Ćwiczenie 4 - w³aœciwoœci cukrów

Ćwiczenie 4
ANALIZA JAKOŚCIOWA CUKRÓW
Część doświadczalna obejmuje:
- wykonanie wybranych reakcji identyfikujących cukry
- analizę jakościową niektórych cukrów na podstawie sposobu krystalizacji ich osazonów
WPROWADZENIE
Cukrowce (cukry), nazywane teŜ węglowodanami lub sacharydami, są, poza białkami, kwasami nukleinowymi i lipidami, jedną z najwaŜniejszych klas cząsteczek biologicznych. W przyrodzie
występują bardzo obficie – ponad 50% węgla organicznego na Ziemi jest przechowywana w postaci skrobi i celulozy. Są to polisacharydy roślinne zbudowane z glukozy róŜniące się jedynie
sposobem jej połączenia. Zawartość węglowodanów w tkankach roślinnych jest duŜo wyŜsza
(80% suchej masy) niŜ w tkankach zwierzęcych (poniŜej 2% suchej masy), takŜe formy ich występowania są bardziej róŜnorodne u roślin niŜ u zwierząt.
Węglowodany pełnią wielorakie funkcje w organizmach Ŝywych. Podstawowe znaczenie biologiczne tych składników polega na ich wykorzystaniu jako głównego źródła energii uwalnianej
w procesach oksydacyjnych (glikoliza). Cukrowce mogą być teŜ przetwarzane w inne metabolity wykorzystywane w róŜnych szlakach przemian, stanowią materiał zapasowy (skrobia u roślin,
glikogen u zwierząt), a takŜe słuŜą jako materiał budulcowy pełniący funkcje strukturalne i nadający komórkom, narządom i całym organizmom odpowiednią stabilność mechaniczną. Na przykład, celuloza stanowi około 40-50% masy ścian komórkowych roślin, mureina występuje w ścianach komórkowych bakterii, a chityna wchodzi w skład ścian komórkowych grzybów oraz pancerzy owadów i skorupiaków. Ponadto, połączenia węglowodanów z białkami i lipidami pełnią kluczową rolę w procesach rozpoznania komórkowego pośrednicząc w oddziaływaniach między
komórkami oraz w interakcjach między komórkami i składnikami środowiska komórkowego.
Budowa i podział cukrowców
Cukry są grupą związków karbonylowych (aldehydów lub ketonów) zawierających kilka grup
hydroksylowych. Dzielimy je na cukry proste (jednocukry), nazywane monosacharydami i cukry
złoŜone (wielocukry) nazywane polisacharydami. Monosacharydy są to związki drobnocząsteczkowe, niedające się rozłoŜyć na inne składniki cukrowe, natomiast polisacharydy są związkami
wielkocząsteczkowymi, zbudowanymi z kilkuset do kilkudziesięciu tysięcy cząsteczek cukrów
1
prostych. Wśród cukrów złoŜonych wyróŜnia się oligosacharydy, które zbudowane są z kilku (2 –
6) cząsteczek cukrów prostych.
Monosacharydy
Większości monosacharydów odpowiada wzór sumaryczny CnH2nOn. W zaleŜności od liczby
atomów węgla w cząsteczce dzieli się je na triozy, tetrozy, pentozy i heksozy. Monosacharydy
zawierające więcej niŜ 6 atomów węgla, np. heptozy czy oktozy, występują w przyrodzie bardzo
rzadko. Ze względu na obecność grupy aldehydowej bądź ketonowej, cukry proste mogą być aldozami lub ketozami. Końcówka -oza jest charakterystyczna dla cukrów.
Najprostszymi monosacharydami są cukry zawierające trzy atomy węgla w cząsteczce, czyli
triozy: aldehyd glicerynowy (aldoza) i dihydroksyaceton (ketoza). Aldozy zawierające co najmniej
trzy atomy węgla, a ketozy zbudowane co najmniej z czterech atomów węgla, posiadają w swojej
cząsteczce centra chiralne wynikające z obecności węgla asymetrycznego, tj. atomu węgla, którego 4 wartościowości są wysycone róŜnymi podstawnikami. Takie związki wykazują czynność
optyczną, tzn. zdolność do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego, którą moŜna mierzyć
w polarymetrze. Obecność węgla asymetrycznego powoduje asymetrię danej cząsteczki oraz istnienie dwóch wzorów przestrzennych tej cząsteczki, które są wzajemnymi odbiciami lustrzanymi.
