania i aktywacji osteoklastów [5]. JNK (c-Jun N-terminalna kinaza) należy do rodziny kinaz białkowych MAPK (ang. mitogen activated protein kinase), które są aktywowane przez stres [7]. Wiele kinaz z tej rodziny jest aktywowanych przez RANK i mogą one przetworzyć stymulację tego receptora na odpowiedź komórkową. Substratami dla JNK są czynniki transkrypcyjne, m.in. Jun, fosforylowany na dwóch resztach seryny w N-terminalnym rejonie łańcucha. Zaktywowane białko cytoplazmatyczne c-Jun w postaci homodimeru lub heterodimeru z czynnikiem transkrypcyjnym c-Fos stanowi czynnik transkrypcyjny AP-1 (ang. activation protein-1), który jest niezbędny do efektywnej osteoklastogenezy [5]. W wyniku współdziałania czynnika TRAF-6 i c-Src następuje aktywacja kinazy serynowo-treoninowej Akt/PKB, uczestniczącej w sygnale anty-apoptotycznym [5]. Efektem oddziaływania RANKL-RANK na poziomie komórkowym jest różnicowanie preosteoklastów do dojrzałych osteoklastów, nasilenie ich aktywności oraz zahamowanie apoptozy [2,4]. Na etapie rozwoju osteoklastów z komórek prekursorowych RANKL wymaga obecności MCSF (ang. macrophage colony stimulating factor), posiadającego swoiste receptory c-fms na osteoklastach [2,3,5]. Szlak RANKL/RANK oprócz udziału w osteoklastogenezie uczestniczy także: w organogenezie węzłów chłonnych, rozwoju limfocytów, funkcjonowaniu komórek dendrytycznych oraz w powstawaniu reakcji zapalnej [5,8]. Podczas ciąży oddziaływanie RANKL-RANK jest niezbędne do rozwoju komórek nabłonkowych gruczołu sutkowego [9]. Sygnalizacja RANKL uczestniczy również w rozwoju zastawek serca [10]. Szlak RANKL/RANK/OPG podlega regulacji przez osteotropowe hormony i cytokiny. Ekspresję RANKL w osteoblastach pobudzają: 1,25-dihydroksycholekalcyferol, PTH, glikokortykosteroidy, PGE2, Il-1, Il-6, Il-11, Il-17, TNF-α, insulinopodobny czynnik wzrostowy IGF-1, natomiast hamują: Il-13, interferon IFN-γ, transormujący czynnik wzrostowy TGF-β i estrogeny [1,3,5]. Ekspresję OPG pobudzają: estrogeny, 1,25-dihydroksycholekalcyferol, Il-1, białko morfogenetyczne kości BMP-2, TGF-β, obciążenia mechaniczne działające na kość, jony wapniowe uwalniane w miejscach resorpcji kości, zaś hamują: PTH (podawany w sposób ciągły, nie okresowy), glikokortykosteroidy, PGE2, IGF-1, IL-1, Il-6, Il-11, Il-17, TNF-α [1,2,3]. Doświadczenia in vitro wykazały, że istotną rolę w regulacji osteoklastogenezy, przez hamujący wpływ na RANKL, pełni cząsteczka tlenku azotu NO. Ponadto wykazano, że RANKL przez indukcję interferonu IFN-β, pobudza ekspresję iNOS (indukowana syntaza tlenku azotu) i uwalnianie copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Ryc. 1. Dojrzewanie i aktywacja osteoklastów Fig. 1. Maturation and activation of osteoclasts tlenku azotu, stanowiącego czynnik ograniczający osteoklastogenezę (mechanizm ujemnego sprzężenia zwrotnego) [11]. Brak równowagi w stosunku RANKL do OPG lub w sygnalizacji RANK leży u podstaw wielu zaburzeń szkieletu, charakteryzujących się nadmierną utratą kości (osteoporoza) bądź nadmiernym jej formowaniem (osteopetroza) lub zaburzoną przebudową. Osteoporoza jest najlepiej zbadaną chorobą kości związaną ze szlakiem RANKL/RANK/OPG. Charakteryzuje się ona zmniejszeniem masy tkanki kostnej, zaburzeniem mikroarchitektury kości i w konsekwencji, zwiększoną podatnością na złamania. Według WHO osteoporoza występuje, gdy gęstość tkanki kostnej pacjenta ma wartość mniejszą co najmniej o 2,5 odchylenia standardowego od średniej wartości dla populacji młodych dorosłych. Natomiast, gdy gęstość tkanki kostnej mieści się w zakresie 1 do 2,5 odchylenia standardowego poniżej średniej wartości dla populacji młodych dorosłych, mamy do czynienia z osteopenią. U kobiet po menopauzie, na skutek zaniku hormonalnej funkcji jajników, zmniejsza się oddziaływanie estrogenów na układ kostny i może rozwinąć się osteoporoza pomenopauzalna. Niedobór estrogenów prowadzi do zwiększenia szybkości przebudowy kości (resorpcji i kościotworzenia). Przesunięcie równowagi pomiędzy procesami resorpcji a procesami kościotworzenia w kierunku nasilenia resorpcji, obserwowane w osteoporozie pomenopauzalnej, jest wynikiem przedłużenia czasu trwania życia osteoklastów i skróceniu czasu życia osteoblastów [4]. Dane eksperymentalne wskazują, że za przyspieszoną przebudowę kości odpowiada wzmożone uwalnianie cytokin (RANKL, Il-1, Il-6, TNF-α), nasilających resorpcję kości, których wydzielanie w warunkach fizjologicznych jest hamowane przez estradiol. Ponadto niedobór estrogenów prowadzi do zmniejszenia wydzielania OPG w osteoblastach. U kobiet w okresie pomenopauzalnym stwierdzono wyższe poziomy RANKL w komórkach zrębu szpiku i limfocytach niż u kobiet przed menopauzą, bądź też po menopauzie, ale stosujących terapię estrogenową. Wykazano, że ekspresja RANKL jest odwrotnie skorelowana ze stężeniem w osoczu 17 β-estradiolu, a dodatnio ze stężeniem markerów resorpcji kostnej. Estradiol może również hamować aktywność jednego z enzymów, biorących udział w kaskadzie sygnałowej wyzwolonej aktywacją receptora RANK, tj. kinazy JNK [12]. Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) należy do grupy chorób kości o podłożu zapalnym. W RZS obserwuje się okołostawową utratę kości i chrząstki. Wiele cytokin stanu zapalnego posiada zdolność indukowania rekrutacji, różnicowania i aktywacji osteoklastów. Objęta stanem zapalnym tkanka synowialna produkuje, wpływające na aktywność osteoklastów, cytokiny i hormony: RANKL, Il-1α, Il-1β, TNF-α, IL-6, Il-17, MCSF i PTHrP (ang. parathyroid hormone-related protein). Badania dostarczają niezbitych dowodów na to, że RANKL jest produkowany przez aktywowane limfocyty T z tkanki synowialnej RZS oraz synowialne fibroblasty, powodując osteoklastyczną resorpcję kości [13]. Inne choroby zapalne stawów, w których może występować podobny mechanizm lokalnej erozji kości to: łuszczycowe zapalenie stawów, młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa czy zapalenie przyzębia [12,13]. Guzy kości zarówno pierwotne, tj.: szpiczak mnogi, pierwotny chłoniak kości, mięsaki kostne, jak i częściej przerzutowe guzy, występujące zwykle u pacjentów z pierwotnym guzem prostaty, gruczołu sutkowego lub płuc, tworzą grupę chorób, w których system RANKL/RANK/OPG odgrywa istotną rolę. Wyniki badań wykazały, że guz zwiększa liczbę i rozmiar osteoklastów w miejscu jego lokalizacji, nasilając osteolizę, objawiającą się nowotworowym bólem kości. W osteolitycznych guzach kości wykazano zwiększone poziomy RANKL i RANK. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że redukcja osteolizy spowodowanej guzem zmniejszyła ból nowotworowy kości. Fakt ten potwierdza doświadczenie na myszach z nowotworem, który wywołał osteolizę i ból. Podanie myszom osteoprotegeryny znacząco zredukowało wskaźniki behawioralne i neurochemiczne bólu oraz osteolizę [14]. Badania naukowe wykazały, że szlak RANKL/RANK/ OPG uczestniczy także w patogenezie: osteoporozy posteroidowej, hiperparatyroidyzmu, hiperkalcemii złośliwej, różnych postaci choroby Pageta (sporadyczna, rodzinna, młodzieńcza) i postępującej hiperfosfatazji [12]. Ostatnio wykazano również, że szlak RANKL/RANK/ OPG pełni ważną rolę w chorobach naczyń krwionośnych [8]. Przeprowadzone badania wskazują, że RANKL w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych promuje kalcyfikację, natomiast OPG prawdopodobnie pełni funkcję protekcyjną. Wyniki najnowszych badań sugerują, że OPG może pełnić rolę inhibitora kalcyfikacji, bez wpływu na wielkość i liczbę zmian miażdżycowych, ilość cytokin w naczyniach czy poziom cholesterolu [15]. Komórki śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych, zwłaszcza w aorcie i naczyniach nerkowych, konstytutywnie produkują OPG. Natomiast w niezwapniałych naczyniach i zastawkach RANK i RANKL są często niewykrywalne. Zwiększony stosunek RANKL/OPG w komórkach śródbłonkowych, obserwowany w procesie kalcyfikacji, wydaje się być związany z zapalną naturą miażdżycy (RANKL wzrasta, a OPG maleje), podobnie jak w innych tkankach objętych procesem zapalnym. Śródbłonek (endothelium) jest głównym koordynatorem odpowiedzi zapalnej i miejscem wytwarzania (obok limfocytów T) zwiększonych ilo- 39 Farm Przegl Nauk, 2009,5 ści RANKL. Pochodzący z komórek endothelium RANKL pobudza ich proliferację, migrację chemotaktyczną, przeżywalność oraz angiogenezę. Podczas wapnienia mięśnie gładkie naczyń ulegają różnicowaniu osteogenicznemu i wytwarzają RANKL, który reguluje w nich ekspresję białek macierzy kostnej. RANKL wzmaga także rekrutację i infiltrację monocytów/makrofagów, przez co stymuluje mineralizację mięśni gładkich naczyń krwionośnych w miażdżycy. Ponadto indukuje w monocytach produkcję metaloproteazy MMP-9 (ang. matrix metalloprotease-9), która wspiera infiltrację i wzrost płytki miażdżycowej. W makrofagach oksydowane lipidy stymulują czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF (ang. vascular endothelial growth factor), który poprzez intensywne namnażanie komórek śródbłonka i indukcję ekspresji receptora RANK, nasila neoangiogenezę. Obecnie uważa się, że zapalnie aktywowane komórki endothelium przyczyniają się do pojawienia, funkcjonowania i przeżywalności komórek osteoklastopodobnych. Pojawiają się one w zaawansowanych zmianach miażdżycowych i biorą udział w remodelingu powstałej w naczyniach tkanki kostnej. Wyniki badań sugerują, że produkcja RANKL przez aktywowane limfocyty T, śródbłonek i wapniejące mięśnie gładkie naczyń krwionośnych może pomagać w inicjowaniu i unieśmiertelnianiu procesów angiogenicznych, które intensyfikują zapalenie i kalcyfikację [8]. W tym przypadku OPG jest postrzegana jako czynnik ryzyka rozwoju miażdżycy i chorób układu sercowo-naczyniowego. Wysokie stężenie OPG jest niezależnym czynnikiem ryzyka choroby kardiowaskularnej [16]. Jednak OPG wydaje się być jedynie markerem, a nie mediatorem miażdżycy [15]. Udział RANKL i OPG w kalcyfikacji naczyń popierają następujące odkrycia: fenotyp kalcyfikacji naczyń u myszy z genetycznym brakiem OPG, wzrost ekspresji RANKL z jednoczesnym spadkiem OPG w zwapniałych naczyniach, indukowanie przez RANKL kalcyfikacji i różnicowania osteoplastycznegow miofibroblastach zastawek serca, związek między chorobą wieńcową a poziomem osoczowym OPG i RANKL [17]. Odkrycie szlaku RANKL/RANK/OPG zapoczątkowało badania nad nowymi możliwościami terapeutycznymi w leczeniu chorób tkanki kostnej. Osteoprotegeryna otrzymana metodą inżynierii genetycznej stanowi znaczący inhibitor resorpcji kości [18]. Liczne przedkliniczne badania naukowe z użyciem osteoprotegeryny obejmują eksperymenty in vivo na modelach zwierzęcych i doświadczenia in vitro. Przeprowadzono także kilka badań klinicznych z zastosowaniem ludzkiej rekombinowanej OPG (hrOPG) jako inhibitora resorpcji kości. Cząsteczka hrOPG zawiera OPG (pozbawioną domeny wiążącej heparynę) sprzężoną na N-końcu z fragmentem Fc ludzkiej immunoglobuliny IgG1 [19,20,21]. Delecja domeny wiążącej heparynę i fuzja skróconej molekuły z IgG1 powoduje wydłużenie okresu półtrwania w organizmie [21]. Pierwsze randomizowane badanie kliniczne hrOPG przeprowadzono na 52 zdrowych kobietach po menopauzie 40 przez pojedyncze podanie podskórne (sc). Uzyskane wyniki wykazały, że hrOPG szybko i znacząco zahamowała resorpcję kostną u badanych kobiet bez istotnych działań ubocznych [19]. W