Marta Markiewicz, Agnieszka Barnyk - IHAR

Ziemniak Polski 2010 nr 2
1
BIAŁKA AKTYWNE BIOLOGICZNIE
OBECNE W SOKU
POKROCHMALNIANYM
POKROCHMALNI NYM
mgr inż. Marta Markiewicz1, dr inż. Agnieszka Barnyk2
1
Politechnika Gdańska, Katedra Technologii Chemicznej, ul. Narutowicza 11/12
80-233 Gdańsk, e-mail: [email protected]
2
IHAR, Zakład Nasiennictwa i Ochrony Ziemniaka w Boninie
e-mail: [email protected]
1.
Białka jako produkt uboczny krochmalnictwa
Podczas przetwarzania jednej tony ziemniaków na skrobię powstaje od 5 do 12 m3 soku
ziemniaczanego, który zawiera 300-410 g/kg
białek w całkowitej suchej masie. Przybliżona zawartość białka w soku poprodukcyjnym
typowego zakładu przetwórstwa ziemniaczanego zawiera się w granicach 1-4 g/l, czysta
frakcja białkowa stanowi ok. 50% osadu (Vikelouda, Kiosseoglou 2004).
Białka znajdują się w soku poprodukcyjnym w formie natywnej (aktywnej funkcjonalnie). Jednakże z uwagi na ich wysoką wrażliwość na ogrzewanie i siły ścinające często
ulegają denaturacji podczas filtrowania, a
nawet przechowywania (Zwijnenbegr i in.
2002).
1.1. Rodzaje białek obecnych
w odpadzie krochmalniczym
Trzy główne grupy białek zawartych w bulwach ziemniaka to: białka typu patatyny, grupa białek złożonych o wielkości 22 kDa oraz
inhibitory proteaz o charakterze zasadowym
(Ralet, Gueguen 2000b).
Białka typu patatyny są jednorodną grupą kwaśnych białek, stanowiących do 40%
wszystkich białek rozpuszczalnych obecnych
w bulwach ziemniaka. Pierwszy raz zostały
wyizolowane przez Racusena i Foote’a w
1980 roku. Białka te występują w formie dimerów o łącznej wielkości ok. 88 kDa, złożonych z podjednostek o wielkości ok. 40 kDa
(Ralet, Gueguen 2000a). Istnieje wiele form
patatyny, można je podzielić na cztery grupy:
A, B, C i D, stanowiące odpowiednio 62, 26,
5 i 7% patatyn występujących w tkance bulw
ziemniaka czy w soku poprodukcyjnym (Pots
i in. 1999). Wszystkie formy mają niemal
identyczną sekwencję aminokwasową i są
immunologicznie nierozróżnialne. Patatyna
służy głównie jako białko zapasowe, ale ma
również aktywność enzymatyczną pozwalającą na trawienie tłuszczów (Ralet, Gueguen
2000a) należących do fosfolipidów, glikolipidów, sulfolipidów oraz mono- i diacylogliceroli. Zdaniem Tonon i innych (2001) aktywność lipolityczna patatyny może być częścią
mechanizmu obronnego, pozwalającego na
hamowanie procesu patogenezy.
Druga grupa białek, obejmujących
związki o wielkości 22 kDa, jest zdecydowanie gorzej poznana niż patatyna. Wiadomo, że białka do niej należące mają charakter zasadowy. Grupa ta obejmuje dwie odrębne rodziny białek, z których każda wykazuje zdolność do hamowania enzymów proteolitycznych trawiących białka. Frakcja ta
stanowi ok. 30-40% białek obecnych w bulwach ziemniaka (Ralet, Gueguen 2000b).