Są one nazywane izomerami optycznymi lub enancjomerami. Tak więc aldehyd D- i Lglicerynowy (Ryc. 1) to enancjomery lub para enancjomerów.
Aldehyd
L-glicerynowy
Aldehyd
D-glicerynowy
Dihydroksyaceton
Ryc. 1. Wzory rzutowe Fischera trioz
W przypadku monosacharydów zawierających więcej niŜ 1 asymetryczny atom węgla, symbole D
i L odnoszą się do konfiguracji asymetrycznego atomu węgla najbardziej oddalonego od grupy
aldehydowej lub ketonowej, jak pokazano to na przykładzie D- i L-fruktozy (Ryc. 2). Jeśli konfi-
2
guracja jest taka jak w aldehydzie D-glicerynowym, cukier naleŜy do szeregu konfiguracyjnego D,
jeśli natomiast jest taka jak w aldehydzie L-glicerynowym – do szeregu L.
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
D-fruktoza
L-fruktoza
Ryc. 2. Wzory rzutowe Fischera enancjomerów (odbicia lustrzane) fruktozy
Ilość moŜliwych, dla określonego monosacharydu, enancjomerów zaleŜy od liczby atomów węgla
asymetrycznego. Ogólnie, dla cząsteczki zawierającej n węgli asymetrycznych moŜna utworzyć 2n
izomerów optycznych, z których połowę będą stanowić izomery D- , drugą połowę izomery L-.
Ze względu na to, Ŝe struktury stereochemiczne z tetraedrycznym centrum węglowym są kłopotliwe do rysowania, powszechnie przedstawia się je stosując wzory rzutowe Fischera (projekcja Fischera), które dają jasny i prosty stereochemiczny obraz przestrzenny przy kaŜdym centrum
asymetrycznym. We wzorach Fischera wiązania łączące atomy podstawników z centralnym atomem węgla są przedstawione jako linie poziome (umownie – skierowane na zewnątrz płaszczyzny
kartki) i pionowe (umownie – skierowane w głąb kartki) (Ryc. 3).
wzór rzutowy
Fischera
wzór
stereochemiczny
Ryc. 3. Sposoby zapisu struktury z tetraedrycznym centrum węglowym
ZaleŜności stereochemiczne dla aldoz i ketoz zawierających 3 – 6 atomów węgla w cząsteczce i
naleŜących do szeregu D przedstawione są odpowiednio, na Ryc. 4 i Ryc. 5.
3
Ryc. 4. Szereg konfiguracyjny D aldoz zawierających 3 – 6 atomów węgla (wg Berg i wsp. 2005)
Ryc. 5. Szereg konfiguracyjny D ketoz zawierających 4 – 6 atomów węgla (wg Berg i wsp. 2005)
W roztworach wodnych otwarte formy łańcuchowe cukrów ulegają w stopniu niemal całkowitym cyklizacji i przyjmują strukturę pierścieniową, w której grupa karbonylowa jest zablokowana
4
wskutek utworzenia wewnątrzcząsteczkowego wiązania hemiacetalowego (półacetalowego) w
aldozach lub hemiketalowego (półketalowego) w ketozach. W przypadku aldoheksozy, np. glukozy, grupa hydroksylowa przy C-5 atakuje atom tlenu przy C-1 grupy aldehydowej tworząc wewnątrzcząsteczkowy 6-członowy pierścień hemiacetalu. W rezultacie mogą powstać dwie formy
anomeryczne, oznaczane jako α i β. Ze względu na podobieństwo pierścienia do piranu powstający cukier nazywany jest piranozą (Ryc. 6). W przypadku ketozy, np. fruktozy, w podobnej reakcji grupa hydroksylowa przy C-6 łączy się z grupą ketonową przy C-2 i powstaje wewnątrzcząsteczkowy 5-członowy pierścień hemiketalu podobny do furanu. Taki cukier nazywany jest furanozą i podobnie jak przy powstawaniu hemiacetalu mogą powstać jego dwie formy anomeryczne – α i β (Ryc. 7).
