Zamrażanie i rozmrażanie komórek

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Zamrażanie i rozmrażanie komórek eukariotycznych
Wstęp.
Krioprezerwacja jest to proces przechowywania materiału biologicznego w
temperaturze między – 79 a – 196 OC, w której procesy metaboliczne komórek ustają
(procesy biochemiczne – 130oC, metaboliczne – 196oC), a uszkodzenia są
zminimalizowane.
W laboratoriach, w których prowadzi się badania w warunkach in vitro linie
komórkowe są zamrażane i przechowywane w tzw. bankach komórek.
Przechowywanie zamrożonych linii komórkowych ma liczne korzyści, a mianowicie:
•
•
•
•
•
Redukuje ryzyko kontaminacji mikroorganizmami
Redukuje ryzyko kontaminacji krzyżowej komórkami innych linii
Redukuje ryzyko dryfu genetycznego, szczególnie komórek mających
niestabilny kariotyp
Redukuje ryzyko różnicowania fenotypowego komórek
Redukuje koszty i czas ciągłego utrzymywania hodowli.
Stosowane procedury zamrażania i rozmrażania różnią się nieco w zależności od
rodzaju materiału biologicznego, ale wszystkie zachowują pewne ogólne zasady.
Najważniejszą z nich jest zasada: powolnego zamrażania i szybkiego
rozmrażania komórek. Szybkość zamrażania komórek powinna być na tyle wolna,
aby pozwolić na dehydratację komórki. Jednocześnie na tyle szybka, żeby
zabezpieczyć przez uszkodzeniami wynikającymi z dehydratacji. Zbyt duże
odwodnienie komórek może powodować wytrącanie się zagęszczonych składników
cytozolu, wypadanie jonów, wysalanie białek, zmianę pH oraz wiele innych,
niekorzystnych zjawisk. W czasie zamrażania komórek szczególnie szybko powinno
przejść się przez zakres temperatur od – 2 do – 5OC, ponieważ wówczas tworzą się
kryształy lodu mechanicznie uszkadzające komórki. Doświadczalnie wykazano, że w
czasie zamrażania komórek optymalnie temperatura powinna spadać z szybkością 1
– 3oC na minutę [Leibo, Mazur 1971; Harris, Griffiths 1977], co uzyskuje się m.in.
dzięki zastosowaniu wypełnionego alkoholem izopropylowym specjalnego pojemnika
do zamrażania materiału biologicznego (rys.1). Dodatkowo komórki, które mają
zostać zamrożone powinny znajdować się w fazie logarytmicznego wzrostu oraz nie
powinny być zainfekowane mikrobiologicznie.
Rys.1 NalgeneTM Mr Frosty
W celu zminimalizowania uszkodzeń komórek w trakcie ich powolnego
zamrażania niezbędne jest stosowanie substancji ochronnych, tzw. krioprotektantów.
Najczęściej stosowanymi krioprotektantami w hodowlach komórkowych in vitro są
DMSO (dimetylosulfotlenek – przenikający przez błonę komórkową) oraz glicerol
(przenikający przez błonę w temperaturze fizjologicznej). DMSO stosowany jest
najczęściej w stężeniu końcowym wynoszącym od 5 do 15 % (v/v), natomiast
glicerol – w stężeniu końcowym od 5 do 20% (v/v). Wybór krioprotektanta zależy od
rodzaju mrożonych komórek. Glicerol często jest związkiem z wyboru, gdyż jest
mniej toksyczny w porównaniu do DMSO. Jednak DMSO łatwiej przenika do wnętrza
komórek, przez co wykazuje większe właściwości ochronne.
Dodatkowo, w celu zwiększenia przeżywalności komórek w medium do
mrożenia zwiększa się stężenie surowicy standardowo do 50%. W przypadku bardzo
wrażliwych komórek (np. hybryd) stężenie surowicy może sięgnąć nawet 95%.
Rozmrażanie powinno przebiegać możliwie jak najszybciej. Po wyjęciu z
banku komórek ampułki umieszcza się w temperaturze 37oC przez z 3 – 5 minut.
