Anti-HIV TETRA ELISA

[PL]
187694/07 – 03/2008
Anti-HIV TETRA ELISA
Test ELISA do jakościowego oznaczania przeciwciał anty-HIV w
surowicy lub osoczu ludzkim.
Wielkość opakowania
807 007
[REF]1
807 008
96 testów
[IVD]
pełen zestaw testowy
480 testów
[IVD]
pełen zestaw testowy
Zastosowanie
Nabyty zespół upośledzenia odporności (acquired immunodeficiency
syndrome – AIDS) charakteryzuje się niepomyślnym rokowaniem. Jako
czynnik wywołujący AIDS zidentyfikowano ludzki wirus upośledzenia
odporności typu 1 (HIV-1) i typu 2 (HIV-2). Wirus HIV jest przenoszony drogą
kontaktów seksualnych pomiędzy osobami zakażonymi tym wirusem, drogą
produktów krwi zanieczyszczonych wirusem HIV, przez niewłaściwie
zdezynfekowane narzędzia medyczne (np. igły do iniekcji) oraz jest
przenoszony z matki na dziecko. Test ELISA (enzyme-linked immunosorbent
assay – test immunoabsorbcji enzymozależnej) jest uznaną metodą
wykrywania przeciwciał anty-HIV w surowicy lub osoczu ludzkim. Jednakże,
test ELISA nie zapewnia 100% bezpieczeństwa w rozpoznawaniu zakażenia
wirusem HIV. Z tego powodu, dodatni wynik oznaczenia przeciwciał testem
ELISA musi zostać potwierdzony przy użyciu innej specyficznej metody
(Western blot, PCR). Ujemny wynik testu ELISA nie wyklucza jednak
całkowicie możliwości obecności wirusa HIV-1/2.
Zasada testu - test trzeciej generacji Biotest Anti-HIV TETRA ELISA jest wysoce czułym immunoenzymatycznym
testem kanapkowym trzeciej generacji do diagnostyki in vitro (in vitro
diagnosis) IVD. Przeciwciała reagują z antygenami MTP, która została
opłaszczona 3 rekombinowanymi białkami i jednym peptydem wirusa HIV (3).
Jeśli przeciwciała wirusa HIV-1/2 są obecne w badanej próbce, zostaną
związane do MTP. Cały materiał związany nieswoiście jest usuwany podczas
procedury przemywania, po czym następuje dodanie koniugatu antygenu.
Koniugat jest mieszaniną 2 rekombinowanych białek i 2 peptydów z regionów
gag/env wirusa HIV-1 i HIV-2, które zostały bezpośrednio oznakowane
peroksydazą chrzanową. Niezwiązany koniugat enzymu jest usuwany w
dalszym etapie przemywania. Obecność związanych kompleksów antygenprzeciwciało jest wykazywana przy użyciu reakcji enzymatycznej dającej
barwny produkt z substratem TMB (3,3´,5,5´-tetrametylobenzydyna). Reakcja
enzymatyczna jest hamowana przy użyciu kwasu siarkowego; absorbancja
jest odczytywana przy długości fali 450 nm w spektrofotometrze względem
referencyjnej długości fali 615-690 nm.
Zestaw zawiera 96 i 480 testów
96x
480x
MTP
NC
PC
1
3,8 ml
3 ml
CONJ
0,5 ml
DIL
1x8
ml
CONJDIL
1 x 15
ml
WB
1 x 50
ml
SUB
1 x 16
ml
STOP
1 x 30
ml
1
SB
FOL
3
1
5
Mikropłytka 12 pojedynczych pasków
każdy
z
8
odrywanymi
dołkami,
opłaszczonymi rekomb. antygenami gp41,
gp36 i p24 oraz peptydem gp41 wirusa HIV
(stężenie: > 0,5 µg/mL).
3,8 ml Kontrola negatywna HIV (gotowa do
użycia)
Próbka królicza nie zawierająca przeciwciał
anty-HIV; środki konserwujące: 0,005%
gentamycyna, 0,05% streptomycyna, 0,05%
penicylina V.
