Architektura funkcjonalna rybozymu hammerhead

Architektura funkcjonalna rybozymu hammerhead
Marta M. Gabryelska*
Streszczenie
R
Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk, ul. Z. Noskowskiego 12/14, 61704 Poznań, tel: (61) 852 85 03 wew. 132, faks:
(61) 852 05 32, e-mail: Jan.Barciszewski@ibch.
poznan.pl
ybozym hammerhead jest najmniejszym katalitycznym RNA pochodzenia naturalnego,
który stanowi doskonały model do badań zależności struktury i funkcji. Początkowo
został zidentyfikowany jako autokatalityczny fragment genomowego RNA roślinnych wiroidów i wirusoidów. Obecnie wiadomo, że występuje on w genomach wielu organizmów
w tym u człowieka i jest najczęściej występującym autokatalitycznym motywem RNA w
przyrodzie. Po 25 latach intensywnych badań dostępna jest duża ilość informacji na temat
jego budowy, dynamiki konformacyjnej oraz oddziaływań trzeciorzędowych wpływających
na stabilność i właściwości. Struktura cząsteczki rybozymu hammerhead stanowi układ elementów, które wzajemnie na siebie wpływają. Poznanie architektury cząsteczki rybozymu
jest niezwykle interesujące w kontekście zasad i logiki projektowania, konstruowania i zastosowania cząsteczek tej klasy jako molekularnych konstrukcji przestrzennych. Obecność
dodatkowych motywów strukturalnych wyróżnia tzw. wydłużony rybozym hammerhead od
minimalnego. Rybozym hammerhead rozpoznaje docelową sekwencję w RNA na zasadzie
komplementarności i katalizuje jej transestryfikację po sekwencji 5’-NUH-3’. Wydajność reakcji uwarunkowana jest aranżacją atomów centrum katalitycznego, obecnością jonów metali oraz innych czynników wewnątrzkomórkowych. Poszukiwane są nowe pochodne rybozymów hammerhead o zwiększonej aktywności, które mogą być wykorzystane w medycynie
molekularnej.
*równorzędni autorzy
Wprowadzenie
Agnieszka
Fedoruk-Wyszomirska*
Eliza Wyszko
Jan Barciszewski
Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk, Poznań

Artykuł otrzymano 24 września 2012 r.
Artykuł zaakceptowano 26 listopada 2012 r.
Słowa kluczowe: struktura RNA, rybozym
hammerhead, transestryfikacja
Wykaz skrótów: HHRz — rybozym hammerhead; HHRzM — rybozym hammerhead minimalny; HHRzW — rybozym hammerhead wydłużony; TLS — struktura podobna do tRNA; NMR
— magnetyczny rezonans jądrowy; TSM —
motyw stabilizujący strukturę trzeciorzędową
Podziękowania: Publikacja powstała w ramach realizacji projektów finansowanych ze
środków budżetowych na naukę w latach
2010-2011 w ramach programu Iuventus Plus,
nr IP2010008770 oraz grantu przyznanego
przez Polskie Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N N302 220535. Marta M.
Gabryelska jest stypendystą w ramach projektu pt.: „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z
punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowanego ze środków
Unii Europejskiej w ramach Europejskiego
Funduszu Społecznego.
Struktura RNA determinuje jego funkcje oraz warunkuje swoiste oddziaływania z innymi cząsteczkami RNA, ligandami, czy białkami [1]. Właściwości
katalityczne RNA zależą od jego konformacji, która ma charakter dynamiczny
[2]. Na początku lat 80-tych XX wieku po raz pierwszy pokazano, że RNA bierze bezpośredni udział w składaniu (ang. splicing) i dojrzewaniu (ang. maturation) RNA [3]. Katalityczne RNA (tzw. rybozymy, RNAzymy) charakteryzują
się obecnością wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań trzeciorzędowych i katalizują reakcje transestryfikacji RNA, hydrolizy/ligacji, syntezy peptydu, fosforylacji, adenylacji aminokwasów, polimeryzacji RNA, reakcję aldolową, utleniania
alkoholi, redukcję aldehydów, syntezę nukleotydów pirymidynowych, aminoacylację i wiele innych [4]. Zachodzą one bez udziału dodatkowych czynników
białkowych [5]. Dotychczas zidentyfikowano dziewięć typów naturalnie występujących katalitycznych RNA [6] (Tab. 1).
Tabela 1. Charakterystyka naturalnie występujących rybozymów.
Podgrupa
Rybozym
Wielkość
cząsteczki (nt)
Rybozymy
małocząsteczkowe
Hammerhead
Hepatitis Delta Virus
Hairpin
Varkud sattelite
~40
~90
~70
~160
transestryfikacja in cis
introny grupy I
introny grupy II
~210
<500
transestryfikacja in cis
Rybozymy
wielkocząsteczkowe
Rybosom
22
Aktywność
RNaza P
350-410
hydroliza tRNA
snRNA (U2, U6)
180, 100
transestryfikacja RNA in trans
23 S rRNA
~2600
transferaza peptydylowa
www.postepybiochemii.pl
Rybozym o strukturze głowy młotka (ang. hammerhead ribozyme) ma niewielkie rozmiary i wykazuje dużą aktywność. Od 25 lat stanowi dobry model do badań relacji
struktury i funkcji RNA [7]. Ostatnio szczególne zainteresowanie wzbudza proces interferencji RNA (ang. RNA interference, RNAi), dzięki któremu możliwe jest efektywne i
wysoce specyficzne blokowanie ekspresji genów przy użyciu krótkich (~20 nt) interferencyjnych RNA (ang. short interfering RNA, siRNA) [8]. Pomimo faktu, że siRNA mogą
być efektywnymi czynnikami hamującymi ekspresję w
stosunku do większości RNA cytoplazmatycznych, nie są
aktywne względem RNA zlokalizowanych w organellach
półautonomicznych. Ponadto, niektóre wirusy wykształciły mechanizmy obronne wobec RNAi, a technologia ta nie
jest wolna od niespecyficznych efektów ubocznych (ang. off-target effects) [9]. W takich przypadkach, opracowanie efektywnych leków w oparciu o siRNA jest niemożliwe. W tym
kontekście, bardzo atrakcyjną alternatywę stanowią nadal
cząsteczki małych katalitycznych RNA, a w szczególności
rybozymy typu hammerhead.
Rybozym typu hammerhead
Rybozym hammerhead (HHRz) został odkryty jako samowycinający się fragment genomowego RNA roślinnych wiroidów i wirusoidów [10]. Ich replikacja odbywa się poprzez
mechanizm toczącego się koła [11]. Kolisty genomowy RNA
jest kopiowany do liniowego produktu, który następnie ulega hydrolizie do cząsteczek o odpowiedniej długości. Etap
ten nie wymaga obecności enzymów białkowych i jest wynikiem spontanicznej reakcji transestryfikacji katalizowanej
przez specyficzny motyw RNA o strukturze głowy młotka
(ang. hammerhead ribozyme, HHRz) [12].
Redukując wielkość cząsteczki, zidentyfikowano najprostszy aktywny wariant, tzw. minimalny rybozym hammerhead (HHRzM), hydrolizujący wiązanie fosfodwuestrowe
w docelowych RNA in trans [13]. Jego struktura drugorzędowa przypomina kształtem literę „Y”. Składa się z trzech
odcinków helikalnych (HI, HII, HIII) zwanych ramionami,
które otaczają wysoce zachowawczą domenę katalityczną
(rdzeń katalityczny) (Ryc. 1). Motyw połączenia trzech helis
Rycina 1. Struktura drugorzędowa rybozymu hammerhead. Na czarnym tle
przedstawiono centrum katalityczne. H I-III – ramiona helikalne. Numeracja nukleotydów zgodnie z [14].
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
Rycina 2. Motyw łączenia trzech helis RNA w kształcie litery „Y” w rybozymach.
(A) Trzy typy rybozymów hammerhead in cis w zależności od tego, która z helis
zawiera końce 5’ i 3’ cząsteczki. Kropkami zaznaczono miejsca oddziaływań trzeciorzędowych o sekwencji nie zachowanej w ewolucji. Cyframi I, II, III oznaczono
helisy rybozymu. Helisy II i III oddziałują współosiowo (zielona strzałka), pętle
helis I i II biorą udział w ustaleniu oddziaływań trzeciorzędowych (niebieska
strzałka). (B) Rybozymy hammerhead in trans. Na pomarańczowo zaznaczono nić
substratową. HHRzM — rybozym minimalny, HHRzW – rybozym wydłużony.
