Ćwiczenie 2

KATEDRA
INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ
INSTRUKCJE ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH
Ćwiczenie nr 2
Przedmiot: Techniki Rozdzielania Mieszanin
Kierunek studiów: Biotechnologia, semestr VI, studiów I-go stopnia
Opracowali:
Zatwierdził:
mgr inż. Anita Skrzypczak
prof. dr hab. inż. Marian Kamiński
mgr inż. Joanna Głazowska
Gdańsk, 2014
Spis treści
1.
Wprowadzenie .................................................................................................................... 3
2.
Chromatografia w normalnych układach faz (NP) ............................................................. 3
2.1. Fazy stacjonarne stosowane w NP .................................................................................. 3
2.2. Fazy ruchome w NP ........................................................................................................ 4
2.3. Mechanizm retencji w NP ............................................................................................... 6
3.
Chromatografia w układzie faz odwróconych .................................................................... 6
3.1. Fazy stacjonarne stosowane w RP................................................................................... 6
3.2. Fazy ruchome w RP ........................................................................................................ 8
3.3. Mechanizm retencji ......................................................................................................... 9
4.
Chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC) ..................................................... 10
4.1. Fazy stacjonarne w HILIC ............................................................................................ 11
4.2. Fazy ruchome w HILIC ................................................................................................. 13
4.3. Mechanizm retencji ....................................................................................................... 13
5.
Test kolumny chromatograficznej .................................................................................... 15
6.
Wymagania do sprawdzianu ............................................................................................. 16
7.
Przebieg ćwiczenia............................................................................................................ 16
8.
Wymagania do sprawozdania ........................................................................................... 22
9.
Literatura ........................................................................................................................... 22
1. Wprowadzenie
Chromatografia jest przede wszystkim techniką rozdzielania substancji. Po zastosowaniu
detektora, spełniającego rolę przepływowego instrumentu pomiarowego staje się techniką
analityczną. Szczególna zaletą chromatografii cieczowej jest ogromnie szeroki zakres
uniwersalności, jako techniki rozdzielania. Można ją zastosować do analizy mieszanin prawie
wszystkich substancji, zarówno lotnych i nielotnych, jak również termicznie trwałych i
nietrwałych.
2. Chromatografia w normalnych układach faz (NP)
Normalne układy faz (NP – ang. Normal Phase) to układy chromatograficzne, w których faza
stacjonarna wykazuje wyższą polarność, niż faza ruchoma.
2.1. Fazy stacjonarne stosowane w NP
W normalnych układach faz możemy wyróżnić dwa najczęściej występujące rodzaje
sorbentów stosowanych, jako fazy stacjonarne: tlenki nieorganiczne tj. żel krzemionkowy
(tlenek krzemu), tlenek glinu, tlenek cyrkonu tlenek tytanu lub inne sole nieorganiczne:
siarczan magnezu, fosforan wapnia, glinokrzemiany, sadzę grafitową. Drugą grupę stanowią
sorbenty (najczęściej żel krzemionkowy, rzadziej tlenek cyrkonu, tytanu lub glinu)
modyfikowane, których do powierzchni sorpcyjnej zostają przyłączone podstawniki
zmniejszające polarność całkowitą sorbentu. Najczęściej używanymi modyfikatorami są
związkami chemiczne, posiadającymi polarne grupy: aminową (NH2), nitrową (NO2),
nitrylową (CN), diolową (R(OH)2), amidową (RCONH2); stosowane są również do
specjalnych zastosowań cyklodekstryny.
Żel krzemionkowy jest najczęściej stosowany, jako faza stacjonarna w normalnych układach
faz chromatografii cieczowej. Wynika to z niskiej ceny żelu krzemionkowego, spowodowanej
powszechną obecnością krzemu i jego związków w przyrodzie, wysokiej odporności
mechanicznej (możliwość stosowania w warunkach wysokiego ciśnienia) oraz możliwość
kontrolowania wielkości ziaren i porowatości wypełnienia, co wpływ na duży zakres
zastosowań. Jednak bardzo poważną wadą żelu krzemionkowego jest brak odporności na
wzrost wartości pH powyżej 7 (niska użyteczność do rozdzielania związków o charakterze
zasadowym). Bardziej odporne na wysokie pH fazy ruchomej są fazy na bazie porowatego
tlenku tytanu, cyrkonu bądź glinu (do pH 9,5).
Na aktywność i właściwości powierzchni adsorbentów nieorganicznych istotny wpływ mają
