QUANTA LiteTM dsDNA

QUANTA Lite® ssDNA ELISA
708525
test ELISA jednoniciowego DNA
Do diagnostyki in vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
Test QUANTA LiteTM ssDNA ELISA jest testem immunoenzymatycznym (ELISA) do wykrywania
autoprzeciwciał przeciwko jednoniciowemu DNA (ssDNA). Zestaw INOVA QUANTA LiteTM ssDNA
ELISA stosowany w połączeniu z zestawem INOVA QUANTA LiteTM dsDNA służy do
półilościowego oznaczania autoprzeciwciał przeciwko ssDNA w surowicy ludzkiej do wspomagania
diagnozy tocznia rumieniowatego układowego (SLE) i określonych innych chorób reumatycznych.
Test nie jest sam w sobie rozstrzygający, ale jest jednym z parametrów procesu diagnostycznego
obejmującego wiele kryteriów.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) występują w wielu różnych chorobach tkanki łącznej i jako takie
stanowią czuły cel badania przesiewowego.1 Przeciwciała przeciwko dwuniciowemu DNA (dsDNA)
występują niemal wyłącznie u pacjentów z SLE i jako takie są uznawane za przeciwciała
markerowe dla tej choroby. Obecność przeciwciał przeciwko dsDNA silnie wskazuje na obecność
SLE, jednak brak tych przeciwciał nie wyklucza SLE we wszystkich przypadkach.2
Autoprzeciwciała przeciwko ssDNA występują w kilku chorobach reumatycznych i różnych
rodzajach innych chorób.3,4 Najczęstsze występowanie i najwyższe miana przeciwciał anty-ssDNA
występują u pacjentów z SLE.4 Stwierdzono, że u pacjentów z SLE i pozytywnym wynikiem testu na
obecność autoprzeciwciał przeciwko ssDNA, miano może posłużyć do monitorowania aktywności
choroby i odpowiedzi na terapię farmakologiczną.5,6 Chociaż przeciwciała przeciwko ssDNA nie są
swoiste dla SLE, u niektórych pacjentów z SLE bez istotnego miana przeciwciał ANA mogą
stanowić one jedyny pozytywny dowód serologiczny.7 Wielu z pacjentów o wysokich mianach
przeciwciał przeciwko ssDNA wykazuje chorobę skórną związaną z fotowrażliwością. Około 25%
pacjentów z toczniem przewlekłym posiada przeciwciała anty-ssDNA i mogą u nich wystąpić objawy
układowe.3 Obecność przeciwciał anty-ssDNA wykazano wyłącznie u pacjentów z ciężkim toczniem
przewlekłym z zapaleniem kłębuszkowym nerek.3 Takie badania wskazują, że oznaczanie
przeciwciał przeciwko ssDNA może stanowić istotny test diagnostyczny do oceny pacjentów z
toczniem przewlekłym lub pacjentów negatywnym pod względem SLE, którzy posiadają
przeciwciała ANA.3 Przeciwciała reagujące z termicznie zdenaturowanym ssDNA reagują z
purynami i pirymidynami oraz szkieletem cukrowo-fosforanowym cząsteczki DNA.1,4 Z technicznego
punktu widzenia nadal niemożliwie jest oznaczenie za pomocą pojedynczego testu prawdziwych
przeciwciał przeciwko ssDNA (z jedynym antygenem w postaci zasad purynowych i
pirymidynowych). Zastosowana w tym teście technika ELISA jest obiektywna i wyniki mogą być
podawane w formie półilościowej. Test ELISA może być dogodnie stosowany do badania małych i
dużych ilości od próbek pacjentów w formacie profilu wraz z innymi testami oceniającymi choroby
reumatyczne, takimi jak testy na obecność przeciwciał przeciwko dsDNA, histonom i
ekstrahowalnych przeciwciał przeciwjądrowych (ENA).
Zasada badania
Wysoce czyszczony zdenaturowany termicznie antygen ssDNA grasicy cielęcej wiąże się z dołkami
płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego stanie natywnym.
Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych
dołków, umożliwiając wszelkim obecnym przeciwciałom przeciwko ssDNA związanie się z
unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany
jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja
umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi
przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich
niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego
enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy.
Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie
intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków
kontrolnych.
Odczynniki
1.
