Zastosowanie krioprezerwacji izolowanych wysp trzustkowych w

&ARM0RZEGL.AUK†
:ASTOSOWANIE KRIOPREZERWACJI IZOLOWANYCH WYSP TRZUSTKOWYCH
WTERAPIICUKRZYCY
!PPLICATIONOFCRYOPRESERVATIONOFISOLATEDISLETSOF,ANGERHANS
IN$IABETES-ELLITUSTHERAPY
!LEKSANDRA-IANOWSKA"ŒA˜EJ'RODNER*AN0ACHECKA
+ATEDRA"IOCHEMIII#HEMII+LINICZNEJ
7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNY
7ARSZAWSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
Streszczenie
Abstract
Celem transplantacji wysp trzustkowych jest osiągnięcie
normoglikemii i poprawa jakości życia chorych z cukrzycą typu 1. Główną korzyścią ze stosowania transplantacji
wysp jest zminimalizowanie komplikacji mikronaczyniowych, które występują u wielu pacjentów pomimo
intensywnej insulinoterapii pozwalającej utrzymać stan
normoglikemii. Odkąd przeszczep izolowanych wysp
trzustkowych stał się jedna z opcji leczenia cukrzycy typu
1 długoterminowe przechowywanie wysp stało się niezbędną procedurą ułatwiającą organizację transplantacji,
bankowanie wysp, immunologiczne dopasowywanie tkanek i przeprowadzenie przeszczepów z wykorzystaniem
wysp pochodzących od wielu dawców. W procedurach
krioprezerwacji dąży się do osiągnięcia możliwie najwyższego odzysku wysp po rozmrożeniu przy jednoczesnym
zminimalizowaniu spadku ich funkcji wydzielniczej.
The purpose of Langerhans islets transplantation is
achieving normoglycemia and life quality improvement
in patients, who suffer from Diabetes Melitus type1. The
main benefit from islet transplantation is minimizing microvascular complications, which occur in many patients
in spite of intensive insulin therapy, maintaining normoglycemia. Since islet transplantation is one of options
diabetes treatment the long-term storage of islets became
indispensable procedure, which can facilitate transplantation proceedings, banking of islets, tissue immunological
matching and performing transplantation with use of islets from many donors. In cryopreservation proceedings
there is a purpose to achieve the highest grade of islets
recovering and to minimize decreasing of their endocrine
function.
Słowa kluczowe: cukrzyca, wyspy trzustkowe, transplantacja, krioprezerwacja
Wstęp
Cukrzyca jest najwcześniej poznaną chorobą układu endokrynnego człowieka. Liczba chorych na cukrzycę w całym
świecie wynosi około 350 milionów, z czego 10% cierpi na
cukrzycę typu 1 [1]. Dzięki odkryciu insuliny w 1922 roku
nastąpiło znaczące obniżenie współczynnika śmiertelności
spowodowanego tą chorobą. Niestety zastosowanie egzogennej insuliny nie zabezpiecza przed takimi odległymi powikłaniami jak retinopatia, nefropatia, angiopatia, neuropatia, które w konsekwencji prowadzą do przedwczesnej utraty
wzroku, schyłkowej niewydolności nerek, choroby naczyń
czy stopy cukrzycowej. Ażeby zminimalizować progresję
tych powikłań konieczne jest utrzymanie pod ścisłą kontrolą
poziomu glikemii [2]. Także u osób, u których rozwinęły się
powikłania, zapewnienie trwałej normoglikemii powoduje
stabilizację, a niekiedy cofanie się zmian morfologicznych
i czynnościowych [3]. Obecnie taki cel może zostać osiągnięty poprzez intensywną terapię składającą się z wielo-
Key words: Diabetes Mellitus, Langerhans islets, transplantation, cryopreservation
krotnych iniekcji insuliny oraz dokładnego monitorowania
glikemii. Jednakże podskórna iniekcja egzogennej insuliny,
pomimo znacznej poprawy czystości i parametrów farmakokinetycznych dostępnych preparatów insuliny i jej analogów nie zapewnia takiej regulacji glikemii jak komórki beta
wysp trzustkowych [2]. W badaniu Diabetes Control and
Complitacions Trial wykazano, że nawet intensywna terapia
cukrzycy nie pozwala na osiągnięcie pełnej normalizacji glikemii i całkowite wyeliminowanie powikłań odległych [4].
Celem niniejszej pracy jest omówienie metod krioprezerwacji i możliwości wykorzystania mrożonych komórek β wysp
Langerhnansa trzustki w terapii cukrzycy typu 1.
