Rola wiązań specyficznych i niespecyficznych w

Rola wiązań specyficznych i niespecyficznych w

UNIWERSYTET GDAŃSKI
WYDZIAŁ CHEMII
Pracownia studencka
Zakładu Analizy Środowiska
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Ćwiczenie nr 3
Rola wiązań specyficznych
i niespecyficznych w mechanizmie
rozdzielania związków o
właściwościach zasadowych
na fazach odwróconych RP-HPLC
KURS: Zastosowanie chromatografii cieczowej w chemii i ochronie środowiska
Gdańsk, 2016
1
1. Wstęp teoretyczny
1.1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa w normalnym i odwróconym układzie faz
W zależności od polarności faz wyróżnia się chromatografię w normalnym (ang. NP
– normal phase) i w odwróconym układzie faz (ang. RP – reversed phase). Porównanie tych dwóch
układów przedstawiono w Tabeli 1.
Tabela 1. Porównanie układu faz normalnych i odwróconych
Cechy układów
Układ faz normalnych
Układ faz odwróconych
Polarność fazy stacjonarnej
wysoka
niska
Polarność fazy ruchomej
niska-średnia
średnia-wysoka
Typowa faza ruchoma
heptan/CHCl3
CH3OH/H2O
Kolejność wymywania
jako pierwszy wymywany jest
związek najmniej polarny
zmniejszenie
polarności
fazy
ruchomej
jako pierwszy wymywany jest
związek najbardziej polarny
zwiększenie
polarności
fazy
ruchomej
Wzrost
retencji
rozpuszczonych
substancji
Przez normalny układ faz rozumiemy układ, w którym faza stacjonarna jest bardziej
polarna niż faza ruchoma. Mechanizm rozdzielania analitów w NP-HPLC jest oparty
na procesach adsorpcyjnych. Tak jak w innych technikach chromatografii cieczowej, rozdzielenie
w NP-HPLC następuje w wyniku konkurencji pomiędzy cząsteczkami analitu
a cząsteczkami fazy ruchomej o miejsca aktywne sorpcyjnie na powierzchni fazy stacjonarnej. Im
silniejsze oddziaływanie analit - faza stacjonarna, tym anality są dłużej zatrzymywane
w kolumnie (tym większa jest ich retencja). Siła adsorpcji wzrasta ze wzrostem polarności
analitów.
Najczęściej stosowaną fazą stacjonarną w NP-HPLC jest krzemionka (Rysunek 1).
Rzadziej używane są inne porowate tlenki np. tlenek glinu. Powierzchnia tych faz stacjonarnych
jest gęsto pokryta grupami hydroksylowymi OH, które powodują, że powierzchnia ta jest silnie
polarna.
H
H
H
O
O
O
O
H
O
O
O
Si
Si
Si
OH
OH
OH
H
Rysunek 1. Struktura krzemionki
Na powierzchni krzemionki występują różne miejsca aktywne. Są to grupy silanolowe
i grupy siloksanowe. Grupy silanolowe występują jako: wolne grupy silanolowe
(o najwyższej zdolności adsorpcyjnej), geminalne (podwójne) grupy silanolowe oraz wicynalne
grupy silanolowe. Struktury i zawartości procentowe tych grup na powierzchni krzemionki
przedstawiono w Tabeli 2.
2
Tabela 2. Struktura i zawartość procentowa grup silanolowych występujących na powierzchni krzemionki
Nazwa grup
silanolowych
Zawartość
procentowa
[%]
Struktura
WOLNE
6 – 19
WICYNALNE
10 – 12
GEMINALNE
60 – 65
Dodatkowo na powierzchni krzemionki zlokalizowane są grupy siloksanowe, stanowiące
20 – 35 % w porównaniu do całkowitej liczby grup silanolowych, które powstają w wskutek
dehydroksylacji grup hydroksylowych.