2.
Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte oczyszczonym antygenem ssDNA
(12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze
Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez
ludzkich przeciwciał przeciwko ssDNA, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
1
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Słabo pozytywna kontrola testu ssDNA ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i
przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko ssDNA, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Silnie pozytywna kontrola testu ssDNA ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i
przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko ssDNA, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka – zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną
buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml
Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x – zabarwienie czerwone, zawiera sól
fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można
znaleźć w sekcji Metody.
Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka – zabarwienie
niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml
Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml
Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344 M, 1 fiolka – bezbarwny, 10 ml
Ostrzeżenia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (0,02% chloramfenikol) w
rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje
raka.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego
produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA
stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna
metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV
lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę testu ssDNA
ELISA, wysoko pozytywną kontrolę testu ssDNA ELISA i kontrolę negatywną testu ELISA
należy obsługiwać w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny.8
Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być
toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może
wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie
wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy
przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku.
Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może
być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń
chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku
wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać
wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami.
Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać
wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje
z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może
być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i
oczami.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony
osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i
lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
Środki ostrożności
1.
2.
3.
4.
5.
Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro.
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować
osiągnięciem niespójnych wyników.
Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami
ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek
oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować
rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem
każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie
zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową
odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania,
dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy
wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i
powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji.
2
6.
7.
8.
9.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z
mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania.
Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu
może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej
sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z
koniugatem HRP.
Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym
czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych
substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z
czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji
czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia.
Warunki przechowywania
1.
2.
3.
Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać.
Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane
zgodnie z instrukcjami.
Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w
torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2–8°C.
Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów
do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających
widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie
zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek.
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca
następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej
nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić
próbkę do temperatury 2–8°C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w
przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20°C lub niższej. Zamrożone
próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane.
Badanie
Dostarczone materiały
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Płytka z mikrodołkami ssDNA ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA
50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP
25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x
10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG
10 ml chromogenu TMB
10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety na 5, 100, 200–300 i 500 µl
Jednorazowe końcówki mikropipet
Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości
Woda destylowana lub dejonizowana
Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania
Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm
dla odczytów przy dwóch długościach fali)
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26oC) i dobrze
wymieszać.
Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki
koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała
płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym
celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na
każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień
w temperaturze 2–8oC.
3
3.
4.
Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500
µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin
od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA,
wysoko pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA i kontroli negatywnej testu ELISA.
Ustalenie obecności lub nieobecności ssDNA z zastosowaniem jednostek arbitralnych
wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla
każdej próbki od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek.
Procedura badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ
DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20–26°C). Umieścić wymaganą
liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w
torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z
parą wodną.
Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ssDNA
ELISA, wysoko pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA, kontroli negatywnej ssDNA ELISA i
rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w
temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu
ostatniej próbki.
Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać 200–300 µl
rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać.
Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania.
Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości
płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym
etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania
próbki.
Do każdego dołka dodać 100 µl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z
butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik
laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY
UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB
CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO
BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie 2.
Etap płukania: Powtórzyć etap 3.
Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut
w temperaturze pokojowej.
Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą
sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu
TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków.
Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu
jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne,
referencyjną długością fali może być długość 620 nm.
Kontrola jakości
1.
2.
3.
Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię
próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu ssDNA ELISA, wysoko
pozytywną kontrolą testu ssDNA ELISA i kontrolą negatywną ELISA.
Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu ssDNA ELISA, wysoko
pozytywna kontrola testu ssDNA ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie
rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z
rozcieńczaniem próbek.
Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami
lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie
surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i
przechowując je w temperaturze ≤-20°C.
4
4.
Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie
poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być
traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone.
a.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA
musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli
testu ssDNA ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie
rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA.
b.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA
musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli
negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2.
c.
Absorbancja słabo pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA musi być przynajmniej
dwukrotnie wyższa niż absorbancja kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać
0,25.
d.
Kontrola negatywna testu ELISA i wysoko pozytywna kontrola testu ssDNA ELISA
mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika.
Silnie pozytywna kontrola testu ssDNA ELISA nie zapewni dokładności przy wartości
granicznej badania.
e.
Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w
dokumencie NCCLS C24-A.
Obliczanie wyników
W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów.
Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki
przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA. Otrzymany wynik
mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA,
którą można znaleźć na etykiecie.
Gęstość optyczna próbki
Wartość próbki =
(jednostki)
Gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu ssDNA ELISA
x słabo pozytywna kontrola testu
ssDNA ELISA
(jednostki)
Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń
przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności,
jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza
podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał
pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i
ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako
miano przeciwciał pacjenta.
Interpretacja wyników
Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze
różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde
laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli,
sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Poniższa informacja
służy jako przykład wspomagający interpretację wyników.
Ponieważ z antygenem ssDNA tego zestawu mogą reagować zarówno autoprzeciwciała przeciwko
jednoniciowemu DNA (ssDNA) oraz niektóre przeciwko dwuniciowemu DNA (dsDNA), próbki
pacjentów powinny być także badane pod kątem reaktywności z dsDNA. Te wyniki podane w
jednostkach WHO powinny być uwzględniane podczas oceny poziomów ssDNA. Łącząc wyniki
testu INOVA QUANTA Lite® dsDNA ELISA z wynikami testu INOVA QUANTA Lite® ssDNA ELISA
obliczając stosunek (ssDNA/dsDNA) można wyciągnąć wnioski na temat występowania przeciwciał
przeciwko ssDNA. Stosunek <0,5 wskazuje na brak przeciwciał przeciwko ssDNA. Stosunek >0,5
wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko ssDNA.
UWAGA: Próbka od pacjenta powinna być uznana za dającą wynik pozytywny jedynie wówczas,
gdy wynik testu na obecność przeciwciał przeciwko ssDNA jest pozytywny i stosunek jednostek
ssDNA do jednostek dsDNA wynosi >0,5.
Przykład 1: Test 1: stężenie przeciwciał przeciwko dsDNA w teście: 120 WHO U/ml
Test 2: stężenie przeciwciał przeciwko ssDNA w teście: 160 U/ml
Stosunek przeciwciał przeciwko ssDNA (ssDNA/dsDNA): 160/120 = 1,33 (+)
Interpretacja: Próbka pacjenta daje wynik pozytywny na obecność przeciwciał
przeciwko ssDNA
5
Przykład 2:
Test 1: stężenie przeciwciał przeciwko dsDNA w teście: 270 WHO U/ml
Test 2: stężenie przeciwciał przeciwko ssDNA w teście: 130 U/ml
Stosunek przeciwciał przeciwko ssDNA (ssDNA/dsDNA): 130/270 = 0,48 (-)
Interpretacja: Próbka pacjenta daje wynik negatywny na obecność przeciwciał
przeciwko ssDNA
Przykład 3: Test 1: stężenie przeciwciał przeciwko dsDNA w teście: 80 WHO U/ml
Test 2: stężenie przeciwciał przeciwko ssDNA w teście: 80 U/ml
Stosunek przeciwciał przeciwko ssDNA (ssDNA/dsDNA): 80/80 = 1.0 (+)
Interpretacja: Próbka pacjenta daje wynik pozytywny na obecność przeciwciał
przeciwko ssDNA
Jeżeli wynik testu ssDNA jest pozytywny, wówczas jednostki ssDNA można porównać z
następującymi kategoriami klinicznymi.
Poniżej 68,6 U/ml
Brak przeciwciał przeciwko ssDNA
68,6–229 U/ml
Wynik na obecność przeciwciał przeciwko ssDNA jest
umiarkowanie pozytywny
powyżej 229 U/ml
Wynik na obecność przeciwciał przeciwko ssDNA jest silnie
pozytywny
Określenie aktywności ssDNA w próbkach wykazujących wartości silnie pozytywne (tj. gęstość
optyczna powyżej 2,0) pod kątem zarówno ssDNA i dsDNA może być trudne. Gdy próbki dają
wynik silnie pozytywny wówczas stosunek może być mylący, ponieważ test ELISA jest wysycony
autoprzeciwciałami pacjenta. Próbki silnie pozytywne zarówno pod względem ssDNA jak i dsDNA
zaleca się zbadać ponownie w rozcieńczeniu 1:4 i 1:20 (tj. 1:404 i 1:2020) w rozcieńczalniku do
próbek HRP w celu ustalenia, czy aktywność ssDNA jest wyższa niż dsDNA. Powyższe obliczenia
muszą zostać przeprowadzone na tym samym rozcieńczeniu próbki pacjenta.