3 ml Kontrola pozytywna HIV (gotowa do
użycia)
Próbka królicza zawierająca poliklonalne
przeciwciała anty-HIV; środki konserwujące:
0,005%
gentamycyna,
0,05%
streptomycyna, 0,05% penicylina V.
3 x 0,5 Koncentrat koniugatu (koncentrat 50x)
ml
Rekombinowane antygeny gp41, p24 oraz
peptydy gp41 i gp36 wirusa HIV; środki
konserwujące: 0,2% proclin 300®, 0,01%
gentamycyna.
1 x 32 ml Rozcieńczalnik próbki (gotowy do użycia)
Środki konserwujące: 0,2% proclin 300®,
200 U/mL penicyliny V i streptomycyny.
2 x 30 ml Rozcieńczalnik koniugatu (gotowy do
użycia)
Środki konserwujące: 0,2% proclin 300®,
0,01% gentamycyna.
3 x 50 ml Bufor do przemywania (koncentrat 25x)
Środki konserwujące: 0,1% kathon®, Tween
< 3%.
4 x 16 ml Roztwór substratu (gotowy do użycia)
Roztwór wodny 3,3´,5,5´ tetrametylobenzydyny
(TMB)
< 0,05%.
Patrz
ostrzeżenia i środki ostrożności.
2 x 30 ml Roztwór hamujący (gotowy do użycia)
Kwas siarkowy < 1 N H2SO4.
1
Torebka do przechowywania: torebka
polietylenowa
do
przechowywania
pozostałych pasków mikropłytki.
12
Samoprzylepne
przezroczyste
folie:
samoprzylepne przezroczyste folie do
uszczelnienia dołków mikropłytki podczas
inkubacji.
1
Ulotka dla pacjenta
Środki konserwujące: stężenie łączne < 0,8%.
Potrzebne materiały niedołączone do zestawu
Mikropipety, spektrofotometr (450 nm, referencyjna długość fali 615-690 nm),
standardowo stosowana myjnia do płukania mikropłytek (płukanie dolne),
inkubator 37°C do MTP w teście ELISA. Jeśli używane są procesory ELISA,
operator musi dokonać walidacji testu na własną odpowiedzialność.
Ostrzeżenia i środki ostrożności
Nie mieszać odczynników. Unikać kontaktu z oczami i skórą. Wszystkie
próbki, kontrole i materiały użyte do wykonania testu należy traktować jako
potencjalnie zakaźne i należy zastosować odpowiednie środki
bezpieczeństwa. Kontrole nie zawierają przeciwciał anty-HIV-1/2, anty-HCV,
antygenu HBsAg, kiły i zwiększonych poziomów transaminaz. Nie zasysać
pipety ustami. Zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej należy nosić
rękawiczki, płaszcz laboratoryjny i okulary ochronne. Materiały płynne i
niepalne należy odkazić podchlorynem sodu (stężenie końcowe: 3%, czas
działania co najmniej 30 minut). Odpadki płynne zawierające kwasy należy
zobojętnić przed wyrzuceniem. Wykorzystane MTP i wszystkie materiały,
które będą użyte ponownie należy poddać autoklawowaniu przez jedną
godzinę w temperaturze 121°C. SUB jest wrażliwy na światło i należy go
chronić przed światłem. Test musi zostać wykonany przez dobrze
wyszkolonych i upoważnionych techników laboratoryjnych. Oznaczenie jest
wykonywane w warunkach aseptycznych i kontrolowanych mikrobiologicznie.
Należy poinformować producenta, jeśli oryginalne opakowanie uległo
uszkodzeniu.
Przechowywanie
Odczynniki zachowują stabilność do upływu daty ważności podanej na
poszczególnych etykietach, jeśli są przechowywane w temperaturze 2...8°C.