innym randomizowanym badaniu klinicznym I fazy porównywano efekt antyresorpcyjny oraz bezpieczeństwo zastosowania hrOPG i pamidronianu. Badanie przeprowadzono na 28 pacjentach ze szpiczakiem mnogim i 26 kobietach z rakiem gruczołu sutkowego, któremu towarzyszyły przerzuty do kości. Pojedyncze sc podanie hrOPG spowodowało szybką i głęboką supresję resorpcji kości u obydwu grup pacjentów, podobną jak po stosowaniu pamidronianu. hrOPG była dobrze tolerowana [ 20]. Przeprowadzono również próbę zastosowania hrOPG u dwojga pacjentów (rodzeństwa) z młodzieńczą postacią choroby Pageta. Resorpcja kostna, mierzona poziomem jej biochemicznych markerów, została zahamowana przez dawki 0,3 i 0,4 mg/kg masy ciała, podawane sc raz w tygodniu przez okres 15 m-cy. Po tym czasie masa kości promieniowej wzrosła o 9% u jednego pacjenta oraz o 30% u drugiego. Z wyjątkiem łagodnej hipokalcemii i hipofosfatemii, nie stwierdzono widocznych działań niepożądanych [22]. Ostatnio przeprowadzone badania in vitro wykazały, że OPG może pełnić rolę czynnika protekcyjnego dla komórek nowotworowych (raka gruczołu sutkowego, prostaty, jelita grubego) [23,24]. Możliwym mechanizmem zwiększenia ryzyka nowotworzenia jest blokowanie przez OPG czynnika TRAIL (ang. tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand), indukującego apoptozę różnych komórek nowotworowych [23]. W ostatnich latach duże nadzieje na wprowadzenie do lecznictwa wiązane są z denozumabem, który jest w pełni ludzkim monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla RANKL [25,26,27]. W przeciwieństwie do OPG charakteryzuje się znacznie dłuższym czasem półtrwania, co pozwala na rzadsze dawkowanie [28]. W randomizowanym badaniu klinicznym I fazy denozumab podawano 25 pacjentom ze szpiczakiem mnogim oraz 29 pacjentkom z przerzutami raka gruczołu sutkowego do kości w pojedynczej dawce sc. Wykazano, że denozumab zmniejszał poziom markera resorpcji kostnej N-telopeptydu (w moczu i osoczu) w ciągu jednego dnia. Spadek utrzymywał się do 84 dni (dla dawek 1.0 lub 3.0 mg/kg.). Dla porównania pamidronian podawany w dawce 90 mg drogą dożylną (iv) również zmniejszał przebudowę kostną lecz działanie utrzymywało się krócej. Denozumab był dobrze tolerowany [25]. Badania kliniczne II fazy z zastosowaniem denozumabu zostały przeprowadzone na 412 kobietach po menopauzie z niską masą kostną. Przez 2 lata wszystkie kobiety otrzymywały denozumab (w dawkach 6, 14, 30 mg) co 3 miesiące lub (14, 60, 100, 210 mg) co 6 miesięcy sc. Po 2 latach podawania denozumabu kobiety podzielono na 3 grupy badane. Grupa pierwsza otrzymywała badany lek co 6 miesięcy przez kolejne 2 lata. W grupie drugiej przerwano terapię, natomiast grupie trzeciej, po rocznej przerwie, ponownie podawano denozumab w odstępach sześciomiesięcznych przez okres roku. Czteroletnia terapia denozumabem u 262 pacjentek spowodowała wzrost copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 gęstości mineralnej kości BMD (ang. bone mineral density) kręgosłupa lędźwiowego o 9,4-11,8%, oraz biodra o 4,0-6,1%, a także zmniejszenie poziomu markerów przebudowy kostnej BTM (ang. bone turnover markers) w czasie stosowania. W ciągu pierwszych 12 m-cy od przerwania podawania denozumabu wykazano spadek BMD o 6,6% w kręgosłupie lędźwiowym i o 5,3% w biodrze, z jednoczesnym wzrostem BTM. Wznowienie leczenia denozumabem w tej grupie pacjentek spowodowało wzrost wartości BMD kręgosłupa lędźwiowego o 9% (licząc od wartości wyjściowych przed rozpoczęciem terapii) oraz redukcję BTM. Lek był dobrze tolerowany, a ilość zdarzeń niepożądanych była podobna jak po placebo [26]. W innym badaniu klinicznym II fazy działanie denozumabu porównywano z różnymi bisfosfonianami (zoledronian, pamidronian, ibandronian). W tym celu denozumab podawano 255 pacjentkom z przerzutami raka gruczołu sutkowego do kości. Wpływ denozumabu na przebudowę kości u tych pacjentek, w ciągu pierwszych 13 tygodni terapii, oceniano przez pomiar markera obrotu kostnego, tj. stosunek moczowego N-telopeptydu do moczowej kreatyniny (uNTx/Cr). Pacjentki otrzymywały lek drogą iniekcji podskórnych co 4 m-ce (30, 120 lub 180 mg) lub co 12 m-cy (60 lub 180 mg) przez okres 24 m-cy. Bisfosfoniany podawano co 4 tygodnie iv. Wykazano, że denozumab u 74% osób spowodował 65% zmniejszenie stosunku uNTx/Cr po 13 dniach stosowania, natomiast bisfosfoniany podobny rezultat wykazały u 63% chorych po 29 dniach. Nie stwierdzono żadnych poważnych działań niepożądanych po podawaniu denozumabu [27]. Obecnie prowadzone są dla denozumabu badania kliniczne III fazy, które zdecydują czy zostanie on wprowadzony do lecznictwa. Piśmiennictwo 1. Ostrowska Z et al. Przebudowa kości, system RANKL/ RANK/OPG a melatonina. Ann Acad Med Siles 2008; 62: 79-84. 2. Lorenc RS, Kryśkiewicz E. Szlak RANKL/RANK/OPG i jego znaczenie w fizjologii i patofizjologii kości. Terapia 2006; 14 (3): 58-63. 3. Kapczuk K, Sowińska-Przepiera E, Friebe Z. Układ Osteoprotegeryna/RANKL/RANK w aspekcie terapii osteoporozy pomenopauzalnej. Ginekol Pol 2003; 74(4): 323-31. 4. Janiec W. Farmakodynamika leków wpływających na układ kostny. W: Farmakodynamika. Podręcznik dla studentów farmacji. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2008; 858-908. 5. Wada T et al. RANKL-RANK signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Trends Mol Med 2006; 12(1): 17-25. 6. Murray RK, Granner DK. Biochemia komunikacji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej. Błony: struktura i funkcja. W: Biochemia Harpera. Red. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2008; 507-577. 7. Kłyszejko-Stefanowicz L. Błona plazmatyczna oraz białka powierzchni komórkowej. W: Cytobiochemia. Biochemia niektórych struktur komórkowych. Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2002; 219-286. 8. Collin-Osdoby P. Regulation of vascular calcification by osteoclast regulatory factors RANKL and osteoprotegerin. Circ Res 2004; 95(11): 1046-57. 9. Kim NS et al. Receptor activator of NF-kappaB ligand regulates the proliferation of mammary epithelial cells via Id2. Mol Cell Biol 2006; 26(3): 1002-13. 10.Lange AW, Yutzey KE. NFATc1 expression in the developing heart valves is responsive to the RANKL pathway and is required for endocardial expression of cathepsin K. Dev Biol 2006; 292(2): 407-17. 11.Zheng H et al. RANKL stimulates inducible nitricoxide synthase expression and nitric oxide production in developing osteoclasts. An autocrine negative feedback mechanism triggered by RANKL-induced interferon beta via NF-kappaB that restrains osteoclastogenesis and bone resorption. J Biol Chem 2006; 281(23): 15809-20. 12.Hofbauer LC, Shoppet M. Clinical implications of the Osteoprotegerin/RANKL/RANK system for bone and vascular diseases. JAMA 2004; 292(4): 490-5. 13.Anandarajah AP, Schwarz M. Anti-RANKL therapy for inflammatory bone disorders: Mechanisms and potential clinical applications. J Cell Biochem 2006; 97(2): 226-32. 14.Clohisy DR, Mantyh PW. Bone cancer pain and the role of RANKL/OPG. J Musculoskelet Neuronal Interact 2004; 4(3): 293-300. 15.Morony S et al. Osteoprotegerin inhibits vascular calcification without affecting atherosclerosis in ldlr(-/-) mice. Circulation 2008; 117(3): 411-20. 16.Kiechl S et al. Osteoprotegerin is a risk factor for progressive atherosclerosis and cardiovascular disease. Circulation 2004; 109(18): 2175-80. 17.Tintut Y, Demer L. Role of osteoprotegerin and its ligands and competing receptors in atherosclerotic calcification. J Investig Med 2006; 54(7): 395-401. 18.Gallagher JC. Advances in bone biology and new treatments for bone loss. Maturitas 2008; 60(1): 65-9. 19.Body JJ et al. A phase I study of AMGN-0007, a recombinant osteoprotegerin construct, in patients with multiple myeloma or breast carcinoma related bone metastases. Cancer 2003; 97(3 Suppl): 887-92. 20.Cundy T et al. Recombinant osteoprotegerin for juvenile Paget’s disease. N Engl J Med 2005; 353(9): 918-23. 21.Vega D, Maalouf NM, Sakhaee K. Clinical Review: the role of receptor activator of nuclear factor-kappaB (RANK)/ RANK ligand/osteoprotegerin: clinical implications. J Clin Endocrinol Metab 2007; 92(12): 4514-21. 22.Pettersen I et al. Osteoprotegerin is expressed in colon carcinoma cells. Anticancer Res 2005; 25(6B): 3809-16. 41 Farm Przegl Nauk, 2009,5 23.Body JJ et al. A study of the biological receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand inhibitor, denosumab, in patients with multiple myeloma or bone metastases from breast cancer. Clin Cancer Res 2006; 12(4): 1221-8. 24.Miller PD et al. Effect of denosumab on bone density and turnover in postmenopausal women with low bone mass after long-term continued, discontinued, and restarting of therapy: a randomized blinded phase 2 clinical trial. Bone 2008; 43(2): 222-9. Adres do korespondencji: Dorota Bolek ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec tel. (032) 364 15 40 e-mail: [email protected] 42 25.Lipton A et al. Randomized active-controlled phase II study of denosumab efficacy and safety in patients with breast cancer-related bone metastases. J Clin Oncol 2007; 25(28): 4431-7. 26.Kostenuik PJ. Osteoprotegerin and RANKL regulate bone resorption, density, geometry and strength. Curr Opin Pharmacol 2005; 5(6): 618-25. Farm Przegl Nauk, 2009,5, 43-46 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Wrażliwość radiacyjna mikroorganizmów Radiosensitivity of microorganisms Sławomir Wilczyński Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM w Katowicach Kierownik Katedry: dr hab. n. fiz. Barbara Pilawa Streszczenie Wyjaławianie ma na celu zabicie lub usunięcie ze środowiska lub materiału wszystkich drobnoustrojów w ich formach wegetatywnych i przetrwalnikowych. Problem jałowości szczególnego znaczenia nabiera w kontekście sterylności leków. Wybór metody wyjaławiana substancji leczniczych zależy od rodzaju, właściwości oraz sposobu ich produkcji. Zastosowanie promieniowania gamma do sterylizacji leków, także produktów spożywczych, materiałów do transplantacji, gleby i wielu innych, wynika z faktu, że wszystkie mikroorganizmy są w większym lub mniejszym stopniu wrażliwe na to promieniowanie [1]. Podstawowym parametrem, który wpływa na efektywność inaktywacji drobnoustrojów, a więc pośrednio na skuteczność sterylizacji, jest dawka zastosowanego promieniowania gamma [2,3-8]. Niemniej jednak promieniowanie gamma należy traktować jako uniwersalny, nieselektywny czynnik biobójczy działający w każdej dawce [3]. Na skuteczność procesu sterylizacji radiacyjnej wpływają trzy podstawowe parametry: poziom wstępnego zanieczyszczenia mikrobiologicznego, poziom SAL (Sterility Assurance Level), który chcemy osiągnąć i wrażliwość radiacyjna mikroorganizmów [9]. Jako czynniki potencjalnie patogenne, zanieczyszczające sterylizowane obiekty mogą być traktowane bakterie, grzyby, glony i wirusy. Abstract Sterilization is process leading to elimination from environment or material microbes both vegetative and spore forms. Microbial purity of drugs plays essential role in treatment. Depending on type, characteristics and way of production of pharmaceutics different methods of sterilizations are apply. It is possible to sterilize drugs, foodstuffs, transplantation materials, soil and many others with gamma radiation because all microorganisms are less or