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Ponieważ uważa się, że przeciwciała IgG mają większe znaczenie kliniczne, niniejszy test
wykorzystuje koniugat swoisty wobec IgG. Nie oznaczane w tym teście przeciwciała IgM
przeciwko ssDNA mogą konkurować z przeciwciałami IgG o dostępne miejsca wiązań. Jeżeli
podejrzewana jest interferencja spowodowana przeciwciałami IgM, należy ponownie zbadać
próbkę przy wyższym rozcieńczeniu rozcieńczalnikiem do próbek HRP. Silne zwiększenie
wartości dla próbki wskazuje na obecność konkurującego przeciwciała IgM. Ta nowa
wartość pozwoli na dokładniejsze oznaczenie miana przeciwciał IgG przeciwko ssDNA w
macierzystej próbce pacjenta.
Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce
pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i
wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu.
Ponieważ z antygenami ssDNA tego zestawu mogą reagować zarówno autoprzeciwciała
przeciwko jednoniciowemu DNA (ssDNA) oraz niektóre przeciwko dwuniciowemu DNA
(dsDNA), próbki pacjentów powinny być także badane pod kątem reaktywności z dsDNA i
wyniki te należy uwzględnić podczas oceny poziomów ssDNA.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one dokładność i
powtarzalność techniki pipetowania, fotometr użyty do pomiaru wyników i błąd
systematyczny czasu podczas testu. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników
wymaga staranności i precyzji.
Test QUANTA Lite® ssDNA ELISA nie jest samodzielnym testem na obecność przeciwciał
przeciwko ssDNA. W celu pomiaru przeciwciał przeciwko ssDNA musi być on stosowany w
połączeniu z testem QUANTA Lite® dsDNA ELISA firmy INOVA Diagnostics, Inc. Nie należy
stosować testu na obecność przeciwciał przeciwko dsDNA innych producentów ponieważ
kalibracje testów ssDNA ELISA i dsDNA ELISA są do siebie dopasowane.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi
badaniami serologicznymi.
Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.
Spodziewane wartości
Zdolność testu QUANTA Lite® ssDNA ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko ssDNA
oceniano poprzez porównanie z dostępnym w handlu testem ELISA. Wyniki testu ELISA ustalono
zgodnie z broszurą jego producenta.
6
Normalny zakres
Wybrano sto siedemnaście losowych próbek surowic prawidłowych i zbadano je za pomocą
zestawu QUANTA Lite® ssDNA ELISA. Spośród tych próbek siedem wykazywało 69 lub więcej
jednostek (wynik pozytywny w tym układzie ELISA). Pięć z tych siedmiu próbek dało także wynik
pozytywny w dostępnej w handlu referencyjnej metodzie oznaczania przeciwciał anty-ssDNA i
dlatego usunięto je z populacji prawidłowej. Średnia próbek populacji wyniosła 27 przy odchyleniu
standardowym 21. Zakres w populacji wynosił od 12 do 186. Badanie to wskazało, że średnia
próbka prawidłowa to 2,0 odchylenia standardowego poniżej wartości granicznej.
Swoistość i wrażliwość względna
Trzydzieści dwie losowe próbki z pozytywnym wynikiem ANA zbadano za pomocą testu QUANTA
Lite® ssDNA ELISA i innego zestawu dostępnego w handlu (metoda referencyjna). Według obu
metod osiemnaście próbek było pozytywnych, a 12 było negatywnych. Dwie próbki były pozytywne
w metodzie referencyjnej, ale negatywne w teście INOVA. Te dwie próbki były także negatywne w
innym zestawie dostępnym w handlu. Wyniki te przedstawiono poniżej.
INOVA
+
+ 18
2
Wrażliwość względna
90%
Referencje
Swoistość względna
100%
0
12
Skuteczność względna 94%
W celu dalszego zbadania swoistości fazy stałej ssDNA, za pomocą zestawu QUANTA Lite®
ssDNA ELISA zbadano różne kontrole autoprzeciwciał monoswoistych o wysokich mianach.