Po otwarciu odczynniki należy wykorzystać w ciągu 30 dni. W przypadku
wielokrotnych oznaczeń odczynniki należy przechowywać bezpośrednio po
użyciu w temperaturze 2...8°C. MTP należy zamknąć szczelnie w torebce
aluminiowej z osuszaczem i do czasu otwarcia przechowywać w
temperaturze pokojowej. Niewykorzystane paski wraz z osuszaczem należy
umieścić ponownie w torebce z zamkiem i przechowywać w ten sposób w
temperaturze 2...8°C. Nie dotykać palcami górnej obwódki dna dołków.
Przygotowanie odczynników
Rozcieńczyć koncentrat buforu do przemywania wodą demineralizowaną lub
dejonizowaną (np. 40 mL rozcieńczyć do 1 litra). Bufor zachowuje stabilność
przez jeden tydzień, jeśli jest przechowywany w temperaturze 18-25°C. W
przypadku wystąpienia krystalizacji podczas przechowywania w temperaturze
2...8°C, koncentrat buforu do przemywania można przywrócić do postaci
roztworu po ogrzaniu do temperatury 37°C. Przed rozcieńczeniem bufor
należy dobrze wymieszać.
Koncentrat koniugatu rozcieńcza się w stosunku 1:50 w warunkach
aseptycznych (np. 100 µL koniugatu + 4,9 mL rozcieńczalnika koniugatu).
Przed rozcieńczeniem koncentrat należy dobrze wstrząsnąć (zwilżając całą
powierzchnię wewnętrzną dołków w butelce), aby rozpuścić zagęszczenia.
Roboczy koniugat po rozcieńczeniu można przechowywać w zamkniętym
pojemniku w zacienionym miejscu przez 4 tygodnie w temperaturze 2...8°C.
Wszystkie pozostałe składniki zestawu testowego są gotowe do użycia.
Wszystkie odczynniki są swoiste dla danej serii i nie można ich używać w
zestawach z innej serii. Nie należy używać odczynników innych producentów.
Przygotowanie próbek
Należy użyć świeżych próbek surowicy lub osocza bez śladów hemolizy.
Próbki surowicy lub osocza z wysokim stężeniem lipidów, bilirubiny lub
zanieczyszczone mikrobiologicznie oraz skoncentrowane preparaty
immunoglobulin mogą prowadzić do otrzymania niewiarygodnych wyników.
Należy unikać powtarzania cykli zamrażania i rozmrażania próbek. Jeśli
konieczne jest transportowanie próbek, należy je zapakować zgodnie z
lokalnymi przepisami dotyczącymi transportu materiałów zakaźnych. Nie
należy inaktywować próbek, ponieważ może to prowadzić do wystąpienia
niespecyficznych reakcji.
Wykonanie testu
Należy ściśle przestrzegać protokołu (patrz procedura pipetowania).
Przed użyciem odczekać aż wszystkie odczynniki osiągną temperaturę
pokojową (18-25°C). Używając rozcieńczalnika próbki rozcieńczyć wszystkie
kontrole i próbki w stosunku 3:4 w mikropłytce. Odmierzyć 50 µL DIL do
każdego dołka. Dołek pusty w A1 jest używany jako kontrola substratu i
dlatego zawiera tylko 50 µL DIL. Odmierzyć pipetą 150 µL NC do wszystkich
dołków B1 i C1. Odmierzyć pipetą 150 µL PC do wszystkich dołków D1 i E1.
Odmierzyć pipetą próbki do dołków rozpoczynając od F1. Wreszcie,
dokładnie wymieszać.
Bezpośrednie rozcieńczanie na płytce jest szczególnie wygodne podczas
używania automatycznego systemu do odmierzania płynu. Jeśli bezpośrednie
rozcieńczanie jest wykonywane ręcznie, należy zachować następujące środki
ostrożności, aby uniknąć niespecyficznego wiązania białek:
a)
początkowo odmierzyć do dołków 50 µL DIL i następnie dodać
150 µL próbki lub kontroli i
b)
podczas dodawania 150 µL próbki lub kontroli zmieszać trzy razy z
DIL.
Procedura przemywania
Procedura przemywania ma kluczowe znaczenie. Niedostateczne
przemywanie doprowadzi do małej dokładności i nieswoistych reakcji.