(ang. 3-way junction) tego typu występuje także w innych
małych RNA, takich jak ryboprzełączniki czy rybozymy,
oraz w dużych kompleksach rybonukleoproteinowych jak
rybosomalne RNA, RNaza P lub kompleks SRP (ang. signal
recognition particle) (Ryc. 2) [15]. Jest to miejsce oddziaływania białek, innych cząsteczek RNA oraz antybiotyków.
Trzeciorzędową strukturę minimalnego rybozymu
typu hammerhead w kompleksie z substratem poznano 20
lat temu (Ryc. 3). Jako substrat wykorzystano początkowo
oligonukleotyd DNA, który nie był degradowany przez rybozym HHRz [16], a później RNA zawierający grupę 2’-O-metylową w miejscu hydrolizy [17] oraz cząsteczkę RNA
bez modyfikacji chemicznych [18]. Helisy II i III ułożone są
współosiowo, podczas gdy helisa I leży pod kątem ostrym
do helisy II (Ryc. 3). Wszystkie występują w konformacji
typu A RNA. Kieszeń katalityczną tworzy jednoniciowa
sekwencja (3)CUGA(6) z charakterystycznym motywem U-skrętu między nukleotydami U4 i G5 [16].
23
Najbardziej charakterystyczną cechą pełnej długości
rybozymu HHRzW jest oddziaływanie pomiędzy pętlą ramienia II i wybrzuszeniem w ramieniu I, tworzące stabilną i aktywną konformację domeny katalitycznej (Ryc. 1 i 3)
[21]. Rybozym ten jest dwukrotnie większą cząsteczką niż
wariant minimalny. Kształtem przypomina literę „γ”, gdzie
ramię II leży w jednej osi z ramieniem III. Zarówno kieszeń
katalityczna, jak i U-skręt różnią się znacznie od tych obserwowanych w wariancie minimalnym [22].
Na aktywność rybozymów in vivo wpływa stężenie jonów magnezu, siła jonowa, temperatura, dostępność substratu, oddziaływanie ze składnikami komórkowymi oraz
kompartmentacja [24]. Poliaminy, takie jak spermina stanowią polikationowe ligandy, występujące w komórce w stężeniach milimolowych, które mają wpływ na konformację
kwasów nukleinowych oraz poprawiają aktywność katalityczną in vitro rybozymów typu hairpin [25] oraz hammerhead (dane nieopublikowane). Wiele różnych makrocząsteczek może powodować zmiany jego konformacji poprzez
zderzenia międzycząsteczkowe, słabe niespecyficzne oddziaływania lub poprzez tzw. efekt stłoczenia molekularnego (ang. molecular crowding effect) [26,27]. Wykazano, że
nukleokapsyd p7 HIV-1, białko hn RNP A1 oraz dehydrogenaza GAPDH zwiększają szybkość reakcji in vitro oraz
tempo dysocjacji produktów [28-31].
Specyficzność substratowa
rybozymu hammerhead
Rycina 3. Minimalny rybozym typu hammerhead (po lewej) i wydłużony (po prawej) w kompleksach z substratami. (A) Struktury drugorzędowe. (B-C) Struktury trzeciorzędowe. N — oznacza dowolny nukleotyd, H — każdy nukleotyd z
wyjątkiem G. Domena katalityczna została przedstawiona kolorem czerwonym
(sekwencja CUGAUGA) oraz zielonym (sekwencja GAA), a substrat kolorem żółtym. Niebieskimi ramkami zaznaczono oddziaływania pomiędzy pętlą ramienia
II a wybrzuszeniem w ramieniu I. Miejsce hydrolizy oznaczono strzałką. Numeracja nukleotydów zgodnie z [14].
W rybozymach in trans (hydrolizujących odrębną cząsteczkę RNA) helisy I i III powstają przez hybrydyzację
katalitycznego RNA z komplementarnymi sekwencjami
substratu. Rybozymy hammerhead w układzie in cis (hydrolizujące własną cząsteczkę) można podzielić na trzy typy, w
zależności od tego, która z helis zawiera końce 5’ i 3’ (helisa
I – typ 1, helisa II – typ 2, helisa III – typ 3) (Ryc. 2) [19,20].
W późniejszych badaniach wykazano, że dodatkowe
elementy strukturalne (TSM, ang. tertiary stabilizing motif)
występujące w naturalnych rybozymach hammerhead odgrywają istotną rolę w stabilizacji aktywnej konformacji cząsteczki, co zwiększa wydajność reakcji [21]. Warianty te nazywane są rybozymami pełnej długości (HHRzW, ang. full-length,) lub wydłużonymi (HHRzW, ang. extended). W 2006
roku poznano trzeciorzędową strukturę rybozymu HHRzW
w kompleksie z RNA zawierającym grupę 2’-O-metylową w miejscu hydrolizy [22]. Następnie udało się uzyskać
struktury krystaliczne aktywnego wydłużonego rybozymu
hammerhead w kompleksie z substratem oraz z produktem,
w którym pozycję G12 zastąpiono A12 [23]. Dzięki temu nie
została zaburzona struktura centrum katalitycznego, ale
uzyskano wielokrotne zwolnienie katalizowanej reakcji.
24
Rybozym hammerhead HHRz rozpoznaje docelową sekwencję w RNA poprzez tworzenie z nią wiązań typu Watsona-Cricka. Długość i skład nukleotydowy ramion otaczających miejsce hydrolizy powinny zapewniać na tyle silne
wiązanie rybozymu HHRz do substratu, aby uniemożliwić
przedwczesną dysocjację [32]. Dzięki temu rybozym może
katalizować kolejną reakcję. Zbyt krótkie ramiona hybrydyzujące mogą być przyczyną utraty specyficzności rybozymu, natomiast ich wydłużenie powoduje wzrost stabilności tworzonego kompleksu z substratem i produktami, co
wiąże się ze spadkiem wydajności hydrolizy [32,33]. Optymalna długość ramion hybrydyzujących wynosi 6-10 reszt
nukleotydowych. Ponadto sekwencja substratu przy końcu
3’ ma większe znaczenie dla szybkości reakcji niż przy końcu 5’ [34]. Wpływ długości ramion na aktywność rybozymu
różni się dla procesów in vitro i in vivo [35].
Rybozym hammerhead hydrolizuje substraty po sekwencji
5’-NUH-3’, gdzie N oznacza dowolny nukleotyd, U urydynę
natomiast H adenozynę, cytozynę lub urydynę niezwiązaną
wiązaniami wodorowymi. Wymagania rybozymu względem sekwencji 5’-NUH-3’ mogą być w pewnym stopniu
zmodyfikowane względem pozycji drugiej i trzeciej. Zidentyfikowano rybozymy rozpoznające sekwencję 5’-NHH-3’,
gdzie H może być dowolnym nukleotydem z wyjątkiem
G [36]. Uzyskano również puryno-specyficzny wariant rybozymu hammerhead, który in vitro hydrolizował wiązanie
fosfodwuestrowe po niesparowanym nukleotydzie G przy
końcu 3’ (5’-GUG-3’) [37]. Stała szybkości reakcji katalizowanej przez rybozym HHRz maleje w następującym po-
www.postepybiochemii.pl
rządku: GUC, AUC > GUA, AUA, CUC > AUU, UUC, UUA
> GUU, CUA >UUU, CUU [38].
W przypadku rybozymów minimalnych obserwowano
nawet 70-krotne różnice szybkości hydrolizy in vitro dla różnych substratów [32]. Rozbieżność ta może być związana z
szybkością dysocjacji produktów oraz zmianami w strukturze [39]. Tolerancja substytucji niektórych nukleotydów
rdzenia katalitycznego wskazuje, że system oddziaływań
elementów struktury drugorzędowej oraz trzeciorzędowej mimo odległości moduluje lokalną strukturę centrum
katalitycznego [40]. Szybkość reakcji jest także zależna od
charakteru nukleotydu w pozycji –1 względem sekwencji
5’-NUH-3’ zgodnie z preferencją U>C>A>G [41].