Transplantacja izolowanych wysp trzustkowych
jako metoda leczenia cukrzycy typu 1
Alternatywną metodą leczenia cukrzycy typu 1 z poprawą kontroli metabolizmu glukozy lub nawet pełną insulinoniezależnością jest transplantacja izolowanych wysp trzustkowych. Jest ona podobnie efektywna jak transplantacja
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
trzustki narządowej. Wyspy trzustkowe stanowią tylko 2%
masy całej trzustki i tylko one, a nie tkanka egzokrynna są
konieczne do normalizacji glikemii. Zaletami transplantacji
wysp trzustkowych jest bezpieczeństwo i mała inwazyjność zabiegu, który polega na infuzji wysp do żyły wrotnej
w znieczuleniu miejscowym pod kontrolą USG i RTG [2, 5].
Zabieg jest przeszczepem heterotropowym (lokalizuje się
w innym miejscu niż naturalna lokalizacja tkanki) z powodu dużej wrażliwości trzustki na każdą manipulację, które
mogą prowadzić do jej zapalenia z towarzyszącym bólem
i zniszczeniem narządu [1]. Także stosowane dawki immunosupresji są niższe w porównaniu z dawkami stosowanymi
po transplantacji trzustki narządowej z powodu dużo niższej
immunogenności wysp [2]. Warto podkreślić, że wprowadzony przez Shapiro i wsp. protokół immunosupresji oparty
na zastosowaniu sirolimusu, niskich, uważanych za niediabetogenne dawek tacrolimusu i daclizumabu jest wolny od
glukokortykosteroidów, które wywierają hamujący wpływ
na funkcję komórek beta i powodują obwodową insulinooporność [6, 7]. Ponadto nawet w przypadku odrzucenia
przeszczepionych wysp nie ma potrzeby re-operacji i usuwania przeszczepu [2].
Możliwość przeszczepienia wysp trzustkowych rozważa
się w szczególności u pacjentów ze źle wyrównaną cukrzycą typu 1 trwającą co najmniej 5 lat, z częstymi epizodami
hiperglikemii, której towarzyszy kwasica ketonowa oraz
gdy intensywna insulinoterapia prowadzi do zagrażających
życiu stanów hipoglikemii (przynajmniej 2 epizody w przeciągu ostatniego roku wymagające hospitalizacji) lub nie zapobiega szybkiemu narastaniu powikłań odległych. Ponadto
u niektórych chorych pomimo właściwie prowadzonej insulinoterapii bezpieczny poziom glikemii nie zostaje osiągnięty. Innym możliwym wskazaniem są kliniczne i emocjonalne problemy związane z podawaniem egzogennej insuliny.
Kolejną grupą, u których transplantacja wysp trzustkowych
może być korzystnym rozwiązaniem są pacjenci wymagający przeszczepu nerek w przebiegu nefropatii cukrzycowej
[3, 8, 9]. Przyjmuje się, że do zapewnienia pełnej insulinoniezależności konieczne jest przeszczepienie od 8 do 9 tyś.
wysepek na kilogram wagi ciała biorcy. Jednocześnie liczba
przeszczepionych wysp nie powinna przekraczać 600 tys,
stąd ograniczenia dotyczące masy ciała biorcy [3, 5, 9].
Krioprezerwacja wysp trzustkowych
Odkąd transplantacja wysp trzustkowych stała się jedną z opcji leczenia cukrzycy insulinozależnej, następuje
rozwój metod ich izolacji, oczyszczania i krioprezerwacji.
Krioprezerwacja pozwala na przechowywanie materiału
biologicznego dzięki ustaniu procesów biochemicznych
(w temperaturze -130oC) i metabolicznych (w temperaturze -196oC) w komórce, z minimalnych uszkodzeniem ich
funkcji. Opracowano procedury krioprezerwacji pozwalające na długoterminowe przechowywanie wysp oraz bardziej
selektywne pod względem układu HLA(Human Leukocyte
Antigen) dopasowanie bankowanych wysp do HLA biorcy.
Ograniczona ilość wysp, które można pozyskać z izolacji
z jednej trzustki jest zazwyczaj niewystarczająca do zapewnienia insulinoniezależności jednemu biorcy. Krioprezerwacja może być rozwiązaniem zwiększającym ilość wysp
do przeszczepu, ponieważ pozwala na bankowanie wysp od
kilku dawców [10]. Bankowane wysepki mogą stanowić suplement do wysp świeżo wyizolowanych lub poddanych hodowli celem zwiększenia masy komórek β wysp Langerhansa
w przeszczepie. Ponadto wykazano, że krioprezerwacja obniża immunogenność wysp dzięki obumieraniu „leukocytów
pasażerskich”, grupy komórek pochodzących z przeszczepionego materiału odpowiedzialnych za reakcję odrzucania przeszczepu oraz redukcji ekspresji antygenów MHC [11-13].