metale, najczęściej żelaza, wapnia, kadmu, sodu, magnezu, potasu, występujące w ilościach
na poziomie śladowych zawartości (0,1-10 ppm). Metale te mają bezpośredni wpływ na
kwasowość powierzchni (wg teorii Lewisa) i w związku z tym dąży się do najwyższego
stopnia ich usunięcia z powierzchni wypełnienia.
2.2. Fazy ruchome stosowane w NP
W normalnych układach faz stosuje się niemieszające się z wodą rozpuszczalniki, jako
pojedyncze ciecze oraz dwuskładnikowe mieszaniny, w których składniki różnią się
polarnością i siłą elucyjną. W niektórych przypadkach stosuje się, jako dodatek do eluentu
polarny składnik np. alkohol (metanol, etanol, propan-2-ol) lub tetrahydrofuran. Znajomość
siły elucyjnej ułatwia dobór fazy ruchomej do rozdzielania mieszanin określonych substancji.
Snyder uporządkował rozpuszczalniki stosowane w chromatografii adsorpcyjnej w kolejności
siły elucyjnej, przypisując im określoną wartość, wyrażaną parametrem ε0 (rys.1) oraz
klasyfikuje rozpuszczalniki do określonych grup na podstawie wartości parametru polarności
P’, który jest sumą trzech składowych: właściwości protonoakceptorowych (xe),
protonodonorowych (xd) i właściwości dipolowych (xn). Wartość tego parametru
charakteryzuje energię oddziaływań fazy ruchomej z powierzchnią adsorbentu. najprościej
pojęcie siły elucyjnej jest określić, jako energię oddziaływania składników fazy ruchomej z
centrami aktywnymi powierzchni fazy stacjonarnej (zgodnie z mechanizmem retencji
charakteryzującym proces rozdzielania w normalnych układach faz – opisanym poniżej)
Wartości siły elucyjnej dla najczęściej stosowanych rozpuszczalników w chromatografii
cieczowej przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1. Wartości siły elucyjnej wybranych rozpuszczalników najczęściej stosowanych w chromatografii
adsorpcyjnej.
Rozpuszczalnik
Siła elucyjna (ε0)
n-pentan
0,00
n-heksan
0,01
czterochlorek węgla
0,11
toluen
0,23
benzen
0,25
chloroform
0,26
dichlorometan
0,30
1,2-dichloroetan
0,32
tetrahydrofuran
0,44
eter tetrbutylowo-metylowy
0,48
aceton
0,50
propan-1-ol, propan-2-ol
0,55
pirydyna
0,55
acetonitryl
0,60
metanol
0,70
kwas octowy
0,91
woda
1,50
Inną miarą określającą przydatność rozpuszczalnika do rozdzielania określonych substancji
jest selektywność. Selektywność można zdefiniować, jako zdolność rozpuszczalnika do
selektywnego roztworzenia (a sorbentu do selektywnego zaadsorbowania) jednego składnika
w porównaniu do drugiego, gdy polarności obu składników są takie same.
Rys.1. Trójkąt selektywności rozpuszczalników wg. Snydera.
Na podstawie parametru polarności P’ klasyfikacja rozpuszczalników do poszczególnych
grup przedstawia się następująco:
I.
II.
etery alifatyczne np. eter metylowo-t-butylowy
alkohole alifatyczne np. metanol
III.
pochodne pirydyny, THF, sulfotlenki
IV.
glikole, kwas octowy, formamid
V.
dichlorometan, 1,2- dichloroetan,
VI.
a) ketony alifatyczne i estry, dioksan, b) nitryle np. acetonitryl
VII.
węglowodory aromatyczne, chlorowane węglowodory aromatyczne, związki nitrowe,
estry aromatyczne, toluen
VIII.
woda, chloroform
2.3. Mechanizm retencji w NP
Do rozdzielnia związków chemicznych w normalnych układach faz, wykorzystywane są
różnice w interakcjach polarnych grup funkcyjnych rozdzielanych składników z polarnymi
centrami aktywnymi, obecnymi na powierzchni fazy stacjonarnej.
Mechanizm retencji opisuje model Snydera-Soczewińskiego zakładający konkurencyjność
oddziaływań między powierzchnią sorbentu (centrami aktywnymi), a cząsteczkami substancji
rozdzielanych i cząsteczkami fazy ruchomej. Polarne cząsteczki rozdzielane oraz faza
ruchoma „współzawodniczą” ze sobą o miejsce na powierzchni fazy stacjonarnej. Są to
oddziaływania natury dyspersyjnej bądź słabe oddziaływania typu dipol-dipol i dotyczą one
przede wszystkim cząsteczek małopolarnych lub niepolanrych. W tych warunkach retencja
wzrasta, gdy spada polarność fazy ruchomej, a polarne anality wykazują większą retencję niż
niepolarne.
Należy pamiętać, że ze względu na duże powinowactwo, nawet niewielkie ilości wody
w fazie ruchomej bądź próbce powodują dezaktywację powierzchni żelu krzemionkowego.
W związku z tym należy, w przypadku chromatografii w układach faz normalnych, unikać
obecności wody.
3. Chromatografia w odwróconych układach faz (RP)
Odwrócone układy faz (ang. Reversed Phase- RP), to układy, w których faza stacjonarna jest
mniej polarna niż faza ruchoma. Układy te stały się obecnie jednymi z najczęściej
wykorzystywanych w analityce oraz zastosowaniach semi- i preparatywnych ze względu na
stosunkowo dużą uniwersalność w porównaniu do faz normalnych; krótki czas
kondycjonowania kolumny („kilka objętości kolumny”); lepsza rozpuszczalność w fazie
ruchomej składników polarnych; a także stosowanie wodnych faz ruchomych, co za tym idzie
mniej toksycznych i tańszych.
3.1. Fazy stacjonarne stosowane w RP
Fazy stacjonarne stosowane w odwróconych układach faz, w chromatografii cieczowej
otrzymuje się najczęściej w wyniku reakcji powierzchniowych grup hydroksylowych żelu