Reakcja transestryfikacji
Rybozymy w fizjologicznym pH katalizują wewnętrzną
reakcję transestryfikacji („hydrolizy”) z szybkością porównywalną do enzymów białkowych. Według mechanizmu
katalizy kwasowo-zasadowej funkcję zasady pełnią pary
elektronów zasad heterocyklicznych kwasów nukleinowych [42] (Ryc. 4). Grupa 2’-OH rybozy przeprowadza atak
nukleofilowy na najbliższy 3’ fosforan zgodnie z mechanizmem reakcji SN2, a produkty reakcji mają 2’,3’-cykliczny
fosforan oraz grupę 5’-OH (Ryc. 4) [44]. Grupa atakująca,
fosforan w miejscu hydrolizy oraz grupa opuszczająca ułożone są liniowo. W pierwszym etapie tworzy się swoisty,
aktywny kompleks enzym:substrat, w którym dochodzi do
hydrolizy wiązania międzynukleotydowego, produkty dy-
Rycina 5. Schemat hydrolizy RNA katalizowanej przez rybozym HH. Rybozym
(Rz) specyficznie przyłącza i hydrolizuje docelowy RNA (S — substrat). Najpierw
tworzony jest kompleks rybozymu z substratem (Rz:S). Po hydrolizie (transestryfikacji) RNA powstaje kompleks rybozymu i dwóch produktów (Rz:P1:P2), a następnie cząsteczka katalityczna ulega dysocjacji od produktów hydrolizy (P1, P2)
i bierze udział w kolejnej reakcji.
socjują, a rybozym może katalizować kolejną reakcję (Ryc.
5) [32]. Stała Michaelis-Menten dla rybozymów wyznaczana jest w warunkach wielo- i jednokrotnego udziału rybozymu w reakcji [32,45]. Wartości kcat i KM dla rybozymów
hammerhead zazwyczaj mieszczą się odpowiednio w zakresie 1-2 min-1 i 20-200 nM [38].
Centrum katalityczne rybozymu hammerhead musi spełniać następujące warunki: i) zasada G12 znajduje się w położeniu umożliwiającym deprotonację grupy nukleofilowej
(C17 2’OH) w celu utworzenia aktywnego prekursora; ii)
zmiany konformacji miejsca aktywnego zapewniają ułożenie liniowe aktywowanego nukleofila (C17 2’OH) i atakowanej reszty fosforanowej; iii) integralność miejsca aktywnego, a także bliskość A9 i atakowanego fosforanu pozwalają na wiązanie jonu dwuwartościowego, iv) reszta G8 jest
utrzymana w pozycji umożliwiającej oddanie protonu grupie opuszczającej (C1.1 5’O) [46].
Wpływ jonów metali na
aktywność rybozymów
Utworzenie dupleksu oraz struktur trzeciorzędowych
jest możliwe dopiero po zrównoważeniu ujemnego ładunku łańcucha cukrowo-fosforanowego kwasów nukleinowych [47]. Z tego względu, RNA i DNA występują w komórce w postaci zasocjowanej z kationami.
Obecność jonów metali w mieszaninie reakcyjnej silnie
wpływa na aktywność rybozymów (Tab. 2) [47]. Uczestniczą one w tworzeniu aktywnej konformacji rybozymu hammerhead, ale obserwowane między nimi różnice przyspieszania reakcji katalitycznej sięgają rzędu 104. Najlepszym
kofaktorem jest Mn2+ [47].
Rycina 4. Schematy proponowanych mechanizmów transestryfikacji RNA katalizowanej przez rybozym HHRz (na podstawie [43,54]). W wyniku ataku nukleofilowego grupy 2’-OH rybozy na wiązanie fosfodwuestrowe powstają produkty
reakcji, z których jeden zakończony jest 2’,3’-cyklicznym fosforanem, a drugi grupą 5’-OH. (A) Mechanizm katalizy kwasowo-zasadowej (H-A – ogólny kwas, :B –
ogólna zasada). (B) Mechanizm kwasowej hydrolizy estrów. Z – zasada azotowa,
R – kontynuacja łańcucha RNA.
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
Analizując struktury krystaliczne rybozymów hammerhead stwierdzono, że zarówno w miejscu katalitycznym,
jak i w jego najbliższym otoczeniu brak jonów magnezu
[16,17,22]. Zaproponowano model, w którym jony metalu
odgrywają rolę strukturalną, co potwierdzały eksperymenty chemicznej modyfikacji zasad oraz obserwacje, że rybo-
25
Tabela 2. Występowanie niektórych jonów w komórce i ich wpływ na aktywność katalityczną rybozymu hammerhead Schistosoma. b.d. – brak danych. Na podstawie
[47,48,51].
Jon
Mg2+
Stężenie w
cytoplazmie
[M]
Stężenie toksyczne
w cytoplazmie [M]
10-3
10-1
Cytoplazma
Główny przedział komórkowy,
w którym występuje
Wiązanie
Kobs (min-1) w 0,1 M NaCl
i 1 mM M2+ lub 600 mM
M+ (Schistosoma HH)
2,6
słabe
odwracalne
Mn2+
10-6
10-5
aparat Goldiego
mitochondrium
Fe2+
10-7
10-5
cytoplazma
+
Na
b.d.
10
zewnątrzkomórkowo
b.d.
<0.02
Ca2+
10-7
10-3
siateczka śródplazmatyczna
b.d.
0,14
Zn2+
10-11
10-9
Pęcherzyki
silne
nieodwracalne
82
Cu2+
10-15
10-9
aparat Goldiego, siateczka
śródplazmatyczna,
zewnątrzkomórkowo
b.d.
b.d.
Ni2+
10-16
10-10
wakuole roślinne
10
10-10
cytoplazma
średnie
nieodwracalne
b.d.
Co
2+
-15
-1
zymy hammerhead są aktywne w obecności wyłącznie jonów
jednowartościowych (Li+, Na+, NH4+) czy poliamin organicznych oraz, że istnieje związek pomiędzy aktywnością
rybozymu, a zależnością G8 i G12 od pH [49,50]. Wpływ pH
środowiska, jak również grup funkcyjnych jest taki sam w
przypadku hydrolizy z udziałem rybozymu HHRz w obecności kationów jedno- i dwuwartościowych [52,53].
W warunkach wysokiego ciśnienia hydrostatycznego
(HHP, ang. high hydrostatic pressure,) wykazano, że jony magnezu stabilizują strukturę rybozymu i nie są bezpośrednio
zaangażowane w katalizę, a reakcja może być rozpatrywana
jako kwasowa hydroliza estrów (Ryc. 4) [54]. Pod wpływem
ciśnienia dochodzi do dysocjacji cząsteczek wody. W pierwszym etapie następuje przyłączenie protonu do tlenu grupy
fosforanowej, co powoduje, że staje się ona podatna na atak
nukleofilowy grupy 2′-OH rybozy zawierającej wolną parę
elektronową. Po utworzeniu stanu przejściowego, następuje protonacja atomu 5’O i w konsekwencji zerwanie wiązania pomiędzy fosforem a tlenem [54,55].
Chociaż proces zwijania HHRz jest zakończony już w
stężeniu 2-3 mM magnezu, szybkość hydrolizy lub ligacji
wzrasta wraz ze stężeniem jonów i nie zawsze ulega nasyceniu nawet przy 100 mM [56]. Sugeruje to istnienie słabego
miejsca wiązania magnezu być może w pobliżu centrum katalitycznego lub występowanie zmian strukturalnych przy
wyższym stężeniu tego jonu [56]. Zaproponowano udział
jonów metalu związanych koordynacyjnie i działających w
bezpośredniej bliskości centrum katalitycznego oraz niespecyficznych, oddziałujących z zasadami w większej odległości od centrum reakcji [57]. Kation może być wiązany koordynacyjnie przez zasadę, która odgrywa rolę katalizatora
kwasowego w modelu kooperatywnego działania zasada-metal. Obecność drugiego kationu w roli strukturalnej byłaby niezbędna do kształtowania centrum katalitycznego,
przesunięcia równowagi w kierunku aktywnej konformacji
lub stabilizacji ujemnego ładunku stanu przejściowego [57].
Na podstawie symulacji komputerowych zaproponowano,
że jon dwuwartościowy migruje z dalszego miejsca wiązania pomiędzy A9 i G10. Sugeruje się, że może on tworzyć
połączenie pomiędzy tlenem fosforanu przy A9 a tlenem
26
200
b.d.
140
atakowanego fosforanu oddalonych od siebie o 4.3Å, co pozwala na osiągnięcie przez G8 pKa umożliwiającego katalizowanie reakcji [46]. Stwierdzenie, że magnez nie odgrywa
w reakcji katalitycznej aktywnej roli zwróciło uwagę na występowanie dodatkowych motywów strukturalnych, które
stabilizują aktywną konformację cząsteczki [21].