Inhibitory proteaz, stanowiące 20-30%
ekstraktu (Ralet, Guegeun 2000b), są w
przeciwieństwie do białek z grupy patatyny
znacznie bardziej zróżnicowane. Białka w tej
grupie różnią się masą cząsteczkową, sekwencją aminokwasów oraz aktywnością enzymatyczną. Można je podzielić na siedem
kategorii (Pouvreau i in. 2001):
● inhibitory I (PI-1) – białka o wielkości 7-8
kDa, hamujące chymotrypsynę oraz w mniejszym stopniu trypsynę;
● inhibitory II (PI-2) – dimery zbudowane z
dwóch podjednostek, wśród których wyróżniamy cztery typy: A, B, C i D. Zależnie od
tego, które z podjednostek tworzą białko,
2
Ziemniak Polski 2010 nr 2
zmienia się powinowactwo inhibitora do trypsyny i chymotrypsyny;
● inhibitory proteazy cysteinowej (PCPI) –
to rodzina białek o wielkości 20-22 kDa. Niektóre z nich wykazują częściową zdolność
do hamowania proliferacji komórek nowotworowych (Ledoigt i in. 2006). Inhibitory te
wykazują maksimum aktywności w pH 5-7,
czyli takim, jakie panuje w przewodzie pokarmowym insektów wytwarzających proteazy
serynowe;
● inhibitory proteazy asparaginowej (PAPI),
o wielkości ok. 20 kDa i optimum aktywności
w zakresie pH 3-5. Bulwy ziemniaka zawierają inhibitor proteinazy asparaginowej – katepsyny D, który hamuje oprócz katepsyny D
także trypsynę i chymotrypsynę, ale nie wykazuje aktywności w stosunku do proteaz
asparaginowych takich jak pepsyna, renina
lub katepsyna E (Lawrence, Kouldal 2002);
● inhibitory proteazy typu Kunitza (PKPI) –
mają wielkość ok. 20 kDa i wykazują aktywność w stosunku do chymotrypsyny i nieco
mniejszą aktywność w stosunku do trypsyny.
Jorgensen i inni (2006) wyizolowali z soku
poprodukcyjnego aż czternaście wariantów
inhibitorów proteaz typu Kunitza, które wykazywały aktywność w stosunku do trypsyny
oraz proteaz pochodzących z grzybów Fusarium;
● inhibitor karboksypeptydaz (PCI) – jest
najmniejszym z inhibitorów obecnych w bul-
wach ziemniaka (4,3 kDa), złożonym tylko z
jednego peptydu. Odznacza się bardzo dużą
odpornością termiczną i wykazuje aktywność
w stosunku do karboksypeptydazy A (Pou-vreau i in. 2001). Inhibitory karboksypeptydaz pochodzące z ziemniaka są silnymi inhibitorami o szerokim spektrum działania, hamującymi zarówno enzymy zwierzęce, jak i
produkowane przez mikroorganizmy, ale nie
działają na karboksypeptydazy serynowe
drożdży i roślin (Lawrence, Koundal 2002);
● inne inhibitory proteazy serynowej (OSPI)
– mają wielkość ok. 21 kDa i są złożone z
dwóch podjednostek. Wykazują aktywność w
stosunku do chymotrypsyny, trypsyny i elastazy (Pouvreau i in. 2001). Inhibitory proteaz serynowych wykazują największą aktywność w pH 9-11, zakres ten odpowiada pH,
jakie występuje w przewodzie pokarmowym
insektów rzędu Lepidoptera, wśród których
wyróżnia się wiele szkodników roślin (Lawrence, Koundal 2002).
Biologiczna rola inhibitorów proteaz nie
jest poznana, ale istnieją hipotezy wskazujące na trzy funkcje, które mogą spełniać: są
białkami zapasowymi, ponadto służą jako regulatory aktywności endogennych proteaz
oraz stanowią czynniki chroniące roślinę
przed insektami i patogenną mikroflorą (Ledoigt i in. 2006).