Ryc. 6. Powstawanie piranozy (wg Garrett i Grischam 1999)
Do przedstawienia cukrów w formie pierścieniowej uŜywa się najczęściej wzoru Hawortha (projekcja Hawortha), w którym widok pierścienia z góry jest przedstawiany perspektywicznie i na ogół nie pokazuje atomów węgla w pierścieniu. W zaleŜności od konfiguracji podstawniki
przy asymetrycznych atomach węgla znajdują się pod lub nad płaszczyzną pierścienia (Ryc. 6 i
7). Grupy OH, które w projekcji Fischera leŜą po prawej stronie łańcucha, w projekcji Hawortha
znajdują się pod płaszczyzną pierścienia, natomiast te, które występują po lewej stronie, znajdują
się nad nią.
5
Ryc. 7. Powstawanie furanozy (wg Garrett i Grischam 1999)
Podczas cyklizacji i tworzenia pierścienia powstaje dodatkowe centrum asymetrii, odpowiednio
przy C-1 w hemiacetalu lub C-2 w hemiketalu (Ryc. 6 i 7). W związku z tym mogą powstawać
dwie struktury pierścieniowe nazywane anomerami i oznaczane jako α (grupa OH przy C-1 lub
C-2 występuje pod płaszczyzną pierścienia) i β (grupa OH przy C-1 lub C-2 znajduje się nad
płaszczyzną pierścienia), np. glukoza występuje w postaci dwóch anomerycznych struktur pierścieniowych nazywanych α-D-glukopiranozą oraz β-D-glukopiranozą (Ryc. 6).
Wzory Hawortha nie uwzględniają tego, Ŝe pierścienie piranozowe i furanozowe nie są płaskie ze względu na tetraedryczne ułoŜenie podstawników przy asymetrycznych atomach węgla.
Pierścienie piranozowe przyjmują 2 rodzaje konformacji: krzesełkową i łódkową (Ryc. 8), natomiast konformacja pierścieni furanozowych nazywana jest formą kopertową.
6
Ryc. 8. (a) Krzesełkowa i łódkowa konformacja pierścienia piranozowego
(b) Dwie moŜliwe konformacje krzesełkowe β-D-glukozy (wg Garrett i Grischam 1999)
Cukry złoŜone
Obecność wielu grup hydroksylowych w monosacharydach umoŜliwia łączenie się dwóch lub
więcej cząsteczek za pomocą wiązań O-glikozydowych i tworzenie połączeń typu acetali lub ketali (Ryc. 9). Produkty przyłączania alkoholi do anomerycznego atomu węgla monosacharydów
nazywa się ogólnie glikozydami.
Ryc. 9. Ogólne reakcje powstawanie acetali i ketali (wg Garrett i Grischam 1999)
Disacharydy
Disacharydy (dwucukry) powstają w wyniku utworzenia wiązania glikozydowego pomiędzy
anomeryczną grupą hydroksylową jednego monosacharydu z jedną z grup hydroksylowych innego
7
monosacharydu. Przykłady powszechnie występujących disacharydów i ich nazewnictwo przedstawione są na Ryc. 10.
Maltoza
O-α-D-glukopiranozylo(1→4)-α-D-glukopiranoza
Laktoza
O-β-D-galaktopiranozylo(1→4)-β-D-glukopiranoza
Sacharoza
O-α-D-glukopiranozylo(1→2)-β-D-fruktofuranozyd
Trehaloza
O-α-D-glukopiranozylo(1→1)-α-D-glukopiranozyd
Celobioza
O-β-D-glukopiranozylo(1→4)-β-D-glukopiranoza
Ryc. 10. Przykłady i nazewnictwo disacharydów
8
Polisacharydy
Polisacharydy są polimerami monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi. Mogą być zbudowane z jednego rodzaju monosacharydów (homoglikany) lub z róŜnych cukrów prostych (heteroglikany) (Tabela I). Polisacharydy występują w postaci liniowych łańcuchów lub są
rozgałęzione. Do najwaŜniejszych polisacharydów naleŜą polimery D-glukopiranozy (glukozy)
nazywane teŜ glukanami (nie mylić z glikanami, które jest pojęciem szerszym). Są to 2 polisacharydy roślinne – skrobia i celuloza oraz występujący w komórkach zwierząt glikogen. Skrobia jest
szeroko rozpowszechnionym polisacharydem zapasowym stanowiącym magazyn glukozy wykorzystywanej jako podstawowe paliwo energetyczne. Jest mieszaniną dwóch glukanów: amylozy i
amylopektyny, które występują w róŜnych stosunkach ilościowych w zaleŜności od pochodzenia
skrobi. Obydwie postacie zbudowane są z α-D-glukopiranozy. Amyloza, nazywana „rozpuszczalną skrobią”, składa się z prostych nierozgałęzionych łańcuchów połączonych wiązaniami α1→4
(tak jak w maltozie), zawierających 200-300 reszt glukozowych (Ryc. 11A). Łańcuchy te są zwinięte w helisę, w której na 1 skręt przypada 6-8 reszt glukozy (Ryc. 11B).