Rozwiązaniem problemu słabej dostępności ludzkich
narządów do przeszczepu mogłyby być ksenotransplantacje
wysp w szczególności pozyskiwanych ze świń z uwagi na
podobieństwo metabolizmu insuliny i węglowodanów u tych
dwu gatunków. Ryzyko chorób odzwierzęcych mogłoby być
częściowo zredukowane przez wykorzystanie specjalnych
wolnych od patogenów świń, hodowanych w ściśle sterylnych warunkach. Także w tym przypadku krioprezerwacja
wysp świńskich miałaby ważne zastosowanie, ponieważ
podczas długiego przechowywania mogłaby być wykonywana kontrola bakteriologiczna i wirusologiczna. Kriporezerwacja może ułatwić badania nad funkcjonowaniem tych
wysp [12].
Podstawowym problemem krioprezerwacji jest przeżywanie komórek w zakresie temperatur -15 oC do -60 oC.
Ten zakres temperatur komórki poddawane krioprezerwacji przechodzą dwukrotnie, w procesie zamrażania do -196
o
C oraz w procesie rozmrażania. Procedura krioprezerwacji obejmuje cztery etapy. W etapie pierwszym następuje
zrównoważenie z krioprotektantem, który ma za zadanie
zabezpieczyć wyspy przed zniszczeniem podczas zamrażania i rozmrażania. W drugim etapie wyspy są chłodzone do
temperatury poniżej punktu zamarzania, po czym następuje
kontrolowana inicjacja zamarzania zewnątrzkomórkowego
i tworzenia kryształów lodu. W trzecim etapie odbywa się
chłodzenie z szybkością pozwalającą na osiągnięcie stanu
równowagi osmotycznej pomiędzy środowiskiem wewnątrz
i zewnątrzkomórkowym. Ten stan równowagi powinien
zostać osiągnięty raczej przez odwodnienie komórki niż
wytworzenie się wewnątrzkomórkowych kryształów lodu.
W ostatnim etapie wyspy umieszcza się w zbiorniku z ciekłym azotem (-196 oC) celem długoterminowego przechowywania [10, 17].
W drugim etapie następuje zjawisko przechłodzenia,
czyli ochładzania poniżej punktu zamarzania bez zmiany
stanu skupienia z ciekłego w stały. Woda i roztwory wodne
mają silną tendencję do ochładzania poniżej ich punktu topnienia, zanim rozpocznie się proces tworzenia kryształów
lodu i w warunkach kontrolowanych temperatura może zostać obniżona nawet do -40 oC. Gdy rozpoczyna się proces
tworzenia kryształów lodu temperatura gwałtownie wzrasta
do temperatury punktu topnienia i pozostaje względnie stała
(ukryta faza stabilizacji ciepła), po czym obniża się szybko
do temperatury otoczenia. W procesie krioprezerwacji komórek i tkanek występuje silna tendencja do występowania
zjawiska przechłodzenia. W celu uniknięcia niszczących
skutków przechłodzenia na zamrażane komórki formowanie się kryształów lodu w tym postępowaniu jest inicjowane
w sposób kontrolowany[14, 17].