more radiosensitive [1]. The most important parameter which impacts on radiosterilization efficiency is dose of ionizating radiation [2, 3-8]. Nevertheless, ionizating radiation can be treat as non selective, universal lethal factor which acts irrespective of radiation dose [3]. The efficiency of ionizing radiation depend on free basic parameters: level of initial microbial contamination, sterility assurance level and microorganisms sensitivity [9]. Among potentially pathogenic factors bacteria, fungi and algae can be mentioned. Key words: ionizing radiation, microorganisms, dose of radiation Słowa kluczowe: promieniowanie jonizujące, mikroorganizmy, dawka promieniowania Wrażliwość radiacyjna bakterii Bakterie są najmniej wrażliwymi na promieniowanie gamma organizmami. Szczególnie oporne są bakterie wytwarzające przetrwalniki [2,9,10]. Generalnie można przyjąć, że im bardziej złożony organizm tym jest bardziej wrażliwy na promieniowanie gamma [2,11]. Wrażliwość bakterii na promieniowanie gamma zależy od typu, gatunku i szczepu bakterii [4], dawki promieniowania [2,3-9], w niewielkim stopniu od mocy dawki [2], temperatury napromieniowania, obecności tlenu, obecności wody, obecności sensybilizatorów lub protektorów (substancji uczulających bądź chroniących przed promieniowaniem gamma) [4-6,12]. Poszczególne gatunki bakterii bardzo różnią się między sobą pod względem wrażliwości radiacyjnej [2,3-8]. Generalnie można przyjąć, że bakterie Gram-dodatnie są zazwyczaj bardziej oporne niż baterie Gram-ujemne, co może wynikać z różnic w budowie ściany komórkowej [2]. Ponadto bardziej wrażliwe są bakterie tlenowe niż beztlenowe [2]. Wyniki otrzymane przez Farkas, Gazsó i Diósi [4] w badaniach mikroflory gleby wskazują, że dawka D10 [kGy] powodująca dziesięciokrotne zmniejszenie populacji dla badanych przez nich bakterii aerobowych waha się pomiędzy 0.8 a 2.44 kGy natomiast dla bakterii anaerobowych oscyluje w granicach 1.86-4.93 kGy. Dawki D10 dla różnych gatunków bakterii mogą się różnić o kilka rzędów wielkości. Dawki D10 dla bakterii za- 43 Farm Przegl Nauk, 2009,5 siedlających produkty spożywcze (mięso wołowe) Bacillus cereus, Staphylococcus aureus czy Escherichia coli wynoszą odpowiednio 0.663, 0.594 i 0.538 kGy [5]. Natomiast Gram-dodatnie bakterie z rodzaju Brevibacterium, naturalnie występujące w glebie, przeżywały napromieniowanie nawet dawką 40 kGy [11]. Do najbardziej opornych na promieniowanie gamma bakterii należy mutant popromienny Micrococcus radiodurans [2]. Parker i Vincent [13] wyizolowali z torfu bakterię podobną do Micrococcus radiodurans, która przetrwała napromieniowanie dawką 25 – 35 kGy. Nie tylko sam gatunek bakterii determinuje jej radiowrażliwość. Także poszczególne szczepy bakterii tego samego gatunku mogą bardzo znacznie różnić się wrażliwością radiacyjną [2,4]. Dla Escherichia coli różnica pomiędzy najbardziej a najmniej wrażliwym szczepem (Texas) w średniej dawce letalnej jest prawie trzykrotna [2]. Może to wynikać z faktu, że u różnych szczepów mogą występować różne mechanizmy naprawcze [14]. Kolejnym parametrem mogącym nieznacznie wpływać na skuteczność sterylizacji (wynikającej z wrażliwości bakterii) jest moc dawki [2]. Dawki podawane impulsowo lub w stosunkowo dużym przedziale czasowym mogą dać szansę na włączenie przez komórkę mechanizmów naprawczych, a więc zwiększyć przeżywalność bakterii. Z praktycznego punktu widzenia nie ma to jednak większego znaczenia, ponieważ wytwórcy starają się zdeponować jak największą dawkę w jak najkrótszym czasie, aby ze względów ekonomicznych jak najbardziej przyspieszyć ten etap technologiczny. Ponadto różnice we wrażliwości radiacyjnej nawet skrajnie różnych mocy dawki nie są duże [2]. Ogromne znaczenie w przebiegu procesu sterylizacji ma obecność lub brak wody w sterylizowanym obiekcie [2,4,5,12]. Wynika to faktu, iż promieniowanie gamma prowadzi do radiolizy wody, której produkty mogą działać letalnie na bakterie [5,8,9,11,12,15]. Pośród produktów radiolizy wody: eaq-, H3O+, ·OH, H, H2 i H2O2, największe zniszczenia u bakterii powoduje rodnik ·OH [12]. Powstające wolne rodniki (powstające zewnątrz- i wewnątrzkomórkowo [11]) zakłócają organizację biochemiczną organizmu, co prowadzi do śmierci komórki [9]. Między innymi niska zawartość wody może powodować małą wrażliwość na promieniowanie gamma przetrwalników bakterii [2]. Natomiast z drugiej strony, jeśli przetrwalniki (w obecności tlenu) znajdują się blisko stanu maksymalnego wysuszenia są bardzo wrażliwe na promieniowanie gamma [2]. McNamara, Black, Beresford i Parekh [11] zauważyli, że sterylizacja mokrej gleby jest efektywniejsza niż suchej ponieważ bakterie w mokrej glebie są bardziej wrażliwe na promieniowanie niż w suchej. Na wrażliwość radiacyjną bakterii ma również duży wpływ temperatura napromieniowania, a w przypadku produktów spożywczych także temperatura przechowywania produktów po napromieniowaniu [14,16]. Zmniejszanie temperatury powoduje unieruchomienie wolnych rodników, co prowadzi do zmniejszenia skuteczności pośredniego działania promieniowania gamma [14]. Dawka D10 dla Listeria monocytogenes napromieniowanej w -72°C była wyższa niż dla próbki napromieniowanej w 0°C – immobilizacja wolnych rodników zadziałała jako czynnik radiopro- 44 tekcyjny [14]. Dla Yersinia enterocolitica i Escherichia coli nie zaobserwowano takiego efektu [14]. Zwiększanie temperatury podczas napromieniowywania może zwiększać skuteczność sterylizacji poprzez synergistyczne działanie tych dwóch czynników wyjaławiających. Jednak metoda ta nie znajduje praktycznego zastosowania ze względu na duże koszty [2]. Zaobserwowano również wpływ środowiska (gazu w jakim prowadzi się napromieniowanie) na wrażliwość bakterii na promieniowanie gamma [6,12]. W literaturze szeroko prowadzi się dyskusję nad wpływem tlenu na wrażliwość radiacyjną mikroorganizmów – zjawisko to nazywane jest efektem tlenowym [6,12]. Porównując wrażliwość przetrwalników Clostridium botulinum typu E zaobserwowano, że najkorzystniejszym środowiskiem do ich niszczenia było powietrze [13]. Mniejszą skuteczność promieniowania gamma dla zarodników Clostridium botulinum zaobserwowano odpowiednio dla atmosfery N2O i N2 [13]. Wrażliwość przetrwalników Clostridium w powietrzu mogła wynikać z tworzenia się rodników peroksylowych i działania tlenu zawartego w powietrzu jako utleniacza [12]. Innym czynnikiem mogącym mieć wpływ na uwrażliwianie bakterii w środowisku tlenowym (powietrzu) jest aktywność ligazy DNA, która naprawia uszkodzony przez promieniowanie kwas deoksyrybonukleinowy. Enzym ten w środowisku tlenowym nie był w stanie połączyć rozerwanych łańcuchów DNA [12]. Efekt wpływu atmosfery napromieniowania na wrażliwość bakterii zaobserwowali również Borsa, Lacroix, Ouattara i Chiasson [6]. Wykazali oni, że zastosowanie środowiska składającego się z 60% tlenu, 30% dwutlenku węgla i 10% azotu (mieszanina MAP) powoduje zmniejszenie dawki D10 z 0.126 kGy (kontrola-powietrze) do 0.086 kGy (MAP) dla Escherichia coli oraz z 0.526 kGy (kontrola-powietrze) do 0.221 (MAP) dla Salmonella typhi [6]. Oprócz wyżej wspomnianych czynników ważnym elementem wpływającym na skuteczność przebiegu procesu wyjaławiania jest obecność różnych substancji chemicznych modyfikujących odpowiedź bakterii na promieniowanie gamma. Substancje te można podzielić na dwie grupy: substancje powodujące uwrażliwienie na promieniowanie gamma oraz substancje działające radioprotekcyjnie [6,12,17]. Do substancji mogących działać radioprotekcyjnie należą niektóre poliaminy. Poliaminy dzięki ładunkowi jaki posiadają, mogą łączyć się z kwasem deoksyrybonukleinowym. Takie połączenie zmienia konformację DNA i wpływa na mechanizmy naprawcze [17]. Do innych radioprotektorów można zaliczyć chlorek sodu czy tioglikolan sodu, które zwiększają przeżywalność gamma napromieniowanych przetrwalników Clostridium botulinum [12]. Jednym z mechanizmów działania radioprotekcyjnego niektórych substancji może być zmiatanie wolnych rodników i stabilizowanie helisy DNA [12]. Do substancji mogących zwiększać wrażliwość radiacyjną bakterii Borsa, Lacroix, Ouattara i Chiasson [6] zaliczyli tymol, karwakrol oraz aldehyd trans-cynamonowy. Już 0.1% (m/m) tymolu znacząco zwiększa wrażliwość Salmonella typhi zakażających mieloną wołowinę [6] Podobne, ale już nie takie spektakularne efekty zaobserwowano dla karwakrolu i aldehydu trans-cynamonowego [6]. copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Na wrażliwość bakterii na promieniowanie gamma wpływa również aktywność metaboliczna i faza cyklu życiowego mikroorganizmu [11]. Wrażliwość radiacyjna grzybów Grzyby są bardziej wrażliwe na promieniowanie gamma niż bakterie [2,7,11,15,18]. Podobnie jak w przypadku bakterii, także u grzybów można zauważyć znaczne różnice w oporności na promieniowanie gamma w zależności od gatunku [2,7,11,15]. Zarodniki, grzybnie, skleroty czy inne struktury morfologiczne mogą wykazywać różną wrażliwość radiacyjną [2]. Można przyjąć, że zarodniki są bardziej odporne niż formy wegetatywne, szczególnie zarodniki wielokomórkowe. Inną przyczyną zmniejszonej wrażliwości niektórych zarodników może być ich wielojądrzastość [2]. Podobnie jak w przypadku bakterii, zwiększanie dawki promieniowania gamma zwiększa skuteczność sterylizacji (zwiększa ilość inaktywowanych grzybów) [2,7,11,15]. W przypadku sterylizacji gleby dawka 10 kGy eliminuje większość (>99%) grzybów glebowych [7,11]. Niektóre gatunki grzybów, jak np. Aspergillus spp., zasiedlający stare książki i dokumenty, jest odporna nawet na dawkę 20 kGy [15]. Równie wysoką odpornością wykazuje się gatunek Cladosporium spp. Ciemny barwnik, melanina, pełni w wypadku tego gatunku rolę radioprotektora i zwiększa jego radioodporność [15]. Promieniowanie gamma stosowane jest także do sterylizacji (przede wszystkim odgrzybiania) zbóż [5]. Dawka 4 kGy powoduje całkowite usunięcie grzybów z ziaren Oryza sativa (ryż siewny) i Cicer arietinum (ciecierzyca pospolita) oraz eliminuje ryzyko zatrucia niebezpiecznymi toksynami produkowanymi przez niektóre gatunki grzybów zasiedlających te zboża [18]. Ponadto, zastosowanie takich dawek promieniowania gamma nie wpływa znacząco na potencjał kiełkowania tych zbóż [18]. Podobnie, jak w przypadku bakterii, zaobserwowano wpływ tlenu na skuteczność eliminacji grzybów. Zauważono, że dawka eliminująca 99.9% zarodni Rhizopus stolonifer zmienia się z 3 kGy w środowisku tlenowym do 4 kGy w środowisku beztlenowym [2]. Mechanizmy działania promieniowania gamma na mikroorganizmy Śmierć komórki pod wpływem promieniowania gamma nie jest natychmiastowa. Niektóre z funkcji komórki mogą być zachowane po gamma napromieniowaniu [2]. Związane jest to często z dużą odpornością enzymów, które mogą pozostać aktywne nawet po zaabsorbowaniu bardzo wysokich dawek promieniowania [2,11]. Zaobserwowano, że napromieniowanie gleby dawką 20 kGy, która skutecznie eliminuje zdecydowaną większość grzybów i bakterii, nie powoduje dezaktywacji enzymów [11]. Nawet po tak wysokiej dawce promieniowania gamma, fosfatazy, urazy, sacharozy czy inne enzymy proteolityczne pozostają aktywne jeszcze przez wiele tygodni [11]. Napromieniowanie gleby dawką 75 kGy zmniejszyło aktywność fosfataz do około 70% aktywności wyjściowej, dekarboksylaz o 0.5% w stosunku do aktywności wyjściowej, a aktywność ureaz nie uległa zmianie [11]. Podobnie jak w przypadku bakterii czy grzybów obecność wody zwiększa wrażliwość enzymów na promieniowanie gamma [11]. Komórka jest najbardziej wrażliwa na promieniowanie gamma w fazie S (podziału komórkowego) [2]. Promieniowanie gamma oddziaływując z mikroorganizmem może powodować jego uszkodzenia bezpośrednie (jonizacja powoduje uszkodzenia DNA <mutacje>, które często są letalne), może również działać pośrednio przez produkty jonizacji (radiolizy) wody czy innych struktur komórki. Wytworzone w ten sposób reaktywne formy tlenu (w tym wolne rodniki) mogą zaburzać działanie podstawowych struktur organizmu i prowadzić do śmierci komórki [11]. Większa odporność niektórych mikroorganizmów na promieniowanie gamma wynika z rozwiniętych mechanizmów naprawczych. Zmienione zasady azotowe są enzymatycznie wycinane, a brakujące elementy łańcucha DNA są odbudowywane na podstawie nici komplementarnej [2]. Niektóre mikroorganizmy, jak np.: jednokomórkowy glon Euglena gracilis posiada system chroniący DNA aktywowany światłem białym [19]. W przypadku niektórych mikroorganizmów (np.: Cladosporium spp.) funkcje radioprotekcyjne może pełnić produkowana i magazynowana w grzybni melanina [15]. Piśmiennictwo 1. Farkas J. Microbiological of irradiated foods. Int J Microbiol 1989; 9: 1-45. 