wykład 5 - Samodzielna Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej
Transkrypt
wykład 5 - Samodzielna Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej
METODY PRZECHOWYWANIA I UTRWALANIA BIOPRODUKTÓW METODY ZAMRAŻANIA CZ.1 Opracował: dr S. Wierzba Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Opolskiego METODY ZAMRAŻANIA Odporność drobnoustrojów na niskie temperatury jest znacznie większa niż na wysokie temperatury. Redukcja OLB następuje głównie w wyniku przemian fazowych wody: • pożywka przechłodzona (-30C) – przeżywalność ok.. 97%, • pożywka zamrożona (-30C) – przeżywalność ok.. 2% • bakterie G- bardziej wrażliwe na niskie temperatury niż G+ • większa przeżywalność dla drobnoustrojów w fazie stacjonarnej niż logarytmicznej • drobnoustroje patogenne i nie patogenne nie wykazują różnic pod względem przeżywalności • Clostridium boutilinum nie rozwija się poniżej -3,3 0C • Staphylococcus aureus, Sallmonella sp. – poniżej -6,70C • dolne granice zdolności rozmnażania: • bakterie -5¸-80C • drożdże -10¸-120C • pleśnie -12¸-150C METODY ZAMRAŻANIA Temperatury subminimalne – niższe od minimalnej temperatury wzrostu (rozmnażanie i większość procesów metabolicznych ulega zahamowaniu), mogą być przyczyną: śmierci, przejścia w stan anabiozy, zaburzeń metabolizmu: • subminimalne dodatnie: „zimny szok” - krzepnięcie lipidów wchodzących w skład biomembran – zaburzenia transportu: • szczególnie wrażliwe G- w log fazie wzrostu – szybkie obniżenie temperatury do 0-50C śmierć większości komórek • skład pożywki: - bogatszy skład – większa wrażliwość - ochronne działanie Mg2+ i Ca2+, oraz ATP, kwasów nukleinowych, białek, aminokwasów (przenikających na zewnątrz wskutek utraty szczelności błon biologicznych) • temperatura – większa oporność bakterii hodowanych w niższych temperaturach (200C) • subminimalne ujemne: spadek liczebności jest wynikiem: • mechanicznego uszkodzenia - kryształy lodu • szoku osmotycznego – wzrost stężenia soli wywołany dehydratacją komórek METODY ZAMRAŻANIA Pod względem wrażliwości na temperatury subminimalne ujemne drobnoustroje dzielimy na: • przeżywające mrożenie i rozmrażanie (przetrwalniki bakterii, zarodniki grzybów), • niewrażliwe na zamrażanie, ale wymierające w czasie przechowywania, • wrażliwe na zamrażanie i wymierające w czasie przechowywania, • nie przeżywające procesu mrożenia niezależnie od warunków (glony, pierwotniaki) METODY ZAMRAŻANIA Schemat postępowania przy zamrażaniu drobnoustrojów zaabsorbowanych na perełkach szklanych, propylenowych – wykorzystywany przy częstym pobieraniu materiału METODY ZAMRAŻANIA Zamrażanie kultur drożdży i grzybów nitkowatych – w szklanych lub propylenowych „słomkach”: a. b. wzrost kultur na podłożu stałym lub płynnym c. sporządzenie zawiesiny w obecności czynników ochronnych d. napełnienie sterylnych „słomek” propylenowych lub szklanych kapilar e. wzrost grzybni na podłożu agarowym z 5% glicerolem f. g. h. napełnienie kapilar grzybnią i. k. zamrożenie w ciekłym azocie METODY ZAMRAŻANIA Utrwalanie drobnoustrojów w warunkach beztlenowych – konieczność stosowania sterylnego, gazu obojętnego (N2, CO2) METODY ZAMRAŻANIA Ważnym czynnikiem w utrwalaniu drobnoustrojów jest kontrola tempa zamrażania (duża ilość małych kryształków lodu) – znanych jest wiele metod kontrolowanego, stopniowego