W temperaturze od -5 oC do -15 oC kryształki lodu formują się w medium zewnętrznym, natomiast zawartość ko-
&ARM0RZEGL.AUK
mórek pozostaje niezamrożona i przechłodzona przypuszczalnie z powodu błon biologicznych hamujących wzrost
kryształów lodu w cytoplazmie. Przechłodzona woda
w komórkach ma wyższy potencjał chemiczny niż woda
w częściowo zamrożonym płynie pozakomórkowym i z powodu różnicy tych potencjałów wypływa z wnętrza komórek i zamarza pozakomórkowo. Jeżeli chłodzenie zachodzi
odpowiednio powoli to komórka jest zdolna tracić wodę
odpowiednio szybko poprzez egzoosmozę i stężenie płynu
wewnątrzkomórkowego będzie wystarczające, aby wyeliminować przechłodzenie i utrzymać chemiczny potencjał
wewnątrzkomórkowej wody w równowadze z wodą zewnątrzkomórkową. W wyniku tego komórka ulega odwodnieniu i tworzą się kryształki lodu zewnątrzkomórkowo. Jeśli
natomiast komórka będzie ochładzana zbyt gwałtownie to
nie będzie w stanie tracić wody wystarczająco szybko, aby
utrzymać stan równowagi. Ulega coraz większemu przechłodzeniu i osiąga równowagę dzięki wewnątrzkomórkowemu tworzeniu się kryształków lodu, co w konsekwencji
prowadzi do śmierci komórki. Celem uniknięcia zamarzania
wewnątrzkomórkowego komórki muszą być ochładzane
wystarczająco powoli, aby pozwolić na osiągnięcie stanu
równowagi zanim zostanie osiągnięta temperatura formowania się kryształów lodu. Przeciętnie szybkość chłodzenia
wynosi 1 oC/ min w zakresie temperatur od 0 oC do około
-7 oC, przy której następuje inicjacja tworzenia kryształów
lodu. W zakresie temperatur od -7 oC do -40 – -50 oC szybkość chłodzenia powinna być wolniejsza i wynosić około
0,25-0,3 oC/min [10-12]. Płyn wewnątrzkomórkowy zamarza wolniej niż zewnątrzkomórkowy gdyż jest chroniony przez błony komórkowe. Dlatego na zewnątrz komórki
wytwarza się środowisko bardziej hipertoniczne, co z kolei
nasila egzoosmozę. Utrata zbyt dużej ilości wody wewnątrzkomórkowej również prowadzi do wytrącania się zagęszczonych składników cytozolu, wypadania osadu soli, wysalania białek oraz zmianę pH. Wyznaczenie odpowiedniej
szybkości i stopnia chłodzenia jest kluczowe dla zachowania równowagi. Zbyt szybkie chłodzenie grozi przechłodzeniem i wytworzeniem się wewnątrzkomórkowych kryształów lodu, zbyt wolne prowadzi do śmierci komórki z powodu przedłużających się warunków hipertonicznych [14,17].
Podczas rozmrażania faza stała częściowo się topi i komórki
zawieszają się w roztworze hipertonicznym, który podczas
topnienia ulega stopniowo rozcieńczaniu. Krioprotektanty
i woda mogą być transportowane przez błony komórkowe
i wewnątrzkomórkowe kryształy lodu mogą wtórnie się rozrastać. W większości wypadków szybkie rozmrażanie jest
lepsze. W granicach temperatur od -196 oC do -10 oC ilość
topiącego się lodu jest jeszcze niewielka. Kluczowy dla powodzenia procedury krioprezerwacji jest zakres temperatur
od -10 oC do punktu topnienia [17].
Krioprotektanty
Krioprotektanty charakteryzują się niską masą molową
oraz zdolnością do wnikania do komórek. Należy zaznaczyć, że niektóre krioprotektanty, jak np. glicerol przenikają przez błony komórkowe tylko w temperaturze pokojowej. Swoje cytoprotekcyjne działanie wywierają poprzez
obniżanie temperatury zamarzania i zwiększanie lepkości.
W rozcieńczonych roztworach wodnych takich jak podłoże
hodowlane, przy temperaturze -10 oC na skutek gwałtownego formowania się kryształów lodu, w układzie jonowym następuje wzrost stężenia jonów, nawet do 3M, co
jest oczywiście śmiertelne dla komórek. Krioprotektanty
osiągają swój efekt ochronny na komórki przez zwiększanie
ilości niezamrożonej frakcji w danej temperaturze i w ten
sposób redukują nadmierny wzrost stężenia jonów. Komórki poddawane nawet wysokiemu stężeniu krioprotektanta,
nie ulegają tak silnej destrukcji, jak w obecności wysokich
stężeń jonów. Wszystkie krioprotektanty w takich samych
stężeniach wywierają porównywalne efekty, jednakże skuteczność ochrony zależy od typu komórek, co ma najprawdopodobniej związek ze stopniem ich przepuszczalności
przez błony i różnym stopniem toksyczności na różne typy
komórek [17].