krzemionkowego z odpowiednimi silanami o ogólnym wzorze (R1R2)R3SiCl. Otrzymuje się
w wyniku tej modyfikacji sorbenty z monomeryczną fazą na powierzchni, typu
Si-O-Si(R1R2)R3. Grupy R1 i R2 to przeważnie grupy metylowe, natomiast o własnościach
powierzchni otrzymanego sorbentu decyduje grupa R3. Pozostałe grupy OH po modyfikacji
usuwane są w reakcji z trimetylochlorosilanem (tzw. end-capping). Przykład reakcji
otrzymywania fazy C8 przedstawia rysunek 2. Przykładowe fazy stacjonarne stosowane
w układach faz odwróconych przedstawia tabela 2.
Rys. 2. Schemat otrzymywania żelu krzemionkowego modyfikowanego grupami C8.
Zalety żelu krzemionkowego, jako materiału do produkcji wypełnień kolumn w układach faz
odwróconych to odporność mechaniczna, możliwość sterowania porowatością ziaren, dobra
sprawność kolumn oraz stosunkowo niska cena. Ograniczeniem w stosowaniu wypełnień
Si-O-SiR3 (podobnie jak niemodyfikowanego żelu krzemionkowego) jest ograniczony zakres
wartości pH w którym powierzchnia sorpcyjna wykazuje najwyższą aktywność od 2,5 do 7,5!
Tabela 2. Fazy Stacjonarne stosowane w układach faz odwróconych na bazie żelu krzemionkowego.
Rodzaj modyfikacji
n-alkanami
grupą fenylową
propylonitrylowa lub
podobną
grupą perfluorową
Grupa funkcyjna (R3)
Stosowany skrót
-CH2CH3;
C2
-CH2(CH2)2CH3;
C4
-CH2(CH2)4CH3;
C6
CH2(CH2)6CH3;
C8
-CH2(CH2)16CH3;
C18
-CH2(CH2)xC6H5;
fenylowa
-CH2(CH2)2CN;
nitrylowa
-CH2(CF2)xCF3;
fluoroalkanowa
grupą polarną, np
amidową,
karbaminianową,
-CH2(CH2)2NHCO(CH2)nCH3;
eterową
3.2. Fazy ruchome stosowane w RP
W chromatografii cieczowej w odwróconych układach faz eluent stanowi mieszanina wody
lub odpowiedniej mieszaniny buforowej z rozpuszczalnikami organicznymi mieszającymi się
w dowolnym stosunku z wodą. Najczęściej stosowane rozpuszczalniki organiczne to:
metanol, acetonitryl, oraz rzadziej: izopropanol, tetrahydrofuran, aceton, metoksymetanol lub
2-metoksyetanol. Ze względu na hydrofobowy charakter faz stacjonarnych w odwróconych
układach faz woda lub bufor o odpowiednim pH jest rozpuszczalnikiem o najsłabszej sile
elucyjnej (praktycznie zero), przez co dodatek rozpuszczalnika organicznego do wody
powoduje wzrost siły elucyjnej fazy ruchomej i spadek wartości współczynnika retencji. Faza
ruchoma powinna być dobrana tak, aby współczynnik retencji mieścił się w zakresie
od 1 do 10.
Dodatek kwasu organicznego (najczęściej kwasu trifluorooctowego, octowego, mrówkowego,
siarkowego, solnego lub ortofosforowego) do eluentu powoduje cofnięcie dysocjacji słabych
lub średniomocnych kwasów nieorganicznych i organicznych, przez to zwiększenie ich
hydrofobowości. Zaletą kwasów nieorganicznych (np. ortofosforowego) w stosunku do
organicznych (np. trifluorooctowego, octowego) jest bardzo niski molowy współczynnik
absorbcji w zakresie promieniowania nadfioletowego (niski cut-off). Z kolei kwasy
organiczne dodane do fazy ruchomej powodują znaczne zwiększenie hydrofobowości
polarnych związków organicznych, w wyniku ich solwatacji i tworzenia par jonowych, co
korzystnie wpływa na sprawność i selektywność układu. Dodatkowo cechują się wyższą
lotnością ( w stosunku do kwasów nieorganicznych), co umożliwia łatwiejsze połączenie
takiego układu chromatograficznego ze spektrometrią mas.
Ze względu na niepolarny charakter fazy stacjonarnej nie należy dopuścić do zastosowania
fazy ruchomej o 100% składzie wody lub rozpuszczalnika organicznego. Prowadzi to do
zmiany stopnia zwilżenia(z ang. dewetting) fazy stacjonarnej, co ma istotny wpływ na
właściwości rozdzielcze takiej fazy. Dlatego też zaleca się stosowanie maksymalnie 97 %
stężenia danego składnika – rozpuszczalnika w fazie ruchomej. Ilustrację obrazującą wpływ
zastosowania 100% wody, jako fazy ruchomej przedstawia rysunek 3.
Rys. 3. Ilustracja przedstawiająca zmianę konformacji hydrofobowej fazy stacjonarnej pod wpływem
zastosowanej fazy ruchomej: (A) mieszanina metanol-woda, (B) 100 % woda.
Związki chemiczne i wysokim stopniu hydrofobowości, tj.: witaminy rozpuszczalne w
tłuszczach, lipidy, karotenoidy, polimery syntetyczne w konwencjonalnym układzie RP
wykazują zbyt dużą retencję, przez co nie zostaną wyeluowane nawet przy zastosowaniu
eluentu o składzie 100% acetonitrylu. Z tego powodu niezbędne jest zastosowanie w takim
przypadku niewodnej fazy ruchomej, w której składnikiem A (tym o niższej sile elucyjnej)
będzie acetonitryl lub metanol, a składnikiem B (o wyższej sile elucyjnej) tetrahydrofuran,
aceton, propan-2-ol, chlorek metylenu, eter t-butylowo-metylowy itp. takie powstępowanie
pozwoli na rozdzielenie mieszaniny z oczekiwanym stopniem selektywności oraz umożliwi
elucję składników w rozsądnym czasie, tzn. ostatni eluowany składnik będzie się
charakteryzował współczynnikiem retencji nie wyższym, niż 10.
Należy pamiętać, że w każdym przypadku wybrany eluent powinien być dostosowany do
wykorzystywanego detektora.
3.3. Mechanizm retencji
Przeprowadzone do tej pory badania pozwoliły stwierdzić, iż retencja analitów opiera się
głównie i jest wypadkową oddziaływań typu:




Siły van der Waalsa pomiędzy hydrofobową fazą stacjonarną, a cząsteczkami
analitów;
Siły elektrostatyczne pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej, zawierającej
polarne grupy funkcyjne a cząsteczkami fazy ruchomej.
Siły van der Waalsa pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej i składnikami
fazy ruchomej,
Wiązania wodorowe pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej i składnikami
fazy ruchomej.
Rozdzielane cząsteczki, w przypadku większej hydrofobowości, niż składniki fazy ruchomej,
„wypychane są” w kierunku niepolarnej fazy stacjonarnej, gdzie oddziałują z fazą
stacjonarną. W zależności od budowy oraz obecności i ilości polarnych grup funkcyjnych w
strukturze rozdzielanych cząsteczek energia oddziaływań z fazą stacjonarną większa lub
mniejsza, co w konsekwencji prowadzi do wzrostu, bądź spadku retencji. Siła oddziaływań
pomiędzy fazą stacjonarną, a substancją rozdzielaną zależy od budowy, wielkości i
właściwości fizykochemicznych rozdzielanych cząsteczek. W tym przypadku duże znaczenie
ma długość łańcuchów węglowodorowych, którymi pokryta jest faza stacjonarna. Wraz ze
wzrostem długości łańcuchów zwiększa się retencja rozdzielanych cząsteczek. Właściwość ta
pozwala na rozdzielenie związków będących homologami strukturalnymi (np. węglowodorów
aromatycznych).
Retencja substancji rośnie ze wzrostem:





Stopnia pokrycia powierzchni fazy stacjonarnej związaną fazą organiczną,
Długości łańcucha fazy związanej,
Hydrofobowości grupy funkcyjnej decydującej o charakterze powierzchni sorpcyjnej,
Hydrofobowości substancji rozdzielanych,
Zawartości wody w fazie ruchomej,
Natomiast retencja substancji maleje ze spadkiem


Temperatury, w której prowadzona jest separacja
pH fazy ruchomej stosowanej do rozdzielania
Na kolejność elucji wpływ mają przede wszystkim:


Polarność substancji rozdzielanej (elucja od najbardziej polarnych do najmniej
polarnych),
Miejsca w szeregu homologicznych (od nisko- do wielkocząsteczkowych substancji).
4. Chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC)
Chromatografia
oddziaływań
hydrofilowych
(ang.
Hydrophilic
Interaction
Liquid
Chromatography –HILIC) to technika łącząca w sobie elementy chromatografii normalnych i
odwróconych układów faz oraz wymiany jonowej (rysunek 4).
RP
faza
ruchoma
HILIC
NP
faza
stacjonarna
IEx
analit
Rys. 4. Schemat przedstawiający zależności
zal
pomiędzy HILIC-, a NP-, RP-LC
LC oraz chromatografią
jonowymienną.
Pierwsze doniesienie o zastosowaniu takiego
takieg układu
ładu ukazało się w 1975 roku
roku, jednakże
termin HILIC został wprowadzony dopiero wprowadził w 1990 przez A.J Aplert
Aplert’a.
Jest to alternatywna technika do rozdzielania polarnych substancji,
substancji, początkowo uważana za
specjalny typ chromatografii adsorpcyjnej z wodnym eluentem – wodne układy faz (ang.
aqueous Normal Phase - aNP).
).
4.1. Fazy stacjonarne w HILIC
Jako fazę stacjonarną w chromatografii
hromatografii oddziaływań hydrofilowych
hydrof
można wykorzystać
każdą polarną fazę,, jednakże najczęściej wykorzystuje się żel krzemionkowy, a także żel
krzemionkowy modyfikowany grupami aminowymi, amidowymi, cyjanowymi bądź grupami
hydroksylowymi (faza stacjonarna typu diol) lub polarne polimery. Obecnie stosowanych jest
wiele faz różniących się miedzy
iedzy sobą strukturą i właściwościami (Tabela 3)).
Tabela 3. Zestawienie najpopularniejszych faz stacjonarnych stosowanych w HILIC. (Buszewski i in. 2012)
Nazwa fazy stacjonarnej
Struktura
Żel krzemionkowy
niemodyfikowany
Faza typu Diol
Faza
modyfikowana
grupami
nitrylowymi
Faza
modyfikowana
grupami
aminowymi
Faza alkiloamidowa
Faza mieszana
Faza
modyfikowana
glikolem
polietylenowym
Faza
modyfikowana
cyklodekstrynami
Faza typu ZIC-HILIC
Ze względu na bardzo dużą różnorodność stosowanych faz stacjonarnych możliwe jest
rozdzielanie bardzo
szerokiej
gamy związków
fizykochemicznych.
Nowopowstające
fazy
o
różnią
zróżnicowanych właściwościach
się
charakterystyką
retencji
i selektywnością. Jednakże nie udało się jak do tej pory stworzyć fazy o podobnych
właściwościach do tych stosowanych w chromatografii, w odwróconych układach faz.
Ciekawą fazą stacjonarną jest tzw. ZIC-HILIC (ang. Zwitterionic - amfoteryczna) zbudowana
z sulfobetainy przyłączonej do powierzchni nośnika (żel krzemionkowy lub polimer)
posiadającej zarówno jon dodatki (grupa sulfonowa), jak i ujemny(IVrz. grupa aminowa).
Złoże to charakteryzuje się oddziaływaniami jonowymi z rozdzielanymi substancjami oraz
wodorowymi, poprzez silnie zaabsorbowaną na powierzchni wodę.
4.2. Fazy ruchome w HILIC
W chromatografii oddziaływań hydrofilowych fazę ruchomą stanowią mieszaniny
rozpuszczalników organicznych, takich jak: acetonitryl, metanol, etanol z wodą lub buforem.
Stosowanie buforu ma wpływ na jonizację i polarność analitów, a także poprawia kształt
pików oraz ogranicza ich ogonowanie (z ang. tailling). Stosowanie buforów jest zbędne w
przypadku rozdzielania naturalnie polarnych analitów takich jak cukry. Dodatek soli do fazy
ruchomej zawierającej wysoką zawartość składnika organicznego zwiększa polarność fazy
ruchomej zmieniając jej właściwości rozdzielcze.
Im większa zawartość wody w eluencie tym siła elucji fazy ruchomej wzrasta. W przypadku
stosowania elucji
gradientowej, podczas rozdzielania substancji z
zastosowaniem
chromatografii oddziaływań hydrofilowych, najczęściej rozpoczyna się program od 97%
zawartości rozpuszczalnika organicznego (celem wytworzenia na powierzchni sorbentu
dynamicznie generowanej warstwy wodnej) , a następnie zwiększa się zawartość wody w
fazie ruchomej, co umożliwia wyeluowanie wszystkich składników próbki z kolumny.
4.3. Mechanizm retencji
W chromatografii oddziaływań hydrofilowych główną role odgrywają oddziaływania,
występujące pomiędzy analitami, fazą ruchomą i fazą stacjonarną:

Wiązania wodorowe – tworzone pomiędzy wodorem związku będącego
protonodonorem, atomem będącym protonoakceptorem, może tworzyć się
wewnątrz jednej cząsteczki jak i pomiędzy dwoma różnymi cząsteczkami;

Oddziaływania typu donor-akceptor – tworzone pomiędzy parą cząsteczek,
z których jedna jest donorem elektronu (zasadą Lewisa), a druga elektrono
akceptorem (kwasem Lewisa);

Oddziaływania typu jon-dipol, gdzie jon oddziaływuje z cząsteczką neutralną;

Oddziaływania typu dipol- dipol, oddziaływania pomiędzy dwoma neutralnymi
cząsteczkami, których energia zależy od momentu dipolowego działających na
siebie cząstek, polaryzowalności i stałej dielektrycznej,

Oddziaływania typu dipol-dipol indukowany – oddziaływanie pomiędzy
cząsteczką posiadającą moment dipolowy a cząsteczką niepolarną

Siły van der Waalsa – słabe oddziaływania pomiędzy fragmentami lub
cząsteczkami, zależne od odległości między cząsteczkami, nieprowadzące do
trwałych połączeń;

