WPŁYW MODYFIKACJI pH GLEBY NA LICZEBNOŚĆ

WPŁYW MODYFIKACJI pH GLEBY NA LICZEBNOŚĆ

R OCZNIKI G L E BO Z N A W C ZE TOM LIV N R 1/2 W A R SZ A W A 2003: 3 5 -4 2
GRZEGORZ GORZAŁA*, DOROTA JABŁOŃSKA-GORZAŁA*,
JÓZEF CHOJNICKI**, DARIUSZ GOZDOWSKI***, STEFAN RUSSEL*
WPŁYW MODYFIKACJI pH GLEBY
NA LICZEBNOŚĆ DROŻDŻY OLIGONITROFILNYCH
INFLUENCE OF SOIL pH MODIFICATION
ON THE NUM BER OF OLIGONITROPHILIC YEAST
Zakład Mikrobiologii Rolniczej* i Zakład Gleboznawstwa**,
Katedra Nauk o Środowisku Glebowym; Zakład Szczegółowej Uprawy Roślin***,
Katedra Agronomii, SGGW, Warszawa
Abstract: The effect of modified pH on survival of oligonitrophilic yeast in acid forest soils was
studied. In the experiments soil samples collected from humus horizons of six selected soil profiles
situated in Puszcza Biała Forest were used. In all soil samples maximum capillary capacity of water
and necessary dose of CaO to rise pH to the level of 7 have been determinated. The experiment was
arranged in three replications and consisted of the following treatments: natural soil, limed natural
soil, sterile soil and limed sterile soil. The soil samples, 50 g each, taken from particular combina­
tions were transferred to plastic-pots and inoculated with 1 cm3 suspension of oligonitrophilic yeasts
in saline containing 31- 104 cells. Moisture of soil samples was adjusted to 60% of the maximum
water capacity and maintained to the end of experiment. Yeast survival was measured after 1, 8,
15, 29, 35, and 49 days using the plate method. In all experimental combinations directly after soil
inoculation rapidly decreased the percentage of live yeast cells and after adaptation period it
gradually increased. Liming influenced the growth of oligonitrophilic yeast in a greater degree in
sterile soil than in natural.
Słowa kluczowe: drożdże oligonitrofilne, Lipomyces, pH gleby, gleby leśne, doświadczenie wazo­
nowe.
Key words: oligonitrophilic yeast, Lipomyces, pH of soil, forest soils, pot experiment.
WSTĘP
Gleba jest siedliskiem tysięcy zróżnicowanych pod względem jakościowym i
ilościowym gatunków mikroorganizmów [Alexander 1977]. Według Jonga
[1989] drobnoustroje glebowe stanowią 25% ogólnej biomasy Ziemi. Pomimo
wyizolowania i zidentyfikowania ok. 40 tys. gatunków drobnoustrojów występu­
jących w środowisku glebowym, to tylko nielicznym gatunkom potrafimy przy­
pisać określone funkcje w procesach metabolizmu gleby [Hawksworth, Mound
1991].
36
G. Gorzała, D. Jabłońska-Gorzała, J. Chojnicki,
D. Gozdowski, S. Russel
Środowisko glebowe jest bogatym źródłem licznych gatunków drożdży, wyko­
rzystywanych w biotechnologii [De Mot 1990, Hatano i in. 1991, Holder i in.1989,
Horn i in. 1992, Imai, Kuwatsuka 1989, Jeffries 1990, Kock i in. 1991, Middelhoven i in. 1992, Neujahr 1990, Schisler i in. 1995]. Drożdże oligonitrofilne nie
stanowią odrębnej jednostki systematycznej, a jedynie grupę fizjologiczną wyod­
rębnioną ze względu na ich zdolność do życia w środowisku o minimalnej
zawartości azotu, określaną jako drożdże z rodzaju Lipomyces. Drożdże z rodzaju
Lipomyces rosną w postaci śluzowatych kolonii na bezazotowych podłożach
stałych wykorzystując jony amonowe dyfundujące do podłoża z atmosfery [Kock
i in. 1991]. Drożdże wyizolowane z gleb Puszczy Białej dodatkowo wykazują
zdolność rozwoju w warunkach silnego zakwaszenia środowiska.