W krioprezerwacji małych organów lub fragmentów
tkanek, takich jak wyspy trzustkowe wymagany jest stosunkowo długi czas równoważenia z powodu trudności w osiągnięciu jednolitej penetracji krioprotektanta do wnętrza komórek. Dlatego ważne jest dobranie takiego czynnika protekcyjnego, który będzie wywierał możliwie najniższy efekt
hamujący na funkcję wydzielniczą wysp. Najczęściej stosowanym krioprotektantem jest dimetylosulfotlenek (DMSO),
choć były też próby wykorzystania glikolu etylenowego
(EG). Wiele badań pokazuje, że DMSO wywiera szereg toksycznych efektów na systemy biologiczne różnych tkanek,
w tym także na wyspy trzustkowe. Warto dodać, że ekspozycja wysp na 2M DMSO w temperaturze 0 oC w zdecydowanie mniejszym stopniu upośledza zdolność wydzielniczą
wysp niż ekspozycja na to samo stężenie DMSO w temperaturze 22 oC. Interesująca wydaje się także perspektywa
użycia EG jako kriporotektanta, ponieważ wykazano jego
relatywnie niską toksyczność na wyspy trzustkowe w szczególności w temperaturze 0 oC [15].
Witryfikacja komórek
W 1985 r. została wprowadzona ultra szybka metoda
zamrażania komórek i tkanek oparta na indukcji zeszklenia
komórek i otaczającego ich środowiska wodnego poprzez
gwałtowne obniżenie temperatury z szybkością 20000 oC/
min. bez tworzenia się kryształów lodu [18] . Witryfikacja
stała się efektywną alternatywną metodą dla techniki kontrolowanego mrożenia w krioprezerwacji ludzkich blastocystów, oocytów oraz tkanki jajnikowej [19]. Technika witryfikacji w odróżnieniu od metody konwencjonalnej wymaga
użycia większego stężenia krioprotektanta od 35 do 40%.
W metodzie kontrolowanego mrożenia stężenie krioprotektanta wynosi zazwyczaj około 10%. W celu uniknięcia
toksycznego wpływu krioprotektanta, komórki przed zawieszeniem w docelowym stężeniu krioprotektanta są równoważone w jego niskim stężeniu. Odwodnienie komórek jest
wymuszane użyciem dodatkowego krioprotektanta o małym
stopniu penetracji i dużej masie molowej (np. sacharoza).
Zaletami tej techniki są łatwość i szybkość wykonania oraz
brak konieczności posiadania specjalistycznego sprzętu
[18]. Pomimo prób wprowadzenia tej techniki do zamrażania izolowanych wysp trzustkowych nie osiągnięto zadawalających efektów w porównaniu z metodą zamrażania
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
konwencjonalnego, a nawet z opracowaną metodą zamrażania niekontrolowanego. Osiągnięty odzysk w metodzie
witryfikacji wynosił 63 % ± 11,0 SE, w metodzie zamrażania kontrolowanego 84%± 1,0SE, w metodzie zamrażania
niekontrolowanego 70% ± 4,0 SE [20].
Żywotność wysp
poddanych procesowi krioprezerwacji
Wiele prac poświęcono badaniom nad rozwojem metod
krioprezerwacji, jako sposobu na zwiększenie masy przeszczepianych wysp. Obecnie metody krioprezerwacji umożliwiają odzysk od 60 do 90% wysp po rozmrożeniu, jednakże w badaniach zarówno in vitro i jak i in vivo obserwuje się
spadek ich funkcji [10]. W teście żywotności z bromkiem
etydyny i oranżem akrydyny odnotowano spadek żywotności szczurzych wysp poddanych krioprezerwacji z 91,7
± 8,5% dla wysp po całonocnej hodowli w RPMI 1640 do
77,5 ± 14,2% dla wysp po hodowli a następnie poddanych
zamrożeniu i rozmrożeniu. Jednocześnie wyspy świeżo wyizolowane, lecz niepodane hodowli wykazywały mniejszą
żywotność (83,2 ± 10,4%) niż wyspy poddane hodowli [21].
W badaniu przeprowadzonym przez Piemontiego i wsp.
[16] odnotowano znaczący spadek ilości całkowitej i ekwiwalentu wysp ludzkich po krioprezerwacji w porównaniu
do świeżo wyizolowanych. Mrożone wyspy utrzymywały
jednak integralność strukturalną oraz nie wykazywały różnic w morfologii [16]. Wyspy szczurze poddane krioprezerwacji wykazują słabszą odpowiedź na stymulację 16,7 mM
roztworem glukozy niż wyspy, które nie były zamrażane,
natomiast wydzielanie insuliny przy podstawowym stężeniu
glukozy (2,8mM) było wyższe w wyspach poddanych krioprezerwacji. Efekt ten można tłumaczyć spadkiem kontroli
sprzężenia zwrotnego wewnątrz komórek lub nieszczelnością systemu błon wskutek odwracalnych zniszczeń poniesionych podczas cyklu mrożenia. Z tego powodu również
większa liczba mrożonych wysp jest potrzebna do zapewnienia normoglikemii u biorcy w porównaniu z wyspami
nie poddanymi krioprezerwacji [11]. Podobnie Piemonti
i wsp. [16] wykazali znacząco wyższą podstawową sekrecję
insuliny w ludzkich wyspach po krioprezerwacji w porównaniu z wyspami świeżymi. Natomiast upośledzona była
odpowiedź wysp na stymulację 16.7 mM glukozą z argininą oraz 16,7 mM glukozą z 3-izobutylo-1-metyloksantyną.