Motywy stabilizujące strukturę
trzeciorzędową rybozymu
Wydłużone rybozymy hammerhead stabilizowane są poprzez trzeciorzędowe motywy (TSM, ang. tertiary stabilizing
motif), które zapewniają wysoką aktywność katalityczną in
vitro oraz in vivo w układzie in trans [58]. Oddziaływania te
mimo znacznej odległości od centrum katalitycznego rybozymu, pośrednio wpływają na jego strukturę poprzez zmiany geometrii cząsteczki [56].
Badając dynamikę konformacyjną wydłużonych rybozymów hammerhead z wykorzystaniem techniki FRET (ang.
fluorescence resonance energy transfer) wykazano, że oddziaływania pętli ramion I i II pozwalają częściej przyjmować
konformację katalitycznie aktywną [59]. Oddziaływania donora oraz akceptora fluoroforu zlokalizowanych przy końcach ramion I i II wykazały, że zwijanie się rybozymu w tym
rejonie i uzyskiwanie aktywnej konformacji zależą od stężenia jonów magnezu. Stężenia jonów magnezu w dwóch
etapach zmian konformacji (całkowitej i zmian lokalnych)
wydłużonego rybozymu są niższe niż dla rybozymu minimalnego [60]. Potwierdzono, że oddziaływania wybrzuszeń
helis I i II prowadzą do zmian struktury rybozymu w miejscu aktywnym oddalonym o ponad 10 Å [59]. Ich usunięcie
prowadzi do utworzenia struktury charakterystycznej dla
minimalnego rybozymu z zachowaniem orientacji helis i
aranżacją rdzenia katalitycznego do konformacji otwartej
nieaktywnej [61]. Tego typu mechanizm allosteryczny obserwowany jest w przypadku innych motywów ze strukturą typu „Y” [15].
Motywy TSM w naturalnie występujących rybozymach
hammerhead różnią się od siebie. W przypadku rybozywww.postepybiochemii.pl
mu hammerhead virusa sTRSV (ang. satellite RNA of tobacco
ringspot virus) potwierdzono tworzenie pary zasad typu
Hoogsteen pomiędzy adenozyną pętli helisy II a urydyną
niehelikalnego regionu helisy I [23]. Oddziaływanie to ma
charakter ewolucyjnie zachowawczy w większości naturalnych rybozymów hammerhead, co wskazuje na jego istotność
funkcjonalną. W rezultacie zmian konformacyjnych reszta
A przy końcu 3’ pętli helisy II może tworzyć parę z wyeksponowaną resztą U przy końcu 5’ pętli helisy I [62]. Te
cechy oddziaływań trzeciorzędowych występują w wielu
naturalnych HHRz [62].
Dla niektórych wydłużonych wariantów rybozymów
hammerhead, które wykazywały niską aktywność in vitro
obserwowano tworzenie alternatywnych struktur kompleksów rybozym:substrat wolniej migrujących w żelu
poliakryloamidowym [20]. Może być to czynnik limitujący
szybkość reakcji [63].
Porównanie rybozymu
minimalnego z wydłużonym
Wydłużone rybozymy hammerhead wykazują wysoką aktywność in vitro, często 50 do 500 razy lepszą niż wariant
minimalny (Tab. 3) [58,61,64].
W strukturze rdzenia katalitycznego minimalnego
HHRzM można wyróżnić dwie odrębne domeny (5’-(3)
CUGA(6)-3’ oraz 5’-(7)UGA(9) połączone wiązaniem typu
Watsona Cricka z 5’-(12)GAA(14)-3’(Ryc. 6). W rybozymie
minimalnym nukleotyd G8 oddziałuje z A13 pomiędzy parami G12-A9 i A14-U7 w obrębie domeny 2, natomiast reszta C17 połączona jest z C3 jednym wiązaniem wodorowym,
znajdując się pomiędzy parą G2.1-C1.1 a U4 w obrębie domeny 1 [65].
Rycina 6. Porównanie domen katalitycznych minimalnego (A) i wydłużonego
(B) rybozymu hammerhead. Miejsce hydrolizy oznaczono strzałką. Numeracja nukleotydów zgodnie z [14]. (A) W rybozymie minimalnym zasada G8 oddziałuje
z A13 pomiędzy parami G12-A9 i A14-U7 w obrębie domeny 2, natomiast reszta
C17 połączona jest z C3 jednym wiązaniem wodorowym znajdując się pomiędzy parą G2.1-C1.1 a U4 w obrębie domeny 1. (B) W rybozymie wydłużonym
nukleotydy G8 oraz U7 umieszczone są w kieszeni katalitycznej. G8 znajduje się
w pozycji zajmowanej przez nukleotyd C17 w strukturze rybozymu minimalnego tworząc wiązania typu Watsona-Cricka z C3, natomiast U7 leży w bliskim
sąsiedztwie U4. Para C3-G8 jest zlokalizowana pomiędzy terminalną parą G2.1-C1.1 helisy I a U7. Obecność dodatkowych nukleotydów w obrębie kieszeni
katalitycznej powoduje przesunięcie położenia reszty C17 (miejsce hydrolizy) w
bezpośrednie sąsiedztwo centrum katalitycznego (G12, A13 i A14). Domeny katalityczne zaznaczono szarymi owalami.
Oddziaływania pętli helisy II z wybrzuszeniem helisy I
w rybozymie o pełnej długości powodują zmianę geometrii miejsca aktywnego poprzez umieszczenie nukleotydów
G8 oraz U7 w kieszeni katalitycznej (Ryc. 3, Ryc. 6) [65]. G8
znajduje się w pozycji zajmowanej przez nukleotyd C17 w
strukturze rybozymu minimalnego tworząc wiązania typu
Watsona-Cricka z C3, natomiast U7 leży w bliskim sąsiedz-
twie U4. Powoduje to przesunięcie reszty C17 (miejsce hydrolizy) w bezpośrednie sąsiedztwo centrum katalitycznego
(G12, A13 i A14). Para C3-G8 jest zlokalizowana pomiędzy
terminalną parą G2.1-C1.1 helisy I a U7 [65]. Substytucja nukleotydów C3 i G8 z zachowaniem parowania zasad, utrzymuje aktywność katalityczną rybozymu [34].
Tabela 3. Porównanie właściwości rybozymów hammerhead – minimalnego i wydłużonego.
Cecha
Rybozym minimalny
Rybozym wydłużony
Ilość rozwiązanych struktur krystalicznych
6
3
Aktywność in vitro względem spontanicznej
degradacji wiązania RNA
~106
~108-109
Aktywność in vivo
niska
wysoka
Rdzeń katalityczny
2 domeny
C17 oddalona od centrum katalitycznego
G8 oddziałuje z C3
C17 w pobliżu G12, A13, A14
zwarty
C17 w centrum katalitycznym
G8 oddziałuje z A13
C17 oddziałuje z C3
G12 oddziałuje z A9
Dominująca konformacja
otwarta, nieaktywna
zamknięta, aktywna
Zależność od jonów dwuwartościowych
wysoka (10 mM in vitro)
niska (1 mM in vitro)
Oddziaływania współosiowe helis
tak
tak
Oddziaływania trzeciorzędowe
brak
tak
Wielkość
~32 nt
~55 nt
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
27
Struktura wydłużonego rybozymu wskazuje na udział
nukleotydów G8 i G12 w mechanizmie katalizy kwasowo-zasadowej [22]. Centrum katalityczne rybozymu wydłużonego zwija się w jeden zwarty rdzeń, w którym atakowany
fosforan sąsiaduje z resztami o potencjalnie katalitycznym
charakterze [65]. Produkt 5’ reakcji wydłużonego rybozymu HHRz dysocjuje 100-300 razy wolniej niż w przypadku
mutantów pozbawionych oddziaływań trzeciorzędowych
[56]. Jest to spowodowane zwijaniem się rdzenia katalitycznego wokół reszty C17. Usunięcie reszty C17 powoduje dysocjację produktu reakcji z szybkością porównywalną
do produktu 5’ minimalnego HHRzM [56]. Przyjęcie przez
rybozym minimalny aktywnej konformacji wymaga zmian
geometrii centrum katalitycznego, aż do przyjęcia struktury
odpowiadającej konformacji podstawowej rybozymu wydłużonego.