Tabela 1
Charakterystyka białek występujących w wodach sokowych
Białko
Patatyna
Masa cząsteczko43
wa (kDa)
Procentowa za37,5%
wartość w soku
Zakres pI
4.0
Liczba izoform
Substrat
lipidy
PI-1
PI-2
PCPI
PAPI
PKPI
PCI
OSPI
7-8
20
20-23
19-22
20
4,3
21
4,5%
22,3%
11,9%
5,9%
3,6%
0,9%
1,5%
nie
ozna- 7,5-8,8
-czono
8
7
8
6
2
2
trp,
trp, chym, trp, chym, trp, chym, trp, chym,
trp, chym
chym,
LEL
LEL
pap
LEL, kat D
LEL
5,1-7,8
5,5-6,9
5,9-9,4
6,2-8,7
8,0-9,0
Objaśnienia: trp – trypsyna, chym – chymotrypsyna, LEL – ludzka elastyna leukocytowa,
kat D – katepsyna D; Źródło: Pouvreau i in. (2001); Ralet, Gueguen (2000)
1.2. Sposoby izolacji białek
z soku poprodukcyjnego
Jednym ze sposobów izolacji białek z produktów ubocznych krochmalnictwa jest kon-
centracja z użyciem odwróconej osmozy połączona z koagulacją termiczną białek, a następnie ich separacją i suszeniem. Tak pozyskane białko ma słony i gorzki smak oraz
Ziemniak Polski 2010 nr 2
ograniczone zastosowanie. Nie może być
używane jako np. dodatek do żywności, a jedynie jako pasza dla zwierząt. Wykorzystanie ultrafiltracji pozwala na uzyskanie preparatu o nieco lepszych właściwościach organoleptycznych, mogącego być np. dodatkiem
do produktów mięsnych, jednak w ilości nie
większej niż 10% masy produktu i przy zastosowaniu substancji maskujących jego
smak i zapach (Zwijnenberg i in. 2002).
Sharma i inni (2004), stosując rozdział na
kolumnach wypełnionych jonowymieniaczem, uzyskali rozdział białek na dwie grupy:
związane na kolumnie – białka kwasowe
(22% ilości białek naniesionych na kolumnę)
i niezwiązane – białka zasadowe (71%).
Frakcja kwasowa wykazywała aktywność antygrzybową.
Możliwe jest również odzyskiwanie białek
z soku poprodukcyjnego na drodze kombinacji koagulacji termicznej i strącania kwasem.
Jednak białka uzyskane w ten sposób są
nieodwracalnie zdenaturowane i pozbawione
aktywności biologicznej właściwej ich formom natywnym (Pots i in. 1998).
Inne metody umożliwiające wydzielenie
białek z soku to kompleksowanie na bentonicie lub karboksymetylocelulozie (Ralet, Gueguen 2000b). Kompleksowanie przy uży-ciu
polisacharydów wydaje się najwłaściwszą
metodą izolacji białek w formie natywnej
(Gonzalez i in. 1991).
1.3. Potencjalne zastosowanie
wyizolowanych białek
Roślinne inhibitory proteaz (enzymów trawiących białka) odgrywają znaczącą rolę w
obronie roślin przed patogenami i zwierzętami roślinożernymi. Hamując aktywność proteaz, ograniczają ilość białek, które są trawione przez szkodniki, oraz powodują nadprodukcję enzymów hydrolitycznych, co
zwiększa utratę aminokwasów siarkowych
(Lawrence, Koundal 2002). W efekcie dochodzi najpierw do zahamowania rozwoju insektów, a ostatecznie do ich śmierci. Niektóre białkowe inhibitory proteaz pozyskiwane z
ziemniaka są toksyczne na przykład w stosunku do: Sesamia inferens, Chrysodeixus
erisoma, Teleogryllus comodus, Diabrotica
virgifera i Diabrotica undecimpuntata (Lawrence, Kouldal 2002). Kim i inni (2005)
stwierdzili, że jeden z inhibitorów proteaz
3
typu Kunitza – potamin-1 – hamuje wzrost i
rozmnażanie się niektórych bakterii, np. Staphylococcus aureus, Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis oraz grzybów, np.