Tabela 1. WaŜne polisacharydy (wg Koolman i Röhm 2005)
9
A
B
C
Cząsteczka jodu
Ryc. 11. Budowa skrobi: (A) Fragmenty wzorów amylozy i amylopektyny; (B) Struktury amylozy i amylopektyny; (C) Kompleks skrobi z jodem – cząsteczki jodu układają się równolegle do długiej osi helisy
amylozy (pokazane są 3 obroty helisy) (wg Garrett i Grischam 1999; Koolman i Röhm 2005)
Niebieskie zabarwienie roztworu skrobi w reakcji z jodem jest spowodowane występowaniem takich helis, poniewaŜ atomy jodu gromadzą się we wnętrzu helisy (Ryc. 11C) i w takim prawie
bezwodnym otoczeniu barwią się na kolor ciemnoniebieski. Polisacharydy o strukturze rozgałęzionej barwią się jedynie na brązowo lub czerwonobrązowo. Amylopektyna, w przeciwieństwie
10
do amylozy praktycznie nierozpuszczalna, jest polisacharydem rozgałęzionym. Przeciętnie, co 2430 reszt glukozowych, występuje rozgałęzienie utworzone przez wiązanie α1→6 (tak jak w izomaltozie), w wyniku czego powstaje rozległa struktura krzaczasta (Ryc. 12). Cząsteczki amylopektyny mogą mieć setki tysięcy reszt glukozowych.
Ryc. 12. Porównanie stopnia rozgałęzienia w amylopektynie i glikogenie
(wg Campbell 1999)
Celuloza (błonnik), najbardziej rozpowszechniony węglowodan roślinny, jest liniowym
homoglikanem zbudowanym z 1500 – 2500 reszt β-D-glukopiranozy połączonych wiązaniami
β1→4, tak jak w celobiozie, którą moŜna otrzymać przez częściową hydrolizę tego polisacharydu.
Długie cząsteczki celulozy nadają tkankom roślinnym wytrzymałość mechaniczną i elastyczność.
Glikogen, cukier zapasowy zwierząt, przypomina strukturą amylopektynę, lecz jego cząsteczka jest bardziej rozgałęziona, poniewaŜ rozgałęzienia występują przeciętnie co dziesięć reszt
glukozy (Ryc. 12).
WaŜne reakcje
Monosacharydy, tworząc róŜne formy, uczestniczą w wielu procesach metabolicznych. Na
ryc. 13, na przykładzie glukozy, przedstawione są niektóre waŜne reakcje monosacharydów.
11
Ryc. 13. Przykłady reakcji monosacharydów (wg Koolman i Röhm 2005)
Reakcje barwne i redukcyjne cukrów
Metody identyfikacji cukrów oparte są na ich właściwościach:
•
Heksozy i pentozy pod wpływem stęŜonych kwasów ulegają odwodnieniu do cyklicznych
aldehydów – hydroksymetylofurfuralu lub furfuralu, które następnie ulegają kondensacji z
fenolami lub aminami dając barwne pochodne:
12
•
W środowisku zasadowym łańcuchowe formy cukrów z wolną grupą aldehydową wykazują
właściwości redukcyjne, przy czym same utleniają się do kwasów:
glukoza
kwas glukonowy
•
Produktami utlenienia cukrów są: kwasy onowe, kwasy uronowe i kwasy cukrowe:
•
Cukry z wolną grupą karbonylową reagują równieŜ z fenylohydrazyną tworząc osazony
wykazujące charakterystyczną dla danego cukru postać krystaliczną oraz temperaturę topnienia
•
Polisacharydy wykazują zdolność adsorbowania cząsteczek jodu (J2), w wyniku czego powstają barwne kompleksy o róŜnym zabarwieniu (granatowe, brunatne, czerwonofioletowe)
(Ryc. 11C).