W1: przemywać 5 razy buforem do przemywania. Aby to wykonać, należy
usunąć z dołków płyn i dodać 300 µL buforu do przemywania. Wypełnić dołek
buforem do przemywania o objętości co najmniej 250 µL (łączna objętość
550 µL). Ta procedura przemywania jest powtarzana 5 razy. Wstrząsnąć
płytką tuż po przemywaniu. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia płytki.
Ocena
Dołek wolny należy wyłączyć z wszystkich wartości kontroli i próbek.
Wartość absorbancji dla dołka wolnego musi wynosić poniżej 0,100 jednostek
absorbancji. Wartości kontrolne muszą spełniać następujące kryteria:
≤ 0,180
≥ 0,600
Średnia absorbancja kontroli negatywnych:
Średnia absorbancja kontroli pozytywnych:
Obliczanie wartości odcięcia i szarej strefy
Wartość odcięcia jest obliczana na podstawie średniej wartości absorbancji
kontroli negatywnych (NCx) + 0,250. Wartość odcięcia = (NCx) + 0,250. Szara
strefa stanowi zakres pomiędzy wartością odcięcia i wartością odcięcia
pomniejszoną o 10%.
Interpretacja wyników
Próbki z wartością absorbancji poniżej szarej strefy należy uznać za ujemne.
Jeśli wartość absorbancji próbki jest równa lub większa od wartości odcięcia,
próbka jest uznawana za dodatnią po względem obecności przeciwciał
swoistych dla wirusa HIV. Próbki z wartością absorbancji mieszczącą się w
szarej strefie należy uznać za niejednoznaczne. Zalecana jest powtórna
analiza próbki.
Procedura pipetowania podczas wykonywania testu
Przed użyciem odczekać aż wszystkie odczynniki osiągną temperaturę
pokojową.
Pipetowanie kontroli i dołka wolnego należy wykonać na końcu.
Niezwłocznie po zakończeniu pipetowania kontroli i próbek należy
rozpocząć inkubację płytki.
etap 1
dołek [µL]
A1
B1/ C1 D1/ E1
G1...
próbka
Dołek wolny (blank)
NC oznaczenia podwójne
50 DIL
−
50 DIL
−
−
150 NC
PC oznaczenia podwójne
−
−
50 DIL
−
150 PC
−
Próbka
−
−
50 DIL
150
Uszczelnić MTP przy użyciu folii samoprzylepnych (niewymagane w procesorze
ELISA*)
Inkubacja 60 ± 2 min., 37 ± 1°C.
5x przemywanie (patrz W1)
550
WB
etap 2
CONJ nie do dołka wolnego!
550
550
550
dołek [µL]
−
100
100
100
Uszczelnić MTP przy użyciu folii samoprzylepnych (niewymagane w procesorze
ELISA*)
Inkubacja 60 ± 2 min., 37 ± 1°C.
5x przemywanie (patrz W1)
550
WB
etap 3
SUB
550
550
550
dołek [µL]
100
100
100
100
Inkubować przez 30 ± 2 min. w temperaturze pokojowej bez dostępu światła
STOP
100
100
100
100
Zmierzyć absorbancję spektrofotometrem natychmiast lub w ciągu 15 min. po
reakcji hamowania przy długości fali 450 nm (referencyjna długość fali: 615-690
nm).
* Jeśli używany jest procesor ELISA, operator musi dokonać walidacji testu
na własną odpowiedzialność.
Dane dotyczące działania testu
Czułość. Podczas badania czułości testu Biotest Anti-HIV TETRA ELISA
uzyskano następujące wyniki: Wszystkie surowice z 460 próbek dodatnich
dla HIV-1 i 200 dodatnich dla HIV-2 oznaczono jako dodatnie. Czułość testu
Biotest Anti-HIV TETRA ELISA określona po oznaczeniu 21 grup próbek
pobranych po serokonwersji koreluje z czułością testów porównawczych na
anty-HIV. W celu analizy reaktywności w wykrywaniu przeciwciał
skierowanych przeciwko różnym podtypom wirusa HIV oznaczono
następujące surowice: Podtyp A (6), B (9), C (5), D (4), E (3), F (3), E/F (3), O
(10). Wyniki oznaczeń wszystkich surowic były dodatnie. Czułość wyniosła
100%.
