autoreferat Aneta Piesiewicz - Wydział Biologii UW

Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Anety Piesiewicz Postembrionalny rozwój rytmu dobowego aktywności biosyntetycznej szyszynki ptaków na przykładzie kury domowej ( Gallus domesticus L. ) Praca doktorska wykonana w Zakładzie Fizjologii Zwierząt, Instytut Zoologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Promotor: Prof. dr hab. Krystyna Skwarło-­‐Sońta Zakład Fizjologii Zwierząt, Instytut Zoologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Recenzenci: Prof. dr hab. Jadwiga Bryła Zakład Regulacji Metabolizmu, Instytut Biochemii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Prof. dr hab. Bogdan Lewczuk Katedra Histologii i Embriologii, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Warmińsko-­‐Mazurski w Olsztynie Szyszynka ptaków jest miejscem lokalizacji zarówno endogennego oscylatora molekularnego, jak i biochemicznego mechanizmu zapewniającego możliwość rytmicznej biosyntezy melatoniny (MEL). Krążąca w krwi MEL, jako uniwersalny nośnik informacji o wzajemnych relacjach długości dnia i nocy, pełni funkcje bio-­‐zegara i bio-­‐kalendarza, synchronizując z warunkami otoczenia endogenne rytmy okołodobowe i okołoroczne organizmu. W badaniach prowadzonych dotychczas w Zakładzie Fizjologii Zwierząt (ZFZ) Wydziału Biologii UW na 3-­‐tygodniowych kurczętach, hodowanych od wyklucia w stałych warunkach fotoperiodu (L:D 12:12), wykazano sezonowość pory występowania nocnego szczytu aktywności N-­‐acetylotransferazy serotoninowej (AANAT), enzymu generującego rytm dobowy biosyntezy MEL. Następnie stwierdzono, że nocny profil aktywności tego enzymu podlega w ciągu początkowych 16 dni po wykluciu modyfikacjom, zależnym od sezonu wyklucia. W stanach chorobowych często dochodzi do zaburzenia rytmów endogennych, co wskazuje na przepływ informacji pomiędzy aktywowanym układem odpornościowym a szyszynką. Potwierdzają to doświadczenia prowadzone w ZFZ, które ujawniły obniżoną aktywność enzymu AANAT w szyszynkach kury domowej z rozwijającą się eksperymentalną reakcją zapalną jamy otrzewnej (RZO). Na podstawie przytoczonych informacji zostały sformułowane hipotezy, zakładające sezonowość postembrionalnego rozwoju rytmu dobowego aktywności biosyntetycznej szyszynki kury domowej oraz obniżoną wydajność etapu/etapów szyszynkowej biosyntezy MEL podczas rozwijającej się RZO. Doświadczenia przeprowadzono na 2-­‐, 9-­‐ i 16-­‐dniowych samcach kury domowej, wyklutych w ściśle określonych porach roku (najdłuższy i najkrótszy dzień) i przetrzymywanych od wyklucia w warunkach L:D 12:12. W szyszynkach tych ptaków badano rytm dobowy transkrypcji genów kodujących enzymy szlaku biosyntezy MEL: hydroksylazy tryptofanowa (TPH), dekarboksylazy aminokwasów aromatycznych (AADC), AANAT oraz transferazy hydroksyindolo-­‐O-­‐metylowej (HIOMT), aktywności tych enzymów i dostępności substratów, a także zawartości MEL. Występowanie rytmu dobowego i jego charakterystyka (krzywa najlepiej dopasowana, akrofaza i amplituda rytmu) oceniane były z zastosowaniem cosinorowej analizy statystycznej, wymagającej wykonywania oznaczeń w ciągu doby w stałych przedziałach czasowych (materiał pobierano w ciągu doby co 2 lub 4 godziny). Dodatkowo, u 16-­‐dniowych kurcząt wywoływano RZO, podając dootrzewnowy zastrzyk tioglikolatu (TG) na początku lub pod koniec dnia, uwzględniając rytmiczne zmiany poszczególnych składowych aktywności szyszynki w ciągu doby. Rozwój RZO oceniano na podstawie liczby leukocytów napływających do jamy otrzewnej. Po upływie 4 godzin od zastrzyku TG w szyszynkach ptaków z grupy doświadczalnej (TG) i kontrolnej (INT) oznaczano poziom mRNA genów kodujących enzymy szlaku biosyntezy MEL, aktywności tych enzymów, a także zawartości substratów i produktu ostatecznego, czyli MEL, której stężenie mierzono zarówno w szyszynce, jak i w krwi kurcząt. Uzyskano następujące wyniki: § Amplituda rytmu dobowego liczby kopii genów Tph i Aadc, w przeciwieństwie do genu kodującego enzym HIOMT, zmienia się w okresie postembrionalnym, wcześniej osiągając stabilizację w szyszynkach kurcząt wyklutych w lecie, niż zimie. § Nocny poziom mRNA genu Aanat jest wyższy w szyszynkach kurcząt wyklutych w sezonie letnim niż w zimie we wszystkich grupach wiekowych, a różnica ta maleje wraz z wiekiem. Zmiany te pokrywają się z wyższą aktywnością enzymatyczną AANAT oraz wyższym stężeniem MEL w szyszynkach kurcząt wyklutych latem. § Bez względu na sezon i wiek, zawartość L-­‐tryptofanu w szyszynkach kurcząt jest bardzo wysoka i nie wydaje się być czynnikiem ograniczającym tempo biosyntezy MEL. § Zawartość serotoniny w szyszynkach kurcząt wszystkich grup wiekowych wyklutych w lecie, jest wysoka i wykazuje rytm dobowy porównywalny z rytmem poziomu mRNA i aktywności enzymu AANAT. Natomiast u ptaków wyklutych w zimie dostępność serotoniny, bez względu na wiek, nie zmienia się rytmicznie w ciągu doby. § Wywołanie RZO na początku dnia nie zmienia znacząco wydajności syntezy MEL w szyszynce kurcząt. § Wywołanie RZO pod koniec dnia koniec dnia obniża biosyntezę N-­‐acetyloserotoniny i MEL w wyniku hamowania transkrypcji genu Aanat, kodującego enzym katalizujący reakcję przekształcenia serotoniny w N-­‐acetyloserotoninę. Zastosowany układ doświadczalny, odwołujący się do ścisłego kontrolowania sezonu wyklucia i warunków przetrzymywania zwierząt, pozwolił na ujawnienie się różnic sezonowych postnatalnego rozwoju rytmicznej aktywności szyszynki samców kury domowej, a głównym czynnikiem zmieniającym się sezonowo okazała się dostępność serotoniny. Na podstawie uzyskanych wyników można również wskazać konkretny etap na szyszynkowym szlaku biosyntezy MEL, odpowiedzialny za obniżenie nocnej aktywności biosyntetycznej tego gruczołu podczas toczącej się na obwodzie reakcji zapalnej. Wykazano, że jest nim transkrypcja genu, kodującego AANAT, enzym odpowiedzialny za kształtowanie nocnego szczytu biosyntezy MEL.