WYKONANIE
Odczynniki:
- 2% roztwory wzorcowe cukrów
- odczynnik Molischa – 1% etanolowy roztwór α-naftolu
- stęŜony H2SO4
- stęŜony HCl
- HCl : H2O (1 : 1)
- odczynnik Seliwanowa – 2% etanolowy roztwór rezorcyny
13
- odczynnik Tollensa – 2% etanolowy roztwór floroglucyny
- odczynnik Biala – 0,2% roztwór orcyny w 20% HCl
- 1% roztwór FeCl3
- 1M roztwór NaOH
- 0,25M roztwór CuSO4
- odczynnik Fehlinga:
I – rozpuścić w wodzie destylowanej 34,65 g krystalicznego CuSO4 5H2O i uzupełnić w
cylindrze miarowym do 500 ml
II – rozpuścić w wodzie 173 g winianu sodu i potasu i 15 g NaOH, uzupełnić do 500 ml
1, Odczynnik Benedicta – w 700 ml wrzącej wody rozpuścić 173 g cytrynianu sodu i 100 g bezwodnego Na2CO3. Po ochłodzeniu dodać powoli 100 ml 17,3% CuSO4 5H2O, stale mieszając.
Uzupełnić wodą do 1 000 ml
2, Odczynnik Barfoeda – rozpuścić na gorąco 24 g Cu(CH3COO)2 w 450 ml wody i dodać 25 ml
8,5% kwasu mlekowego. Wstrząsnąć aŜ do rozpuszczenia osadu. Oziębić, uzupełnić wodą do 500
ml i przesączyć.
3, Roztwór J2 w KJ
Reakcje charakterystyczne
1, Próba Molischa z α-naftolem
Jest to najbardziej ogólna reakcja na cukrowce, tak wolne jak i związane. Ujemny jej wynik
wyklucza obecność cukrowca, dodatni zaś nie wystarcza do stwierdzenia jego obecności, gdyŜ
dodatnią reakcję dają takŜe aldehydy, aceton, kwas szczawiowy, cytrynowy. Nie moŜna równieŜ
stosować tej próby do wykrycia cukrowców w moczu, poniewaŜ dodatni odczyn dają obecne tam
związki niecukrowe. Zasada próby polega na powstaniu czerwono-fioletowego zabarwienia w
wyniku kondensacji pochodnych furfuralowych z α-naftolem.
Do około 0,5 ml 2% roztworu badanego cukru dodać 2 krople etanolowego roztworu α-naftolu.
Po dokładnym zmieszaniu, po ściance ukośnie ustawionej probówki wprowadzić bardzo
14
ostroŜnie 0,5 ml stęŜonego H2SO4 tak, aby była widoczna granica między cieczami. W miejscu
zetknięcia się obu cieczy powstaje czerwono-fioletowy pierścień. Wyniki podać w tabeli.
2, Próba Seliwanowa z rezorcyną na ketozy
W reakcji tej barwny związek z rezorcyną daje hydroksymetylofurfural, powstający pod działaniem kwasu solnego duŜo łatwiej z ketoz niŜ z aldoz. Próba ta pozwala więc na odróŜnienie ketoz od aldoz, poniewaŜ w obecności 3-krotnie rozcieńczonego roztworu HCl tylko ketozy ulegają odwodnieniu w czasie ogrzewania w 100oC przez 30 sekund.
Do około 0,5 ml 2% roztworu fruktozy dodać 1 ml roztworu HCl (rozcieńczonego wodą 1 : 1) i
kroplę roztworu rezorcyny. Po zmieszaniu próbę wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Po około 30
sekundach powstaje czerwono-łososiowe zabarwienie. Po dłuŜszym ogrzaniu barwa moŜe wystąpić i przy innych cukrach. Próbę powtórzyć z roztworami pozostałych cukrów.
3, Próba Tollensa z floroglucyną na pentozy
Wskutek działania kwasu chlorowodorowego na pentozy powstaje furfural, który tworzy z floroglucyną związek o barwie wiśniowej.
Do około 0,5 ml 2% roztworu pentozy dodać 1 ml stęŜonego roztworu HCl i 2 krople roztworu
floroglucyny. Ogrzać. Powstaje barwa wiśniowa. Reakcję powtórzyć z roztworami pozostałych
cukrów.