Candida albicans i Rhizoctonia solani. Inhibitor ten odznacza się niezwykłą aktywnością
antydrobnoustrojową, jednocześnie nie oddziałując na komórki ssaków. W rok później
grupa badaczy pod kierunkiem Kima wyizolowała z bulw ziemniaka inne białko o charakterze inhibitora proteaz serynowych typu
Kunitza o wielkości zbliżonej do potamin-1,
ale innej sekwencji aminokwasowej. Białko
to otrzymało nazwę potide-G i wykazywało
aktywność antybakteryjną i przeciwgrzybową
w stosunku do tych samych patogenów co
potamin-1, a ponadto także względem Listeria monocytogenes i Escherichia coli (Kim i
in. 2006). Potide-G ma zdolność hamowania
infekcji wirusa PVYO nawet w stężeniu dziesięciokrotnie niższym niż jego średnie stężenie w bulwach ziemniaka (Tripathi i in. 2006).
Białkowe inhibitory proteinaz wyizolowane
z bulw ziemniaka są wykorzystywane w
przemyśle spożywczym do hamowania niekorzystnych zmian enzymatycznych w mięsie ryb, mięczaków i skorupiaków. Podczas
przetwarzania tych produktów w temperaturze 60°C aktywowane są enzymy rozkładające miozynę i powodujące zniszczenie tekstury tych surowców. Inhibitory proteaz z ziemniaka znalazły też zastosowanie w produkcji
surimi (jap. „mielone mięso”, produkt na bazie zmielonego mięsa białych ryb, najczęściej mintaja lub morszczuka; popularny w
kuchniach dalekowschodnich; najbardziej
znana postać to paluszki krabowe – przyp.
red.) z kilku gatunków ryb, co pozwoliło na
poprawę jakości produktu i zwiększenie zysków (Garcia-Carreño 1996).
Opisywano antynowotworowe działanie
inhibitorów proteaz pochodzących z bulw
ziemniaka. Inhibitory proteaz I i II posiadają
zdolność hamowania zmian w komórkach
prowadzących do transformacji nowotworowej (Billings i in. 1991). Natomiast ziemniaczane inhibitory karboksypeptydaz hamują
proliferację komórek kilku linii gruczolaka
trzustki (Blanco-Aparicio i in. 1998). Ma to
ogromne potencjalne znaczenie terapeutyczne ze względu na brak skutecznej terapii w
przypadku tego nowotworu.
4
Ziemniak Polski 2010 nr 2
Ponadto wykazano, że spożywanie izolowanych z bulw ziemniaka inhibitorów proteaz
powoduje uwalnianie substancji powodujących zmniejszenie wchłaniania spożywanego pokarmu, a w efekcie prowadzi do
zmniejszenia masy ciała. Na bazie inhibitorów proteaz wyprodukowano i wprowadzono
na rynek dwa suplementy diety w postaci napoju (Satietrol) i kapsułek (Satise), zawierające mieszaninę białek z ziemniaka i kwasów
tłuszczowych, efektywnie wspomagające odchudzanie (Fear i in. 2007).
Ruseler-van Embden i inni (2004) udowodnili, że inhibitory proteaz pozyskiwane z
ziemniaka mogą być z doskonałym skutkiem
stosowane w leczeniu pooperacyjnych zapaleń skóry będących efektem podrażnień wywoływanych przez enzymy trzustkowe. Z badań tych wynika też, że inhibitory trypsyny z
soi również hamują działanie enzymów
trzustkowych, jednak w znacznie mniejszym
stopniu niż inhibitory proteaz izolowane z
ziemniaka. Te ostatnie blokują niemal zupełnie aktywność wszystkich trzech enzymów
trzustkowych.
Ze względu na zdolność do hamowania
wzrostu Candida albicans inhibitory proteaz
mogą być stosowane również w leczeniu
drożdżyc jamy ustnej, przełyku i dróg moczowych (Kim i in. 2005).