Analizując aktywności mutantów wydłużonego rybozymu Schistosoma mansoni zasugerowano istnienie sieci
wiązań wodorowych pomiędzy N1A14-NH2G5, N6A13-O2C17, 2’OHG5-N3A15.1 oraz N1/O6G12-2’OHC17 [61].
Wiązania wodorowe G10.1-C11.1, A15.1-U16.1 oraz C3-G8
są prawdopodobnie niezbędne do stabilizacji rdzenia katalitycznego [61].
Reakcje hydrolizy i ligacji katalizowane przez minimalny rybozym hammerhead mogą być opisane przez trzy stałe równowagi: i) szybka izomeryzacja pomiędzy wieloma
nieaktywnymi konformacjami i jedną aktywną Ku rybozymu przed reakcją, ii) kataliza prowadzona przez aktywny
rybozym Kint zależna od równowagi pomiędzy stałymi reakcji cięcia (k2) a ligacji (k-2); iii) szybka izomeryzacja jednej aktywnej konformacji po reakcji do wielu możliwych
konformacji nieaktywnych Kc (Ryc. 7) [65]. Na tej podstawie
oszacowano, że przeciętnie rybozym przed reakcją przyjmuje aktywną konformację tylko przez 0,2% czasu, a po hydrolizie pozostaje w tej konformacji przez 0,03% czasu [65].
Porównanie struktur dwóch wydłużonych HHRzW Smα
i sTRSV o różnych wartościach Kint pozwoliło na postawienie hipotezy o istnieniu mechanizmu konformacyjnego
przełącznika pomiędzy reakcją cięcia i ligacji. Kieruje on
zmianami w regionach oddziaływań trzeciorzędowych jak
i w rdzeniu katalitycznym [66]. Interakcje pomiędzy pętlą
Rycina 7. Schemat równowagi dynamicznej reakcji cięcia-ligacji rybozymu minimalnego. (A) Większość cząsteczek rybozymu hammerhead przed hydrolizą
tworzy dynamiczną pulę struktur, które przypominają strukturę krystaliczną
rybozymu minimalnego. (B) Niewielka frakcja cząsteczek zdefiniowana przez
stałą równowagi Ku nietrwale przyjmuje aktywną konformację, która przypomina strukturę krystaliczną rybozymu wydłużonego. Wewnętrzna stała równowagi cięcia/ligacji (Kint) opisana jest jako stosunek stałej cięcia (k2) i ligacji (k-2).
(C) Struktura aktywnej cząsteczki po reakcji znajduje się w równowadze Kc z
mieszaniną nieaktywnych struktur, które przypominają strukturę krystaliczną
rybozymu minimalnego. (D) Cząsteczki rybozymu hammerhead po reakcji tworzą
dynamiczną pulę struktur. Na podstawie [65]. Czarny – rybozym, niebieski —
substrat przed reakcją; zielony — produkty reakcji.
28
GNRA rybozymu, a partnerem w helisie I zależą od ekspozycji adenozyny do utworzenia wiązania typu Hoogsteen i
są związane z termodynamiczną rywalizacją z konformacją
kanoniczną w odizolowanej pętli. Z kolei w wielu przypadkach naturalnych wydłużonych rybozymów hammerhead
zachowana w ewolucji urydyna tworząca parę typu Hoogsteen z adenozyną pętli GNRA ma możliwość tworzenia
równocześnie pary AU lub GU. Zatem elementy strukturalne mogą występować w różnych konformacjach [66]. W obrębie rdzenia katalitycznego dochodzi do obrotu G8, która
tworzy parę z A13 helisy II w strukturze o niskiej aktywności, natomiast parę z C3 helisy I w strukturze aktywnej.
Na podstawie symulacji komputerowych rybozymów
oraz ich mutantów zaproponowano, że kluczowe dla utrzymania aktywnej konformacji rybozymu jest parowanie Watsona-Cricka pomiędzy G8 i C3, sieć wiązań wodorowych
pomiędzy C17 a G5 oraz oddziaływania warstwowe (ang.
base stacking) zasad G8 i C1.1 [46]. Umożliwiają one ustawienie liniowo grupy atakującej i opuszczającej [66].
Modyfikacje strukturalne
rybozymów hammerhead
Jednym z ograniczeń związanych z zastosowaniem katalitycznych RNA jako terapeutyków jest zależność ich aktywności od wysokiego stężenia jonów magnezu. In vitro,
najwyższą wydajność hydrolizy RNA katalizowaną przez
minimalny rybozym HHRzM obserwuje się w obecności 10
mM Mg2+ [45], podczas gdy stężenie magnezu w komórce
waha się w zakresie 0,5-1 mM [67]. Podstawowym celem
w projektowaniu nowych katalitycznych kwasów nukleinowych jest zwiększenie ich aktywności katalitycznej w
niskich stężeniach jonów magnezu.
Jeden z wariantów rybozymu HHRz wykazujący wysoką aktywność w niskich stężeniach Mg2+ uzyskano poprzez
skrócenie helisy II [68]. Transkrypt zawierający multimeryczny rybozym hammerhead Rz1-7 przeciwko siedmiu miejscom w transkrypcie docelowym okazał się wysoce skuteczny in vitro oraz in vivo w obniżaniu poziomu białka CCR5 w
potencjalnej terapii AIDS [69].
Dotychczas do stabilizacji struktury trzeciorzędowej rybozymów wykorzystywano naturalne motywy TSM, otaczające ich domenę katalityczną [21,64,65,70]. Nową generację efektywnych HHRz działających in trans projektowano
poprzez wydłużenie helisy I i zastąpienie pętli wybrzuszeniem lub wprowadzenie do helisy I końców 5’ i 3’ odpowiednio rybozymu i substratu [58]. Najbardziej aktywne
in trans są pochodne rybozymu wirusa PLMVd (ang. peach
latent mosaic viroid) oraz sTRSV [58].
Stabilizację struktury trzeciorzędowej rybozymów można uzyskać także poprzez dołączenie motywów, które naturalnie występują w innych cząsteczkach RNA. Receptory czteronukleotydowych pętli GNRA zaangażowane są
w oddziaływania trzeciorzędowe i występują w intronach
grupy I i II oraz RNazie P [71]. Rybozym TLR-HRz-gp41
hydrolizujący transkrypt genu gp41 wirusa HIV-1 zaprojektowano poprzez dołączenie do końca 5’ minimalnego
rybozymu HHRzM fragmentu RNA zawierającego motyw
www.postepybiochemii.pl
Tabela 4. Przykłady organizmów eukariotycznych, u których zidentyfikowano
rybozym hammerhead [81].
Nazwa
potoczna
Liczba
motywów
człowiek
makak
lemur mysi
lemur
(bushbaby)
szympans
lemur (tarsier)
2
3
3
1
Cavia porcellus
Mus musculus
Ochotona princeps
Oryctolagus cuniculus
Rattus norvegicus
Spermophilus
tridecemlineatus
świnka morska
mysz
pika
królik
szczur
2
3
2
2
2
wiewiórka
1
Laurasiatheria
Bos taurus
Canis familiaris
Equus caballus
Myotis lucifugus
Sorex araneus
Sus scrofa
Tursiops truncates
Vicugna pacos
krowa
pies
koń
nietoperz
ryjówka
świnia
delfin
alpaka
2
4
3
1
1
1
1
2
Afrotheria
Echinops telfairi
Loxodonta Africana
tenrek mniejszy
słoń
4
1
Xenartha
Choloepus hoffmanni
Dasypus novemcinctus
leniwiec
pancernik
2
2
Inne ssaki
Macropus eugenii
Manodelphis domestica
walabia
opos
1
3
Gallus gallus
Taeniopygia guttata
kurczak
zięba
1
2
Xenopus tropicalis
żaba
afrykańska
8
Danio rerio
danio
pręgowany
tetraodon
2
komar żółtej
febry
komar
muszka
owocowa
muszka
owocowa
osa
trojszyk
gryzący
1
Rośliny
Arabidopsis lyrata
Arabidopsis thaliana
Physcomitrella patens
Vitis vinifera
tasznik
tasznik
mech
winorośl
3
3
1
2
Grzyby
Aspergillus flavus
Aspergillus oryzae
Pichia stipitis
żółta pleśń
pleśń Koji
drożdże pichia
1
1
1
Caenorhabditis
briggsae
Caenorhabditis
remanei
Hydra magnipapillata
Ixodes scapularis
Schistosoma japonicum
Schistosoma mansoni
nicień
1
nicień
1
stułbia
kleszcz jeleni
przywra krwi
przywra krwi
35
1
2
24
Grupa
Naczelne
Gatunek
Homo sapiens
Macaca mulatta
Microcebus murinus
Otolemur garnettii
Pan troglodytes
Tarsius syrichta
Gryzonie
Ptaki i gady
Płazy
Ryby
Tetraodon nigroviridis
Aedes aegypti
Culex quinquefasciatus
Drosophila persimilis
Owady
Inne wielokomórkowce
Drosophila
pseudoobscura
Nasonia vitripennis
Tribolium castaneum
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
1
4
1
2
3
5
2
2
receptora dla czteronukleotydowej pętli GAAA [72]. Przyjęto, że oddziaływania pomiędzy czteronukleotydową pętlą i jej receptorem będą stabilizować aktywną konformację
rdzenia katalitycznego podnosząc wydajność hydrolizy w
niskich stężeniach jonów magnezu [72]. Analizowany rybozym wykazywał wyższą aktywność katalityczną w porównaniu do wariantu minimalnego wobec tej samej cząsteczki
docelowej RNA HIV-1.
