Artykuł naukowy

MIKROKALORYMETRYCZNE I SPEKTROSKOPOWE
BADANIA KOMPLEKSÓW ANTYBIOTYKU
AMFOTERYCYNY B Z JONAMI Cu2+
G. CZERNEL, M. GAGOŚ, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie,
Wydział Inżynierii Produkcji, Zakład Biofizyki, ul. Akademicka 13, 20-950 Lublin.
Abstrakt
W pracy przedstawiono wyniki pomiarów mikrokalorymetrycznych (DSC) oraz
elektronowej spektroskopii absorbcyjnej (UV-Vis) amfoterycyny B i jej kompleksów
z jonami Cu2+. Pomiary wykonano w roztworach wodnych przy dwóch wartościach pH,
2.0 oraz 10.6. Przy pH 2 w pomiarach DSC odnotowano endotermiczny efekt cieplny,
który przypisano dysocjacji struktur zagregowanych AmB. Dla kompleksu AmB-Cu2+ w
pH 10.6 pojawił się egzotermiczny efekt cieplny o niewielkim natężeniu. Pomiary
spektroskopowe (UV-Vis) kompleksu AmB-Cu2+ w różnych temperaturach wskazują na
stopniowy rozpad kompleksu wraz ze wzrostem temperatury.
1. Wprowadzenie
Amfoterycyna B (AmB) jest makrolidowym antybiotykiem polienowym (rys.1)
szeroko stosowanym w leczeniu systemowych infekcji grzybiczych. Pomimo stosowania
jej od ponad 50 lat w praktyce klinicznej oraz uznania AmB jako złoty standard w
leczeniu ciężkich grzybic systemowych, pozostaje jednym z najbardziej toksycznych
farmaceutyków. Efekty agregacyjne odgrywają ważną rolę w selektywnej toksyczności
tego antybiotyku.[1-2].
CH3
O
O
OH
H3C
NH3+
OH
COO-
CH3
HO
O
H3C
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
Rys.1. Struktura AmB
2. Część eksperymentalna
Do preparatyki kompleksów użyto następujących odczynników:
Amfoterycyna B (VETRANAL®, analytical standard) – zakupiono w Sigma Aldrich
Miedzi (II) chlorek ( odważka analityczna 10 g/l) – zakupiono w Sigma Aldrich
KOH (odważka analityczna 0.1 M ) – zakupiono w POCh w Gliwicach
HCl (odważka analityczna 0.1 M ) – zakupiono w POCh w Gliwicach
Azot 5.0 cz.d.a Linde Gas, Polska.
Amfoterycynę B rozpuszczono w 100 ml podwójnie destylowanej wody o pH 12.7
zalkalizowanej za pomocą KOH. Roztwór podzielono na 2 równe części. W pierwszej
części roztworu pH obniżono za pomocą 1M HCl do 10.6 w drugiej do 2.0. W celu
zapobiegnięcia procesom destrukcyjnym cząsteczki próbki do badań przygotowywano w
świetle czerwonym a następnie do czasu wykonywania pomiarów
próbki
przechowywano w ciemności w atmosferze N2.
Rejestrację elektronowych widm absorpcji przeprowadzono przy użyciu
dwuwiązkowego spektrofotometru UV-Vis Cary 300 Bio firmy Varian, wyposażonego
w termostatowany blok Peltiera. Pomiary mikrokalorymetryczne wykonano przy użyciu
Różnicowego Mikrokalorymetru Skaningowego MC DSC, TA Instruments w zakresie
temperatur 25oC-95oC, z szybkością skanowania 1oC/min.
3. Wyniki
Wyniki badań spektroskopowych AmB oraz AmB po dodaniu jonów Cu2+ w pH 2.0
i 10.6 zaprezentowano na Rys. 2, 3 oraz 4.
2
25oC
90oC
345
A
333
Absorbancja
1.6
408
AmB pH 2.0
1.2
0.8
0.4
0
A
0.4
90oC-25oC
B
0
-0.4
-0.8
320
360
400
Długość fali [nm]
440
480
Rys.2. Elektronowe widma absorpcyjne AmB w roztworach wodnych przy pH 2.0 cAmB = 1.5x10-5 M
w temperaturze 25oC (linia ciągła) i 90oC (linia przerywana)-panel A. Widmo różnicowe AmB (90 oC-25oC)panel B.
Amfoterycyna B w pH 2.0 występuje głównie w formie dimerów [3-4].
Odzwierciedleniem tego w widmach absorpcji elektronowej (UV-Vis) jest
występowanie pasm w obszarze krótkofalowym (345 nm oraz 333 nm) widma. Widma
rejestrowano w zakresie temperatur 25oC do 95oC co 5oC i zaobserwowano zmiany
mogące świadczyć o monomeryzacji molekuł AmB. Analiza widm różnicowych AmB w
różnych temperaturach przy pH 2.0 potwierdza proces monomeryzacji molekuł
związany ze wzrostem temperatury [5]. Dla AmB w obecności jonów Cu2+ przy pH 2.0
zarejestrowano identyczne zmiany w widmach UV-Vis jak dla czystej AmB. Przy pH
10.6 AmB występuje głownie w formie monomerycznej [3] z charakterystycznym
najbardziej intensywnym pasmem przy 408 nm. Podwyższenie temperatury próbki, od
25oC do 95oC co 5oC nie powodowało tak dużych zmian w widmie UV-Vis jak
w przypadku AmB przy pH 2.