Zapobiega to mechanicznemu uszkodzeniu komórek związanego z zjawiskiem
wtórnego rozrastania się kryształów lodu.
WYKONANIE ĆWICZENIA
MATERIAŁY I SPRZĘT
1. komórki nowotworowe pochodzenia ludzkiego
2. pożywka hodowlana
3. surowica FBS
4. DMSO
5. probówka wirówkowa 50 ml i 15 ml typu Falcon
6. pipety
7. probówki do mrożenia
8. naczynia hodowlane
9. zlewka
10. wirówka
11. pudełko do zamrażania Nalgene Mr Frosty
12. termostat
13. zamrażarka –80oC
14. bank komórek –196oC
Mrożenie komórek
1. Przy pomocy sterylnej pipety usunąć pożywkę z nad komórek będących w
fazie logarytmicznego wzrostu. Do komórek rosnących w postaci warstwy
(monolayer) dodać 3 ml trypsyny w celu odklejenia ich od podłoża i wstawić do
inkubatora. Gdy wszystkie komórki odkleją się od naczynia hodowlanego dodać 7
ml ciepłej pożywki i delikatnie rozpipetować, obmywając powierzchnię na której
rosły komórki.
2. Pobrać 0,5 ml zawiesiny komórek i przenieść do naczynka zawierającego 9,5 ml
izotonu. Określić gęstość komórek w mieszaninie przy pomocy licznika Coulter
Counter. Na jedną ampułkę do mrożenia komórek potrzeba 6 mln komórek/ml.
3. Zawiesinę komórek przenieść do 50 ml probówki wirówkowej typu Falcon i
zwirować (1000 obr. / min. w temp. 4oC przez 5 min.)
4. Po zwirowaniu zlać supernatant, a uzyskany pelet komórek delikatnie zwiesić w
medium do mrożenie składającego się z:
50% surowicy
40% pożywki hodowlanej
10% DMSO
5. 1 ml zawiesiny komórek przenieść do probówek do mrożenia, a następnie
probówki umieścić w pojemniku z lodem na 45 minut.
6. Przenieść probówki do wypełnionego alkoholem izopropylowym pojemnika (firmy
NalgeneTM TZW. Mr Frosty), zapewniającego dalsze schładzanie z szybkością
1oC/min. i umieścić w lodówce w temperaturze – 80oC na 24 godziny. Po tym
czasie probówki przenieść do banku komórek wypełnionego ciekłym azotem (196oC).
Rozmrażanie komórek
1. Po wyjęciu z banku (-196oC), ampułkę zawierającą zamrożone komórki
umieścić w łaźni wodnej ogrzanej do temperatury 37oC i delikatnie mieszać aż
do całkowitego rozpuszczenia. Należy unikać całkowitego zanurzenia ampułek
w wodzie w celu uniknięcia ewentualnej kontaminacji.
2. Rozmrożoną zawiesinę komórek przenieść jak najszybciej i najdelikatniej do
probówki wirówkowej, zawierającej 15 ml zimnej pożywki hodowlanej i
zwirować (1000 obr./min. w temp. 4oC przez 5 min.).
3. Po zwirowaniu zlać supernatant, a uzyskany pelet komórek delikatnie zwiesić
w 2 ml pożywki hodowlanej.
4. Tak uzyskaną mieszaninę komórek przenieść do naczynia hodowlanego,
zawierającego 8 ml pożywki hodowlanej i umieścić w inkubatorze CO 2 w
37oC.
5. W przypadku komórek adherentnych, po 24 godzinach sprawdzić pod
mikroskopem, czy komórki przykleiły się do powierzchni naczynia
hodowlanego.
Przygotowanie sprawozdania:
1. Opisać dokładnie przeprowadzoną procedurę zamrażania i rozmrażania
komórek.
2. Dlaczego do przechowywania kultur in vitro stosuje się zamrażanie w niskich
temperaturach?
3. Opisać sposoby krioprezerwacji materiału roślinnego.
Literatura:
1. Cryopreservation, In: Culture of animal cells, ed. R.I. Freshney, Wiley-Liss, 2005,
321-334.
2. Fundamental Techniques in Cell Culture… a Laboratory Handbook. Sigma, 2005.