Jednocześnie wykazano wyższą sekrecję cząsteczek proinsulinopodobnych (PLM) w wyspach poddanych krioprezerwacji niż w świeżo wyizolowanych. Poziom cząsteczek
proinsulinopodobnych wyznaczono jako różnicę wartości
otrzymanych z pomocą pomiaru RIA (Radio Immuno Assay)
i MEIA (Microparticle capture Enzyme Immunoassay), która pozwala na oznaczenie insuliny bez reakcji krzyżowych
z cząsteczkami proinsulinopodobnymi [16, 22]. PLM to
kilka typów cząsteczek na szlaku produkcji insuliny z proinsuliny (C-peptyd oraz nienaruszona i częściowo zhydrolizowana proinsulina) wykazujące niską aktywność biologiczną. Podwyższony poziom PLM występuje często w surowicy pacjentów z cukrzycą typu 2 oraz z cukrzycą typu
1 w początkowej fazie choroby [22, 23]. Wysoki poziom
podstawowej sekrecji insuliny oraz cząsteczek proinsulinopodobnych w wyspach po krioprezerwacji świadczyć może
o utracie równowagi w biosyntezie, wewnątrzkomórkowej
degradacji i uwalnianiu insuliny z komórek β. Można także przypuszczać, że uwalnianie insuliny następowało zanim jeszcze zakończył się proces jej dojrzewania [16].
W badaniu przeprowadzonym przez Mendola i wsp. [21]
wykazano, że krioprezerwacja nie jest wystarczającym
czynnikiem mogącym zmniejszyć immunogenność wysp.
Długość życia allogenicznego przeszczepu szczurzych
wysp po krioprezerwacji bez zastosowania immunosupresji była równa z przeszczepem z wysp poddanej tylko
całonocnej hodowli w RPMI 1640 [21].
Długoterminowa hodowla wysp trzustkowych
Długoterminowa hodowla wysp trzustkowych do tej
pory nie była możliwa z powodu obniżenia ich żywotności
i funkcji biologicznych w warunkach prowadzenia hodowli. Ostatnie badania wykazują, jednak, że hodowlę można
znacznie wydłużyć wykorzystując SIS (porcine small intestinal submucosa). SIS jest kolagenowym podłożem pozyskiwanym z jelita cienkiego świni przez mechaniczne
usunięcie warstwy śluzówkowej i mięśniówki gładkiej. Pozostająca półprzeźroczysta 100 μm, pozbawiona komórek
warstwa jest zbudowana z kolagenu, glikoprotein, proteoglikanów i glikoaminoglikanów w ich naturalnej konfiguracji i stężeniu. Wyspy poddane krioprezerwacji hodowane
na SIS wydzielają insulinę zarówno pod wpływem 4 mM
roztworu glukozy jak i stymulowane 20mM roztworem glukozy nawet w 5 tygodniu hodowli w odróżnieniu od wysp
hodowanych w standardowym medium CMRL 1066, które
nie odpowiadały na stymulacje glukozą już w drugim tygodniu hodowli [10].
Ocena zdolności wydzielniczej
wysp trzustkowych
Zdolność do produkcji i wydzielania insuliny przez
izolowane wyspy trzustkowe ma kluczowe znaczenie dla
powodzenia całej procedury transplantacyjnej. Krioprezerwacja prowadzi do częściowego upośledzenia funkcji wydzielniczej wysp. Dlatego zarówno mrożone jak i świeże
wyspy muszą podlegać kontroli ich zdolności wydzielniczej.