Kontrole te obejmowały kontrole silnie pozytywne z następujących zestawów NOVA QUANTA Lite®
ELISA: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, mikrokosmki i tyroglobulina tarczycy, histony i
mitochondrialne M2. Wszystkie spośród powyższych kontroli dały w teście ssDNA wyniki
negatywne.
Reaktywność ssDNA w różnych chorobach tkanki łącznej
SLE
Zespół Sjogrena
Twardzina
Zapalenie wielomięśniowe
Toczeń polekowy
Reumatoidalne zapalenie stawów
Liczba pacjentów
43
21
15
6
20
11
% Pozytywny
58
62
80
17
80
45*
*2 z 5 próbek pozytywnych były jedynie granicznie pozytywne (69 i 99 jednostek).
Dwudziestu pięciu pacjentów z SLE miało pozytywny wynik ssDNA. Sześć spośród tych
pozytywnych wyników ssDNA należało do pacjentów z SLE, dla których w czułej metodzie ELISA
wykrywania dwuniciowego DNA (dsDNA) (INOVA) uzyskano wynik niejednoznaczny. Trzynaście
spośród 21 pacjentów z zespołem Sjogrena miało pozytywny wynik ssDNA. Przy zastosowaniu
metody metodą ELISA (INOVA) wszystkich 21 pacjentów miało pozytywny wynik SS-A, SS-B lub
zarówno SS-A i SS-B. Trzy spośród próbek od pacjentów z zespołem Sjogrena miało pozytywny
wynik ssDNA, chociaż było całkowicie negatywne w czułej metodzie ELISA dsDNA (INOVA).
Dwunastu z piętnastu pacjentów z twardziną i pozytywnym wynikiem Scl-70 miało także pozytywny
wynik ssDNA, natomiast taki wynik pozytywny miał tylko 1 z 6 pacjentów z zapaleniem
wielomięśniowym. Przy zastosowaniu metody ELISA (INOVA) wszyscy pacjenci z zapaleniem
wielomięśniowym mieli pozytywny wynik autoprzeciwciał Jo-1. Jeden pacjent z zapaleniem
wielomięśniowym, który miał pozytywny wynik ssDNA (112 U) był całkowicie negatywny pod
względem przeciwciał przeciwko dsDNA badanych metodą ELISA (INOVA).
Precyzja i powtarzalność
Precyzja i powtarzalność badania wyznaczono testując sześć powtórzeń każdej negatywnej,
umiarkowanie pozytywnej i silnie pozytywnej próbki w czterech oddzielnych badaniach. Średnia
wyników silnie pozytywnych wyniosła 814 jednostek, umiarkowanie pozytywnych wyniosła 300
jednostek, a negatywnych 72 jednostki. Poniżej znajduje się podsumowanie odchylenia
standardowego oraz współczynnika zmienności dla każdej próbki.
Łącznie
W ramach serii
Pomiędzy seriami
Negatywny
SD
CV
4,7
6,6%
4,7
6,5%
4,6
6,3%
Silnie pozytywna
SD
CV
36
4,5%
35
4,3%
24
3,0%
7
Średnio pozytywna
SD
CV
8,0
2,7%
6,8
2,7%
8,7
2,9%
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in
Immunology 33: 167-239, 1982.
Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA is systemic lupus
erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: 379-390, 1964.
Provost TT, Herrera-Esparza R and Diaz LA: Nucleoprotein autoantibodies in lupus erythematosus.
J. Invest. Dermatol. 85: 133-139, 1985.
Koffler D, et al: Occurence of single-stranded DNA in serum of patients with systemic lupus
erythematosus and other diseases. J. Clin. Invest. 52: 196-204, 1973.
Land A: Evaluation of the simultaneous estimation of antidsDNA and antissDNA antibodies for clinical
purposes. Clin. Exp. Immunol. 31: 472-481, 1978.
Gripenberg M, et al: Assessment of class-specific antibodies against denatured DNA in patients with
systemic lupus erythematosus. J Clin Immunol. 5: 314, 1985.
Maddison PJ, Provost TT and Reichlin M: Serological findings in patients with "ANA" negative
systemic lupus erythematosus. Medicine(Baltimore) 60: 87-94, 1981.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National
Institute of Health, 2007, Fifth Edition
QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc.
Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady):
877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628525POL
Merzec 2011
Wersja 0
8