Zaproponowano również metodę łączenia kilku cząsteczek katalitycznych w jednym konstrukcie, co wzmacnia
jego aktywność. Zaprojektowany chimeryczny transkrypt
zawierający połączone łącznikiem shRNA (ang. short hairpin RNA) oraz HHRz skierowane przeciwko segmentowi M1 genomu wirusa grypy typu A wykazywał wyższą
aktywność i ochronę przed infekcją niż osobno stosowane
pojedyncze elementy nawet po zsumowaniu ich osobnych
efektów [73]. Rybozym może być połączony z aptamerem
tworząc tzw. aptazym, co daje możliwość kontrolowania
jego aktywności. Indukowany teofiliną rybozym hammerhead zastosowano do kontroli ekspresji genu reporterowego
[74]. Innym przykładem modyfikacji struktury rybozymu
jest dołączenie przy końcu 5’ promotora dla tRNAVal oraz
przy końcu 3’ sygnału rekrutacji helikazy do skutecznej
degradacji prnp mRNA [75]. Helikaza po przyłączeniu do
cząsteczki prowadzi do rozplecenia mRNA, co umożliwia
rybozymowi dostęp do dowolnego miejsca w cząsteczce.
Rybozymy można wykorzystać do degradacji docelowych RNA kodowanych w genomie jądrowym jak i mitochondrialnym. Utworzono chimeryczny konstrukt posiadający sekwencję rybozymu hammerhead, łącznik, sekwencję
kierującą typu tRNA (TLS, ang. tRNA-like structure) oraz
sekwencję rybozymu HDV in cis kodowany w wektorze
[76]. Po transfekcji ulegał on transkrypcji w jądrze komórkowym i był aktywnie kierowany do mitochondrium, gdzie
skutecznie degradował docelowy mRNA. Zaproponowana
strategia stanowi przełom w analizie i manipulacji mitochondriami in vivo. Do tej pory badania transkrypcji, przetwarzania, edycji, stabilności i degradacji RNA organelli
półautonomicznych były badane jedynie in vitro lub in organello. Daje to także nadzieje na terapię chorób mitochondrialnych [77].
Rybozym hammerhead w genomach
różnych organizmów
Od czasu zidentyfikowania rybozymów typu hammerhead w genomach wirusowych pojawiały się kolejne doniesienia na temat ich występowania w różnych organizmach. W
2008 roku odkryto wysoce aktywny rybozym hammerhead
w obrębie regionu 3’UTR ludzkiego genu CLEC2 [78]. Wykazano, że cząsteczka ta jest aktywna in cis zarówno in vitro
jak i in vivo oraz wysunięto hipotezę o jej roli w postaci eukariotycznego ryboprzełącznika [66]. Niektóre z cząsteczek
posiadają dodatkowe elementy stabilizujące strukturę trzeciorzędową oraz obszerne motywy mogące pełnić funkcje
kontrolną [7]. Część z nich występuje w pojedynczych, odizolowanych miejscach w genomie, a inne w tandemowych
powtórzeniach [79]. Nie można wykluczyć, że rybozymy te
odgrywają rolę regulatorów ekspresji genów. Sugeruje się,
że naturalne HHRz występujące w intronach w zmienio-
29
Rycina 8. Rozpowszechnienie sekwencji rybozymu hammerhead w różnych
domenach świata żywego. Dotychczas
znane były 364 przykłady naturalnie
występujących motywów HH. Liczba ta
obecnie wynosi 11014. Na podstawie [7].
nych warunkach mogą wpływać na elongację transkrypcji
lub oddziaływać z maszynerią spliceosomu, prowadząc do
alternatywnego składania [79].
W obrębie flory bakteryjnej człowieka zidentyfikowano
kolejnych 20 kandydatów na nowe rybozymy hammerhead
[80]. Spośród cząsteczek działających in cis, 12 rybozymów
wykazało najwyższą szybkość reakcji in vitro zaproponowaną do tej pory. Dzięki analizom bioinformatycznym znaleziono kolejne 284 unikalne motywy, z czego 124 stanowiły znane rybozymy hammerhead z patogenów roślinnych i
Arabidopsis thaliana [81]. Pozostałe 160 cząsteczek stanowiło nowe przykłady rybozymów hammerhead z 50 różnych
genomów. Występowały one w regionach powtórzonych,
intronach lub regionach kodujących białka (Tab. 4, Ryc. 8)
[81]. Jest mało prawdopodobne, aby wszystkie te motywy
pochodziły od jednej sekwencji, która uległa zmianom w
trakcie ewolucji. Najprawdopodobniej pojawiały się one de
novo kilkakrotnie.
Rozmieszczenie sekwencji rybozymów w genomach sugeruje, że pełnią one funkcje odmienne od zaproponowanych dla pierwszych HHRz. W niektórych przypadkach
obserwowano tolerancję dla zmian nukleotydów w obrębie
rdzenia katalitycznego [7]. Do tej pory zidentyfikowano ponad 10 tysięcy przykładów rybozymów hammerhead typu I,
II i III, co czyni go najczęściej występującym motywem autokatalitycznym w naturze [7].
Perspektywy
Wiedza na temat elementów budulcowych oraz reguł
rządzących składaniem biologicznych makrocząsteczek w
skomplikowane struktury stanowi podstawę modelowania
i projektowania nowych obiektów. Analiza trzeciorzędowej
struktury RNA jest niezwykle istotna dla wszystkich obszarów badań biomolekularnych. Powstają nowe metody bioinformatyczne i matematyczne, mające na celu uzyskanie
wiernych modeli struktury trzeciorzędowej RNA. Badania
z dziedzin bioinformatyki, biologii eksperymentalnej i krystalografii uzupełniają obraz zależności funkcjonalno-struk-
30
turalnych cząsteczek RNA, co pozwala nam coraz lepiej pojąć funkcjonalną architekturę rybozymów.
Odkrywanie nowych motywów katalitycznych w obrębie transkryptomu może w przyszłości pozwolić lepiej zrozumieć mechanizmy kontroli ekspresji genów. Konieczne
są dalsze badania genetyczne i biochemiczne, aby określić,
czy motywy te są w pełni funkcjonalne oraz jakiej podlegają
regulacji.
Niezbędnym etapem rozwoju terapii genowej w oparciu
o kwasy nukleinowe jest projektowanie nowych rybozymów o wysokiej aktywności in vivo. Obecnie przeważa pogląd, że wydłużenie rybozymu minimalnego o dodatkowe
motywy stabilizujące ma większe znaczenie dla cząsteczki
niż udział jonów metali. Wykorzystanie wysoce aktywnych
rybozymów hammerhead w badaniach podstawowych jak i
do celów praktycznych w tym terapii chorób, stanowi nadal
istotne zagadnienie biologii molekularnej. Rozwój technologii opartych o katalityczne RNA być może pozwoli wkrótce
także na terapię chorób kodowanych mitochondrialnie.