Funkcję przeszczepu można ocenić metodami in vivo przeszczepiając wyspy myszom, u których wywołano cukrzycę
streptozocynową oraz in vitro metodami perifuzji lub inkubacji statycznej. Chociaż zdolność do korekty hiperglikemii
w modelu zwierzęcym jest najbardziej dokładną oceną to
wymaga najwięcej czasu (kilkunastu dni) oraz dużej ilości
wysp. Natomiast z dwóch technik in vitro metoda statyczna daje możliwość otrzymania indeksu stymulacji glukozą
znacznie szybszą i prostszą drogą [24]. Indeks stymulacji
glukozą określany jest jako stosunek ilości wydzielonej insuliny lub C-peptydu w odpowiedzi na wysokie stężenie
glukozy do ilości wydzielonej przy niskim stężeniu glukozy [7]. Metoda statyczna nie daje jednak możliwości oceny
pulsacyjnego wydzielania insuliny przez wyspy trzustkowe [20]. Pulsy mogą być wykrywane zarówno in vivo jak
i in vitro w perfundowanych wyspach. Ich częstotliwość
w izolowanych ludzkich wyspach wynosi w przybliżeniu
6 minut, co jest zgodne z częstotliwością pulsów obserwo-
&ARM0RZEGL.AUK
waną in vivo, kiedy pobierano próbki z żyły wrotnej u psów
i ludzi. Po pobraniu z układu krążenia i oznaczeniu metodami immunochemicznymi początkowo uzyskiwano niższą
częstotliwość pulsów (co 15-20 minut). Ilość uwalnianej
insuliny przez izolowane perfundowane wyspy trzustkowe
jest na tyle niewielka, że w niektórych badaniach są trudności w rozróżnieniu zmienności stężenia w wyniku małych
fluktuacji powstałych wskutek epizodycznej sekrecji blisko
limitu detekcji metody [25]. Standardowo stężenie insuliny
w próbkach jest oznaczane metodami RIA (Radio Immuno
Assay) lub ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).
Obie charakteryzują się wysoką czułością, jednakże w RIA
kluczowy reagent - antygen lub przeciwciało wyznakowane 125I ma ograniczoną stabilność z uwagi na krótki okres
półtrwania izotopu. Większość dostępnych testów nie jest
specyficzna – związaniu z przeciwciałem podlega nie tylko
cząsteczka insuliny, ale także proinsulina jak i częściowo
zhydrolizowane pochodne [26]. Stąd też nie ma możliwości
oznaczenia insuliny w obecności substancji proinsulinopodobnych . Metodami zapewniającymi lepszą rozdzielczość
są elektroforeza kapilarna (EC) oraz HPLC. Dlatego oznaczając stężenie insuliny w homogenacie tkanki metodami
ELISA oraz EC otrzymano dużą rozbieżność wyników: odpowiednio 80 μg/g i 32 μg/g tkanki. Jednakże EC i HPLC
zapewniają dużo niższą czułość w porównaniu z metodami
immunochemicznymi [27].
Podsumowanie
Transplantacja wysp trzustkowych, która jest procedurą relatywnie nieinwazyjną niesie wielkie nadzieje chorym
cierpiącym na cukrzycę typu 1, szukającym alternatywy
dla życia z wielokrotnymi iniekcjami insuliny, epizodami
hipoglikemii i konsekwencjami powikłań naczyniowych
[8]. Długi i kosztowny proces izolacji wysp trzustkowych
ma kluczowe znaczenie dla powodzenia całej procedury
ich transplantacji a utrzymanie zdolności do produkcji
i wydzielania insuliny przez komórki β wysp Langerhansa jest warunkiem powodzenia całego postępowania terapeutycznego. Krioprezerwacja znacznie ułatwia procedury
transplantacji dając możliwość zgromadzenia większej
ilości wysp trzustki do przeszczepu i lepsze dopasowanie
biorcy. Optymalizacja procedury krioprezerwacji umożliwi uzyskanie najwyższego odzysku komórek o odpowiedniej żywotności. Jednocześnie szybka i tania metoda
analityczna oceny zdolności wydzielniczej wysp pozwoli
na przeprowadzenie kontroli ich żywotności i wydzielania
insuliny zarówno przed transplantacją jak i po procesie
krioprezerwacji.
Piśmiennictwo
1. Narang A, Maheto R. Biological and Biomaterial Approaches for Improved Islet Transplantation Pharmacol
Rev 2006; 58: 194-243.
2. Gunasekaran S. Human pancreatic islet transplantation.
Int J Diab Dev Countries 2003; 23: 55-57.
3. Popow A, Durlik M, Rydzewski A. Przeszczepianie izolowanych wysp trzustkowych: nowa metoda leczenia cukrzycy i jej powikłań. Przeg Gastroenterol 2006; 1: 202-207.
4. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. Hypoglycemia in the Diabetes Control and
Complications Trial. Diabetes 1997; 46: 271-286.