Faza ruchoma w normalnym układzie faz składa się z niepolarnego rozpuszczalnika np.
heksanu, heptanu i niewielkiego dodatku modyfikatora o charakterze polarnym. Typowymi
dodatkami polarnymi są alkohole (np. metanol, etanol). Ich dodatek pozwala na kontrolowanie
retencji analitu w kolumnie. Stosowane rozpuszczalniki, ułożone według wzrastającej polarności
i mocy elucyjnej tworzą tak zwany szereg eluotropowy (Rysunek 2). Ze wzrostem polarności fazy
ruchomej zwiększa się retencja analitów.
Rysunek 2. Szereg eluotropowy rozpuszczalników
3
Normalny układ faz jest rzadziej stosowany niż odwrócony układ faz. Spowodowane jest
to znaczną hydrofilowością polarnej fazy stacjonarnej w NP-HPLC, która silnie adsorbuje wodę
znajdująca się w niewielkich ilościach w rozpuszczalnikach, co prowadzi do zmian właściwości
wypełnienia kolumny i ostatecznie dezaktywacji jej powierzchni. Takie procesy nie zachodzą na
fazie stacjonarnej w odwróconym układzie faz, co znacznie wydłuża żywotność kolumny.
Faza stacjonarna w RP-HPLC ma charakter bardziej hydrofobowy w stosunku do fazy
ruchomej. Jako fazę ruchomą stosuje się mieszaninę wody i rozpuszczalnika organicznego
w niej rozpuszczalnego, np. metanolu czy acetonitrylu. Również tutaj siłę wymywającą
rozpuszczalnika można określić posługując się szeregiem eluotropowym (Rysunek 2). Natomiast
jako fazę stacjonarną używa się najczęściej krzemionkę zmodyfikowaną grupami alkilowymi alifatycznymi bądź aromatycznymi. Ogólnie przyjęte jest, że mechanizm rozdzielania w RPHPLC
oparty
jest
na
oddziaływaniach
hydrofobowych,
które
wynikają
z istnienia sił odpychających/przyciągających pomiędzy polarnym eluentem, względnie
niepolarnym analitem i niepolarną fazą stacjonarną. RP-HPLC posiada wiele zalet w porównaniu
do NP-HPLC. Należą do nich m.in.:
1)
zdolność rozdzielenia związków o szerokim zakresie polarności,
2)
niższy koszt faz ruchomych,
3)
szybsze ustalenie stanu równowagi fazy ruchomej w kolumnie,
4)
możliwość separacji związków jonowych i jonizowalnych przez użycie odczynników
tworzących pary jonowe,
5)
szybsze analizy i wyższa ich powtarzalność.
Odwrócony układ faz ma także pewne ograniczenia. Dla wielu faz związanych, stabilność
wypełnienia kolumny utrzymuje się tylko w zakresie pH od 3 do 8 (związane jest
to ze stabilnością krzemionkowego szkieletu złoża oraz chemicznie związanych modyfikatorów
jego powierzchni). Kolejną wadą jest obecność resztkowych grup silanolowych na powierzchni
krzemionki, co wynika z niepełnego przereagowania grup hydroksylowych krzemionki
z odczynnikami alkilującymi. Może to powodować wydłużenie czasów retencji analitów
i niepowtarzalność wyników uzyskanych na różnych kolumnach z powodu silnej adsorpcji
substancji badanej oraz asymetrię pików, szczególnie związków o charakterze zasadowym
w formie sprotonowanej. W przypadku ogonowania piku współczynnik asymetrii przekracza
graniczną wartość symetryczności piku (równą 1,15). Natomiast w przypadku rzadziej
występującego zjawiska przodowania piku wartość ta jest niższa od 0,95.
Poszerzanie i ogonowanie pików w chromatografii powoduje m.in. niejednorodność fazy
stacjonarnej. Wynika to z obecności na jej powierzchni dwóch miejsc adsorpcji, różniących się
szybkością kinetyki (przenoszenia masy próbki) oraz procesu adsorpcji-desorpcji.
Na powierzchni fazy stacjonarnej występuje kilka silnych miejsc o dużej energii adsorpcji
(zjonizowane silanole) w obecności dużej liczby miejsc o małej energii adsorpcji (hydrofobowe
ligandy). Sprotonowane formy analitów o charakterze zasadowym silniej oddziałują
ze zjonizowanymi silanolami niż za pomocą oddziaływań hydrofobowych z ligandami fazy
stacjonarnej. W momencie wzrostu ilości substancji następuje nasycenie miejsc
wysokoenergetycznych, wówczas substancja adsorbuje się w miejscach niskoenergetycznych.