2. Zagórski ZP. Sterylizacja radiacyjna. Warszawa: PZWL; 1991. 3. Katušin-Ražem B, Novak B, Ražem D. Microbiological decontamination of botanical raw materials and corresponding pharmaceutical products by irradiation. Rad Phys Chem 2001; 62: 261-275. 4. Farkas G, Gazsó LG, Diósi G. Radiosensitivity of subterranean bacteria in the Hungarian upper permian siltstone formation. J Env Rad 2002; 61: 233-239. 5. Jo C I wsp. Inactivation of foodborne pathogens in marinated beef rib by ionizing radiation. Food Microbiol 2004; 21: 543-548. 6. Borsa J i wsp. Radiosterilization: enhancing the radiation inactivation of foodborne bacteria. Rad Phys Chem 2004; 71: 135-139. 7. McNamara NP i wsp. The sensitivity of a forest soil microbial community to acute gamma-irradiation. Appl Soil Ecol 2007; 37: 1-9. 8. Ishii N i wsp. Takahashi S. Impact of gamma irradiation on the transformation efficiency for extracellular plasmid DNA. J Env Rad 2007; 97: 159-167. 9. Pourahmad R, Pakravan R. Radiosterilization of disposable medical devices. Radiat Phys Chem 1997; 49: 285286. 10. Ražem D, Katušin-Ražem B. Dose requirements for microbial decontamination of botanical materials by irradiation. Rad Phys Chem 2002; 63: 697-701. 11. McNamara NP i wsp. Effects of acute gamma irradiation on chemical, physical and biological properties of soils. Appl Soil Ecol 2003; 24: 117-132. 45 Farm Przegl Nauk, 2009,5 12. Lim YH, Hamdy MK, Toledo RT. Combined effects of ionizing-irradiation and different environments on Clostridium botulinum type E spores. Int Food Microbiol 2003; 89: 251-263. 13. Parker FE, Vincent JM. Sterilization of peat by gamma radiation. Plant Soil 1962; 94: 71-74. 14. Kamat A i wsp. Low-dose irradiation as a measure to improve microbial quality of ice cream. Int J Food Microbiol 2000; 62: 27-35. 15. Da Silva M i wsp. Inactivation of fungi from deteriorated paper materials by radiation. Int Biodeter Biodegr 2006; 57: 163-167. 16. Adu-Gyamfi A, Nketsia-Tabiri J, Apea Bah F. Radiosensitivities of bacterial isolates on minced chicken and poached chicken meal and their elimination following irradiation and chilled storage. Rad Phys Chem 2008; 77: 174-178. 17. Kim IG, Oh TJ. SOS induction of the recA gene by UV-, γ-irradiation and mitomycin C is mediated by polyamines in Escherichia coli K-12.Tox Lett 2000; 116: 143-149. 18. Maity JP i wsp. Radiation-induced effects on some common storage edible seeds in India infested with surface microflora. Rad Phys Chem 2004; 71: 1065-1072. 19. Hayashi H i wsp. Light dependency of resistance to ionizing radiation in Euglena gracilis. J Plant Physiol 2004; 161: 1101-1106. Adres do korespondencji: Sławomir Wilczyński Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM w Katowicach tel. 32-3641162, kom. 507169625; e-mail: [email protected] 46 Farm Przegl Nauk, 2009,5, 47-53 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Białko opiekuńcze GRP94 i jego rola w terapii nowotworów Chaperon GRP94 and its role in anti-cancer therapy Marzanna Cechowska-Pasko Zakład Biochemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku Kierownik Zakładu: Marzanna Cechowska-Pasko Streszczenie Summary Indukcja białek chaperonowych, należących do rodziny GRP (białka regulowane przez glukozę), jest mechanizmem obronnym komórek, adaptującym je do stresu retikuloendoplazmatycznego. Jednym z nich jest białko GRP94. Specyficzne warunki stresowe, niedobór glukozy czy hipoksja, w mikrośrodowisku guzów litych mogą prowadzić do indukcji GRP. Poznano budowę GRP94 oraz niektóre czynniki i mechanizmy regulujące jego ekspresję. Podczas gdy wzmożona ekspresja GRP może zmniejszać uszkodzenie organów narażonych na stres RE, ich indukcja w komórkach nowotworowych i antyapoptotyczne działanie może pobudzać rozwój nowotworów i powodować ich oporność na leki. Wyjaśnienie funkcji GRP i regulacji ich syntezy otwiera nowe możliwości w leczeniu nowotworów oraz chorób związanych z zaburzeniami homeostazy siateczki endoplazmatycznej. The induction of chaperon proteins, which belong to GRPs (glucose-regulated proteins) family, is a mechanism which protects the cells against the endoplasmic reticulum stress. GRP94 is a member of GRPs family. Solid tumours are often placed under stress conditions, such as glucose starvation and hypoxia. These conditions result in enhanced expression of GRPs. The structure as well as some factors and mechanisms which regulate the expression of GRP94 were described. Whereas GRPs overexpression could limit damage in organs exposed to ER stress, the anti-apoptotic function of the GRPs also predicts that their induction in neoplastic cells could lead to cancer progression and drug resistance. The explanation of GRPs function and regulation of their synthesis create new therapeutic possibilities in neoplasm diseases and those induced by endoplasmic reticulum stress. Słowa kluczowe: białka chaperonowe, GRP94, siateczka endoplazmatyczna, terapia nowotworów Key words: chaperons, GRP94, endoplasmic reticulum, anti-cancer therapy Wstęp Formowanie struktury przestrzennej białka i jej stabilność jest w dużym stopniu uzależniona od ich interakcji z białkami opiekuńczymi (ang. molecular chaperones). Chaperony wiążą się w sposób odwracalny z niesfałdowanym fragmentem polipeptydu, który w innym przypadku mógłby służyć jako ośrodek agregacji lub błędnego fałdowania nowopowstałych cząsteczek. Białka, które wchodzą w interakcję z chaperonami, są określane jako ich substraty. Białka opiekuńcze wiążą się z częściowo sfałdowanymi łańcuchami umożliwiając im kontynuację zwijania się w sposób najbardziej korzystny energetycznie. Pomagają białkom w porządkowaniu ich struktury przestrzennej, a niektóre z nich chronią białka komórkowe przed skutkami działania czynników stresowych; hipertermii, głodu, niedotlenienia, infekcji, toksyn, promieniowania UV. [1,2] Białka opiekuńcze cechują się wysokim powinowactwem do hydrofobowych odcinków łańcuchów polipeptydowych i wykazują aktywność ATP-azową [1,3]. Występują one w cytosolu, w organellach cytoplazmatycznych, takich jak: mitochondria i siateczka endoplazmatyczna oraz w jądrze komórkowym [1,3-5]. Fałdowanie bądź renaturacja białek wymaga energii w postaci ATP. W jej uwalnianiu uczestniczy aktywność ATP-azowa chaperonów. Niedobór glukozy pobudza ekspresję różnych białek opiekuńczych w siateczce śródplazmatycznej, tzw. GRPs (glucose-regulated proteins) [6,7]. Jednym z nich jest białko GRP94 [8]. Wartość liczbowa, następująca po symbolu GRP, oznacza masę cząsteczkową tego białka, wyrażoną w kilodaltonach. Indukcja białek należących do rodziny GRP jest mechanizmem obronnym komórek, przystosowującym je do stresu retikuloendoplazmatycznego (stres RE), powodowanego głównie przez niedobór tlenu [5] i niedostatek glukozy, jako substratu energetycznego [9-11]. Budowa GRP94 Dojrzałe szczurze białko GRP94 składa się z 782 reszt aminokwasowych. Monomeryczna postać tego białka powstaje po odcięciu sekwencji sygnałowej, złożonej z 21 reszt aminokwasowych. W białku tym można wyróżnić kilka domen strukturalnych (Ryc.1), ale ich znaczenie funkcjonalne nie zostało dotąd dostatecznie poznane. Sekwen- 47 Farm Przegl Nauk, 2009,5 Ryc.1. Model struktury GRP94. Dwa monomery tego białka asocjują ze sobą za pomocą domeny dimeryzacji tworząc dimer. Sekwencja N-końcowa i C-końcowy tetrapeptyd KDEL są odpowiedzialne za kierowanie GRP94 do siateczki śródplazmatycznej. N-końcowa domena jest miejscem miejscem wiązania nukleotydów, antybiotyków (geldanamycyna, radicicol) oraz oligosacharydów (CHO). Pierwsza z domen kwasowych jest odpowiedzialna za regulację wiązania leków. Aminokwasy od 421 do 448 tworzą 7 powtarzających się sekwencji, podobnych do tzw. „suwaka leucynowego”, które mogą być odpowiedzialne za interakcje białko-białko. Domena ta posiada trzy miejsca glikozylacji (XXX). Następna domena o nieznanej funkcji, od 559 do 609 aminokwasu, zawiera sekwencję KEKE, która prawdopodobnie odpowiada za interakcje między białkami [12]. Fragment C-końcowy, zbudowany z 60 aminokwasów, stanowi drugą domenę kwasową, homologiczną z domenami występującymi w wielu białkach jądrowych, także w czynnikach transkrypcyjnych, regulujących funkcję polimerazy RNA. cja aminokwasowa N-końcowej domeny GRP94 wykazuje wysoki stopień homologii do innego białka chaperonowego; HSP90. Jest ona miejscem wiązania nukleotydów, oligosacharydów oraz antybiotyków (geldanamycyna, radicicol). Po niej występuje domena kwasowa, która w GRP94 jest krótsza niż w homologicznej domenie HSP90. Jest ona odpowiedzialna za regulację wiązania leków. Aminokwasy od 421 do 448 tworzą 7 powtarzających się sekwencji, podobnych do tzw. „suwaka leucynowego”, które mogą być odpowiedzialne za interakcje białko-białko. Domena ta posiada trzy miejsca glikozylacji (Ryc.1). Następna domena o nieznanej funkcji, od 559 do 609 aminokwasu, zawiera sekwencję Met-Gln-Met-Gln, wyrażaną w jednoliterowym kodzie aminokwasowym, jako KEKE, która prawdopodobnie odpowiada za interakcje między białkami [12]. Fragment C-końcowy, zbudowany z 60 aminokwasów, stanowi drugą domenę kwasową, homologiczną z domenami występującymi w wielu białkach jądrowych, także w czynnikach transkrypcyjnych, regulujących funkcję polimerazy RNA. N-końcowa sekwencja sygnałowa i C-końcowy tetrapeptyd Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL w kodzie jednoliterowym) kierują GRP94 do siateczki endoplazmatycznej. Białko to występuje w postaci dimeru (Ryc.1) [13]. Asocjację monomerów składowych umożliwiają fragmenty C-końcowe, zwane domenami dimeryzacji (23 kDa), a ściślej 44aminokwasowy fragment tej domeny wykazuje autonomiczną aktywność dimeryzacji na drodze interakcji hydrofobowych [8]. Posttranslacyjne modyfikacje GRP94 GRP94 jest glikoproteiną, która posiada sześć potencjalnych miejsc glikozylacji. Są nimi atomy azotu zawarte w grupach amidowych reszt asparaginy (Asn), ale zazwyczaj tylko Asn196 jest glikozylowana [14]. W warunkach fizjologicznych GRP94 występuje w