Patatyna – stanowi część systemu obronnego rośliny przed patogenami, wykazując
zdolność degradacji ścian komórkowych
bakterii i grzybów (Sharma i in. 2004). Ponadto aktywność patatyny powoduje uwal-nianie substratów do wytwarzania toksycznych dla patogenów pochodnych kwasów
tłuszczowych i wosków (Andreau i in. 1998).
Patatyna okazała się też bardzo obiecującym czynnikiem pianotwórczym. Jej zdolność do tworzenia i utrzymania piany jest porównywalna ze sproszkowanym białkiem jaja
kurzego, a nawet lepsza (Ralet, Guegen
2000). Może też być stosowana jako enzymatyczny katalizator niektórych procesów,
jak deacylacja czy synteza estrów, wykazujący aktywność nawet przy małej dostępności wody w środowisku (Hirschberg i in.
2001).
Białko to wykazuje także właściwości antyutleniające w stosunku do β-karotenu i
kwasu linolenowego, więc może znaleźć zastosowanie jako ekologiczny konserwant. Ma
też zdolność neutralizacji wolnych rodników,
mających istotne znaczenie w indukcji choroby Alzheimera, nowotworów, choroby wieńcowej oraz procesu starzenia się organizmu,
mogłoby więc być brane pod uwagę jako
czynnik hamujący lub opóźniający tego typu
zmiany chorobowe (Yen-Wenn i in. 2003).
1.4. Podsumowanie
W ciągu ostatniego dziesięciolecia znacznie
wzrosło zainteresowanie białkami obecnymi
w produktach ubocznych przemysłu krochmalniczego ze względu na ich wielokierunkowe potencjalne zastosowanie. Obecnie udowodniono, w skali laboratoryjnej, przydatność tych związków jako biodetergentów,
emulsyfikatorów, insektycydów, bakteriocydów, leków, katalizatorów reakcji chemicznych, konserwantów itp., a nawet z powodzeniem zastosowano je jako dietetyczne
dodatki do żywności dla ludzi. Ponieważ białka pozyskiwane z ziemniaka mają naturalne
pochodzenie, są uważane za bardziej bezpieczne i mogą stanowić alternatywę dla
chemicznych dodatków do żywności, m. in.
konserwantów lub środków pieniących. Odpad pokrochmalniczy jest bogatym źródłem
patatyny i inhibitorów proteaz, powstającym
w ogromnych ilościach. Przetworzenie 100 t
ziemniaków daje 75 m3 płynnych odpadów
zawierających biologicznie aktywne białko,
które może być źródłem dodatkowych dochodów.
Literatura
1. Billings P., Jin T., Ohnishi N., Liao D., Habres J.
1991. The interaction of the potato-derived chymotripsin inhibitor with C3H/10T1/2 cells. – Carcinogenesis
12: 653-657; 2. Blanco-Aparicio C., Molina M. A.,
Fernández-Salas E., Frazier M. L., Mas J. M., Querol
E., Avilés F. X., de Llorens R. 1998. Potato
carboxypeptidase inhibitor, a T-knot protein, is an epidermal growth factor antagonist that inhibits tumor cell
growth. – J. Biol. Chem. 273: 12370-12377; 3. Fear
G., Komarnytsky S., Raskin I. 2007. Protease inhibitors and their peptidomimetic derivatives as potential
grugs. – Pharmacology and Therapeutics 113: 354368;
4. Garcia-Carreño F. L. 1996. Protease
inhibitors. – Trends Food Sci. Tech. 7(6): 197-204; 5.