Biorąc pod uwagę obecność silnych i słabych miejsc adsorpcji ogonowanie pików może wynikać
ze znacznie wolniejszego procesu sorpcji-desorpcji cząsteczek analitów z silnych miejsc adsorpcji
w porównaniu do słabych miejsc. W celu ujednolicenia energetycznie powierzchni fazy
4
stacjonarnej, czyli dążenia do występowania jednego rodzaju oddziaływań dodaje się
do fazy ruchomej m.in. ciecze jonowe czy aminy, oddziałujące z miejscami sorpcyjnie aktywnymi.
W wyniku tego, desorpcja substancji rozpuszczonej z powierzchni fazy stacjonarnej następuje z
taką samą szybkością, powodując poprawę kształtu pików.

Innymi źródłami ogonowania lub niesymetryczności pików mogą być m.in:
Niewłaściwie zapakowane czoło kolumny - może powodować rozdwajanie pików

Zbyt duża siła elucyjna rozpuszczalnika próbki

Zanieczyszczone czoło kolumny

Wiek kolumny

Przebicie kolumny - zmiany kształtu spowodowane mogą być także tym, iż każda kolumna
posiada określoną pojemność sorbcyjną (tj. ilość półek teoretycznych dla dalej substancji), zbyt
duże objętości nastrzyku lub zbyt duże dozowane stężenia powodują, że kolumna jest
przeładowana

Obecnością martwych objętości w kolumnie oraz złe podłączenie kolumny do drenów

Zbyt krótki okres kondycjonowania kolumny - wpływa na odtwarzalność kształtu sygnałów,
podobnie jak jednorodność przepływu (brak pulsacji w układzie pomp), zmiany składu fazy
ruchomej
1.2.
Fazy stacjonarne zbudowane ze zmodyfikowanej krzemionki
Złoże zbudowane z krzemionki można modyfikować wieloma podstawnikami różniącymi
się polarnością, co uznaje się za główną z jej zalet. Wśród niepolarnych podstawników wymienić
można łańcuchy alkilowe np. C4, C8, C18, C30 (Rysunek 3). Mniej niepolarne są złoża
zmodyfikowane niepolarnymi łańcuchami alkilowymi zawierające polarne grupy takie jak fenyl,
amid, -NH2, -CN, -NO2 (Rysunek 3).
Okazuje się, że nie można całkowicie pokryć grup silanolowych znajdujących się
na powierzchni krzemionki. Grupy hydroksylowe niepodstawione nazywane są resztkowymi
grupami silanolowymi. Ilość takich grup świadczy o jakości wykonania kolumny. Ostatecznie,
zmodyfikowane fazy stacjonarne zawierają najczęściej dwa centra adsorpcji, hydrofobowe grupy
alkilowe bądź arylowe, które mogą zawierać polarne grupy funkcyjne oraz polarne, resztkowe
grupy silanolowe. Właściwości chemiczne faz stacjonarnych na bazie krzemionki
w odwróconym układzie faz są określone przez strukturę związanych z powierzchnią ligandów,
ich długości, gęstości pokrycia (stężenia powierzchniowego), jednorodności pokrycia, mobilności,
ale także przez obecność resztkowych grup silanolowych.
5
Rysunek 3. Różne rodzaje połączeń faz stacjonarnych używanych w chromatografii cieczowej: (A) grupa
oktadecylowa, (B) grupa oktylowa, (C) grupa fenylo-propylowa, (D) grupa amino-propylowa, (E) grupa Nacyloamidowa, (F) cholestero-amidowa
Fazy stacjonarne w odwróconym układzie faz traktowane są jako system trójwymiarowy,
do których wnętrza substancje rozpuszczone i składniki fazy ruchomej mogą przenikać na różną
głębokość. Proces ten jest uzależniony od wielkości i struktury związanych z nimi ligandów.