siateczce śródplazmatycznej. W łańcuchach oligosacharydowych dominuje mannoza. Są one wrażliwe na hydrolityczne działanie endoglikozydazy H. W warunkach fizjologicznych GRP94 jest w małym stopniu glikozylowane. Proces ten nasila się, kiedy ekspresja 48 tego białka rośnie [15]. Glikozylacja GRP94 nie jest warunkiem jego zdolności do interakcji z substratami białkowymi. Zaobserwowano bowiem, iż nawet nieglikozylowane GRP94 może także asocjować z nowo powstającymi polipeptydami [16]. GRP94 może być fosforylowane. Miejscem wiązania fosforanu są reszty serylowe i treonylowe, natomiast reszty tyrozylowe nie ulegają fosforylacji. Nie jest poznany mechanizm enzymatyczny tego procesu. In vitro fosforylacja GPR94 jest katalizowana przez kinazę kazeinową II [17], jednak nie wykryto tego enzymu w siateczce śródplazmatycznej. Fosforylacja reguluje aktywność GRP94. Przykładem jest zanik zdolności fosforylowanego GRP94 do interakcji z lekkimi łańcuchami immunoglobulin [16]. Wiązanie wapnia GRP94 jest białkiem zdolnym do wiązania dużej ilości wapnia, chociaż powinowactwo tego białka do Ca2+jest niewielkie. Jest ono jednym z głównych białek regulujących homeostazę wapnia w siateczce śródplazmatycznej. Posiada 15 miejsc wiązania Ca2+, z których 4 wykazują umiarkowane powinowactwo (KD ~2 µM) i 11 niskie powinowactwo (KD ~600 µM) [18]. Miejsca wiązania wapnia są rozmieszczone w kilku ujemnie naładowanych rejonach monomeru GRP94. Związanie wapnia z GRP94 moduluje strukturę i aktywność tego białka. In vitro, obecność Ca2+ w stężeniu 100 nM powoduje zmianę konformacji, polegającą na zmniejszeniu udziału struktury α-helikalnej z 40% do 34% [18]. Oczyszczone GRP94, in vitro, w obecności Ca2+wiąże kalmodulinę, hamując tą drogą jego interakcję z filamentami aktynowymi [19]. Jest prawdopodobne, że związanie wapnia reguluje interakcje GRP94 z białkami siateczki śródplazmatycznej także in vivo. Wiązanie leków/ATP N-końcowy, 35 aminokwasowy fragment dojrzałego białka GRP94 wykazuje unikatową sekwencję, bez cech homologii z HSP90 (Fig.1), podczas gdy sekwencja 35-274 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 jest wysoce homologiczna do fragmentu 9-236 ludzkiego HSP90 oraz do fragmentu 1-220 HSC82 drożdży [20,21]. W HSP90 ta domena odpowiadająca za fałdowanie białek, pośredniczy w wiązaniu trzech strukturalnie niepodobnych małych cząsteczek: ATP oraz leków przeciwnowotworowych: geldanamycyny i radicicolu. Wszystkie trzy cząsteczki wiążą się z tym samym miejscem w cząsteczce GRP94. Miejsce wiązania tworzy wiele helis, które są ułożone na powierzchni utworzonej przez strukturę pofałdowanej kartki. W GRP94 wszystkie reszty aminokwasowe, zaangażowane w tworzenie miejsc wiążących są wysoce konserwatywne, wiążą geldanamycynę i radicicol na drodze mechanizmu zależnego od ATP [22]. Zapotrzebowanie na wiązanie ATP/ leków jest różne pomiędzy HSP90 i GRP94. Podczas gdy w HSP90 N-końcowa domena jest wystarczająca do wiązania, w GRP94 dodatkowo konieczna jest pierwsza kwasowa domena (266-347) [22]. Ta różnica pomiędzy GRP94, a HSP90 może mieć znaczenie w przypadku kiedy lek musi rozróżnić te dwa białka. Wykazano, że związanie geldanamycyny przez GRP94 ma ważne funkcjonalne konsekwencje. Wykazano, że kompleks GRP94 z geldanamycyną i białkiem erbB2 – jednym z substratów tego chaperonu, rozpada się i substrat jest kierowany do degradacji w proteasomach [23,24]. Wiązanie radicicolu wywołuje podobny efekt na losy lekkich łańcuchów immunoglobulin, które są także substratem tego chaperonu. Wiązanie białek Zasadniczą różnicą pomiędzy GRP94 a białkami opiekuńczymi takimi jak GRP78 czy kalneksyna jest fakt, że GRP94 wchodzi w interakcje ze ściśle określonymi substratami białkowymi. Podczas gdy GRP78 rozpoznaje i wiąże się z dużą liczbą białek, które podlegają fałdowaniu w siateczse śródplazmatycznej, kalneksyna rozpoznaje glikanową część wspólną dla wielu glikoprotein, GRP94 asocjuje ze ściśle określonymi kilkoma białkami: z łańcuchami immunoglobulin [25], z białkiem MHC klasy II [26], tyreoglobuliną [27], białkiem erbB2 [23], glikoproteinami herpes virus [28], z apolipoproteiną B [29], kolagenem [30], białkiem C [31] oraz białkiem BSDL [32]. Nie oddziaływuje natomiast z wieloma innymi glikoproteinami wirusowymi, nawet z białkiem MHC klasy I. Przypuszczalnie ta specyficzność substratowa jest funkcją struktur białkowych, które GRP94 rozpoznaje. Interakcje z łańcuchami lekkimi immunoglobulin jest relatywnie dobrze zbadana. Preferowanym substratem jest prekursor w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego, połączony wiązaniami siarczkowymi [33,34]. Asocjacja z GRP94 występuje przez większość czasu, kiedy łańcuchy lekkie immunoglobulin przebywają w siateczce śąródplazmatycznej, w przeciwieństwie do interakcji z GRP78, które występują w pierwszych kilku minutach po zsyntetyzowaniu immunoglobulin [33]. Podczas syntezy MHC klasy II, GRP94 wiąże się z prekursorem w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego [26]. W przypadku esterazy cholesterolowej GRP94 wiąże się mocno z natywnym białkiem i transportuje je. GRP94 wydaje się asocjować z prekursorem białka w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego czy z niekompletnie utworzonym oligomerem, ale nigdy z formą wczesną fałdującego się białka. Ta preferencja łączenia się ze sfałdowanym prekursorem białka jest również zgodna z preferencjami HSP90 do substratów podczas rozwijania ich struktury in vitro [35-37]. Podczas wiązania z białkiem w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego GRP94 uczestniczy w jego zatrzymywaniu w siateczce śródplazmatycznej, podobnie jak inne białka opiekuńcze, ale brak na to bezpośrednich dowodów. Inną cechą oddziaływań GRP94 z białkami jest fakt, że każdy z jego substratów białkowych wykazuje zdolność do interakcji zarówno z GRP78 jak i kalneksyną [26,27,30,33,38]. Spostrzeżenia te sugerują, iż w ochronie nowosyntetyzowanych białek i w ułatwianiu ich fałdowania współdziałają różne białka opiekuńcze. Przez analogię do HSP90 jest prawdopodobnym, że działanie GRP94 nasila się poprzez interakcje z innymi białkami opiekuńczymi. Ponadto, nie ma dowodów na istnienie w siateczce śródplazmatycznej homologów, zasocjowanych z HSP90 białek tj. p23, Hop, FKBP51 czy Cyp40 [39,40]. Podsumowując, GRP94 jest specyficznym białkiem opiekuńczym, zaangażowanym w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego prekursorów syntezowanego białka, który współpracuje z innymi białkami opiekuńczymi. Zatem, w świetle siateczki śrórplsazmatycznej występuje system chaperonów bardzo podobny w komórkach eukariotycznych, jak i u bakterii, gdzie GRP94 bierze udział w procesie fałdowania, jako „kończące” białko opiekuńcze [34]. Ważnym celem dalszych badań jest sprecyzowanie cech strukturalnych, które powodują wiązanie GRP94. Wiązanie peptydów Liczne dowody sugerują, że GRP94 wiąże peptydy. Najbardziej przekonywujących dowodów dostarczają badania immunologiczne Srivastava i wsp. [41], Arnolda i wsp. [42] oraz elucja antygenu peptydowego pochodzącego z oczyszczonego GRP94 z komórek zainfekowanych wirusem pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej – VSV [43]. W innym układzie doświadczalnym Lammerta i wsp. [44] wprowadzono światłoczułe peptydy do cytosolu używając streptolizyny O. Peptydy te asocjowały tylko z kilkoma białkami siateczki śródplazmatycznej. Głównym akceptorem była izomeraza disiarczkowa oraz GRP94 [44]. Większość z tych peptydów posiada właściwości peptydów przenoszonych przez białka transportujące w siateczce śródplazmatycznej związane z prezentacją antygenu. Ponadto badano grupę białek, które były systematycznie mutowane w pozycji 2 i 9. GRP94 przyłączał się preferencyjnie do peptydów z aminokwasami pozbawionymi ładunku w tych pozycjach [45]. Te badania wykazały specyficzność wiązania peptydów przez GRP94. Peptydy wiążące się z GRP94 wchodzą do siateczki endoplazmatycznej zarówno przy udziale białek transportujących, związanych z prezentacją antygenu (TAP) jak i drogą niezależną od tych transporterów, co sugeruje że GRP94 włącza je do całkowitej puli peptydów siateczki śródplazmatycznej [44-46]. Nie znaleziono wspólnego fragmentu 49 Farm Przegl Nauk, 2009,5 znajduje się miejsce wiązania peptydu. Prawdopodobnie występują inne czynniki zaangażowane in vivo, które ułatwiają te procesy. Obecny stan wiedzy na temat aktywności wiązania peptydów przez GRP94 nie pozwala określić zakresu substratów białkowych oraz ich preferencji do fałdowania prekursorów. Badania białka HSP90 wykazały, że posiada ono oddzielne miejsca wiązania peptydów, jedno na każdym końcu cząsteczki [49,50] oraz dodatkowo C-końcowa domena może wiązać białka zawierające powtarzający się fragment (tetratrico peptide repeat – TPR) [51]. Prawdopodobnie GRP94 jest zbudowany podobnie, posiada miejsce wiązania peptydów oddzielone od domeny interakcji z innymi białkami. Rola ATP w funkcjonowaniu GRP94 Zasadniczym problemem w badaniach nad GRP94 i innymi białkami z grupy HSP90, jest relacja pomięRyc.2. Indukcja GRP i ochrona komórki. Stres retikuloendoplazmatyczny aktywuje transkrypcję genów wiązaniem substratu, GRP za pośrednictwem sekwencji ERSE, czego skutkiem jest wzrost ekspresji białek chaperonowych. dzy Pobudzanie promotora GRP może być wykorzystane do transkrypcji celowanej w terapii genowej. Eks- a wiązaniem i hydrolizą ATP. presja GRP może być blokowana na poziomie transkrypcji przez leki hamujące ich syntezę np. geniste- Wszystkie białka opiekuńina. Stabilność i translacja GRP może być także hamowana przez stosowanie wektorów z rybozymami, czewiążące peptydy, któczy antysensami. Hamowanie syntezy GRP w warunkach stresu retikuloendoplazmatycznego prowadzi rych działanie jest poznane do podwyższonej cytotoksyczności i apoptozy. w szczegółach, wykazują akw budowie tych peptydów, który wymusza wiązanie się tywność ATP-azową. Wykazano, że GRP94 wiąże [52,53] z GRP94. Nawet w przypadku kiedy średnio powinowac- i hydrolizuje ATP [54]. Jednak aktywność ATP-azowa GRP94 two GRP94 do peptydów jest 10 razy niższe niż do MHC jest niższa niż GRP78, a zdolność do wiązania ATP jest przyklasy I, nadmiar GRP94 (i innych białek wiążących peptydy najmniej 20 razy słabsza niż w przypadku GRP78 [53]. Pow świetle ER) działa jak „zlew” znacznie zmniejszający nadto wiązanie peptydów in vitro przez GRP94 jest niezależne pulę wolnych peptydów w świetle siateczki śródplazma- od ATP [55], asocjacja z łańcuchami immunoglobulin in vivo tycznej. Nie ma wyraźnych przesłanek, że GRP94 asocjuje jest utrzymywana nawet, gdy zawartość ATP w komórce jest z kompleksami białek TAP jak również nie jest bezpośred- bardzo niska [25]. Dlatego rola nukleotydów adeninowych nio przyciągany przez klasę I peptydów [47]. w funkcjonowaniu GRP94 jest ciągle nieznana. Wiązanie GRP94 przez peptydy in vitro powoduje zmiany konformacyjne, które wykazano przez rosnące wiązanie barwników hydrofobowych, fluorescencji Trp i wrażliwości na proteazy [48]. Obecne badania nie pozwalają na wyznaczenie powinowactwa GRP94 do peptydów, ale umożliwiają wyjaśnienie mechanizmu wiązania peptydów. Jest bardzo ważnym wyznaczenie, dlaczego przyłączenie peptydu do GRP94 jest nieefektywne w porównaniu z białkami opiekuńczymi takimi jak GRP78, jaki mechanizm prowadzi do odłączenia peptydu i w jakiej części cząsteczki