Specyficzność. Specyficzność testu Biotest Anti-HIV TETRA ELISA był
badana w niezależnym laboratorium. Spośród 4133 próbek surowicy
pobranych od zdrowych dawców krwi 7 próbek oznaczono jako reaktywne.
Specyficzność wyniosła 99,83%.
Próbki surowicy/osocza. Próbki surowicy i osocza (cytrynian/EDTA)
pobrane od 165 HIV-ujemnych dawców krwi oznaczono równolegle przy
użyciu testu Biotest Anti-HIV TETRA ELISA. Nie obserwowano istotnych
odchyleń w wartościach absorbancji w zależności od zastosowania do
badania surowicy lub osocza. Ponadto, do 45 próbek surowicy/osocza
wszczepiono ludzką surowicę zawierającą przeciwciała anty-HIV. Wartości
absorbancji par próbek nie wykazały istotnych różnic.
Precyzja. Zmienność wewnątrzseryjną testu Biotest Anti-HIV TETRA ELISA
badano przez dodanie pipetą próbek reaktywnych do 45 dołków mikropłytki.
Uzyskano następujące współczynniki zmienności (coefficient of variation –
CV):
Próbka
CV
Reaktywność wysoka
3,9%
Reaktywność umiarkowana
10,1%
umiarkowanych i wysokich zakresach absorbancji, niezależnie, 16 razy w
ciągu 3 dni. Otrzymano następujące współczynniki zmienności (CV):
Próbka
CV
Reaktywność wysoka
8,7%
Reaktywność umiarkowana
10,4%
Reaktywność krzyżowa. Test Biotest Anti-HIV TETRA ELISA zbadano przy
użyciu następujących 151 próbek potencjalnie reagujących krzyżowo:
zawierające przeciwciała przeciwko czynnikowi reumatoidalnemu (13),
przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) (8), przeciwciała przeciwko wirusowi
zapalenia wątroby typu A (17), przeciwciała przeciwko wirusowi zapalenia
wątroby typu B (22), przeciwciała przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu
C (15), przeciwciała przeciwko wirusowi HTLV-I/II (10), przeciwciała
przeciwko wirusowi Epsteina-Barr (37), przeciwciała przeciwko wirusowi ospy
wietrznej (11), przeciwciała przeciwko E. coli (18). Nie wykryto reaktywności
krzyżowej testu Biotest Anti-HIV TETRA ELISA. Ponadto, oznaczono próbki
zawierające tylko antygen p24 (23) uzyskany od zdrowych dawców krwi bez
jakichkolwiek związków z wirusem HIV. Po analizie metodą Western blot
prążki tych surowic wypadały poza regionem gag (p24, p40, p50). Kwas
nukleinowy swoisty dla wirusa HIV nie został wykryty w tych surowicach.
Tylko 3 z 23 próbek „tylko p24“ zostały oznaczone jako dodatnie (13%) przy
użyciu testu Biotest Anti-HIV TETRA ELISA. W przypadku otrzymania
dodatniego wyniku w teście Biotest Anti-HIV TETRA ELISA identyfikację
próbki jako „tylko p24“ można wykonać przy użyciu metody Western blotting.
Ograniczenia metody
Uzyskanie wyniku ujemnego przy użyciu testu Biotest Anti-HIV TETRA ELISA
nie wyklucza z całkowitą pewnością możliwości zakażenia wirusem HIV.