W strukturze fazy stacjonarnej wyróżnia się dwa rodzaje miejsc o właściwościach aktywnie
sorpcyjnych, które są określone na podstawie rozkładu energii (Rysunek 4). Miejsca
wysokoenergetyczne są najprawdopodobniej ośrodkami głęboko ukrytymi w warstwie związanej
z grupami alkilowymi, więc ich dostępność jest kontrolowana przez wielkość tych cząsteczek.
Mniejsze substancje rozpuszczone mogą przenikać głębiej wewnątrz warstwy związanej niż
większe. Miejsca niskoenergetyczne występują na granicy łańcuchów alkilowych i fazy ruchomej.
Rysunek 4. Występowanie miejsc nisko- i wysokoenergetycznych na zmodyfikowanej krzemionce
6
1.3. Mechanizm retencji na fazach RP
Zatrzymywanie (retencja) analitu w kolumnie zależy od siły jego oddziaływania z fazą
stacjonarną wypełnienia kolumny chromatograficznej. W Tabeli 3 znajduje się opis
podstawowych oddziaływań, których suma ma pływ na czas retencji analitu. Zostały one także
przedstawione graficznie na Rysunku 5.
Tabela 3. Oddziaływanie cząsteczkowe w RP-HPLC
Oddziaływanie cząsteczkowe
Wkład do RP
Dyspersyjne, hydrofobowe
Oddziaływanie specyficzne dla układu RP. Występuje
pomiędzy hydrofobowymi elementami cząsteczki
analizowanej a łańcuchami alkilowymi, które wprowadzono
na szkielet krzemionkowy kolumn typu C18 czy C8. Im jest
silniejsze tym większa jest retencja analitu, stąd przybliżoną
retencję można przewidzieć znając wartości log P
mieszaniny analitów.
Oddziaływania pi-pi,
Występujący gdy cząsteczka oznaczana posiada wiązania
aromatyczne
nienasycone, w tym aromatyczne i gdy faza stacjonarna
posiada wbudowane grupy fenolowe
3. Wiązania wodorowe (charakter Występują w przypadku gdy analit może być donorem lub
kwasowy)
akceptorem wodoru i gdy faza stacjonarna posiada grupy
funkcyjne, które takimi donorami lub akceptorami mogą
być
4. Oddziaływania dipol-dipol
Obserwowane gdy faza stacjonarna posiada specyficzne
(charakter zasadowy)
grupy funkcyjne
Oddziaływania jonowe
Oddziaływania niespecyficzne dla RP-HPLC (pierwotne
dla faz normalnych) pomiędzy analitem a fazą stacjonarną
w przypadku gdy faza posiada dużą gęstość resztkowych
grup hydroksylowych. Wiązanie to należy usuwać /
supresować, gdyż negatywnie wpływa na retencję
związków o właściwościach zasadowych.
Oczywiście na retencję analitu wpływa znacznie więcej czynników, takich jak rodzaj
modyfikatora organicznego, rodzaj dodatku do fazy ruchomej i jej pH, sprawność układu i jego
parametry (przepływ, rodzaj i rozmiary kolumny, temperatura).
7
Rysunek 5. Przykłady modyfikacji krzemionki i ich polarność
1.4. Supresja resztkowych grup silanolowych
W celu dezaktywowania grup silanolowych stosuje się proces określany w języku
angielskim jako end-capping, natomiast w polskim jako zabezpieczanie resztkowych grup
silanolowych. Jest to proces, w którym resztkowe grupy silanolowe są przekształcane
w znacznie mniej polarne grupy funkcyjne. Wpływa to na zmniejszenie wtórnego ich
oddziaływania z cząsteczkami polarnymi analitów. Oddziaływania silanolowe prowadzą
do asymetrii piku, niskiej wydajności kolumn i nieodtwarzalności retencji. Proces end-capping
zmniejsza ogonowanie pików na chromatogramach analiz polarnych analitów. Najczęściej
stosowanymi czynnikami chemicznymi używanymi w celu blokowania wolnych grup
silanolowych są trimetylochlorosilan (TMCS) i heksametylodisilazan (HMDS), wprowadzające
ugrupowania trimetylosililowe (TMS) (Rysunek 6).