GRP94 50 GRP jako cel chemioterapii nowotworów Podczas gdy wzmożona ekspresja GRP może zmniejszać uszkodzenie organów narażonych na stres ER, ich indukcja w komórkach nowotworowych i antyapoptotyczne działanie może pobudzać rozwój nowotworów i powodować ich oporność na leki (Ryc.2). W różnych liniach komórek nowotworowych i w guzach ludzkich, poziom GRP78 i GRP94 jest podwyższony i koreluje ze złośliwością guza [7,56]. Dodatkowo wykazano, że wzmożona indukcja GRP78 chroni ko- copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 mórki nowotworowe, podczas gdy zahamowanie ekspresji tego białka nasila apoptozę, hamuje wzrost guza i zwiększa podatność na działanie czynników cytotoksycznych [7,57]. Dlatego celowane hamowanie ekspresji i funkcji GRP w komórkach nowotworowych jest nowym kierunkiem w chemioterapii nowotworów. Genisteina, flawonoid o działaniu przeciwnowotworowym, zmniejsza syntezę GRP, hamuje wzrost guzów indukowanych karcynogenami u szczurów oraz komórek ludzkiej białaczki, przeszczepianych do myszy [58]. Wykazano także, że GRP94 asocjuje z erbB2 (także określany jako HER-2/neu), który ulega powszechnie ekspresji w raku sutka i jest związany ze złym rokowaniem [59]. Traktowanie komórek raka sutka geldanamycyną pobudza rozpad kompleksów GRP94-p185 i degradację p185. Indukcja GRP w wielu liniach ludzkich komórek nowotworowych nadaje im oporność na leki będące inhibitorami topoizomerazy II (np. etoposid) [60,61]. Bezpośrednie hamowanie syntezy GRP94 metodą wbudowywania antysensów skutkuje zwiększoną wrażliwością na cytotoksyczne działanie leku cytostatycznego - etoposidu [62]. Apoptozie wywołanej przez etoposid towarzyszy proteoliza GRP94 katalizowana przez kalpainę, która także trawi antyapoptotyczne białko Bcl -xL, przekształcając je w białko proapoptotyczne [62,63]. Specyficzne warunki stresowe w mikrośrodowisku guzów litych mogą prowadzić do indukcji GRP. Funkcja chaperonowa GRP jest konieczna do ich działania cytoprotekcyjnego. Prawdopodobnie zatrzymują one nowo syntetyzowane receptory czynników wzrostowych w siateczce śródplazmatycznej. Wynikający stąd niedobór receptorów błonowych prowadzi do zahamowania podziału komórek w fazie G1 i oporności na leki cytotostatyczne działające w fazie S cyklu komórkowego [60]. Inny mechanizm ochrony, w którym pośredniczą GRP, polega na ich interakcji z czynnikami proapoptotycznymi, co zmniejsza ich aktywność a w konsekwencji skuteczność farmakoterapii nowotworów. Rola GRP w immunoterapii Wykazano, że GRP94 towarzyszy wielu peptydom, zarówno tym, które powstają przez degradację białek prawidłowych, jak i białek nowotworowych, bakteryjnych, czy wirusowych [64]. Nowotworowy GRP94 przenosi peptydy antygenowe guza na powierzchnię komórki. W podobny sposób GPR94 syntetyzowany w komórkach zainfekowanych przez wirusy przenosi antygeny wirusowe na powierzchnię komórki. Procesy te noszą nazwę prezentacji antygenu. W warunkach prawidłowych GRP94 jest zlokalizowany wewnątrz komórki. Rozpad komórek nekrotycznych uwalnia kompleksy GRP94-peptyd, które są przenoszone na powierzchnię żywych komórek. Prezentacja antygenów peptydowych na powierzchni komórek prowadzi do stymulacji limfocytów T i odpowiedzi prozapalnej. Kompleksy GRP94 z peptydami wywołują odpowiedź immunologiczną specyficzną dla chronionych przez GRP94 antygenów peptydowych [65]. Nie obserwowano autoimmunizacji, co sugeruje, że odpowiedź immunologiczna jest skierowana przeciwko peptydom, a nie przeciwko GRP94. Wykorzystując wnioski z badań na zwierzętach podjęto próbę immunizacji pacjentów onkologicznych kompleksami GRP94-peptyd, pochodzącymi z ich własnych nowotworów. Ten eksperyment terapeutyczny stwarza perspektywę uzyskania specyficznej szczepionki, przydatnej w immunoterapii ludzkich nowotworów [65]. Ostatnio wykazano, że także inne białko z rodziny GRP, określane symbolem GRP170/ORP150, jest skuteczne jako szczepionka przeciwnowotworowa [66]. Promotor genu GRP78 w przeciwnowotworowej terapii genowej W agresywnych nowotworach na skutek niedokrwienia i braku składników odżywczych miejscowo rozwija się hipoksja i kwasica. W tych warunkach dochodzi do specyficznej aktywacji promotora genu GRP78. Użycie indukowanego przez stres promotora GRP78, jako nośnika w celu wprowadzenia terapeutycznego genu samobójczego, otwiera nowe możliwości terapii genowej słabo unaczynionych guzów czy chorób niedokrwiennych. Enzym, kodowany przez terapeutyczny gen samobójczy, umożliwia przekształcenie nieaktywnego proleku w aktywny lek, którego działanie zwiększa wrażliwość komórki nowotworowej na chemio- lub radioterapię, prowadząc w konsekwencji do jej śmierci. Promotor GRP78 cechuje się wyższą efektywnością niż promotory wirusowe w niszczeniu dużych guzów, np. doświadczalnych mysich nowotworów: włókniakomięsaka i raka sutka [67,68]. Dodatkowo promotor genu GRP78 jest zawsze pobudzany w przebiegu terapii laserowej (terapia fotodynamiczna), która pobudza rozwój stresu oksydacyjnego i niedokrwienie in vivo [69], umożliwiając kontrolowaną ekspresję genu terapeutycznego. Praktyczne aspekty badań nad białkami opiekuńczymi Odkrycie GRP78 i GRP94 zapoczątkowało gwałtowny rozwój wiedzy na temat syntezy i funkcji GRP w hodowlach komórkowych. Współczesne badania skupiają się na fizjologicznej roli GRP in vivo i zmierzają do poznania ich roli w patomechanizmie i farmakoterapii chorób nowotworowych. Już wiadomo, że indukcja chaperonów w komórkach nowotworowych i ich antyapoptotyczne działanie może pobudzać rozwój nowotworów i powodować ich oporność na leki. Postęp w badaniach nad farmakologiczną regulacją syntezy GRPs otwiera nowy kierunek w leczeniu nowotworów oraz chorób związanych z zaburzeniami homeostazy siateczki endoplazmatycznej. Piśmiennictwo 1. Wójcik C, Moskalewski S. Wybrane procesy cytoplazmatyczne. W: Seminaria z cytofizjologii dla studentów medycyny, weterynarii i bologii. Red. Kawiak J, Zabel M Urban & Partner. Wrocław 2002, 214-215. 2. Widłak W. Odpowiedź na stres komórkowy I ekspresja genów Hsp 70 w męskich komórkach rozrodczych. Postepy Biochem 2006; 52: 289-295. 51 Farm Przegl Nauk, 2009,5 3. Marzec Ł i wsp.: Białka szoku termicznego 72 (Hsp72) w chorobach nerek. Nefrol Dial Pol 2007; 11: 78-82. 4. Little E i wsp.: The glucose- regulated proteins (GRP78 and GRP94): functions, gene regulation, and applications. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1994; 4: 1-18. 5. Cechowska-Pasko M, Bańkowski E, Chene P. The effect of hypoxia on the expression of 150 kDa oxygen-regulated protein (ORP 150) in HeLa cells. Cell Physiol Biochem 2006; 17: 89-96. 6. Lee AS. Mammalian stress response: induction of the glucose-regulated protein family. Curr Opin Cell Biol 1992; 4: 267–273. 7. Little E i wsp.: The glucose-regulated proteins (GRP78 and GRP94): functions, gene regulation, and applications. Crit Rev Eukaryotic Gene Expr 1994; 4: 1–18. 8. Wearsch PA, Nicchitta CV. Endoplasmic reticulum chaperone GRP94 subunit assembly is regulated through a defined oligomerization domain. Biochemistry 1996; 35: 16760–16769. 9. Cechowska-Pasko M, Bańkowski E, Chene P. Glucose effect on the expression of 150 kDa oxygen-regulated protein in HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun 2005; 337: 992-997. 10. Cechowska-Pasko M, Pałka J, Bańkowski E. Glucose-depleted medium reduces the collagen content of human skin fibroblast cultures. Mol Cell Biochem 2007; 305: 79-85. 11. Cechowska-Pasko M, Surażyński A, Bańkowski E. The effect of glucose deprivation on collagen synthesis in fibroblast cultures. Mol Cell Biochem 2009; 327: 211-218. 12. Realini C, Rogers SW, Rechsteiner M. KEKE motifs. Proposed roles in protein–protein association and presentation of peptides by MHC class I receptors. FEBS Lett 1994; 348: 109–113. 13. Wearsch PA, Nicchitta CV. Purification and partial molecular characterization of GRP94, an ER resident chaperone. Prot Expr Pur 1996; 7: 114–121. 14. Qu D, Mazzarella RA Green M. Analysis of the structure and synthesis of GRP94, an abundant stress protein of the endoplasmic reticulum. DNA Cell Biol 1994; 13: 117–124. 15. Lenny N, Green M. Regulation of endoplasmic reticulum stress proteins in COS cells transfected with immunoglobulin u heavy chain cDNA. J Biol Chem 1991; 266: 20532–20537. 16. Melnick J. Duke Univ, PhD thesis 1995. 17. Cala SE, Jones LR. GRP94 resides within cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles and is phosphorylated by casein kinase II. J Biol Chem 1994; 269: 5926–5931. 18. Van PN, Peter F, Soling HD. Four intracisternal calcium-binding glycoproteins from rat liver microsomes with high affinity for calcium. No indication for calsequestrin-like proteins in inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive calcium sequestering rat liver vesicles. J Biol Chem 1989; 264: 17494–17501. 19. Koyasu S i wsp.: HSP100, a 100-kDa heat shock protein, is a Ca2+-calmodulin-regulated actin-binding protein. J Biol Chem 1989; 264: 15083–15087. 20. Stebbins CE i wsp.: Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex: targeting of a protein chaperone by an antitumor agent. Cell 1997; 89: 239–250. 21. Prodromou C i wsp.: A molecular clamp in the crystal structure of the N-terminal domain of the yeast Hsp90 chaperone. Nat Struct Biol 1997; 4: 477–482. 52 22. Schulte TW i wsp.: Interaction of radicicol with members of the HSP90 family of molecular chaperones. Mol Endocrinol 1999; 13: 1435-1448. 23. Chavany C i wsp.: p185erbB2 binds to GRP94 in vivo. Dissociation of the p185erbB2/GRP94 heterocomplex by benzoquinone ansamycins precedes depletion of p185erbB2. J Biol Chem 1996; 271: 4974–4977. 24. Mimnaugh EG, Chavany C, Neckers L. Polyubiquitination and proteasomal degradation of the p185c-erbB-2 receptor protein-tyrosine kinase induced by geldanamycin. J Biol Chem 1996; 271: 22796–22801. 25. Melnick J, Aviel S, Argon Y. The endoplasmic reticulum stress protein GRP94, in addition to BiP, associates with unassembled immunoglobulin chains. J Biol Chem 1992; 267: 21303–21306. 26. Schaiff WT i wsp.: HLA-DR associates with specific stress proteins and is retained in the endoplasmic reticulum in invariant chain negative cells. J Exp Med 1992; 176: 657–666. 27. Kuznetsov G, Chen LB, Nigam SK. Several endoplasmic reticulum stress proteins, including ERp72, interact with thyroglobulin during its maturation. J Biol Chem 1994; 269: 22990–22995. 28. Ramakrishnan M i wsp.: Conformation-defective herpes simplex virus 1 glycoprotein B activates the promoter of the grp94 gene that codes for the 94-kD stress protein in the endoplasmic reticulum. DNA Cell Biol 1995; 14: 373–384. 29. Linnik KM, Herscovitz H. Multiple molecular chaperones interact with apolipoprotein B during its maturation. The network of endoplasmic reticulum-resident chaperones (ERp72, GRP94, calreticulin, and BiP) interacts with apolipoprotein b regardless of its lipidation state. J Biol Chem 1998; 273: 21368–21373. 30. Ferreira LR i wsp.: Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. J Cell Biochem 1994; 56: 518–526. 31. Katsumi A i wsp.: Protein C Nagoya, an elongated mutant of protein C, is retained within the endoplasmic reticulum and is associated with GRP78 and GRP94. Blood 1996; 87: 4164–4175. 