zamrażania: • zamrażarki – 1-20C/minutę, do temperatury kilka stopni powyżej punktu przemiany faz (-20/-300C) • ciekły azot – bardzo szybkie mrożenie, aż do przekroczenia temperatury przemiany faz • ewentualne ponowne wolne ochładzanie 10C/minutę, aż do właściwej temperatury przechowywania W przypadku długotrwałego przechowywania (wartościowych tkanek) stosuje się zamrażanie w ciekłym azocie (-1960C), oraz witryfikację: • jednostopniowe, głębokie zamrażanie w zawiesinie krioochronnej o bardzo dużym ciśnieniu osmotycznym (8 mol/dm3), gwałtowne zamrażanie - 10000C/minutę: • dehydratacja • brak kryształów – powstaje jednolita tafla lodu METODY ZAMRAŻANIA Zamrażanie biopreparatów – powszechnie stosowana metoda utrwalania np. kultur starterowych bakterii fermentacji mlekowej, drożdży piekarskich, zarodków zwierzęcych. Zamrażanie biomas mikroorganizmów: • zamrażarki mechaniczne od -100C do -800C • ciekłe gazy (azot -1960C) Przeżywalność mikroorganizmów uzależniona jest od: • rodzaju mikroorganizmów np. Lactobacillus acidophilus • wolne tempo (stres przedzamrażalniczy) – mała przeżywalność • gwałtowne zamrożenie z 370C do -800C – mała przezywalność (ok.. 40%) • wolne, stopniowe obniżanie temperatury (adaptacja do niższych temperatur – wstępna inkubacja 6h – 220C, itd..) – wysoka przeżywalność (ok.. 75%) • oddziaływanie na skład lipidów ścian komórkowych, adaptacja zwiększa udział nienasyconych kwasów tłuszczowych, znacznie poprawia termotolerancyjność komórek • warunki hodowli • pH (Lactococcus sp.) • pH < 5,5 znaczne obniżenie krioodporności • pH ok.. 6,0 mniejsza podatność komórek na pogorszenie żywotności • podwyższone ciśnienie osmotyczne (dehydratacja, bisynteza trehalozy) METODY ZAMRAŻANIA • skład pożywki – udział krioprotektantów • zewnątrzkomórkowych: manitol, sorbitol, dekstran, metoloceluloza, żelatyna, • wnikających do wnętrza komórki: DMSO, alkohole polihydroksylowe • wiek kultury – najodporniejsze komórki w stacjonarnej fazie wzrostu Reakcja drożdży na stres temperaturowy – synteza protektorów – czynników ochronnych komórek: • „białka szoku cieplnego” – przeciwdziałają agregacji białek o zmienionej termicznie strukturze: • NSR1 – warunkujących syntezę mRNA w niskich temperaturach • TIP1, TIP1/2 – regulujących funkcje ściany komórkowej • CSF1 – umożliwiające aktywność fermentacji w niskich temperaturach • glikogen • trehaloza (disacharyd) – najważniejszy metabolit stresowy drożdży (szok temperaturowy, osmotyczny), oddziaływuje na ściany komórkowe drożdży METODY ZAMRAŻANIA Rozmrażanie bioproduktów – proces zmiany stanu zawartej w nich wody i przywrócenie produktom ich własności naturalnych (poprzez doprowadzenie ciepła z zewnątrz): • proces przebiega na zasadzie odwróconej krzywej zamrażania, • znacznie wolniej (ciepło jest doprowadzane z zewnątrz przez rozmrożoną powierzchnie o niższej przewodności cieplnej, wyższym cieple właściwym, większej gęstości) • 3-4 krotnie zmniejszony współczynnik dyfuzyjności cieplnej (mniejsza prędkość i czas wyrównania temperatur) • niebezpieczeństwo powierzchniowego przegrzania produktu – zbyt intensywne ogrzewanie METODY ZAMRAŻANIA Przemysłowe metody rozmrażania produktów: • ogrzewanie powierzchniowe – doprowadzenie ciepła do powierzchni produktu: • w powietrzu o temperaturze 0-40C (wolne) • para wodna – powietrze w temperaturze 