Celem niniejszej pracy była ocena wpływu modyfikowanego pH na przeżywalność drożdży oligonitrofilnych w warunkach in vitro.
MATERIAŁ I METODY
Do badań stosowano próbki gleb pobrane z poziomów próchnicznych sześciu
różniących się profili glebowych położonych na terenie Puszczy Białej (tab. 1).
Pobrane próbki z poszczególnych typów gleb po przewiezieniu do laborato­
rium przesiano przez sito o średnicy oczek 1 mm i doprowadzono do stanu
powietrznie suchego. W próbkach tych określono na wstępie maksymalną poje­
mność wodną (PWm) gleb oraz ustalono dawkę CaO potrzebną do podwyższenia
pH do 7,0. Następnie próbki gleby podzielono na 2 części. Jedną część pozosta­
wiono bez zmian (w stanie naturalnym), drugą wyjałowiono w autoklawie. W
kolejnym etapie próbki naturalne i wyjałowione ponownie podzielono na dwie
grupy. Jedną grupę próbek pozostawiono bez zmian, natomiast drugą grupę
potraktowano CaO w celu doprowadzenia pH do 7,0.
Z przygotowanych próbek naważono po 50 g do przepłukanych 75% alkoho­
lem etylowym i naświetlonych promieniami UV plastikowych wazonów. Nastę­
pnie do gleb w poszczególnych wazonach wprowadzono po 1 cm3 zawiesiny w
roztworze soli fizjologicznej zawierającej 31- 104 komórek drożdży oligonitrofil­
nych. Zawiesinę komórek uzyskano spłukując roztworem soli fizjologicznej pię­
ciodniową hodowlę drożdży na podłożu wg Saburouda (glukoza - 40 g, Aminobak
- 10 g, agar - 20 g oraz woda wodociągowa - 1000 ml). Liczba komórek drożdży
oligonitrofilnych w 1 cm3 określono metodą płytkową na podłożu bezazotowym
(K2H P 0 4 - 1g, M gS 04 -7H20 - 0,5 g, C aC 03- 5 g, glukoza - 20 g, mikroelementy
- 1 ml, 15 g agaru oraz woda wodociągowa 1000 ml). Odczyn pożywki doprowa­
dzono do wartości pH 7,0. Do badanych gleb w wazonach dodano określoną
objętość jałowej wody destylowanej w celu doprowadzenia wilgotności do 60%
PWm. Uzyskaną wilgotność gleby utrzymywano do końca trwania doświadczenia
systematycznie uzupełniając ubytki jałową wodą destylowaną. Wazony przykryto
jałową laboratoryjną folią aluminiową ograniczając parowanie gleby. Hodowle
inkubowano w temperaturze pokojowej przez 49 dni. Wszystkie kombinacje
doświadczalne przygotowano w trzech powtórzeniach. Przeży walność drożdży w
glebie inkubowanej w wazonach określano metodą płytkową po 1, 8, 15, 29, 35 i
49 dniach trwania doświadczenia. Z poszczególnych kombinacji pobierano i
odważano określone próbki gleby i zawieszano w jałowej wodzie wodociągowej
przygotowując rozcieńczenia zawiesin glebowych w zakresie od 10_l do 10 .
Pobierano po 1 cm3 poszczególnych rozcieńczeń gleb i wysiewano wgłębnie do
Wpływ modyfikacji pH gleby na liczebność
_______ drożdży oligonitrofilnych _______
37
TABELA 1. Charakterystyka poziomów próchnicznych badanych profili glebowych wykorzysta­
nych w doświadczeniu
TABLE 1. Some physico-chemical properties selected humus horizons of investigated soils profile
Nr
pro­
filu
No.