Gonzalez J. M., Lindemood J. B., Desai N. 1991. Recovery of proteins from potato plant waste effulents by
complexation with carboxymethylcelulose. – Food Hydrocolloids 4: 355-363; 6. Hirschberg H., Simons J.,
Ziemniak Polski 2010 nr 2
Dekker N., Egmond M. 2001. Cloning, expression,
purification and characterization of patatin, a novel
phospholipase A. – Eur. J. Bioch. 268: 5037-5044;
7. Jorgensen M., Bauw G., Welinder K.G. 2006. Molecular Properties and Activities of Tuber Proteins from
Starch Potato Cv. Kuras. – J. Agric. Food Chem. 54
(25): 9389-9397; 8. Kim J. Y., Seong-Cheol Parka,
Mi-Hyun Kima, Hak-Tae Limb, Yoonkyung Parka,
Kyung-Soo Hahm 2005. Antymicrobial activity studies
on a trypsin-chymotripsin protease inhibitor obtained
from potato. – Bioch. Biophys. Res. Communic. 330:
921-927; 9. Kim M., Park S., Kim J., Lee S., Lim H.,
Cheong H., Hahm K., Park Y. 2006. Purification and
characterization of heat-stable serine protease inhibitor
from the tubers of new potato variety „Golden Valley”.
– Bioch. Biophys. Res. Communic. 346: 681-686;
10. Lawrence P., Koundal K. 2002. Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects. – Electr. J.
Biotech. 5: 93-109; 11. Ledoigt G., Griffaut B., Debiton E., Vian C., Mustel A., Evray G., Maurizis J. C.,
Madelmoth J.C. 2006. Analysis of secreted protease
inhibitors after water stress in potato tubers. – Intern.
J. Biol. Macromol. 38: 268-271; 12. Pots A., Gruppen
H., Hessing M., van Boekel M. A. J. S., Voragen A.
G. J. 1999. Isolation and Characterization of Patatin
Isoforms. – J. Agric. Food Chem. 47: 4587-4592; 13. Pouvreau L., Gruppen H., Piersma S.,
van den Broek L., van Koningsveld G., Voragen A.
2001. Relative abdundance and inhibitory distribution
of protease inhibitors in potato fruit juice cv. Elkana. –
J. Agric. Food Chem. 49: 2864-2874. 14. Ralet M.,
Gueguen J. 2000 A. Fractionation of potato proteins:
5
Solubility, Thermal coagulation and Emulsifying properties. – Food Sci. Tech. 33: 380-387; 15. Ralet M.,
Gueguen J. 2000 B. Foaming properties of potato raw
proteins and isolated fractions. – Food Sci. Tech. 34:
266-269; 16. Ruseler-van Embden J., van Lieshout
L., Smith S., van Kessel I., Laman D. 2004. Potato
tuber proteins efficiently inhibit human faecal proteolytic activity: implication for treatment of per-anal
dermatitis. – Eur. J. Clinical Invest. 34: 303-311;
17. Sharma N., Gruszewski H., Park S.W., Holm D.,
Vivanco J. 2004. Purification of an isoform of patatin
with antimicrobial activity against Phytophtora infestans. – Plant Phys. Bioch. 42: 647-655; 18. Tonon C.,
Daleo G., Oliva C. 2001. An acidic β-1,3 gucanase
from potato tubers appears to be patatin. – Plant Phys.
Bioch. 39: 847-854; 19. Tripathi G. R., Park J., Park
Y., Hwang I., Park Y., Hahm K.S., Cheong H. 2006.
Potide-G derived from potato (Solanum tuberosum L.)
is activeagainst potato virus YO (PVYO) infection. – J.
Agric. Food Chem. 54(22): 8437-8443; 20. Vikelouda
M., Kiosseoglou V. 2004. The use of carboxymethylcellulose to recover potato proteins and control their
functional properties. – Food Hydrocolloids. 2004. 18:
21-27; 21. Yen-Wenn L, Chuan-Hsiao H., Mei-Hsien
L., Feng-Lin H., Wen-Hi H. 2003. Patatin, the tuber
storage protein of potato (Solanum tuberosum L.), exhibits antioxidant activity in vitro. – J. Agric. Food
Chem. 51: 4389–4393; 22. Zwijnenberg H., Kemperman A., Borringter M., Lotz M., Dijkstehuis J.,
Poulsen P., Koops G. 2002. Native protein recovery
from potato fruit juice by ultrafiltration. – Desalination
144: 331-334