5. Fiedor P i wsp. Przeszczepianie izolowanych wysp
trzustki. Transplantologia kliniczna. Rowiński W,
Wałaszewski J, Pączek L. PZWL Warszawa 2004,
394-409.
6. Shapiro J i wsp. Islet transplantation in seven patients
with type 1 Diabetes Mellitus using a glucocorticoidfree immunosuppressive regimen. N Engl J Med 2000;
343: 230-238.
7. Robertson P. Islet Transplantation a Decade Later and
Strategies for Filling a Half-full Glass Diabetes 2010;
59: 1285-1291.
8. Fiorina P, Shapiro J, Riccordi C. The Clinical Impact of
Islet Transplantation. Am J Transplant 2008; 8: 1990-7.
9. Berman A, Pawelec A, Fiedor P. Allogenic transplantation of isolated islet cells in clinical practice. Pol Arch
Med Wewn 2009; 119: 336-331.
10. Woods EJ i wsp. Enhanced recovery of cryopreserved islets using SIS. Transplant Proc 2004; 36:
1139-1142.
11. Corominola H i wsp. Cryopreservation of Pancreatic
Islets Priori to Transplantation: A Comparison between
UW Solution and RPMI Culture Medium. Cryobiology
1998; 37: 110-118
12. Duvivier V, Darquy S, Reach G. Cryopreservation of
Specific Pathogen-Free (SPF) Pig Islet Cells; Effect of
Culture Time before Cryopreservation and after Thawing. Cryobiology 1999; 38: 386-397.
13. Budziszewska M, Korecka-Polak A, Korczak-Kowalska G. Rola komórek dendrytycznych w odpowiedzi transplantacyjnej. Post Biol Komórki 2009;
36: 745-754.
14. Wolfe J, Brylant G. Cellular cryobiology: thermodynamic and mechanical effects. Int J Refrigeration 2001;
24: 438-450.
15. Sakonju I i wsp. Cryopreservation of Isolated Rat Islets of Langerhans in the Presence of Ethylene Glycol
or Dimethyl Sulfoxide: Evaluation of Toxicity and the
Dynamic Pattern of Subsequent Insulin Relase in Vitro.
Cryobiology 1996; 33: 354-362.
16. Piemonti L i wsp. Effects of cryopreservation on in vitro
and in vivo long-term function of human islets. Transplantation 1999; 68: 655- 662.
17. Özkavukcu S, Erdemli E. Cryopreservation: Basic
knowledge and Biophysical Effects. J Ankara Med
School 2002; 24: 187-196.
18. El-Danasouri I, Selman H. Vitryfication versus conventional cryopreservation technique. Middle East Fertil
Soc J 2005; 10: 205-206.
19. Keros V i wsp. Vitryfication versus controlled –rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue. Hum
Reprod 2009; 24: 1670 -1683.
20. Sabat M. Porównanie wartości metod bankowania wysp
Langerhansa. Rozprawa doktorska. Warszawski Uniwersytet Medyczny 2001.
21. Mendola J i wsp. Follow-up study of the revascularization process of cropreserved islets of Langerhans. Cryobiology 1996; 33: 530-543.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
22. Monti LD i wsp. A sensitive and reliable method for assaying true human insulin without interaction with human
proinsulin-like molecules. Acta Diabet 1995; 32: 57-63.
23. Bertuzzi F i wsp. Long-term in vitro exposure to high
glucose increases proinsulin-like-molecules release by
isolated human islets. J Endocrinol 1998; 158: 205-211.
24. Street C i wsp. Islet Graft Assesment in the Edmonton
Protocol. Implications for Predicting Long-Term Clinical Outcome. Diabetes 2004; 53: 3107-3114.
25. Soong S i wsp. Pulsatile insulin secretion by human
pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87:
213-221.
26. Andersen L i wsp. Enzyme Immunoassay for Intact Human Insulin in Serum or Plasma. Clin Chem 1993; 39:
578-582.
27. Shihabi ZK, Friedberg M. Insulin stacking for capillary electrophoresis. J Chromatogr A 1998; 807:
129-133.
data otrzymania pracy: 04.08.2010 r.
data akceptacji do druku: 03.09.2010 r.
Adres do korespondencji:
mgr Aleksandra Mianowska
Katedra Biochemii i Chemii Klinicznej
Wydział Farmaceutyczny Warszawski Uniwersytet Medyczny
Warszawa ul. Banacha 1
tel. +48 22 572 07 35
e-mail: [email protected]