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Si
O
Si
O
O
O
H2
H2
H2
C
CH3
C
C
CH3
Si C
C
C
C
H2
H2
H2
2
CHH
3
H
CH3
wprowadzony ligand (TMS)
Si CH3
CH3
H2
H2
H
H2
CH3
CH3
C
C
C
C
C
Si
C
C
H2
H2
H2
2
CHH
3
H2
H
H2
H2
CH3
C
C
CH3
C
Si C
C
C
C
H2
H2
H2
2
CHH
3
H CH
H2
H2
H2
3
C
C
CH3
C
Si
C
C
C
C
H
2
H
H
H
2
2
2
H CH3
H
Rysunek 6. Powierzchnia krzemionki z zabezpieczonymi grupami silanolowymi poprzez wykorzystanie TMCS lub
HMDS
Oszacowano, że efektywność procesu end-capping wynosi 50 %, co oznacza,
że następuje zablokowanie tylko około 50 % ilości resztkowych grup silanolowych. Innym
sposobem tłumienia oddziaływań pomiędzy analitem a resztkowymi grupami silanolowymi jest
8
dodatek do fazy ruchomej alkiloamin, takich jak: trietyloamina (TEA), dimetylooktyloamina
(DMOA), cykloheksyloamina, czwartorzędowe jony amoniowe, czy rzadziej dwuwartościowe
kationy lub po prostu – amoniak.
Na Rysunku 7 przedstawiono przykładowy wpływ dodatku TEA i zmiany pH na czas
retencji i symetrię pików związków z grupy pochodnych fenyloetyloamin.
Rysunek 7. Chromatogram HPLC-UV/Vis rozdziału związków zasadowych (1. fenylopropanoamina, 2. efedryna, 3.
amfetamina, 4. meta-amfetamina, 5. fenteramina) w kolumnie typu C8 (4.6x150mm, 5 µm) z zastosowanie fazy nośnej
85 % buforu fosforanowego 10 mM i 15 % ACN oraz jej modyfikacji
1.5. Teoria półek teoretycznych
W chromatografii podziałowej rozdzielanie składników próbki jest wynikiem ich różnej
rozpuszczalności w fazach chromatograficznych. Dla zobrazowania procesu podziału przyjmuje
się, że kolumna chromatograficzna składa się z wielkiej ilości połączonych ze sobą sekcji, czyli
tzw. półek teoretycznych. Termin ten został zaczerpnięty z teorii destylacji i ma wymiar
całkowicie teoretyczny. Pod pojęciem półki teoretycznej rozumiemy taką objętość kolumny,
w której zostaje osiągnięty stan (dynamicznej) równowagi pomiędzy stężeniem związku w fazie
stacjonarnej, a jego stężeniem w fazie ruchomej.
Sprawność kolumn chromatograficznych decyduje o tym, czy uzyskane piki są wąskie czy
szerokie. Sprawność kolumn zależy od liczby półek teoretycznych (N) w danej kolumnie.
Im więcej półek teoretycznych, tym kolumna jest sprawniejsza i uzyskane piki rozdzielanych
substancji są węższe.
9
Liczba półek teoretycznych zależy od długości kolumny L oraz od wysokości pojedynczej półki
H:
N = L/H
gdzie:
N – liczba półek teoretycznych,
L – długość kolumny,
H – wysokość równoważna półce teoretycznej, inaczej oznaczana WRPT
Im większa jest wysokość półki teoretycznej, tym mniej półek teoretycznych znajduje się
w danej kolumnie i tym mniej sprawna jest kolumna, co powoduje, że uzyskane piki rozdzielanych
substancji są szersze.
Liczbę półek teoretycznych, czyli sprawność kolumny można wyznaczyć bezpośrednio
z chromatogramu przy użyciu substancji testowej. Substancją testową może być związek,
dla którego współczynnik retencji k mieści się w granicach od 5 do 10. Pik substancji testowej
powinien być symetryczny. Liczbę półek teoretycznych w kolumnie wyznacza się
z następujących zależności:
𝑡𝑅 2
𝑁=( )
𝜎
2
𝑡𝑅
𝑁 = 5,54 (
)
𝑊1/2
𝑡𝑅 2
𝑁 = 16 ( )
𝑊𝐵
gdzie:
𝞼 – odchylenie standardowe krzywej Gaussa (szerokość piku na wysokości równej 0,882 h),
W1/2 – szerokość piku w połowie jego wysokości,
WB – szerokość piku przy podstawie.