32. Bruneau N, Lombardo D, Bendayan M. Participation of GRP94-related protein in secretion of pancreatic bile saltdependent lipase and in its internalization by the intestinal epithelium. J Cell Sci 1998; 111: 2665–2679. 33. Melnick J, Dul JL, Argon Y. Sequential interaction of the chaperones BiP and GRP94 with immunoglobulin chains in the endoplasmic reticulum. Nature 1994; 370: 373–375. 34. Melnick J, Argon Y. Molecular chaperones and the biosynthesis of antigen receptors. Immunol Today 1995; 16: 243–250. 35. Wiech H i wsp.: Hsp90 chaperones protein folding in vitro. Nature 1992; 358: 169–170. 36. Jakob U i wsp.: Transient interaction of Hsp90 with early unfolding intermediates of citrate synthase. Implications for heat shock in vivo. J Biol Chem 1995; 270: 7288–7294. 37. Freeman BC, Morimoto RI. The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. Embo J 1996; 15: 2969–2979. 38. Ferreira LR i wsp.: Hsp47 and other ER-resident molecular chaperones form heterocomplexes with each other and with collagen type IV chains. Connect Tissue Res 1996; 33: 265–273. copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 39. Johnson JL, Toft DO. A novel chaperone complex for steroid receptors involving heat shock proteins, immunophilins, and p23. J Biol Chem 1994; 269: 24989–24993. 40. Chen S i wsp.: Differential interactions of p23 and the TPR-containing proteins Hop, Cyp40, FKBP52 and FKBP51 with Hsp90 mutants. Cell Stress Chaperones 1998; 3: 118–129. 41. Suto R, Srivastava PK. A mechanism for the specific immunogenicity of heat shock protein-chaperoned peptides. Science 1995; 269: 1585–1588. 42. Arnold D i wsp.: Cross-priming of minor histocompatibility antigen-specific cytotoxic T cells upon immunization with the heat shock protein gp96. J Exp Med 1995; 182: 885–889. 43. Nieland TJ i wsp.: Isolation of an immunodominant viral peptide that is endogenously bound to the stress protein GP96/ GRP94. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 6135–6139. 44. Lammert E i wsp.: The endoplasmic reticulum-resident stress protein gp96 binds peptides translocated by TAP. Eur J Immunol 1997; 27: 923–927. 45. Spee P, Neefjes J. TAP-translocated peptides specifically bind proteins in the endoplasmic reticulum, including gp96, protein disulfide isomerase and calreticulin. Eur J Immunol 1997; 27: 2441–2449. 46. Arnold D i wsp.: Influences of transporter associated with antigen processing (TAP) on the repertoire of peptides associated with the endoplasmic reticulum-resident stress protein gp96. J Exp Med 1997; 186: 461–466. 47. Lammert E i wsp.: Expression levels of stress protein gp96 are not limiting for major histocompatibility complex class I-restricted antigen presentation. Eur J Immunol 1996; 26: 875–879. 48. Wearsch PA, Voglino L, Nicchitta CV. Structural transitions accompanying the activation of peptide binding to the endoplasmic reticulum Hsp90 chaperone GRP94. Biochemistry 1998; 37: 5709–5719. 49. Scheibel T, Weikl T, Buchner J. Two chaperone sites in Hsp90 differing in substrate specificity and ATP dependence. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 1495–1499. 50. Young JC, Schneider C, Hartl FU. in vitro evidence that hsp90 contains two independent chaperone sites. FEBS Lett 1997; 418: 139–143. 51. Young JC, Obermann WM, Hartl FU. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. J Biol Chem 1998; 273: 18007–18010. 52. Clairmont CA, Maio A De, Hirschberg CB. Translocation of ATP into the lumen of rough endoplasmic reticulumderived vesicles and its binding to luminal proteins including BiP (GRP 78) and GRP 94. J Biol Chem 1992; 267: 3983–3990. 53. Dierks T i wsp.: A microsomal ATP-binding protein involved in efficient protein transport into the mammalian endoplasmic reticulum. EMBO J 1996; 15: 6931–6942. 54. Li Z, Srivastava PK. Tumor rejection antigen gp96/grp94 is an ATPase: implications for protein folding and antigen presentation. EMBO J 1993; 12: 3143–3151. 55. Wearsch PA, Nicchitta CV. Interaction of endoplasmic reticulum chaperone GRP94 with peptide substrates is adenine nucleotide-independent. J Biol Chem 1997; 272: 5152–5156. 56. Fernandez PM i wsp.: Overexpression of the glucose-regulated stress gene GRP78 in malignant but not benign human breast lesions. Breast Cancer Res Treat 2000; 59: 15–26. 57. Jamora C, Dennert G, Lee AS. Inhibition of tumor progression by suppression of stress protein GRP78/BiP induction in fibrosarcoma B/C10ME. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 7690–7694. 58. Zhou Y, Lee AS. Mechanism for the suppression of the mammalian stress response by genistein, an anticancer phytoestrogen from soy. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 381–388. 59. Chavany C i wsp.: p185erbB2 binds to GRP94 in vivo. Dissociation of the p185erbB2/GRP94 heterocomplex by benzoquinone ansamycins precedes depletion of p185erbB2. J Biol Chem 1996; 271: 4974–4977. 60. Tomida A, Tsuruo T. Drug resistance mediated by cellular stress response to the microenvironment of solid tumors. Anticancer Drug Des 1999; 14: 169–177. 61. Belfi CA i wsp.: Increased sensitivity of human colon cancer cells to DNA cross-linking agents after GRP78 up-regulation. Biochem Biophys Res Commun 1999; 257: 361–368. 62. Reddy RK, Lu J, Lee AS. The endoplasmic reticulum chaperone glycoprotein GRP94 with Ca2+-binding and antiapoptotic properties is a novel proteolytic target of calpain during etoposide-induced apoptosis. J Biol Chem 1999; 274: 28476–28483. 63. Nakagawa T, Yuan J. Cross-talk between two cysteine protease families. Activation of caspase-12 by calpain in apoptosis. J Cell Biol 2000; 150: 887–894. 64. Binder RJ, Han DK, Srivastava PK. CD91: a receptor for heat shock protein gp96. Nat Immunol 2000; 1: 151–155. 65. Janetzki S i wsp.: Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived heat shock protein gp96 preparations: a pilot study. Int J Cancer 2000 88: 232–238. 66. Wang XY i wsp.: Characterization of heat shock protein 110 and glucose regulated protein 170 as cancer vaccines and the effect of fever-range hyperthermia on vaccine activity. J Immunol 2001 166: 490–497. 67. Gazit G i wsp.: Use of the glucose-starvation inducible GRP78 promoter in suicide gene therapy of murine fibrosarcoma. Cancer Res 1999; 59: 3100–3106. 68. Chen X i wsp.: Eradication of murine mammary adenocarcinoma through HSVtk expression directed by the glucose-starvation inducible GRP78 promoter. Breast Cancer Res Treat 2000; 59: 81–90. 69. Gomer CJ i wsp.: Glucose regulated protein induction and cellular resistance to oxidative stress mediated by porphyrin photosensitization. Cancer Res 1991; 51: 6574–6579.0 Adres do korespondencji: Marzanna Cechowska-Pasko Zakład Biochemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku ul. Mickiewicza 2A 15-089 Białystok tel. 085 748 56 91 e-mail: [email protected] 53 Farm Przegl Nauk, 2009,5 54 copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 55 Farm Przegl Nauk, 2009,5 INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OF MANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY 1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewed transdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicine and related sciences. The journal publishes conference reports and materials, conference announcements, as well as letters to the Editor. 2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printed and an electronic form. Electronic versions of articles are to be sent to [email protected] or supplied on CD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagrams and figures) should be addressed to: Farmaceutyczny Przegląd Naukowy 41-200 Sosnowiec ul. Jedności 8 3. 4. 5. 6. 7. 8. 56 Disk label should contain the first name(s) and surname(s) of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphics should be included in separate files. Do not paste pictures and graphics to text files. The Editor advises to use Star Office, Word, or Word Perfect. The preferred graphics format is *. TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi. All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief. The Authors are encouraged to suggest their reviewers, however the final selection of a reviewer is up to the Editorial Board. The Editors-in-Chief reserves the right to correct or abbreviate the text (after the Author’s approval). The manuscript that has been rejected by the Scientific Review in Pharmacy should not be resubmitted. A cover letter should be included with the manuscript, containing a declaration that the manuscript has not been previously published in print or electronic format and is not under consideration by another journal or electronic medium, signed by all the Authors. It should also include written approval from the head of the institution in which the study was conducted. All human and animal research will have obtained ethical consent from the local Bioethical or Ethical Committee. The material sent in and the review will remain among the documentation of the Board of Editors. Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the whole of the copyrights for the published papers (including the right to publishing in print, on electronic media, such as CD-ROM disks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries is allowed without any written permission of the Editor. Instructions for authors: 8.1. Manuscript Page Setup • Paper: white, A4 format. • Margins: 2.5cm (top, left, right, bottom) • Font: Times New Roman, no smaller than 12 points. • Text: Double-spaced, one side of the page only. • Numbering: Insert page numbers at bottom right of each page. • Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extra line space between paragraphs. • Subheads: All subheads should be flush with the left margin, with one line above. Indent first line after a subhead. Use an extra line space between the subhead and the text. • TITLE or HEADING OF THE ARTICLE: all capitals, boldface, on separate line. • Second-Level Subhead: initial capitals, boldface, on separate line. • Third-Level Subhead: initial capitals, italic, on the same line as the text, with extra letter space between the subhead and the text. 8.2. Organization of Manuscript • Title page should include: submission date and Author(s) full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’ full current affiliations (for papers with multiply authors, please enumerate the authors and their affiliations in the following way: Author1, Author2, etc; 1Affiliation, Affiliation, etc.). Affiliations should contain the full name and academic degrees/titles of the head of the institution. One corresponding author must be designated for papers with coauthors. At the bottom of the page the full name, academic degrees/titles, and address of the corresponding author should be given, including the telephone number, fax number and/or e-mail address. If research has been funded, please indicate the source of funding (including grant index/ symbol, grant agencies, corporations, or sponsors). • The second page should include an abstract (150-250 words). The abstract must be self-contained, and must not require reference to the paper to be understood. The abstract should present objectives and scope of the study or reasons for writing the paper. The methods and techniques or approaches should be described only to the extent necessary for comprehension. The findings and conclusions should be concise and informative. The abstract should be followed by the key words consistent with the Medical Subject Headings Index Medicus, and should not contain unfamiliar terms that are not defined, undefined acronyms and reference citations. Neither displayed equations or lists should appear in the abstract. • Body text should be organized as follows: original paper - introduction, material and methods descriptions, research results, discussion; review papers – free structure; case studies – introduction (motivation for the study), case descriptions, discussion of the characteristic symptoms, treatment results etc. • Figures (diagrams, drawings, color or black-and-white photographs) should be put into a separate envelope. On each figure there should be its number (Arabic numerals), the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking. Figure captions should be placed on separate pages and numbered consecutively using Arabic numerals. Previously published visual materials should be supplied together with the written consent of the Publisher for reprint. • Tables, each on a separate page, should be numbered using Roman numerals and preceded by their captions. Table captions should be placed on separate pages, numbered using Roman numerals. • The papers should not exceed the following limitations: original and review work – 10 pages and others – 5 pages. 