Metody uzupełniające, które można wykorzystać, obejmują Western blot,
oznaczenie p24 i techniki oznaczania kwasów nukleinowych (NAT). Badano
wpływ czynników zakłócających na reaktywność testu Biotest Anti-HIV
TETRA ELISA. Obejmowało to badanie surowic żółtaczkowych,
hemolitycznych i lipemicznych po dodaniu bilirubiny, hemoglobiny i
trójglicerydów w różnych seriach rozcieńczeń. Oceniano następujące
wartości stężeń:
Bilirubina
0,02-0,16 mg/mL
Trójglicerydy
5-80 mg/mL
Hemoglobina
0,2-4 mg/mL
W przypadku bilirubiny i trójglicerydów nie zaobserwowano zmiany w
wartości absorbancji w pełnym zakresie stężenia zarówno dla próbek
zawierających, jak i nie zawierających przeciwciał przeciwko wirusowi HIV. W
przypadku hemoglobiny wzrost aktywności tła obserwowano jedynie dla
stężeń powyżej 2 mg/mL w surowicach nie zawierających przeciwciał antyHIV. Z tego powodu, w przypadku surowic z wysokim stężeniem hemoglobiny
należy brać od uwagę możliwość wystąpienia wyników fałszywie dodatnich.
Dlatego surowice hemolityczne należy oznaczać przy użyciu dodatkowej
metody ELISA lub testu potwierdzającego (Western blot, NAT), jeśli uzyskane
zostaną wielokrotnie wyniki dodatnie. W przypadku próbek dodatnich pod
względem przeciwciał anty-HIV, nie zaobserwowano istotnej różnicy w
reaktywności testu w zależności od stężenia hemoglobiny.
Literatura
1.
DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical
devices.
2.
Promoting early HIV diagnosis and entry into care. Valdiserri R. O. et al.
AIDS, 13: 2317-2330,1999 (Editorial Review).
3.
Evaluation of a new third generation HIV-1/2 Immunoassay. Lang, D. et
al. Clin. Lab. 45, 1999.
Rozwiązywanie problemów
1)
Nieoczekiwanie
wysoka
częstotliwość
wyników
reaktywnych:
Pipetowanie próbek i kontroli wykonano przed pipetowaniem DIL lub
niewłaściwie wykonano etap mieszania.
2)
Średnia wartość dla dołka wolnego przekracza kryteria walidacji,
≥ 0,100 jednostek absorbancji:
a) Zmiana barwy SUB na niebieską z powodu utlenienia lub
zanieczyszczenia.
b) Błąd przemywania: Wykonać 5 razy cykle przemywania/etapy
przemywania. Użyć WB zawartego w zestawie testu Biotest.
c) Błąd inkubacji: Zbyt wysoka temperatura, przekroczono czas
inkubacji lub inkubacja płytki nie została wykonana niezwłocznie po
zakończeniu pipetowania.
d) Błąd długości fali: Pomiar bez filtra referencyjnego spowoduje
zwiększenie wartości absorbancji o około + 0,120 jednostek
absorbancji.
3)
Żółte zabarwienie we wszystkich dołkach (patrz punkty 2a, 2b):
a) Zanieczyszczenie WB; przygotować nowy bufor do przemywania.
b) Zanieczyszczenie DIL lub CONJ; powtórzyć oznaczenie stosując
odczynniki z nieotwartych fiolek. Użyć odczynników w warunkach
bardziej sterylnych.
4)
Średnia wartość PC poniżej 0,600 jednostek absorbancji:
a) Przekroczona data ważności.
b) Zbyt niska temperatura lub zbyt szybki spadek temperatury w trakcie
inkubacji.
c) Błąd przemywania: Zbyt intensywne przemywanie lub kontakt
mechaniczny rurki pipety z fazą stałą dołków.
d) Zanieczyszczenie PC lub 3b.
5)
Średnia wartość NC powyżej 0,180 jednostek absorbancji (patrz punkty 1
i 2 a-d):
a) NC nie została dodana pipetą po pipetowaniu próbek; dodać pipetą
wszystkie próbki przed pipetowaniem dołków wolnych i kontroli.
b) Zanieczyszczenie z pokrywy PC
Zmienność międzyseryjna została zmierzona przez oznaczenie 2 próbek w
| Biotest
M| Biotest, Industriestr. 1, D-63303 Dreieich,
Germany, www.biotest.de, [email protected]
Tel.: +49-6103-801-0, Fax: +49-6103-801-140
|
0197