Piśmiennictwo
1. Wan Y, Kertesz M, Spitale RC, Segal E, Chang HY (2011) Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat Rev Genet 12: 641655
2. Scott WG (2010) What can the new hammerhead ribozyme structures teach us about design? RNA technologies and their applications,
W: Erdmann VA, Barciszewski J (red) RNA Technologies and Their
Applications, RNA Technologies. Springer-Verlag Berlin Heidelberg,
str. 305-323
3. Kruger K, Grabowski PJ, Zaug AJ, Sands J, Gottschling DE, Cech TR
(1982) Self-splicing RNA: autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena. Cell 31: 147-157
4. Silverman SK (2008) Nucleic acid enzymes (ribozymes and deoxyribozymes): in vitro selection and application. Wiley encyclopedia of chemical biology. John Wiley & Sons, Inc.
5. Scherer LJ, Rossi JJ (2003) Approaches for the sequence-specific knockdown of mRNA. Nat Biotechnol 21: 1457-1465
6. Doudna JA, Cech TR (2002) The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature 418: 222-228
7. Perreault J, Weinberg Z, Roth A, Popescu O, Chartrand P, Ferbeyre
G, Breaker RR (2011) Identification of hammerhead ribozymes in all
www.postepybiochemii.pl
domains of life reveals novel structural variations. PloS Comp Biol 7:
e1002031
8. Bora RS, Gupta D, Mukkur TK, Saini KS (2012) RNA interference therapeutics for cancer: Challenges and opportunities. Mol Med Report
6: 9-15
9. Singh S, Narang AS, Mahato RI (2011) Subcellular fate and off-target
effects of siRNA, shRNA, and miRNA. Pharm Res 28: 2996-3015
10.Bruening G (1989) Compilation of self-cleaving sequences from plant
virus satellite RNAs and other sources. Methods Enzymol 180: 546-558
11.Branch AD, Robertson HD (1984) A replication cycle for viroids and
other small infectious RNA’s. Science 223: 450-455
12.Symons RH (1989) Self-cleavage of RNA in the replication of small
pathogens of plants and animals. Trends Biochem Sci 14: 445-450
13.Uhlenbeck OC (1987) A small catalytic oligoribonucleotide. Nature
328: 596-600
14.Hammann C, Lilley DM (2002) Folding and activity of the hammerhead ribozyme. Chembiochem 3: 690-700
15.De la Pena M, Dufour D, Gallego J (2009) Three-way RNA junctions
with remote tertiary contacts: a recurrent and highly versatile fold.
RNA 15: 1949-1964
16.Pley HW, Flaherty KM, McKay DB (1994) Three-dimensional structure
of a hammerhead ribozyme. Nature 372: 68-74
17.Scott WG, Finch JT, Klug A (1995) The crystal structure of an all-RNA
hammerhead ribozyme: a proposed mechanism for RNA catalytic
cleavage. Cell 81: 991-1002
18.Scott WG, Murray JB, Arnold JR, Stoddard BL, Klug A (1996) Capturing the structure of a catalytic RNA intermediate: the hammerhead
ribozyme. Science 274: 2065-2069
19.Burke DH, Greathouse ST (2005) Low-magnesium, trans-cleavage activity by type III, tertiary stabilized hammerhead ribozymes with stem
1 discontinuities. BMC Biochem 6: 14
20.Roychowdhury-Saha M, Roychowdhury S, Burke DH (2011) Conformational heterogeneity and the determinants of tertiary stabilization
in the hammerhead ribozyme from Dolichopoda cave crickets. RNA
Biol 8: 1-11
21.Khvorova A, Lescoute A, Westhof E, Jayasena SD (2003) Sequence elements outside the hammerhead ribozyme catalytic core enable intracellular activity. Nat Struct Biol 10: 708-712
32.Fedor MJ, Uhlenbeck OC (1990) Substrate sequence effects on hammerhead RNA catalytic efficiency. Proc Nat Acad Sci USA 87: 16681672
33.Hertel KJ, Herschlag D, Uhlenbeck OC (1994) A kinetic and thermodynamic framework for the hammerhead ribozyme reaction. Biochemistry 33: 3374-3385
34.Hertel KJ, Herschlag D, Uhlenbeck OC (1996) Specificity of hammerhead ribozyme cleavage. EMBO J 15: 3751-3757
35.Crissel P, Thompson S, James W (1993) Inhibition of HIV-1 replication
by ribozymes that show poor activity in vitro. Nucleic Acids Res 21:
5251-5255
36.Kore AR, Vaish NK, Kutzke U, Eckstein F (1998) Sequence specificity
of the hammerhead ribozyme revisited; the NHH rule. Nucleic Acids
Res 26: 1116-1120
37.Eckstein F, Kore AR, Nakamaye KL (2001). In vitro selection of hammerhead ribozyme sequence variants. Chembiochem 2: 629-635
38.Sun LQ, Cairns MJ, Saravolac EG, Baker A, Gerlach WL (2000) Catalytic nucleic acids: from lab to applications. Pharmacol Rev 52: 325-347
39.Sawata S, Shimayama T, Komiyama M, Kumar PK, Nishikawa S, Taira
K (1993) Enhancement of the cleavage rates of DNA-armed hammerhead ribozymes by various divalent metal ions. Nucleic Acids Res 21:
5656-5660
40.Przybilski R, Hammann C (2007) The tolerance to exchanges of the
Watson-Crick base pair in the hammerhead ribozyme core is determined by surrounding elements. RNA 13: 1625-1630
41.Lee TS, Giambaşu G, Harris ME, York DM (2011) Characterization of
the structure and dynamics of the HDV ribozyme at different stages
along the reaction path. J Phys Chem Lett 2: 2538-2543
42.Westhof E (1999) Chemical diversity in RNA cleavage. Science 286:
61-62
43.Doherty EA, Doudna JA (2001) Ribozyme structures and mechanisms.
Annu Rev Biophys Biomol Struct 30: 457-475
44.Ferré-D’Amaré AR, Scott WG (2010) Small self-cleaving ribozymes.
Cold Spring Harb Perspect Biol 2: a003574
45.Stage-Zimmermann TK, Uhlenbeck OC (1998) Hammerhead ribozyme kinetics. RNA 4: 875-889
46.Lee T, York DM (2010) Computational mutagenesis studies of hammerhead ribozyme catalysis. J Am Chem Soc 132: 13505-13518
22.Martick M, Scott WG (2006) Tertiary contacts distant from the active
site prime a ribozyme for catalysis. Cell 126: 309-320
47.Schnabl J, Sigel RKO (2010) Controlling ribozyme activity by metal
ions. Curr Opin Chem Biol 14: 269-275
23.Chi Y, Martick M, Lares M, Kim R, Scott WG, Kim S (2008) Capturing hammerhead ribozyme structures in action by modulating general
base catalysis. PloS Biol 6: 2060-2068
48.Williams RJP, Fraústo da Silva JJR (2000) The distribution of elements
in cells. Coordin Chem Rev 200-202: 247-348
24.Chen X, Denison L, Levy M, Ellington AD (2009) Direct selection for
ribozyme cleavage activity in cells. RNA 15: 2035-2045
25.Real AN, Greenall RJ (2004) Influence of spermine on DNA conformation in a molecular dynamics trajectory of d(CGCGAATTCGCG)
(2): major groove binding by one spermine molecule delays the AàB
transition. J Biomol Struct Dyn 21: 469-488
26.Nakano S, Karimata HT, Kitagawa Y, Sugimoto N (2009) Facilitation
of RNA enzyme activity in the molecular crowding media of cosolutes. J Am Chem Soc 131: 16881-16888
27.Kilburn D, Roh JH, Guo L, Briber RM, Woodson SA (2010) Molecular
crowding stabilizes folded RNA structure by the excluded volume effect. J Am Chem Soc 132: 8690-8696
28.Tsuchihashi Z, Khosla M, Herschlag D (1993) Protein enhancement of
hammerhead ribozyme catalysis. Science 262: 99-102
29.Bertrand EL, Rossi JJ (1994) Facilitation of hammerhead ribozyme catalysis by the nucleocapsid protein of HIV-1 and the heterogenous
nuclear ribonucleoprotein A1. EMBO J 13: 2904-2912
30.Herschlag D, Khosla M, Tsuchihashi Z, Karpel RL (1994) An RNA
chaperone activity of non-specific RNA binding proteins in hammerhead ribozyme catalysis. EMBO J 13: 2913-2924
31.Sioud M, Jespersen L (1996) Enhancement of hammerhead ribozyme
catalysis by gliceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Mol Biol
257: 775-789
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
49.Murray JB, Seyhan AA, Walter NG, Burke JM, Scott WG (1998) The
hammerhead, hairpin and vs. ribozymes are catalytically proficient in
monovalent cations alone. Chem Biol 5: 587-595
50.Han J, Burke JM (2005) Model for general acid-base catalysis by the
hammerhead ribozyme: pH activity relationships of G8 and G12 variants at the putative active site. Biochemistry 44: 7864-7870
51.Boots JL, Canny MD, Azimi E, Pardi A (2008) Metal ion specificities for
folding and cleavage activity in the Schistosoma hammerhead ribozyme.