o f soil
profile
Typ gleby
Soil type
Poziom
gene­
tyczny
Genetic
horizon
Głębokość pH
Depth
H20
[cm]
14
Opadowo glejowa
pseudogley soil
Rdzawa właściwa
rusty soil
Murszowa
muck soil
Glejobielicowa
gley-podzol soil
Gruntowo-glejowa
gley soil
Czarna ziemia
black earth
A
2-16
A
15
21a
33
35
38
[g • kgJ ]
С
N
C:N
KC1
4,2
3,7
24,8
1,3
18,51
5-12
3,7
3,0
28,7
1,1
26,82
AM
5-10
5,1
4,6
365,0
20,9
17,46
A
3,5-13
3,3
2,8
63,2
2,8
22,25
A
1-17
4,1
3,4
66,5
6,3
10,44
A
2,5-18
3,8
3,0
17,1
1,1
15,27
podłoża bezazotowego. W celu ograniczenia wzrostu bakterii i innych grzybów
do podłoży dodawano jałowe roztwory cykloheksamidu (50 ppm) i streptomycyny
(50 ppm). Hodowle inkubowano przez 15 dni w temperaturze 28°C. Uzyskane
wyniki opracowano statystycznie metodą analizy wariancji wykorzystując pro­
gram komputerowy Statgraphics. Wyznaczono grupy homogeniczne korzystając
z testu t-Studenta przy poziomie istotności a = 0,05.
WYNIKI I DYSKUSJA
Rozwój drobnoustrojów w środowisku glebowym i ich bioróżnorodność są
warunkowane przez wiele czynników środowiska. Te same gatunki drobnoustro­
jów mogą występować często w drastycznie różniących się warunkach środowi­
skowych [Alexander 1977]. Duży wpływ na liczebność drobnoustrojów w glebie
wywiera zakwaszenie [Widmer i in. 1989, Amato i Ladd 1994]. Badane gleby
leśne charakteryzowały się niskimi wartościami pH (od 3,3 do 5,1). W pracy
przedstawiono badania dotyczące wpływu zmian pH z kwaśnego na obojętne na
przeżywalność w glebach leśnych drożdży oligonitrofilnych.
Analizy wykazały znaczne zmiany w liczebności wprowadzonych do gleby
drożdży oligonitrofilnych w badanych kombinacjach doświadczalnych. Bez
względu na wartość pH po żaszczepieniu gleby drożdżami nastąpił gwałtowny
spadek liczby żywych komórek, a po okresie przystosowania liczba ta stopniowo
wzrastała. Reakcja ta może wynikać z potrzeby adaptacji tych organizmów do
nowych warunków środowiska. W przypadku gleb niejałowionych na zachowanie
drożdży może również mieć wpływ wzajemna konkurencja pomiędzy drobnou­
strojami [Kottler, Alexander 1995, Vishniack 1995]. W dostępnej literaturze nie
G. Gorzała , D . Jabłońska-Gorzała, J. Chojnicki,
D. Gozdowski, S. Russel
38
□ niewapnowana, no limed | wapnowana, limed
о
Czas inkubacji (dni)
Time of incubation (days)
RYSUNEK 1. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró­
chniczym gleby opadowo-glejowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 1. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of pseudogley soil (*mean significant differences are marked with different letters)
znaleziono danych dotyczących wpływu wapnowania gleb na występowanie
drożdży oligonitrofilnych. Wydaje się jednak, że obojętne pH jest czynnikiem
sprzyjającym ich rozwojowi.
W przypadku gleby naturalnej opadowo glejowej (rys. 1) początkowo stwier­
dzono w glebie wapnowanej istotnie wyższą ilość żywych komórek. Następnie
począwszy od 8 dnia do 35 dnia od analizy stwierdzono istotnie niższą liczbę
jednostek tworzących kolonie (jtk) w glebie wapnowanej. W ostatniej analizie (po
49 dniach) nie stwierdzono istotnych różnic w ilości drożdży oligonitrofilnych w
glebach kontrolnych i wapnowanych. W przypadku gleby jalowionej z tego
samego profilu nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy liczebnością w dniu
□ niewapnowana, no limed щ wapnowana, limed
Czas inkubacji (dni)
Time of incubation (days)
RYSUNEK 2. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró­
chniczym gleby rdzawej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 2. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of rusty soil
(*mean significant differences are marked with different letters)
Wpływ modyfikacji pH gleby na liczebność
_______ drożdży oligonitrofilnych _______
39
□ niewapnowana, no limed Iwapnowana, limed
naturalna, natural
jalowiona. sterile
Czas inkubacji (dni)
Time of incubation (days)
RYSUNEK 3. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró­
chniczym gleby murszowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 3. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of muck
soil (*mean significant differences are marked with different letters)
1 i 15 analiz. W pozostałych terminach analizy liczba żywych komórek drożdży
w glebie wapnowanej była istotnie wyższa niż w glebie niewapnowanej.