15
4, Próba Biala na pentozy
Do 2 ml roztworu orcyny w HCl dodać kroplę 1% FeCl3 i 0,5 ml roztworu pentozy. Próbę wstawić
do wrzącej łaźni wodnej. Powstaje zielone zabarwienie. Reakcję powtórzyć z roztworami pozostałych cukrów. W obecności jonów Ŝelaza (III), powstający furfural daje z orcyną kompleks o
zielonej barwie.
5, Próba Trommera
Do około 1 ml roztworu glukozy dodać 3 krople 1M NaOH i ostroŜnie, kroplami roztworu CuSO4
tak długo, dopóki następuje rozpuszczanie się osadu wodorotlenku miedzi (II), a następnie próbę
ogrzać ostroŜnie do wrzenia. Cu(OH)2 w obecności glukozy tworzy rozpuszczalny kompleks. Podczas ogrzewania glukoza redukuje Cu2+ do Cu+; produktem reakcji jest pomarańczowo-czerwony
osad tlenku miedzi (I), Cu2O.
6, Próba Fehlinga
Zmieszać w probówce 3 ml roztworu Fehlinga I z 3 ml roztworu Fehlinga II. Próbę ogrzać do
wrzenia w celu sprawdzenia czy nie wystąpi redukcja własna odczynnika. Do 1 ml sprawdzonego
roztworu Fehlinga dodać kilka kropel badanego roztworu cukru, a następnie ogrzać w łaźni
wodnej. Opisać wynik.
7, Próba Benedicta
Do 1 ml odczynnika Benedicta dodać 2 krople 2% roztworu cukru i wstawić na 5 minut do wrzącej
łaźni wodnej. Powstające pomarańczowe zabarwienie roztworu wynika z redukcji Cu2+ do Cu+.
Próba Benedicta naleŜy do najbardziej specyficznych i czułych prób redukcyjnych na cukrowce.
Odczynnik róŜni się od odczynnika Fehlinga tym, Ŝe zamiast wodorotlenku sodu zawiera węglan
sodu i zamiast winianu, cytrynian sodu. Powstaje więc nie wodorotlenek miedzi (II) a węglan. Jest
to próba bardziej swoista od próby Fehlinga, gdyŜ związki redukujące odczynnik Fehlinga, jak:
chloroform, kreatynina i kwas moczowy, nie redukują odczynnika Benedicta. Czułość próby jest
dość duŜa. JuŜ 0,1% stęŜenie cukrowca powoduje zmianę barwy z niebieskiej na zieloną. Zielone
zabarwienie jest wynikiem nakładania się pomarańczowej barwy zawiesiny Cu2O z niebieskim zabarwieniem odczynnika.
16
8, Próba Barfoeda w modyfikacji Tauber-Kleinera – odróŜnienie jednocukrów od dwucukrów redukujących
Do 1 ml 2% roztworów badanych cukrów dodać po 1 ml odczynnika Barfoeda. Próbę wymieszać, a następnie wstawić dokładnie na 3 min do wrzącej łaźni wodnej. Zanotować wynik reakcji. Próby następnie pozostawić we wrzącej łaźni wodnej na dalsze 15 minut, po czym zanotować
wynik reakcji.
Próba ta pozwala na odróŜnienie mono- od dwucukrów redukujących. Jednocukrowce wykazują właściwości redukujące w środowisku lekko kwaśnym po krótkim ogrzewaniu (3 min), natomiast dwucukrowce redukujące dopiero po 15 minutach ogrzewania we wrzącej łaźni wodnej .
9, Reakcja z jodem.
Reakcja ta pozwala na odróŜnienie polisacharydów od innych cukrowców, poniewaŜ kompleksy z jodem mogą tworzyć tylko cząsteczki o uporządkowanej strukturze i odpowiednio duŜe. Efekt
barwny jest związany z wielkością cząsteczki – im większa cząsteczka polisacharydu tym więcej
cząsteczek jodu jest związanych w kompleksie. Amyloza barwi się intensywnie na kolor ciemnoniebieski. Barwa kompleksów jodu z polisacharydami o krótszych łańcuchach zmienia się
na fioletowoczerwoną (amylopektyna) i czerwoną (dekstryny). Glikogen daje kompleks o
barwie czerwonej.
Do 1 ml zawiesiny skrobi dodać 1 kroplę roztworu J2 w KJ. Powstaje niebieskie zabarwienie. Reakcje powtórzyć z pozostałymi cukrowcami.
Cukier
Reakcja
Molischa
Seliwanowa
Tollensa
Biala
Fehlinga
Trommera
Benedicta
Barfoeda
J2 w KJ
UWAGA ! Wyniki uzyskane w powyŜszych reakcjach zestawić w tabeli zaznaczając dodatni
wynik jako + , a ujemny jako –
17
Tworzenie osazonów
Cukry tworzą z fenylohydrazyną Ŝółte, trudno rozpuszczalne w wodzie dwuhydrazony (osazony). Osazony róŜnią się formami kryształów i temperaturą topnienia, co pozwala na identyfikację róŜnych cukrów (Ryc. 14). Związki te mogą powstawać tylko w reakcji z cukrami redukującymi, gdyŜ fenylohydrazyna kondensuje z wolną grupą aldehydowa lub ketonową. PoniewaŜ cukry w roztworach występują przewaŜnie w postaci pierścieniowej, w której grupa karbonylowa jest zablokowana, konieczne jest rozerwanie mostka tlenowego. Proces ten zachodzi w środowisku zasadowym; równieŜ niektóre organiczne zasady m.in. fenylohydrazyna mogą powodować otwarcie pierścienia w mono- i dwucukrach.
W pierwszym etapie reakcji aldozy z fenylohydrazyną tworzy się fenylohydrazon, w wyniku
dalszej reakcji z dwiema cząsteczkami fenylohydrazyny powstaje osazon:
Jak wynika z powyŜszych reakcji, w tworzeniu osazonu uczestniczą tylko dwa pierwsze atomy
węgla (C-1 i C-2). Cukry róŜniące się tylko ugrupowaniami przy C-1 i C-2, np. glukoza, fruktoza i mannoza dają w związku z tym identyczne osazony.
18
Ryc. 14. Kryształy osazonów (wg Vogel 2006)
Odczynniki:
- chlorowodorek fenylohydrazyny (UWAGA ! Silna trucizna !)
- octan sodu in subst.
- wzorcowe roztwory cukrów – 0,2 % roztwory glukozy, ksylozy i galaktozy oraz 2% roztwory
maltozy i laktozy
19
Postępowanie:
Do probówek napipetować po 1,5 ml roztworu badanych cukrów, dodać po około 100 mg
chlorowodorku fenylohydrazyny i około 150 mg octanu sodu. Próby wstawić do wrzącej łaźni
wodnej na 45 min. Po tym czasie, próby wyjąć i umieścić w zlewce z zimną wodą pozostawiając
do powolnej krystalizacji (około godziny). Osad kryształów przenieść na szkiełko podstawowe
i obejrzeć pod mikroskopem. Wykonać rysunki kryształów badanych osazonów
UWAGA ! W reakcji powszechnie stosuje się chlorowodorek fenylohydrazyny, trwalszy od wolnej zasady. PoniewaŜ w reakcji z chlorowodorkiem będzie powstawał dodatkowo przeszkadzający
w tworzeniu osazonów HCl, dla jego zobojętnienia do mieszaniny dodaje się octanu sodu in subst.
Zagadnienia do przygotowania:
- szeregi konfiguracyjne D aldoz i D ketoz
- wzory rzutowe Fischera i wzory Hawortha
- wyjaśnić terminy: enancjomer, anomer, mutarotacja, epimer,
- budowa disacharydów (maltoza, laktoza, sacharoza, trehaloza, celobioza)
- polisacharydy (budowa skrobi, glikogenu i celulozy)
- powstawanie furfuralu i hydroksymetylofurfuralu
- reakcje barwne pozwalające wykrywać róŜne cukry
- produkty utleniania cukrów
- reakcja powstawania osazonow; identyfikacja cukrów
Piśmiennictwo:
1. Berg JM, Tymoczko, JL, Stryer L – Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa
2005.
2. Campbell MK – Biochemistry. Saunders College Publishing. Harcourt Brace College Publishers. Philadelphia, 1999.
3. Garrett RH, Grischam ChM – Biochemistry. University of Virginia 1999.
4. Koolman J, Röhm K-H – Biochemia. Ilustrowany przewodnik. Wydawnictwo Lekarskie
PZWL, Warszawa 2005.
5. Vogel AI – Preparatyka organiczna. WNT 2006.
20