Wszystkie wielkości mierzone są w jednostkach czasu i wyznaczane bezpośrednio
z chromatogramu (Rysunek 8). Liczba półek teoretycznych jest oczywiście wartością
bezwymiarową.
Rysunek 8. Sposób wyznaczania wartości niezbędnych do obliczenia sprawności kolumny
10
Efektywną liczbę półek teoretycznych w kolumnie wyznacza się z następujących zależności:
2
𝑁𝑒𝑓
𝑡𝑅 − 𝑡𝑀
= 5,54 (
)
𝑊1/2
𝑘 2
𝑁𝑒𝑓 = Nx (
)
1+𝑘
Sprawność rozdzielenia jest wyrażana także rozdzielczością pików. Rozdzielczość pików określa
rozdzielenie dwóch pików z uwzględnieniem ich średnich szerokości na linii podstawy.
Rozdzielczość pików liczy się z następującego wzoru:
𝑅𝑆 =
2(t R2 − t R1 )
WB1 + WB2
gdzie:
RS – rozdzielczość pików, nazywana też zdolnością rozdzielczą kolumny,
tR1 – czas retencji substancji 1,
tR2 – czas retencji substancji 2, przy czym tR2 > tR1,
WB1 – szerokość piku 1 na linii podstawy,
WB2 – szerokość piku 2 na linii podstawy.
2. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z mechanizmem rozdzielania w RP-HPLC na przykładzie
leków o właściwościach zasadowych, sposobami supresji oddziaływań niespecyficznych
i tworzeniem par jonowych.
3. Część doświadczalna
Przed przystąpieniem do ćwiczenia i włączeniem chromatografu należy sprawdzić jego stan objętość zlewek i faz ruchomych. Dreny A i B powinny być włożone odpowiednio do butli
z wodą i acetonitrylem a pozostałe dreny zanurzone w mieszaninie woda-metanol (1:1).
Odpowiednimi przyciskami należy włączyć pompy i detektor UV/Vis i poczekać na
ustabilizowanie się detektora. W tym czasie można włączyć komputer i program zbierający dane.
Następnie należy wykonać odgazowanie systemu, tj. okręcić odpowiedni zawór na pompie i
włączyć przycisk purge. Poczekać na automatyczne wyłączenie się opcji purge. W tym czasie,
sprawdzić aktualne pH pozostałych faz ruchomych niezbędnych do ćwiczenia (Tabela 4)
a następnie należy je wstawić na 10 min do łaźni ultradźwiękowej w celu odgazowania.
Tabela 4. Skład oraz wartość pH składnika A faz ruchomych
Nr fazy
1
2
3
4
5
Składnik A fazy ruchomej
H2O + 10 % ACN
H2O + 10mM octanu amonu + 10% ACN
H2O + 10mM octanu amonu + kwas octowy + 10% ACN
H2O + 10 mM TEA + kwas octowy + 10 % ACN
H2O + 10 mM heksafluorofosforan amonu +10 % ACN
11
pH fazy
Wzorce oznaczanych leków (Tabela 5) powinny znajdować się w lodówce. Do analiz HPLC
należy wykorzystać stężenie 10 µg/ml. Jeśli w wialce nie będzie wystarczającej objętości należy
wykonać odpowiednie rozcieńczenie wykorzystując stężenia 100 µg/ml pojedynczych leków.
Podobnie w przypadku niewystarczającej objętości faz ruchomych należy, po konsultacji
z prowadzącym, przygotować odpowiednią ich ilość.