A
Absorbancja
25oC
90oC
406
408
AmB pH 10.6
1.2
347
0.8
0.4
0
A
0.2
90oC-25oC
B
0
-0.2
320
360
400
Długość fali [nm]
440
480
Rys.3. Elektronowe widma absorpcyjne AmB w roztworach wodnych przy pH 10.6 c AmB = 1.0x10-5 M
w temperaturze 25oC (linia ciągła) i 90oC (linia przerywana)-panel A. Widmo różnicowe AmB (90 oC-25oC)panel B.
Widma różnicowe AmB w różnych temperaturach przy pH 10.6 wskazują na efekt
termochromowy w obszarze długofalowym widma oraz na procesy deagregacji molekuł
w obszarze krótkofalowym. Na rys. 4 zaprezentowano widmo kompleksu AmB z jonami
Cu2+ w temperaturze 25oC (synteza kompleksu) i po podwyższeniu temperatury do 50oC
i 75oC. Jak można zauważyć wzrost temperatury próbki powoduje stopniowy rozpad
kompleksu z pojawieniem się w widmach różnicowych pasm charakterystycznych dla
form monomerycznych.
25oC
50oC
75oC
A
350
Absorbancja
0.8
408
AmB + Cu2+
pH 10.6
0.4
0
75oC-25oC
A
B
0
-0.3
320
360
400
Długość fali [nm]
440
Rys.4. Elektronowe widma absorpcyjne kompleksu AmB-Cu2+ w roztworze wodnym przy pH 10.6 w różnych
temperaturach.-panel A. Widmo różnicowe kompleksu (75oC-25oC)-panel B.
Na rys. 5 przedstawiono krzywe DSC czystej AmB oraz AmB w obecności jonów Cu 2+
przy pH 2.0 w roztworach wodnych. W temperaturze 77oC zarejestrowano
endotermiczny efekt cieplny związany z procesem deagregacji molekuł AmB (zrywanie
wiązań wodorowych dimerów AmB) a następnie egzotermiczny efekt cieplny (90oC).
12000
AmB
AmB + Cu2+
pH 2
W]
8000
4000
0
70
75
80
85
90
Temperatura [oC]
95
100
Rys.5. Krzywe DSC AmB (linia ciągła) i AmB z jonami Cu 2+ (linia przerywana) w wodzie przy pH 2.
Stężenie, AmB cAmB = 1x10-3 M, jonów Cu2+ cCu = 6x10-4 M.
Dla czystej AmB przy pH 10.6 zarejestrowano egzotermiczny efekt cieplny
o niewielkim natężeniu. Dla kompleksu AmB z jonami Cu2+ pomimo jego rozpadu wraz
z temperaturą (pomiary spektroskopowe) nie otrzymano w pomiarach DSC (rys.6)
krzywej odpowiadającej przemianie endotermicznej. Wynik ten związany jest
prawdopodobnie ze stopniowym rozpadem kompleksu. Ponadto na krzywej DSC
kompleksu AmB-Cu2+ pojawił się efekt egzotermiczny w temperaturze 83oC o
niewielkim natężeniu związany z reakcją jonów Cu2+ z AmB.
2300
AmB + Cu2+
pH 10.6
2280
A
2260
2240
W]
2220
2200
AmB
1160
B
1120
1080
1040
70
75
80
85
Temperatura [oC]
90
Rys.6. Krzywa DSC kompleksu AmB-Cu2+ w wodzie przy pH 10.6. Stężenie, AmB cAmB = 1x10-3 M, jonów
Cu2+ cCu = 6x10-4 M-panel A, oraz AmB przy pH 10.6. stężenie, AmB c AmB = 1x10-3 M-panel B.
4. Wnioski.
AmB w roztworach wodnych przy pH 2.0 tworzy formy zagregowane (dimery),
które pod wpływem temperatury ulegają dysocjacji z endotermicznym efektem cieplnym
w temperaturze 77oC. Kompleksy AmB-Cu2+ otrzymane w roztworach wodnych przy
pH 10.6 ulegają stopniowemu rozkładowi termicznemu bez wyraźnego efektu
endotermicznego w określonej temperaturze.
Praca została wykonana w ramach projektu badawczego nr N N401 015035
finansowanego przez MNiSW na lata 2008-2011
Literatura:
1.
Torrado, J.J., et al., Amphotericin B formulations and drug targeting. J Pharm Sci, 2008. 97(7): p.
2405-25.
2.
Espada, R., et al., Effect of aggregation state on the toxicity of different amphotericin B
preparations. Int J Pharm, 2008. 361(1-2): p. 64-9.
3.
Gagoś, M., Herec, M., Arczewska, M. Czernel, G. Dalla Serra, M. Gruszecki, W. I., Anomalously
high aggregation level of the polyene antibiotic amphotericin B in acidic medium: implications for
the biological action. Biophys Chem, 2008. 136(1): p. 44-9.
4.
Gruszecki, W.I., M. Gagos, and M. Herec, Dimers of polyene antibiotic amphotericin B detected by
means of fluorescence spectroscopy: molecular organization in solution and in lipid membranes. J
Photochem Photobiol B, 2003. 69(1): p. 49-57.
5.
Gaboriau, F., et al., Heat-induced superaggregation of amphotericin B reduces its in vitro toxicity:
a new way to improve its therapeutic index. Antimicrob Agents Chemother, 1997. 41(11): p. 234551.