8.3. References to the works cited should be presented at the end of the paper and arranged according to the sequence of citations in the body text. The acronyms for journal titles should be used according to Index Medicus. Each entry, starting with a new line, should be given a number and must be presented as follows: • journal citation: Varga J, Abraham D: Systemic sclerosis: a prototypic multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67. If there are more than three authors, the name of the first one should be given, followed by an ,,et all” annotation. Komosińska-Vassev K et all: Graves’ disease-associated changes in the serum lysosomal glycosidases activity and glycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331: 97-102. • the specific chapter: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. Biochemia Harpera. Murray RK et all. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1994, 59-69. • monograph: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw 2004. 2 References to the works cited within the text should be numbered using Arabic numerals and placed between brackets, e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations: original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliography entries. copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM 1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowane prace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe, z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych. Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na temat konferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji. 2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać w formie elektronicznej na adres: [email protected] (w wyjątkowych przypadkach na dysku CD-ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego (z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji: Farmaceutyczny Przegląd Naukowy 41-200 Sosnowiec ul. Jedności 8 3. 4. 5. 6. 7. 8. Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów) i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory. Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych. Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word, Word Perfect. Preferowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor: CMYK, rozdzielczość 300 dpi. Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych każdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca się autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja zastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta, jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu z autorem). Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta nie może być ponownie przedkładany Redakcji Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie była uprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcji innego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawierać również podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodę Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie publikacji w czasopiśmie. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, które są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji Redakcji. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskich do wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, na nośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy. Instrukcje dla autorów 8.1 Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu • Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, na białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego odstępu między kolejnymi wierszami. • Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny). • Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt. • Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy od strony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnym rogu. • Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowych odstępów pomiędzy kolejnymi akapitami. • Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównane do lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstem należy wprowadzić jeden odstęp. • TYTUŁ PRACY – powinien być napisany dużymi literami, pogrubioną czcionką i w oddzielnej linii. • Tytuł Rozdziału – kolejne wyrazy tytułu rozdziału powinny być napisane pogrubioną czcionką i w oddzielnej linii, zaś pierwsze litery tych wyrazów powinny być napisane dużymi literami. • Tytuł Podrozdziału – kolejne wyrazy tytułu podrozdziału powinny być napisane pochyloną czcionką i w tej samej linii co tekst tego podrozdziału, z zachowaniem odstępu pomiędzy tytułem i tekstem. Ponadto, pierwsze litery wy- razów tytułu podrozdziału powinny być napisane dużymi literami. 8.2 Układ manuskryptu • Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowych przy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afiliację każdego z nich, w następujący sposób Autor1, Autor2, …; 1Afiliacja, 2Afiliacja, tytuł pracy w języku polskim i angielskim, nazwę placówki naukowej, oraz tytuł lub stopień naukowy, imię i nazwisko kierownika placówki naukowej, skąd pochodzi praca. U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres, telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję, dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanych prosimy o wskazanie źródła finansowania (w tym numery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lub sponsorów). • Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie (150-250 słów w języku polskim i angielskim), będące autonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczać odnośników literaturowych. Streszczenie powinno zawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawowe procedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Pod streszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w języku polskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject Headings Index Medicus. • Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały, według następującego schematu: prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań, dyskusja oraz wnioski; prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziały i podrozdziały; prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby, charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp. • Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe) powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane, opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy, z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać na oddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy na ponowną publikację. • Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami umieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać na oddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframi rzymskimi. • Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinna wynosi 10, a pozostałych – 5 stron. 8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowania w tekście pracy. Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z Index Medicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza, powinna być opatrzona numerem oraz zredagowana zgodnie z niżej podanym przykładem: • czasopismo naukowe: np.: Varga J, Abraham D: Systemic sclerosis: a prototypic multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67. Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”. np.: Komosińska-Vassev K i wsp.: Graves’ disease-associated changes in the serum lysosomal glycosidases activity and the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331: 97-102. • wydawnictwo zbiorowe: np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1994, 59-69. • monografia: np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław 2004. Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1]. Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach oryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do 10 pozycji. 57 Farmaceutyczny Przegląd Naukowy Miesięcznik PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH Scientific Review in Pharmacy Prosimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literami o dokonanie wpłat na poczcie lub w banku. Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu. Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeraty otrzymają Państwo po około 2 tygodniach od dokonania wpłaty. Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeraty i Kolportażu: Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała TEL. 033 817 38 99 WYDAWCA Nr rachunku odbiorcy: 0 IC Value - Current 3.66 MNiSW 4 PRENUMERATA 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego 43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 ODBIORCA: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała kwota:....................................................................................... wpłacający:.............................................................................. ................................................................................................. ................................................................................................. Zamawiam PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY Nr ............ Nr rachunku odbiorcy: 0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego 43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 ODBIORCA: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała kwota:....................................................................................... wpłacający:.............................................................................. ................................................................................................. ................................................................................................. Zamawiam FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY Nr ............ PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY