Recenzja 1 - BIOL

.!-
ocena pracy doktorskiej p. mgr. Magdaleny Swisłockiej
pt. ,,Struktura genetyczna populacji łosia (Alces alces) w dolinie Biebrry''
Jeś|izróŻnicowanięmiędzy udomowionymi rasami i odmianami roślinizwierzątprzev,,ryisza
obserwowane w naturze, a powstałoprzez wybiórcze kojarzenia (selekcję) dokonywane
ptzez hodowców, d|aczegopodobny proces nie mógłby przebieg w natutze? odkryty przez
K. Darwina proces selekcji naturalnej za!<ładil'
istnienie dziedzicznej zmiennościw
populacjach leżąceju podłozaadaptacji,i dodalibyśmydziś,potencjałuewolucyjnego.
Jednak przez całestulecie,jedynym argumentemza słusznościąwnioskuo genetycznym
podglebiu, byłamoŻliwośćzmiany dowolnych cech organizmów przez selekcję sztuczną.
Długi spór o strukturę genetycznąpopulacji naturalnych, Muller contra Dobzhansky, czy|i
jednolitośóversus rozmaitośćgenowa rozwiązałynowe techniki bada,wcze:elektroforeza
białek(allozymów,1966) sekwencjonowanieDNA (1983)' i dzisiejszebadaniagenomowe'
wskazując, ze normąbiologicznąjest zmienność.FuŃcjonalne (adaptacyjne)znaczenie
wykrytej zmiennościsekwencji DNA pozostałoenigmatyczne,.thejury is still out'. Muchy,
we wsponrnianym Sporze odegrałybezprecedensowarolą wartąwspomnieniazuwagina
sąsiedawo Litwy, gdzie .much dostatek' (Mickiewicz 1834).Jeślimuchy sąorganizmami
modelowymi, czy w takim przypadku, łosiem (łosiami)w ogóle warto się zajmowaó?
.deer' tłumaczą
,,Niech z bólu ryczy ranny łoŚ...''jest raczejluŹnąparafrazązHarrieta. Inni
jako jeleń (BarafrczaĘ lub rogacz (Słomczyński)'. Konfuzja lingwistyczno-taksonomicza,
przywodzi na myślpytanie nafuralisty Gilberta White'a' 18. wiecznego anglikńskiego
duchownego, który po zbadaniu padłejw niewoli samicy łosia,w liściedo Thomasa
Pennanta pyta: ,,whetheryou think still that the American moose and European elk are the
same creature''. G. White, przezwyciężzając
fetor padłejklempy dokonuje oględzin i
pomiarów dziwacznego stworzenia, zdaje raport adresatowi,v,ryznająciŻ ,,theputrefaction
precluded allfurther curiosity''. Dowiadujemy się także,żewłaŚcicielmiał nadziejęuzyskaó
potomstwo Ł'rzyzówkijelenia (red deer) i łosia (elk), w co White wątpił. ,,theirinequality of
height must have always been a bar to any commerce of the amorous kind".
Doktorantka' wyposźVonawe współczesneteorie, techniki badawcze inatzędziaana|ityczne
stawia zasadticzo to samo co White pytanie: czy łosie biebrzańskie sątymi samymi co gdzie
indziej stworzeniami (ewoluononami)? Bada i ana|izujestrukturę genetycznąpopulacji łosia
w dolinie Biebrzy na tle populacji sąsiednich.
Praca doktorska p. mgr Magdaleny Świsłockiej \lczy 2I0 stron o układzie standardowym:
Wstęp' Materiał i metody, Wyniki, Dyskusja zakończona Podsumowaniem' Literatva(345
pozycji)' Tabele (30) i Ryciny (17). Pracę poprzedzają Podziękowania, Uwagi wstępne,z
których dowiadujemy się, żewybrane elementy pracy zostaŁywcześniejopublikowane w
czterechpracach (nazwisko doktorantki występuje na pierwszym miejscu) oraz Streszczenie
(2.5 strony).
Praca mav,,yruźny,bardzodobrze przemyŚlany układ.I tak, ponieważobecny zasób
zmiennościksfahowały rozmaite procesy genetycznei demograficzne (ewolucyjne),
przebiegającew różnej skali czasowej, doktorantkaprzedstawia we wstępie historię zmian
zasięgów gatunków wywołanych plej stoceńskimi oscylacjami klimatycznymi. okresowe
kurczenie się i rozszerzanie zasięgów zostawiło wyruźnieśladywe wzorach zmienności,
umożliwiających m.in. odtworzenie pochodzenia populacji Europy środkoweji północnej
oraz dróg rekolonizacji z refugiów glacjalnych położonychbardziej na południu.Genetyczne
skutki zmianzasięgów dobrze opisująrozmaite modele populacyjno genetyczne;izo|acja
pod wpĘwem dryfu i doboru,a ponowre
populacjiw refugiachprowadzido zróżmicowania
zetknięciesię genetycznieodmiennychpopulacjitworzy wtórne stres mieszńcowe' mogące
ogtantczaÓprzepływgenów. Interesującymprocesemjest takżesurfing genetyczny,moŻe
szybko zwięksryćczęstość
wariantóww procesieekspansjiprzestrzennej.
iwznacznikiem potencjału
Ważnymskładnikiemrozmaitości
wewnątrzgatunkowej
jak podkreśla
ewolucyjnego,
doktorantka,
sąpopulacjereliktowe.Cechujeje m.in.mała
genetyczna.Choć sąone
liczebność,
zmienność
i izo|acjaprzestrzenna
czy odrębność
szczególniezagroŻone,
nieuchronność
ich wyginięcia,jest wątpliwa;ochronaidentyfikowanych populacjiwinna byó priorytetowa.
w tzw. ESU, jednostki
Populacjeodseparowane
w dłuższej
skali czasowejprzekształcająsię
wa:Żne
ewolucyjne,posiadajązarwyczajwłasnelokalneadaptacje,chronioneograniczonym
przepływemgenów wskutekizo|acji.Sąto także,zprakĘcznegopunku widzenia,tzw. MU,
jednostki zarządzania,
a cechujeje autonomiademograflczna.Zdaniemdoktorantki,odkrycie
złoŻonej
strukturyprzestrzennejpopulacjinaturalnych,czegokonsekwencjąjeststworzenie
takichpojęójak ESU czy MU,jest ogromnymosiągnięciem
filogeografii;pojęciate mają
przełoŻenie
bezpośrednie
na działanlaMiędzynarodowejUnii ochrony Przyrody i Jej
Zasobów,opracowaniętzw. CzerwonejKsięgi gatunków,a takŻepostulaĘ,ratyfikowanej
przez Polskę,Konwencji Berneńskiej.
omówienie rozmaitychklas markerówmolekularnychi ich zastosowaniaw badaniach
populacyjny ch,przy gotowuje tłoi uzasadnienie przy szłych badan.Poniewaz r ozmaite
segmentygenomudająodmiennywglądw strukturęgenetycznau
i podlegająinnymprocesom
ewolucyjnym,w za|einości
od Ą' sposobudziedziczerua,
tempamutacji,dryfu i doboru,
najlepiejbadaćrównocześnie
rozmaiteklasy markęrów.
Dwudziestopięciostronicowy
Wstępkoilczy opis historii populacjiłosiana świeciei w
Polsce' oraz sformułowanie
trzechceli pracy:
1. określeniestrukturygenetycznejunikalnej(unikatowej)populacjibiebrzńskiej zapomocą
rozmaitychmarkerówmolekularnych
2.Wyznaczenie czynrtikówwpływających
na obecnezróznicowaniemiędzypopulacyjne
w Polsce.
3. określenieźródeł
i kierunków powojennejekspansjiłosiaw Polsce za pomocąróŻnych
klas markerów i o róznym sposobiedziedziczenia.
W Materiałachi metodach(37stron)przedstawiaautorkanajpierwobiektbadan:taksonomię
gatlsttkllAlces,z dwomaopisanymigatuŃami A. alces i A. americana'geograftcznym
(2N:68 1ub70),indelemsegmentuCR w mtDNA, jak
zróŻnicowarliem
chromosomow).m
irozmaiteopiniebadaczynt.tzeczywistejliczby gatunków(1-3).Następnie
opisujebiologię
łosia,sezonowei długodystansowe
migracjeosobników'otaz terenbadańtj. obszarpoboru
prób, których położenie
i lokalnąliczebność
łosiw
i wielkośódobrzereprezentujązasięg
kraju,(27 miejsc),dodatkowedwie pochodzązLitwy i Niemiec. Próby z optymalnegodla
łosiaśrodowiska
dol. Biebrzy, zasiedlanejprzez unikatowąlinię ewolucyjnąstanowiłyok.Il4
wszystkichprób.Łącznie,próby współczesne(odchody,tkanki lub pozostałości
tkanęk)oraz
muzęalne|iczyłykilkaset sŹuk.
dostosowanedo
opis analiz genetycznychza'wieruprocedury
izol'acjiDNA genomowęgo,
rodzajupobranegomateriafu.Nieinwazyjnametoda,izolacji DNA z odchodówłosiopisana
jest odrębnie.Dodajmy,ze od jakościuzyskanegoDNA za\eŻysukgęsdalszychana|iz.
Doktorantka zastosowała3 kategorie markerów DNA: mtDNA, markery chromosomów płci
(X, Y), oraz chromosomów autosomalnych(mikrosatelity, oraz MHC II DRB). Kolejno
przedstawiaje i charakteryzlje. W obrębie mtDNA amplifikowała metodąPCR fragment
od
szybko ewoluującysegmentCR, różnejdługoŚci,607,35I,|ub 237 bp' * zaleŻności
jakościDNA, ad|areprezentatywnych haplotypów takŻęcyt b 1140 bp.
Markery chromosomów płci' umożliwiające śledzenieudziału samców w populacjach, czy
płciowo-za|eŻnejdyspersji, obejmowałysekwencje YCATS (zlokalizowane w chromosomie
Y).Z 8 wybranych segmentów, 6 dałoprodukty i czytelne sekwencje. Autorka przeprojektowała startery i przeprowadziłaszczegółowe ana|izy dlapolimorficznego DBY14 (15a bp).
Ponadto badatafragment genu SrRI(47f bp), projektując nowe starteryw oparciu o
sekwencje z GenBaŃu. Dla chromosomu X wybrałasegmentZfX (523 bp); opracowałatakŻę
sposób uzyskania amplikonu tego fragmęntuu samców.
Celęm identyfikacji alleli wysoce polimorficznych mikrosatelitów, sprawdziłanajpierw 38
par starterów. Tylko 11 loci dałoczyte|nei powtarzalne odczy.ty.Loci te amplifikowała w
dwu multiplexach, w jeden wkomponowałaodcinek genu SRI, co umożliwiłoidentyfikację
płci w próbach biologicznych. Dla MHC II DRBbadałapolimorficzny segment2f6bp.
Sposoby amplifikacji, oczyszczaniaamplikonów, reakcji sekwencjonowania'dokonywania
odczy.tówopisanesąw kolejnych akapitach.
Druga częśćMateriałów i metod zawięraprzeg|ąd ana|iz statystycznych stosowanychw
pracy. Rozpatruje najpierw sposób pobierania prób mogący prowadzić do zaniŻęniaczęstości
heterozygot (tzw. efekt Wahlunda), po czym przestawia sposoby rrniknięcia błędów
genotypowaniaczy sekwencjonowania.Fragment ten jest opisany bardzo dobrze. Dalej
podaje miary zmiennoŚci wykorzystującesekwencjenukleotydów dla oszacowaniastopnia
zróinicowania wewnątrzimiędzy populacyjnego, następnieodpowiednie statystyki dla loci
mikrosatelitów' i programy wykorzystane do obliczeń. Statystyki F czy R mierzą m.in.
ztóŻnicowanie i odstępstwaod kojarzen losowych. WykorzystałatakŻe maclęrze dystansów
genetycznych, i ftzycznych między populacjami do testowaniaprostego modelu tzo|acji
przez odległość
(IBD). W graficzne przedstawienie ztoŻnicowaniamiędzy populacjami
zaprzęgłaana|izęskładowychgłównych' wariancji molekulamej (AMoVA) i program
STRUCTURE. Pozwalająone na badanie wzorów geograftcznychi ocenę składowych
elementów wariancji genetycznej.
Kolejnym elementem analiz jest ocena pokrewieństwa genetycznego,współczynnika r, co
umożliwiająprogramy Kinship' korzystającez wielogenowych genotypów. Stopień wymiany
genów wraz z identyfikacjąmigrantów, tj., genotypów niepasujących do lokalnej struktury,
genetycznejjest logicznym następstwemana|iz. Częśćsegmentów genomu moŻepodlegać
nie tyle zmianom losowym' wynikającymze zmian demograficznych, Ne,Iecz podlegać
selekcji. Poszukiwanie odstępców (outliers), loci, których zroŻnicowanie przev,ryŻsza
neutralne tło umożliwił autorceprogram LOSITAN; oczywistym kandydatem był locus MHC
II DRB, tłem 11 loci mikrosatelitów.
Do ana|tzfilogeneĘcznych sekwencji mtDNA i konstrukcji dendrogramów stosowała
doktorantka 3 podstawowe metody NJ, ML, BI. Wykorzystują one albo dystanse genetyczne,
albo modele ewolucji sekwencji. Metody wielokrotnego próbkowania pozwa|ajątakze na
szacowanie poparcia dla określonychgał.ęzi,abardziĄ Zaawansowanealgorytmy na
datowanie dywergencji grup. (Niniejsza praca stosuje znacznię prostsze datowanie
porównawcze)' Alternatywną metodąujmowania podobieństw są sieci haplotypów metodą
MS minimalizującej liczbę róŻnic. ograniczeniem metody MS jest rekombinacja, stąd
autorska sieci skonstruowaładla tylko dla segmentów mtDNA oraz DBY]4
(nierekombinujący segment Y).
Sekwencji nukleotydolvych niosątakże informacje historyczne o zmianach demograficznych
populacji. opisuje je kilka statystyk' a takżerozl<ład|iczbyroŻnic nukleotydów między
sekwencjami (mismatch distribution)' która doktorantka wykorzystałado w pracy (programy
Arlequin i DnaSP w wersji uwspółcześnionej.
Do projektowania starterów, czy w rozmaitych ana|izach,gdzie jest to wskazane, posiłkuje
się autorka sekwencjami zdeponowanymi w GenBaŃ-u, sąto albo dodatkowe sekwencje łosi
z innych regionów, albo homologi najblizszych krewniaków łosia(samy,jeleni, bydła).
Prezentację Wyników otwiera perspektyrvamtDNA' jego zmienność,dywergencja
haplotypów i struktura. Dla współczesnychłosi uzyskałaautorka 612 sekwencji CR i
przylegającegotRNA uzyskałaautorka dla 588 prób (osobników) z Polski, 15 zLitv'1, i 9 z
Niemiec, (razem 612) znajdując 12hap|otypów; wśródnich najczęstszym był opisany przęz
niąhaplotyp Hl .biebrzański';wykryła takŻe4 haplotypy .skandynawskie'.Najczęstszymi
były H1 (0.36)orazH2 (.fiński'). Korygując nadreprezentację
populacji biebrzańskich,
wybrała433 osobników z 12 populacji;w nich dominowałhaplotypH2 fiński' drugim był
biebrzańskiH|;łącznie trzy haplotypy fińskie zna|ęzionou 50oń osobników. Zaskakuje, Że
wywodzący się od najv,ryŻq3 introdukowanych z Białorusi klemp haplotyp kampinoski
odkry.touŻu20Yo łosi.W badanymsegmencie27 pozycjibyło polimorficznych, dając
h:0.758, t:I.3; haplotypy roŻniłysię Średnio 7.3 tranzycjami.Szczegółoweanalizy
zmiennościprzeprowadziładoktorantkadla 13 populacji ze zwartego zasięgu łosia. Skład
haplotypowy (od2-6), ich częstoŚć i odrębność,
wykazały spore zróŻnicowanie, stądjego
miary, @,,i Ą', dla ok. 50 % porównywanych par, były wysokie' sugerującograniczenie
przepływugenów w linii żeńskiej.
W próbach muzealnych pochodzących od 92 łosi, sekwencje 35 1 bp fragmentu doktorantka
zidentyfikował.aaŻ
10 haplotypow,z22 miejscamipolimorficznymi'h:0.702,t:1.6,które
roŻnlłysię średnio5.7 tranzycjami. Jednego z haplotypów muzealnych H18, nie odszukano w
populacji współczesnej,a3 we współczesnychw próbach muzealnych' Jednak i w 5-cio
krotnie mniejszej próbie zroznicowanie jest wysokie.
Sekwencje cytb uzyskałaautorka d|a20 łosi' po 1-3 dla zidentyfikowanych haplotypów CR,
wykrywając 4 warianty, wszystkie 5 substytucji stanowiły tranzycje.
Po okreŚleniu najlepszegomodelu ewolucji d|a CR, cytb oraz sekwencjipołączonych,
skonstruowaładrzęwaNJ,ML i BI. Drzewa dla CR jednoznac,znieumieszczająI2
zidentyfikowanych haplotypów w obrębie haplogrupy europejskiej Hundertmarka et al.
(2002). Haplotypy opisane w niniejszej pracy tworzą2 gałęzie:nazwane Centralna Europa
(CE) i Ural. Klad CE obejmuje3 gałęzie:Biebrza,Polesie i Fennoscandia (tu przynaleŻy
kampinowski haplotyp H11). Topologię drzewaBl różni jedynie odmienny układ
haplotypów kladu CE. Krótszy odcinek CR (351 bp), mimo znacznej utraty informacji,
uzyskany dla okazów muzealnych dałtaki sam obraz stosunków haplotypów w drzewach NJ
i ML. Dychotomię haplogrupy europejskiej i trichotomię kladu CE, obejmującej gałęzie
Btebrza, Polesie i Fennoscandia potwierdziły równteŻ drzewaNJ, ML i BI, skonstruowane
d|a cytb+CR (łącznie 1747 bp). Podobne rezultaty uzyskaładoktorantka konstruując sieć
haplotypów. Sieci te lepiej od ukorzenionych drzęw obrazĄąstopień dywergencji
haplotypów; np' biebrzński Hl rozni 11 substytucjiod najbliżSzegoHII z gałęzi
Fennoscandta,ate od uralaskich oddziela 10 substytucji.odrębnośćhąplotypów grupy
azjatyckiej od europejskiej uwypukla co najmniej 30 substytucji.
Datowanie czasu dywergencji kladów mtDNA oparłaautorska na wartościachDa,
przyjmując literaturowe szacunki tempa ewolucji d|aCRi cytb u Cervidae i bydła
domowego. W takim ujęciu dywergencja kladów Centralna Europa i Ural nastąpiłaprzed ok.
138 000 |aty, azróinicowartie trzech gałęziCE nieco póżniej,ok. 130 000 1.t.Tempo bydlęce
daje odpowiednio47 570 i 46 780lat. Wszystkie wartościmają szerokie przedziałyufności.
Rozkłady liczby róznic (MD) dla róinych grup haplotypów (Polska, klad CE, gałęzi
FennoscandiaorazBiebrza) sąwielo-, dwu- lub jednomodalne.L-kształtnyrozkł'adgałęzi
Biebrzawskazuje na ekspansjędemograficznąiprzestrzetrlą co potwierdzają odpowiednie
parametry Tau, ThetaOi Thetaloraztesty. Dwa tempa substytucji 4 lub 8 ońll m|n lat datują
biebrzański wzrost demograficzny na 8 826 lub 4 413 l.t., a ekspansję przestrzenrtąna320
lub l60 l.t. Analizy krótszego odcinka CR mtDNA' 351 bp, przesuwajądatydwu zjawisk
bardziejwstecz na15262lub7 63II.t.oraz 463 lub 23f l.t.
11 loci mikrosatelitów dałoniską frekwencję alleli zerowych, stąd dalsze ana|tzyoparła
doktorantka na tej grupie loci. Niekompletne dane dla locus obejmowałymaksymalnie 16,80ń
wszystkich osobników tj. 386 reprezenĘących 14 populacji. ZmięnnośÓmikrosatelitów
okazałasię względnie wysoka, od 7-15 alleli na locus, ł'ącznie119,połowazntch miała
niskie częstości'WartościHo i H" były wysokie i zb|iŻone'choć w 10 populacjachistotnie
róine. ZroŻnicowanie międzypopulacyjne było małeĄ1 :0.03, lecz istotnie róine od zera,
wskazując nanieznaczne ograniczenie przepływu genów. Na tle porównań mtędzy parami
populacyjnych wyróżnia się populacja PKN. Zr ożznicowaniamiędzypopulacyjnego nie
wyj aśniaizo|acja przez dystans.
Ana|izy pokrewieństw wykazałaniskie współczynniki r, tj. niespokrewnienie osobników w
populacjach, wewnątrzpopulacyjneporównania w parach ujawniły niski udział krewnych (522yo),układy rodzic - potomek są rzadkie (zaledwie 023% par), najczęściejkrewni to
kuzyni (4.95 % par).
Ana|iza składowychgłównych zastosowanado zroŻnicowania @srmikrosatelitów i CR'
pokazał.a4grupy populacji: I' związanajestz biebrzańskimhaplotypemHl, Z.łączy
populacje wzdłuŻwschodniej granicy kraju i zLitv,ry,3.ł.ączy4 inne populacje,4. KPN
pochodząca z introdukowanych łosi białoruskich.Podobne ana|izyprzeprowadzono dla Fsr
CR, oraz rR51mikrosatelitów,który ukazały zasadniczo zbieine grupy populacji, podkreślając
odrębnośćniektórych
ANOVA zmiennościsekwencji CR zakładająca1 populacjęnajwiększe źródłozmienności
przypisuje zmiennościwewnątrzpopulacyjnej,potem międzypopulacyjnej, a w przypadku
mikrosatelitów prawie całazmlennośókoncentruję się wewnątrz populacji'
SAMovA dla sekwencji CR i mikrosatelitów wskazałana7 grup,maksymalizując
zróŻnicowanie międzypopulacyjne i minimalizuj ąc wewnątrzpopulacyjne.
Zko|ei program Structure wskazałna dwie genetycznie odmienne grupy, pierwsza ma
rodowód wschodni, druga biebrzański.
Nm:|.83 odpowiada3-4
W wybranych l l parach sąsiednichpopulacji dla CR śrędnia
wskazującana swobodny
migrantomna generację;dla mikrosatelitówNm:8.l, wartość
porównania
przeptyw genów. Jednak
dwu klas markerów, dla4 par populacji sugerują
większą efoktywną dyspersję samców.
GenClass2 sklasyfikowałl6 łosijako prawdopodobnychmigrantów, dominującątendencją
j est dyspersja ze wschodu na zachód.
Z7. genowzlokalizowanych w chromosomieY, tylko jeden DBY14 byłpolimorftczny,z4.
haplotypamiwykrytymi d|a23l samców z Polski i l3 spoza niej' w tym z Syberii. Wariant
Hl był najczęstszy' niestety populacje nie vtykazałyztoŻnicowaniamiędzypopulacyjnego.
Doktorantka skonstruowałasieć filogenetycznąd|a DBR] 4, wykorzystując własnesekwencje
homologu sarny euopejskiej i syberyjskiej,oraz 4 gatunków Bovidae. Jak możnabyło
oczekiwać z taksonomii,łosiegrupująsię z samami' bowidy są oddzielone.
Sekwencja intronu Zfx specyftcznad|achromosomuX, nie dałapolimorfizmów ani u 11
samic ani 13 samców zróŻnychpopulacji, stądnie prowadzonodalszych badań.
SegmentMHC II DRB dał9 alleli d|a196 łosiz Polskii16zlitwy. Dwa alleleDRB]*I] i
DRB] *1 sąnowe dla łosia.W populacjachwystępujeod 5-8 alleli, trzy najczęstszewarianty
są najczęstszei spotkanewe wszystkich populacjach,heterozygotydominują stądwysoka
wartoŚćh:0.7-0.8,znacznarI.4-1r.6Yo.RóŻnicmiędzypopulacyjnych
nie można
wytłumaczyćdoborempozy.tywnym(programLOSITAN), jednak locus ten moŻepodlegać
doborowi równowazącemu,faworyzującemuheterozygoty.Populacja biebrzańska(BIE)
odbiega od pozostałych,na co wskazuje wartoŚćFsr w porównaniach par populacji, czy
skrajnapozycja BIE względem osi głównych.
Końcowe dwa podroz działyWyników zawierają zestawienie charakterystyki reliktowej
populacji łosiw dol. Biebrzy oraz opis subpopulacjiw trzechjej basenach,górnym,
środkowymi dolnym. Próba biebrzańska(N:155), z 4hap|otypamiCR (lokalnym H1 i 3
fińskimi H2,H3, H4) jest małozmienna(h:0,33,x:0.564%),dominujehaplotypHl (0.81),
odmienny (9-I3 róŻnic)od blizszych sobie fińskich (4-6 róŻnic); muzealnepróby sprzed 12
lat nie zawterająH3 iH4, sugerująceich niedawne przywędrowanie w czasie memorandum
ochronnego.Biebrzański haplotypjawie sięjako wyjątkowy odszczepieniecw centralnej
Europie, ślademreliktowych autochtonów i długotrwałejich izolacji. Taką interpretację
popierają wariant HL-DBY]4, nie występującypoza Biebrząi KPN, ani Polską dwa lokalne
warianty MHC II DRB, mikrosatelityo największejśredniejliczbie alleli, oraz wysokie miary
@51i F51 dla CR w stosunkudo najbliższych,jak i dalszych populacji. ograniczenia
przepływulinii matriarchalnejnie wykazująmarkery biparentalne.W basenach
biebrzańskich' częstość
haplotypuH1 rośniez N na S' spadawięc róznorodność
h i x d|aCR.
Mikrosatelity dają obraz odwrotny; w basenie górnym zidentyfikowała doktorantka
najvtyŻszyodsetek krewnych. WyruŹne zroŻnicowanie@sr między basenami dla CR
wskazuj e ograniczony pr zepŁyw haplotypów mtDNA.
Dyskusję rozpoczynaprzywołaniezasadyzgodnościgenealogicznejtjej czterechaspektów
przemawiającychza istnieniemgłębokiej'nie płytkiej,strukturyfilogeograficznejpopulacji.
Ana|iza dywergencjimtDNA wysuwa się na pierwszy plan, poniewaŻntepodlega on
rekombinacji i szybko gromadzi mutacje. Wszystkie wykry.tewarianty 601 bp CR mtDNA
(12) lokują się w grupie EuropejskiejHundertmarkaet a| (2002),odmiennejod Azjatyckiej,
co wskazuje na ich nieza|eŻnąhistorięewolucyjną a w jej obrębie dwa klady, z
domniemanymirefugiami LGM w Europie i wschodniej częŚci zasięgu.Możnaje uznaćza
odrębne ESU. Kolejno omawia autorka czasowy aspekt dywergencji na tle zmian
klimatycznych, oraz porównań z innymi gatunkami (pokrewna sarn$, poszukując zgodności
filogeograficznej (aspekt III wymienionej zasady)' Klad CE ztrzemagilęziami cechuje duża
różnorodność,
zachowana Zapęwnew odrębnych refugiach, na co wskazuje bimodalny
roz|<ład
roŻnic (niedopasowań)nukleotydowych, i dane paleontologiczne z klasycznych
refugiów. Zbałkafiskich i karpackich ostoi Zapewnepochodząłosie Europy centralnej i
pótnocnej,te z ostoi apenińskiejwyginęły.Polskę zasiedliłytakze łosieszeroko
rcZprzęstrzenionegokladu Ura| (z refugium na południuod Uralu)' który jak i inne gatunki
ssaków wykazał gwałtownąpostglacjalną ekspansję demograficznąi przestrzennąlinii
matczynych. Wkład karpackich ostoi w ksztahowanie składyjest zdaniem autorki
niedoceniany; w ostoi tej niewątpliwie przetrwały|iczne populacje/gatunkio własnych
adaptacjach.Szczątki kopalne zKarpat i Bałkanów dobitnie świadcząoprzesunięciach
w
zasięgu w następstwie zmian środowiskowych,przekształceńkrajobrazu i roślinności
obniżeniach terenów powstających dolinach rzeczny ch. Czas ekspansji demograftcznĄ
przypadat.na okres borealny holoceny, której Ślady w grupie Biebrzapokazująparametr Tau
i ujemna wartośćtestu D Tajimy. Ekspansja przestrzenrlatej grupy jest jednak bardzo
świeżej,najwyŻejkilkusetletniej, proweniencji.
Łosie polskie wywodząsię z kilku linii' przybyłychz odmiennychkierunkóW' co przyczyniło
się do ich zwiększonej różnorodnościw strefie wtórnego kontaktu w SN Polsce. Podobny
wzrost zmiennościna tym regionie obszarzęcechuje inne gatunki ssaków. Łosie tworządwa
genetycznieodmienneklastery populacji,północny(dominująHl i H2) oraz południowocentralny(dominująH3 i kampinowski H11).
Kolejny podrozdziałomawia reliktowy charakter biebrzńskich populacji, podkreślając
na gwahownejredukcji liczebnoŚci łosido kilkunastu
odrębnośói niewielką zmienność,
osobników w rezerwacie Czerwone Bagno. Haplotypy rzadkie stanowią zagadkę,byc moŻe
pochodząod osobników które przetrwałydewastującyefekt II wojny w małych lokalnych
populacjach (np. Polesie), lub tez prz1rvędrowałyalbo pochodzą z introdukcji. Zgodny obraz
dajątakie sekwencje genów jądrowych, autrzymywanie się polimorfizmow MHCII DRB o
znanej funkcji moŻe mieć związek z doborem równowaŻącym czy wzrostem zagęszczenia
łosi na terenach chronionych. Mikrosatelity pokazująrozmaite struktury genetycznepopulacji
lokalnych panmiktyczne z jednej' zinbredowane z drugiej, w których rzeczywiście
zidentyfikowano osobniki spokrewnione ze sobą najczęŚciej kuzynów, rzadko rodzicat
potomka.
Populację biebrzńskąprzekonuje autorka rozprary na|eŻyuznac zare|ikt biogeograficzny
(Lomolio et al. 2006),zw. reliktem właściwym'a w komplementarnymujęciu (Zimmermann
et al. 2010) za relikt genetyczny,plejstoceńskąpopulacjęreliktową skraja zasięgu.Powinna
zyskać,status specjalnejjednostki zarządzania(MU)' gdyżjest odrębnoŚć genetyczna nie
ulega wątpliwościi jest nieza|eŻnademograficznie od innych populacji. Stanowi waŻny
składnikzmiennościwewnątrzgatunkoweji potencjałuewolucyjne go, zatem w myśl
Konwencj i Genewskiej winna podlegać ochronie. Dyskusj ę zamyka podrozdziały
rekonstruującypowojennąhistorięłosiw Polsce i opis wysokiego genetycznego
zroŻnicowaniamiędzypopulacyjnego między nimi. Doktorantka przedstawia kilka tłllnaczen.
Populacje przeszłyprzez wąskie gardłow czasach historycznych; dryf wzmocnił
zroŻnicowanie.Telemetria wskazuje na filopatrię obu płci,jednak w niniejszej pracy markery
dowodzą ograniczonejdyspersjiklemp w większościbadanychpopulacji' Dwukierunkowa
ekspansja moŻerównież prowadzió do wzrostu zrożłicowania;sugerując złoŻone
pochodzenie populacji, na których autochtoniczej strukturze genetycznej napływłosi z Prus
Wschodnich i Polesia, wycisnąć mógł wyraŹnepiętno. Podsumowanie kończy pracę.
Pracę p. mgr. Magdaleny Swisłockiej czytałemkilkakrotni e) zawsze z wielkim
zainteresowaniem i podziwem dla kilku aspektów: tematyki' tłateoretycznego,rozmaitości
technik laboratoryjnych eksplorujących zmiennośćrozmaitych segmentów genomów w
Świetle oczekiwań' ogromu włożonejpracy, Zapęwnefrustrującejnieskutecznościąusiłowań
czy brakiem interpretowalnejzmienności.Praca, dotyczącaważnegozagadnienia,o
konsekwencjach praktycznych dla ochrony łosi, napisanajest bardzo dobrym, zrozumiałym
językiem. Dwie częścipracy zostałyjuŻ opublikowane,trzecia zostanie Zapewneszybko
przygotowana do druku.
Doktorantka musiałaopanować rozmaite techniki anaIizy genomu, izo|ację DNA ze
zróŻnicow anegomateriału,amplifi kację wybranych fragmentów, sekwencjonowanie czy
genotypowanie mikrosatelitów. Ponadto uzyskałabiegłośów różnych sposobach arlalizy
zmiennościi struktury populacji. Były to m.in. konstrukcje dendrogramów, sieci haplotypów,
ana|izy zroŻnicowaniawewnątrz i międzygatunkowego,oparte o modele genetyki
populacyjnej i analizy wariancji genetycznej,wreszcie datowanie dywergencji i
wnioskowanie o przemianach demograficznych w długiejczy krótkiej skali czasowej.
Pokonałaliczne przeszkody, ominęłarafy i mielizny, ptzestawiającpracę świadczącą
również o opanowaniu przez Nią teorii kilku odrębnych dziedzin, na których zasadza się
filogeografia i biologia konserwatorska.Cytuje oglomna liczbę prac Źrodłolvych(345).
i zawiłościstruktury
Jej praca pod małooryginalnym tytułem,odkrywa nie tylko złoŻoność
genetycznejkrajowych łosi,lecz takżeposzukujejej fuódełeksplorująci testując
alternatywnehipotezy. Dobrzę poznanai udokumentowanastruktura genetycznałosidomaga
się, moim zdaniem, podejściagenomowego,do którego kierowana przez Jej promotora grupa
ma predyspozycje.
Uwagi h'rytyczne sąnieliczne. Brakuje mi mapy zasięgów łosi na świecie,czy przynajmniej
zachodniego krańca zasięgu' które by krajowe zroŻnicowaniei opisytvane drogi kolonizacji
przedstawiaływ szerszej skali przestrzennej,Kluczowe ryc. 1 i 2 sąmylące,
niekonsekwentnie oznaczone.Róznica między kolorem f,roletowyma niebieskim jest zbyt
subtelnadla nosicielajednego iksa (opsyny SW sąkodowanew chromosomieX). Skala
zagęszczeniałosi nawiązującado widma, nagle przeskakuje na jego drugi kraniec
(czerwony). oznaczenie populacji jest niekonsekwentne;ryc. l są tylko numery' na ryc. f
brak oznaczen,w tekścietrzyliterowe skróty. Czytelnik sam musi dokonaó korekt. Skośna
perspektywaplacków i ortogonalnakraju kłócą się z moim odczuciem perspektyw.
Tabele: Nie potrafię biegle czytać kolumn tekstu scentrowanegow środku,a tym bardziej
porównywać,|iczb tak zapisanych. Maniera centrystyczna niestety się szerzy również w
poważnych czasopismach. Inne uwagi sąjęzykowe, dotycząsłów czy nomenklatury' głównie
polskich odpowiedników słów i terminów angielskich (patrz doł'ączonalista). Proszę o
wyjaśnieniejak uniknięto pobierania prób od tych samych osobników, skoro zbierano tylko
odchody.
Uwagi povtyŻszei zamieszczone na końcu, są małoistotne dla wysokiej oceny pracy.
Mogąłatwo być uwzględnione w przygotowywanej pracy' a językowe dwuznacznościznikną
w wersji angielskiej.
Reasumując,ptacap.mgr Magdaleny Świsłockiej spełniawszelkie wymaganiastawiane
rozpIawom doktorskim. Wnoszę o jej przyjęcie i dopuszczenie doktorantki do dalszych
etapów przewodu.
Równocześnie,zwaŻywszy wyjątkowę walory naukowe pracy, Wloszę o jej wyróżnienie.
.(
J a".łJ^f^, )7** rĄ
prof' dr hab.JacekM. Sźymura
członekPAU
ZakŁadAnatomii Porównawczei U I
Kraków, 29 wrześnta2}I4r,
Uwagi:
str.36 rządArtiodactyla_ dziśCetartiodactyla
sh. 37 - unikalnalinia ewolucyjna- unikatowa
str. 40 _ pobieranieprób kuidej zimy _ jak unikniętopobieraniaprób od Ęch samych
osobników?JeślibadanomikrosatelĘ,czy zna\ezionotakie sameprofile?
stt.44 linia 11_ niejasne_ jeślidoktorantkaamplifikowałanp. odcinekmtDNA dfugości
607bp, wiarygodnaselnvencjanukleotydówmusi byó skrócóna o długość
starterów,
gdyż,temogą sięłączać,
z nieco ńimpi sekwencjami.
geny
na
Y
chromosomie
znajdljąsię w chromosomie
.
str.49 brak szczegółówamplikowaniamikrosatelików(Tabela3 i 5)
w drugimakapicie,niekonsekwentny
opis schematuamplifikacji.
-34
85 1.10/11 miejscamipolimorficznymi-34 subst5rtucjami
_macięrz wartości
(ang.matrix: macierz,matrycapoangielsku
90 _I.20 matrycawartości
to template
107- l. 4 - unikalnahistoria- unikatowahistoria
118-l. 6-3 oddoh _ zdafię niejasne"nie wiadomoo jakie wą5kiegardłochodzl 7'apis
(Bńncken I8f6) sugerujejakoby on dokumentował
spadekliczebności.
Rok 1826
jego
nic nie mówi o końcu wieku XlX,raczej pierwszej
połowie.