25-400C (szybkie) • woda lub solanka w temperaturze 4-200C przez zanurzenie • w lodzie (bardzo wolne) • na gorącej metalowej powierzchni (bardzo szybkie) - kontaktowe • ogrzewanie wewnętrzne całej objętości produktu w polu elektrycznym wysokiej częstotliwości: dielektryczne, mikrofalowe, oporowe Ogrzewanie w powietrzu: • 1 etap – ogrzewanie do temperatury krioskopowej na powierzchni produktu • 2 etap – właściwe rozmrażanie przemiana fazowa lodu w całej objętości produktu Urządzenia tunelowe (obieg ciepłego, wilgotnego powietrza) METODY ZAMRAŻANIA Rozmrażanie przez ogrzewanie wewnętrzne – produkty o jednolitej strukturze i regularnych kształtach: • mikrofalowe • fale elektromagnetyczne o częstotliwości 915 i 2450 MHz, fale są absorbowane przez substancje dielektryczne powodując efekt grzejny • efekt grzejny zależy od właściwości dielektrycznych produktów (tłuszcz, tkanka mięśniowa) • zaletami są duża równomierność nagrzewania, znaczne skrócenie czasu rozmrażania, możliwość kontroli przebiegu procesu i jego automatyzacji • dielektryczne, oporowe – pole elektryczne jest wytwarzane przez elektrody otaczające produkt, częstotliwość fal 27-100 MHz • duża szybkość, lepsza jakość produktu w porównaniu do innych metod rozmrażania, możliwość rozmrażania wewnątrz opakowań Rozmrażanie drobnoustrojów: • łaźnia wodna 20-350C • powietrze 200C i łaźnia wodna • ważne usunięcie, rozcieńczenie krioprotektantów METODY ZAMRAŻANIA Czynniki chłodnicze Woda – środowisko chłodzące stosowane w metodach wstępnego wychładzania produktów: • zimna woda wodociągowa • woda lodowa temperatura ok.. 00C (zraszanie woda wodociągową lodu) Solanki – wodne roztwory chlorków sodu, wapnia, magnezu: • zakres stosowania jest ograniczony właściwościami fizycznymi (punkt eutektyczny) • NaCl MgCl2 CaCl2 • zamrażanie przez zanurzenie (ograniczenie – przenikanie soli do produktu) METODY ZAMRAŻANIA Amoniak (R717) -33,30C – duże instalacje przemysłowe • duża wydajność chłodnicza, ciepło parowania • mała rozpuszczalność w oleju (pompy olejowe) • toksyczność – dopuszczalne stężenie 0,01% Freony – halogenowe związki węglowodorów nasyconych, mają różny potencjał zagrożenia ekologicznego (stopniowo wycofywane z użycia), duża sprawność, rozpuszczają olej: • CFC – w pełni halogenowe związki węgla (chlorofluorokarbony), wszystkie atomy wodoru zastąpione chlorem i fluorem np.. R12 (CF2Cl2) wydajność ok.. 35% mniejsza niż amoniak, duże zagrożenie ekologiczne, wycofany z użycia, • HCFC – wodorochlorofluorokarbony, nie wszystkie atomy wodoru zastąpione chlorem i fluorem np.. R22 (CHF2Cl) wydajność zbliżona do amoniaku, powszechnie stosowany zamiennik R12, • HFC – wodorofluorokarbony, część atomów wodoru zastąpiona fluorem np. R134a (CH2FCF3), nieco mniejsza wydajność w porównaniu do R22, przewidziany jako główny zamiennik R12, • FC – węglowodory w pełni halogenowe, wszystkie atomy wodoru zastąpione fluorem Ciekły azot (LIN): -195,80C, z uwagi na bardzo niską sprawność procesu (ok.. 10-krotnie mniejsza niż w przypadku amoniaku) stosuje się na małą skalę do celów specjalnych, lub w kombinacji z tradycyjnymi metodami Ciekły dwutlenek węgla (LIC) pod ciśnieniem 2MPa, temperatura -20/-300C, • współczynnik wnikania ciepła ok.. 2-krotnie mniejszy niż w LN2 • dłuższy czas zamrażania • korzystny pod względem ekonomicznym