Oddziaływania hydrofobowe – siły występujące w środowisku wodnym pomiędzy
cząsteczkami o słabym powinowactwie do wody – cząsteczkami hydrofobowymi.
Ze względu na bardzo dużą ilość oddziaływań warunkujących rozdzielenie substancji
w układach HILIC technika ta stwarza szerokie możliwości rozdzielania skomplikowanych
mieszanin. Uważa się, że na powierzchni hydrofilowej fazy stacjonarnej tworzy się
dynamicznie „cienka” warstwa wody zaadsorbowanej z eluentu, Jej grubość zależy od
rodzaju fazy stacjonarnej oraz stężenia wody w fazie ruchomej. Warstwa ta pozwala
polarnym analitom na podział pomiędzy hydrofilową warstwą wodną na powierzchni
stacjonarnej, a mniej hydrofilowym rozpuszczalnikiem (np. acetonitrylem). Cząsteczki
analitów modą oddziaływać z grupami funkcyjnymi fazy stacjonarnej lub rozdzielać się
w zależności od polarności, na cząsteczki pozostające bardziej w fazie organicznej i te
bardziej polarne dyfundujące w głąb wodnej warstewki. Trzeba brać pod uwagę także
możliwość jonowych interakcji rozdzielanych cząsteczek z fazą stacjonarną. Kolejność elucji
substancji może być częściowo odwrotna, niż w RP-HPLC tzn. hydrofilowe związki
wykazują większą retencję niż związki hydrofobowe.
5. Test kolumny chromatograficznej
W celu sprawdzenia poprawności naładowania kolumny oraz okresowej kontroli technicznej,
wykonuje się rozdzielanie testowe, a na podstawie otrzymanego chromatogramu oblicza się
charakterystyczne parametry. Pełny test kolumny powinien opisywać:

sprawność kolumny (N),

przepuszczalność kolumny (Φ),

selektywność kolumny (k, α),

asymetrię pików (As0,1, lub / i As0,5),

impedancję rozdzielania (E),

efekty poza-kolumnowego rozmycia stref (

ocenę przydatności separacyjnej kolumny.
ext),
Należy zapewnić reprezentatywność i dobrą odtwarzalność warunków testu, tzn., wybrać
substancje zdolne charakteryzować różne cechy oddziaływań sorpcyjnych w kolumnie
(charakteryzujące się zróżnicowaną energią oddziaływań, w tym - mogące, w konkretnych
warunkach rozdzielania, być przyczyną asymetrii pików. Wraz z dozowaną mieszaniną
wzorców konieczne jest zadozowanie składnika niewykazującego retencji na badanym złożu.
Może to być odpowiedni związek chemiczny lub powietrze. Przykładowy Chromatogram
testowy przedstawia rysunek 5. Do testowania kolumny powinno się wybrać:

substancje łatwo rozdzielające się o prostej budowie cząsteczek,

niskie stężenie substancji w mieszaninie testującej (w liniowym zakresie izotermy
sorpcji),