W glebie naturalnej rdzawej (rys. 2) stwierdzono istotne różnice w liczebności
drożdży oligonitrofilnych w zależności od wapnowania w dwóch ostatnich termi­
nach analiz. W glebie jałowionej natomiast nie stwierdzono istotnego wpływu
wapnowania na liczebność drożdży tylko w pierwszym terminie.
W glebie naturalnej murszowej (rys. 3) istotny wpływ wapnowania stwierdzo­
no we wszystkich terminach analiz z wyjątkiem drugiej analizy. Natomiast w
glebie jałowionej podczas dwóch pierwszych analiz nie stwierdzono istotnych
różnic w liczbie drożdży pod wpływem wapnowania.
C zat Inkubacji (dni)
Tim» of incubation (days)
RYSUNEK 4. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró­
chniczym gleby glejobielicowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 4. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of gley-podzol soil (*mean significant differences are marked with different letters)
40
G. Gorzała, D. Jabłońska-Gorzała, J. Chojnicki,
D. Gozdowski, S. Russel
□ niewapnowana, no limed щ wapnowana, limed
naturalna, natural
ja ło w io n a ,
sterile
Czas inkubacji i (dni)
Time of incubation (days)
RYSUNEK 5. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie
próchniczym gleby gruntowo-glejowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 5. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of gley soil
(*mean significant differences are marked with different letters)
W przypadku gleby naturalnej glejobielicowej (rys. 4) nie stwierdzono istot­
nego wpływu wapnowania na liczebność drożdży oligonitrofilnych we wszystkich
terminach analiz. W glebie jałowionej glejobielicowej wapnowanie zwiększyło
liczebność drożdży począwszy od 3 analizy.
W przypadku gleb naturalnych gruntowo-glejowych (rys. 5) istotnie większą
liczbę drożdży stwierdzono w dwóch pierwszych terminach analiz w glebie
niewapnowanej. W pozostałych terminach nie stwierdzono istotnego wpływu
wapnowania na liczebność drożdży oligonitrofilnych. W glebach jałowionych z
tego samego profilu glebowego istotnego wpływu wapnowania nie stwierdzono
na liczbę drożdży w 8 dniu doświadczenia.
□ niewapnowana, no limed щ wapnowana, limed
naturalna, natural
jałow iona. sterile
Czas inkubacji (dni)
Time of incubation (days)
RYSUNEK 6. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró­
chniczym gleby typu czarna ziemia (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 6. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of black
earth (*mean significant differences are marked with different letters)
Wpływ modyfikacji pH gleby na liczebność
_______ drożdży oligonitrofilnych _______
41
W czarnej ziemi (rys. 6) nie stwierdzono istotnego wpływu wapnowania na jtk
drożdży w terminach pierwszym i drugim analizy w glebie naturalnej oraz drugim
i trzecim w glebie sterylizowanej. W pozostałych terminach zaobserwowano
istotny wpływ wapnowania na jtk drożdży oligonitrofilnych.
Przeżywalność mikroorganizmów introdukowanych do gleby ma związek z
różnymi czynnikami środowiskowymi, takimi jak: zasobność gleby w składniki
pokarmowe, temperatura, odczyn, zasolenie oraz różne biologiczne interreakcje.
Może również zależeć w znacznym stopniu od właściwości fizjologicznych
mikroorganizmów wprowadzonych do gleb [Kottier, Alexander 1995, Vishniack
1995].
Z dostępnej literatury wynika, że drożdże oligonitrofilne wykazują znaczne
możliwości adaptacyjne do zmieniających się warunków środowiska. Z niniejszej
pracy wynika, że również stosunkowo łatwo adaptują się do różnych wartości pH.
Wydaje się jednak, że nasza wiedza o zachowaniu się tych samych drobnou­
strojów w różnych warunkach środowiskowych jest wciąż ograniczona i wyma­
gane są do zrozumienia tego zjawiska dalsze badania naukowe.
WNIOSKI
1. Bezpośrednio po wprowadzeniu do gleby drożdży oligonitrofilnych ich liczebność
spadała gwałtownie, a następnie obserwowano wzrost liczby komórek.