RNA 14: 2212-2222
52.Curtis EA, Bartel DP (2001) The hammerhead cleavage reaction in monovalent cations. RNA 7: 546-552
53.O’Rear JL, Wang S, Feig AL, Beigelman L, Uhlenbeck OC, Herschlag D
(2001) Comparison of the hammerhead cleavage reactions stimulated
by monovalent and divalent cations. RNA 7: 537-545
54.Fedoruk-Wyszomirska A, Wyszko E, Giel-Pietraszuk M, Barciszewska MZ, Barciszewski J (2007) High hydrostatic pressure approach
proves RNA catalytic activity without magnesium. Int J Biol Macromol 41: 30-35
55.Fedoruk-Wyszomirska A, Giel-Pietraszuk M, Wyszko E, Szymański
M, Ciesiołka J, Barciszewska MZ, Barciszewski J (2009) The mechanism of acidic hydrolysis of esters explains the HDV ribozyme activity.
Mol Biol Rep 36: 1647-1650
56.Shepotinovskaya I, Uhlenbeck OC (2010) Enhanced product stability
in the hammerhead ribozyme. Biochemistry 49: 4494-4500
31
57.Leclerc F (2010) Hammerhead ribozyme: true metal or nucleobase catalysis? Where is the catalytic power from? Molecules 15: 5389-5407
58.Carbonell A, Flores R, Gago S (2011) Trans-cleaving hammerhead ribozymes with tertiary stabilizing motifs: in vitro and in vivo activity
against a structured viroid RNA. Nucleic Acids Res 39: 2432-2444
59.McDowell SE, Jun JM, Walter NG (2010) Long-tertiary interactions in
single hammerhead ribozymes bias motional sampling toward catalytically active conformations. RNA 16: 2414-2426
60.Rueda D, Wick K, McDowell SE, Walter NG (2003) Diffusely bound
Mg2+ ions slightly reorient stems I and II of the hammerhead ribozyme
to increase the probability of formation of the catalytic core. Biochemistry 42: 9924-9936
61.Nelson JA, Uhlenbeck OC (2008B) Hammerhead redux: Does the new
structure fit the old biochemical data? RNA 14: 605-615
62.Dufour D, de la Pena M, Gago S, Flore R, Gallego J (2009) Structurefunction analysis of the ribozymes of chrysanthemum chlorotic mottle
viroid: a loop-loop interaction motif conserved in most natural hammerheads. Nucleic Acids Res 37: 368-381
63.Buskiewicz IA, Burke JM (2012) Folding of the hammerhead ribozyme: Pyrrolo-cytosine fluorescence separates core folding from global folding and reveals a pH-dependent conformational change. RNA
18: 434-448
64.Saksmerprome V, Roychowdhury-Saha M, Jayasena S, Khvorova A,
Burke DH (2004) Artificial tertiary motifs stabilize trans-cleaving hammerhead ribozymes under conditions of submillimolar divalent ions
and high temperatures. RNA 10: 1916-1924
65.Nelson JA, Uhlenbeck OC (2008) Minimal and extended hammerheads utilize a similar dynamic reaction mechanism for catalysis. RNA
14: 43-54
66.Scott WG, Martick M, Chi Y (2009) Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim
Biophys Acta 1789: 634-641
67.Uetani T, Matsubara T, Nomura H, Murohara T, Nakayama S (2003)
Ca2+-dependent modulation of intracellular Mg2+ concentration with
amiloride and KB-R7943 in pig carotid artery. J Biol Chem 278: 4749147497
68.Conaty J, Hendry P, Lockett T (1999) Selected classes of minimised
hammerhead ribozyme have very high cleavage rates at low Mg2+
concentration. Nucleic Acids Res 27: 2400-2407
69.Nazari R, Ma XZ, Joshi S (2008) Inhibition of human immunodeficiency virus-1 entry using vectors expressing a multimeric hammerhead
ribozyme targeting the CCR5 mRNA. J Gen Virol 89: 2252-2261
70.Weinberg MS, Rossi JJ (2005) Comparative single-turnover kinetic
analyses of trans-cleaving hammerhead ribozymes with naturally derived non-conserved sequence motifs. FEBS Lett 579: 1619-1624
71.Costa M, Michel F (1995) Frequent use of the same tertiary motif by
self-folding RNAs. EMBO J 14: 1276-1285
72.Fedoruk-Wyszomirska A, Szymański M, Wyszko E, Barciszewska
MZ, Barciszewski J (2009) Highly active low magnesium hammerhead
ribozyme. J Biochem 145: 451-459
73.Kumar P, Sood V, Vyas R, Gupta N, Banerjea AC, Khanna M (2010)
Potent inhibition of influenza virus replication with novel siRNA-chimeric-ribozyme constructs. Antiviral Res 87: 204-212
74.Ausländer S, Ketzer P, Hartig JS (2010) A ligand-dependent hammerhead ribozyme switch for controlling mammalian gene expression.
Mol BioSyst 6: 807-814
75.Stobart MJ, Simon SLR, Plews M, Lamoureux L, Konx JD (2009) Efficient knockdown of human prnp mRNA expression levels using hybrid hammerhead ribozymes. J Tox Env Health Part A 72: 1034-1039
76.Val R, Wyszko E, Valentin C, Szymanski M, Cosset A, Alioua M, Dreher TW, Barciszewski J, Dietrich A (2011) Organelle trafficking of chimeric ribozymes and genetic manipulation of mitochondria. Nucleic
Acids Res 39: 9262-9274
77.Federico A, Cardaioli E, Da Pozzo P, Formichi P, Gallus GN, Radi E
(2012) Mitochondria, oxidative stress and neurodegeneration. J Neurol
Sci 322: 254-262
78.Martick M, Horan LH, Noller HF, Scott WG (2008) A discontinuous
hammerhead ribozyme embedded in a mammalian messenger RNA.
Nature 454: 899-902
79.De la Pena M, Garcia-Robles I (2010) Ubiquitous presence of the hammerhead ribozyme motif along the tree of life. RNA 16: 1943-1950
80.Jimenez RM, Delwart E, Luptak A (2011) Structure-based search reveals hammerhead ribozymes in the human microbiome. J Biol Chem
286: 7737-7743
81.Seehafer C, Kalweit A, Steger G, Graf S, Hammann C (2011) From alpaca to zebrafish: hammerhead ribozymes wherever you look. RNA
17: 21-26
Functional architecture of the hammerhead ribozyme
Marta M. Gabryelska*, Agnieszka Fedoruk-Wyszomirska*, Eliza Wyszko, Jan Barciszewski
Institute of Bioorganic Chemistry, Polish Academy of Sciences, 12/14 Z. Noskowskiego St., 61-704 Poznań, Poland

e-mail: [email protected]
*first two authors contributed equally to this work
Key words: RNA structure, hammerhead ribozyme, transestrification, catalytic core
Abstract
Hammerhead ribozyme is the smallest naturally occurring catalytic RNA. It is a perfect model for structure-function relation studies. Initially,
it was identified as an autocatalytic part of viroid and virusoid genomic RNA. It exists within the genomes of many organisms including human, which makes it the most common autocatalytic motif in the nature. After 25 years of intensive research, there are a lot of data considering
its structure, conformational dynamics and an influence of tertiary stabilizing motifs on its stability and properties. Structure of the hammerhead ribozyme is a system of elements that influence each other. The knowledge of ribozyme architecture is outstandingly interesting in the
context of rules and logic of design, construction and application of such molecules as spatial molecular constructions. Presence of additional
structural motifs distinguishes extended hammerhead ribozyme from the minimal one. Hammerhead ribozyme recognizes complementary
RNA and catalyses transesterification after the 5’-NUH-3’ sequence. Reaction efficiency depends on an arrangement of atoms of the catalytic
core presence of metal ions and other intracellular factors. Innovative and potentially better derivatives of the hammerhead ribozyme are
objects of extensive research in the field of molecular medicine.
32
www.postepybiochemii.pl