małą objętość dozowania (Vi <= 20µl, gdy dc=4 mm, Lc> 100 mm),

warunki dobrej dynamiki układu detektor – rejestrator.
Rys. 5. Schemat przedstawiający przykład chromatogramu testowego oraz sposób
wyznaczenia najważniejszych parametrów kolumny. Mieszanina parabenów (metylowy,
etylowy, propylowy), kolumna: LiChrospher RP18 125 x 4mm, 5m, 100Å, eluent:
metanol:woda 6:4, objętościowe natężenie przepływu 1,5 mL/min, detekcja
spektrofotometryczna w zakresie UV – = 254 nm.
6. Wymagania do sprawdzianu
Na sprawdzianie obowiązuje treść niniejszej instrukcji, jak również odpowiednie, związane
z treścią instrukcji rozdziały książki*. Dodatkowo Student winien być zaznajomiony
materiałem podstawowego kursu Inżynierii Chemicznej i Procesowej oraz Technologii
Chemicznej.
7. Przebieg ćwiczenia
Grupa laboratoryjna zostanie podzielona na trzy podgrupy. Każda z podgrup będzie
samodzielnie wykonywać wybrany moduł ćwiczenia (A, B lub C). Każdy moduł składa się
z dwóch części:
1)
Test kolumny analitycznej
2)
Rozdzielenie wskazanej mieszaniny/ekstraktu wraz z zebraniem odpowiednich
frakcji za pomocą jednego z układów: NP, RP-HPLC lub NILIC.
Każda podgrupa wykonuje test kolumny, na jakiej będzie wykonywane ćwiczenie
w warunkach odpowiednich dla testu, wskazanych przez Prowadzącego. Wynikiem
wykonanego testu jest chromatogram na podstawie, którego podgrupa wykonuje obliczenia
wskazane w pkt. 5 niniejszej instrukcji. Studenci po krótkim wstępie i zapoznaniu z aparaturą
wykonują samodzielnie wskazane rozdzielania oraz zbierają frakcje.
Moduł A
Zadaniem podgrupy jest uzyskanie chromatogramu rozdzielenia składników serwatki
w warunkach RP-HPLC z zastosowaniem detektorów UV-Vis-DAD oraz elucji gradientowej,
a także zebranie frakcji eluatu zawierającego będące obiektem zainteresowania białka
serwatkowe. Warunki prowadzonego rozdzielania przedstawi Prowadzący. Zadaniem
podgrupy jest zadozowanie wskazanej mieszaniny wzorców oraz próbki, a także zebranie
odpowiedniej frakcji.
Dobór w skali modelowej układu chromatograficznego do rozdzielania białek:
- układ faz odwróconych (RP-HPLC)
Materiały i Sprzęt Laboratoryjny
Wzorzec α-laktoalbuminy, acetonitryl o czystości gradient grade, woda dejonizowana,
probówki i fiolki szklane, pipeta automatyczna, strzykawka do HPLC z płaską igłą, naczynie
na ścieki;
Aparatura
Aparat chromatograficzny typu HPLC: pompa z programowanym składem elucji, dozownik
zaworowy, kolumna LiChrospher RP 18e (5μm) 250 x 4 mm, detektor UV-VIS lub UV typu
DAD, integrator albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych.
Warunki rozdzielania i detekcji
W trakcie analizy roztworu wzorcowego α-laktoalbuminy jak i próbki serwatki warunki
prowadzenia rozdzielania (oprócz programu składu elucji) powinny być stale i nie zmienne.
Program elucji: A- acetonitryl, B- woda, 0 min.- A-3%, B-97%, 40 min. – A-95%, B-5%.
Natężenie przepływu fazy ruchomej powinno wynosić 1 mL/min., temperatura pokojowa,
objętość próbki dozowanej do kolumny: 20 μL, długość fali detekcji: 280 nm;
Sposób wykonania:
Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji
1) Ustawić w programie komputerowym początkowy oraz końcowy skład eluentu:
A- acetonitryl, B- woda, 0 min.- A-3%, B-97%, 40 min. – A-95%, B-5% oraz
natężenie przepływu 1 mL/min.
2) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora UV-VIS
typu DAD, powierzchnia
sorpcyjna kolumny „zrównoważona” z początkowym
składem eluentu).
3) Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o
pojemności 20 µL, co najmniej 50 µL próbki w położenie ”load” zaworu. Po
stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych (komunikat „ready
for injection”, znika ikona „klepsydry”- w przypadku stosowania komputerowego
systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny
(„zadozować”, „wstrzyknąć” próbkę, przekręcić zawór w pozycję „inject”).
Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu,
zanotować warunki rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także
wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości.
4) Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji poszczególnych pików.
5) W wyżej opisany sposób wykonać analizę chromatograficzną sporządzonego roztworu
wzorca α-laktoalbuminy. Zarejestrować chromatogramy oraz odczytać czas retencji
piku α-laktoalbuminy.
6) W identycznych jak wcześniej warunkach, które stosowano podczas analizy wzorca αlaktoalbuminy i w taki sam sposób, zadozować do kolumny roztwór próbki serwatki.
7) Zarejestrować chromatogram oraz odczytać czas retencji piku α-laktoalbuminy
rozdzielonej od innych składników serwatki.
Moduł B
Zadaniem podgrupy jest uzyskanie chromatogramu rozdzielenia składników serwatki
w
warunkach
HILIC
z
zastosowaniem
detektorów
UV-Vis-DAD
oraz
elucji
gradientowej/izokratycznej, a także zebranie frakcji eluatu zawierających cukry oraz białka
serwatkowe. Warunki prowadzonego rozdzielania przedstawi Prowadzący. Zadaniem
podgrupy jest zadozowanie wskazanej mieszaniny wzorców oraz próbki, a także zebranie
odpowiedniej frakcji.
Oznaczenie zawartości laktozy w serwatce za pomocą chromatografii oddziaływań
hydrofilowych. Zebranie frakcji eluatu, bogatego w laktozę.
Materiały i Sprzęt Laboratoryjny
Wzorzec laktozy, acetonitryl o czystości do HPLC, woda dejonizowana, probówki i fiolki
szklane, pipeta automatyczna, strzykawka do HPLC z płaską igłą, naczynie na ścieki;
Aparatura
Aparaty chromatograficzne typu HPLC: pompa, dozownik zaworowy, kolumna NH2 (5μm)
250 x 4 mm, detektor refraktometryczny RI, detektor UV-VIS lub UV typu DAD, integrator
albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych.
Warunki rozdzielania i detekcji
W trakcie analiz roztworów wzorcowych laktozy (otrzymanych od prowadzącego) jak i