2. Wapnowanie wpłynęło w większym stopniu na liczebność drożdży oligonitrofil­
nych w glebach jałowych niż naturalnych.
LITERATURA
ALEXANDER M. 1977: Introduction to soil microbiology. Wiley J., New York.
AMATO M. , LADD J. N. 1994: Application of the ninhydrin-reactive N assay for microbial
biomass in acid soils. Soil Biol. Biochem. 26: 1109-1115.
DE MOT R. 1990: Conversion of starch by yeasts. [W] Yeast. Biotechnology and biocatalysis,
Verachtert H., De Mot R. (red.), Marcel Dekker, Inc., New York and Basel: 163-196.
HATANO T., KOSAKA M., CUI Z., KAWAGUCHI M., MIYAKAWA T., FUKAI S. 1991:
Purification and characterization of carboxymethylcellulose-degrading enzyme secreted by
yeasts strain newly isolated from soil. J. Fermentation and Bioengineering 71: 313-317.
HAWKSWORTH D. L., MOUND L. A. 1991: Biodiversity of microorganisms and invertebrates:
Its Role in sustainable agriculture. Hawksworth D. L.(red.) CAB Int., Wallingford, UK: 14-29.
HOLDER N. H. M., KILIAN S. G., DU PREEZ J. С. 1989: Yeast biomass from bagasse
hydrolysates. Biol. Wastes. 28: 239-246.
HORN C. H., DU PREEZ J. C., KILIAN S. G. 1992: Protein enrichment of gmin sorgum by
submerged culture of the amylolytic yeast Schwanniomyces occidentalis and Lipomyces
kononenkoae. World J. Microbiol. Biotechnol. 8: 416-422.
IM AI Y., KUWATSUKA S. 1989: Characteristics of paraquat-degrading microbes. J. Pesticide
Sei., 14: 475-480.
JEFFRIES T. W. 1990: Fermentation of D-xylose and cellobiose. [W] Yeast. Biotechnology and
biocatalysis. Verachtert H., De Mot R. (red.), Marcel Dekker, Inc, New York and Basel:
349-381.
JONES D., GRIFFITHS E. 1967: Microbial aspects of soil structure. Plant and Soil 27: 187-200.
JONG S. C. 1989: Microbial germplasm. [W] Biotic diversity and germplasm preservation, global
imperatives. Knutson 1., Stone A. K. (red.), Kluwler Academic Publications, Derdrecht:
241-273.
42
G. Gorzała , D. Jabłońska-Gorzała , J. Chojnicki,
D. Gozdowski, 5. Russel
KOCK J. L. F., COETZEE D. J., VAN DYK M. S., TRUSCOTT M., CLOETE F. G., VAN WYK
V., AUGUSTYN О. P. H. 1991: Evidence for pharmacologically active prostaglandins in
yeasts. S. Afr. J. Sei. 87: 73-76.
KOTTLER B. D., ALEXANDER M. 1995: Survival as a ciriterion for autochthony. Soil Biol.
Biochem. 28: 633-638.
MIDDELHOVEN W., J., KOOREVAAR M., SCHUUR G. W. 1992: Degradation of benzene
compounds by yeasts in acidic soil. Plant and Soil 145: 37-43.
NEUJAHR H. Y. 1990: Yeasts in biodégradation and biodeterioration processes. [W] Yeast
biotechnology and biocatalysis. Verachtert H., De Mot R. (red.): 321-341.
SCHISLER D. A., KURTZMAN C. P., BOTHAST R. J., SLININGER P. J. 1995: Evalution of
yeasts for biological control of Fusarium dry rot potatoes. Am. Potato J. 72: 339-353.
VISHNIACK H. S. 1995: Simulated in situ competitive ability and survival of representative soil
yeast, Cryptococcus albidus. Microbial Ecology 30: 309-320.
WIDMER P., BROOKES P. C., PARRY L. C. 1989: Microbial biomass nitrogen measurements
in soils containing large amounts of inorganic nitrogen. Soil Biol. Biochem. 21: 865-867.
M gr ini. G rzegorz G orzała
Z akład M ikrobiologii Rolniczej,
K atedra Nauk o Środowisku G lebow ym ,
Szkoła Główna G ospodarstw a Wiejskiego,
ul. Rakowiecka 26/30, 02-528 Warszawa.