Tabela 5. Struktura i właściwości badanych trójcyklicznych antydepresantów (TCA)
Związek
Struktura
pKa
log Ko/w
9,3
4,3
9,4
4,8
9,5
5,2
O
Doksepina
N
CH3
CH3
N
Imipramina
N CH3
CH3
Klomipramina
N
Cl
Cl
N CH3
CH3
Trójcykliczne antydepresanty (ang. TCA - Tricyclic Antidepressants) należą do klasy leków
przeciwdepresyjnych. Ich działanie polega na blokowaniu wychwytu noradrenaliny i serotoniny
w wyniku czego zwiększają poziom tych neuroprzekaźników. Poprzez przywrócenie równowagi
tych neuroprzekaźników w mózgu, TCA łagodzą stan depresyjny. Dodatkowo powodują
uspokojenie i blokują działanie histaminy. Trójcykliczne antydepresanty wpływają również na
działanie acetylocholiny, substancji chemicznej w mózgu, która wpływa na ruch mięśni i funkcje
organizmu m.in. trawienie.
Wyjściowymi parametrami analizy HPLC jest przepływ 1 ml/min, stosunek fazy A (H2O + 10 %
ACN) do B (ACN) równy 65 do 35, analityczna długość fali 254 nm. Po upewnieniu się, że takie
warunki są wprowadzone w systemie, należy włączyć pompę. Po ustabilizowaniu się linii bazowej
na podglądzie sygnału detektora (po ok. 10 min od włączenia systemu) należy wykonać analizę
mieszaniny TCA dozując 10 µl próbki. Próbkę pobierać odpowiednią strzykawką, którą po
zadozowaniu należy przemyć specjalnie przygotowanym metanolem. Konieczne jest także
możliwe szybkie zakręcenie wialki z badanych roztworem.
Po wykonaniu oznaczenia należy zbadać ten sam roztwór z zastosowaniem pozostałych czterech
faz ruchomych. Przy każdej podmianie butli należy wykonać „purge” i odczekać min. 20 min na
12
skondycjonowanie systemu. Należy także określić czasy retencji analitów z zastosowaniem
wybranej fazy ruchomej. Po zakończonych analizach należy powrócić do pierwotnej fazy
i wypłukać kolumnę. Ostatecznie, należy zgrać uzyskane chromatogramy, wyłączyć przepływ
na pompie, poczekać aż ciśnienie spadnie do wartości bliskiej zeru, wyłączyć ją, detektor oraz
komputer i monitor.
4. Wymagania do ćwiczenia i raportu
Przed przystąpieniem do ćwiczenia należy przygotować się z zagadnień zawartych w części
teoretycznej instrukcji oraz:
- wartość stałej dysocjacji kwasowej i zasada „pH 2”
- rodzaje wiązań międzycząsteczkowych
W raporcie należy przedstawić i odpowiednio opisać uzyskane chromatogramy, policzyć liczbę
półek teoretycznych dla każdego z analitu i każdej fazy ruchomej, a także rozdzielczość dla dwóch
dowolnych analitów. Należy także odpowiedzieć na pytania:
- dlaczego anality wychodzą z kolumny w określonej kolejności?
- czy na ich oznaczanie ma wpływ pH fazy ruchomej? narysować dysocjację kwasową
klomipraminy i wskazać jaką ma postać zjonizowania w pH 4, 9 i 11
- czy dodatek TEA jako supresanta był dobrym rozwiązaniem?
- czy anality wytworzyły pary jonowe w anionem PF6-? jak to wpłynęło na ich retencję?
- które oddziaływania miały wpływ na retencję TCA w kolumnie C18?
- wskazać która faz ruchoma była najlepsza do analizy TCA i dlaczego.
5. Spis szkła i odczynników
- strzykawka mikrolitrowa 50 µl razem z opakowaniem
- buteleczka z rozpuszczalnikiem do przepłukiwania
- 5 butli 1 L na fazy ruchome
- cylinder miarowy na 1000 ml
- łaźnia ultradźwiękowa
- do przygotowania faz: kwas octowy, octan amonu, trietyloamina, heksafluorofosforan amonu
- acetonitryl czystości HPLC
6. Literatura
- Techniki separacyjne, Piotr Stepnowski, Elżbieta Synak, Beata Szafranek, Zbigniew
Kaczyński, Wydawnictwo Uniwersytetu Gdańskiego, 2010
- Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych, Zygfryd Witkiewicz, Wydawnictwo
WNT, 2013
- opracowania własne
13