próbki serwatki warunki prowadzenia rozdzieleń powinny być stale i niezmienne. Skład
eluentu - acetonitryl: woda 85:15, natężenie przepływu fazy ruchomej powinno wynosić
1ml/min., temperatura pokojowa, objętość próbki dozowanej do kolumny: 20 μL.
Sposób wykonania:
Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji
1) Ustawić skład eluent- acetonitryl: woda 85:15, natężenie przepływu fazy ruchomej – 1
mL/min.
2) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora RI oraz
detektora UV-VIS typu DAD, powierzchnia sorpcyjna kolumny „zrównoważona” ze
stosowanym eluentem).
3) Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o
pojemności 20 µL, co najmniej 50 µL próbki w położenie ”load” zaworu. Po
stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych (komunikat „ready
for injection” i znikła ikona „klepsydry”, w przypadku stosowania komputerowego
systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny
(„zadozować – „wstrzyknąć” próbkę, przekręcić zawór w pozycję „inject”).
Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu,
zanotować warunki rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także
wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości.
4) Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji i powierzchnie
poszczególnych pików z detektora RI.
5) *W wyżej opisany sposób wykonać analizy chromatograficzne wszystkich
sporządzonych roztworów kalibracyjnych laktozy. Zarejestrować chromatogramy i
wyznaczyć
powierzchnie
pików
laktozy
dla
poszczególnych
roztworów
kalibracyjnych. Wykonać krzywą kalibracyjną za pomocą programu Microsoft Exel,
wyznaczyć równanie współczynniki a i b z równania y = ax + b
6) W identycznych jak wcześniej warunkach, które stosowano podczas wzorcowania i w
taki sam sposób, zadozować roztwór próbki serwatki o nieznanym stężeniu laktozy
7) Zarejestrować chromatogram i odczytać powierzchnię piku oznaczanej laktozy w
analizowanej próbce serwatki
8) Na postawie uzyskanej krzywej kalibracyjnej wyznaczyć zawartość laktozy w próbce
serwatki wyrażonej w mg/L
W celu uzyskania frakcji laktozy należy, w sposób podany powyżej zadozować próbkę
serwatki, a następnie podczas rozdzielania, na podstawie wyznaczonego czasu retencji
laktozy z próbek wzorcowych, zebrać, w odpowiednim czasie retencji, do przygotowanej
fiolki eluat z kapilary wychodzącej z detektora.
Moduł C
Podgrupa, oprócz wykonania testu kolumny w warunkach układów faz normalnych,
wykonuje rozdzielanie mieszaniny wzorców oraz próbki ekstraktu roślinnego. Warunki
prowadzenia rozdzielania chromatograficznego podane zostaną przez prowadzącego. Podczas
zajęć zastosowana zostanie detekcja UV-Vis-DAD.
Materiały i Sprzęt Laboratoryjny
Roztwory, ekstrakty metabolitów roślinnych, ekstrakty olejów jadanych, strzykawka do
HPLC z płaską igłą, naczynie na ścieki;
Aparatura
Aparat chromatograficzny typu HPLC: pompa z programowanym składem elucji, dozownik
zaworowy, kolumna LiChrospher Si (5μm) 250 x 4 mm, detektor UV-VIS lub UV typu DAD,
integrator albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych.
Warunki rozdzielania i detekcji
W trakcie rozdzielania ekstraktu chlorofili warunki prowadzenia rozdzielania (oprócz
programu składu elucji) powinny być stale i nie zmienne. Faza ruchome: MTBE:nheksan:izopropanol 5:6:6 (v/v). Natężenie przepływu fazy ruchomej powinno wynosić 1
mL/min., temperatura pokojowa, objętość próbki dozowanej do kolumny: 20 μL;
Sposób wykonania:
Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji
1) Ustawić w programie komputerowym natężenie przepływu eluentu.
2) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora UV-VIS
typu DAD, powierzchnia
sorpcyjna kolumny „zrównoważona” z początkowym
składem eluentu).
3) Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o
pojemności 20 µL, co najmniej 50 µL próbki w położenie ”load” zaworu. Po
stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych (komunikat „ready
for injection”, znika ikona „klepsydry”- w przypadku stosowania komputerowego
systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny
(„zadozować”, „wstrzyknąć” próbkę, przekręcić zawór w pozycję „inject”).
Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu,
zanotować warunki rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także
wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości.
4) Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji poszczególnych pików.
5) W wyżej opisany sposób wykonać analizę chromatograficzną pozostałych roztworów.
6) Zarejestrować chromatogram oraz odczytać czas retencji pików rozdzielonych
chlorofili od innych składników ekstraktu.
8. Wymagania do sprawozdania
Sprawozdanie grupy powinno składać się z strony tytułowej, trzech sprawozdań podgrup
wykonanych, oraz wniosków końcowych, sformułowanych po wykonaniu poszczególnych
sprawozdań, podsumowujących całe ćwiczenie. Każde sprawozdanie i jego części powinny
być odręcznie podpisane przez autorów.
Szczegółowe wytyczne i wskazówki dotyczące przygotowania sprawozdania znaleźć można
na
stronie
domowej
Chemiczna/Techniki
Katedry:
zakładka:
Dydaktyka/Przedmioty/Technologia
Rozdzielania/Wytyczne
do
sprawozdań.pdf
(http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/images/data/tch/tch_tr_spr.pdf).
9. Literatura

Snyder
L.R.,
Kirkland
J.J.,
Dolan J.W.
Introduction
to
Modern
Chromatography, Third Edition, Wiley 2010.

Witkiewicz Z., Podstawy chromatografii, WNT-W-wa, wyd. 2000 lub 2005;

Linden JC, Lawhead CL J Chromatogr A 105 (1975) 125.

Alpert A.J., J. Chromatogr. 499 (1990) 177

Buszewski B., Noga S. Anal Bioanal Chem 402 (2012) 231.

*Kamiński M. (ed.) Chromatografia Cieczowa, CEEAM, Gdańsk, 2004
Liquid