Recenzja 2
Transkrypt
Recenzja 2
Ocena pracy doktorskiej mgr. inż. Joanny Krzciuk-Guli p.t. „Synteza i badanie właściwości konformacyjnych wybranych grup peptydomimetyków” Szczególne nadzieje pokładane w możliwościach wykorzystania endogennych i syntetycznych peptydów w praktyce medycznej wiążą się z ich korzystnymi cechami takimi jak: wysoka aktywność i specyficzność, niska toksyczność, niska akumulacja w tkankach oraz praktycznie brak oddziaływań z innymi lekami. Niestety, peptydy ulegają szybkiej proteolizie w przewodzie pokarmowym, stąd ich utrudniona biodostępność, która bardzo limituje drogi podania. Właściwości te, a także inne, między innymi ograniczona przenikalność przez błony komórkowe, szybka degradacja w komórkach czy ryzyko wystąpienia efektów immunogenicznych bardzo ogranicza ich zastosowanie jako środki terapeutyczne. Jednym ze sposobów minimalizujących te niekorzystne cechy jest wprowadzenie do struktur peptydów syntetycznych ugrupowań przypominających budową wiązania peptydowe lub łańcuchy boczne aminokwasów proteinogennych. Badania nad tą grupą modyfikowanych peptydów, określanych jako „peptydomimetyki”, są intensywnie prowadzone przez wiele grup i bez wątpienia należą do głównego nurtu zainteresowania współczesnej chemii bioorganicznej. Problematyka ta stanowi od wielu lat jeden z wiodących tematów badawczych ośrodka wrocławskiego. Sukcesy na tym polu, bardzo dobrze udokumentowane licznymi publikacjami w renomowanych czasopismach z listy JCR, stanowią także znakomity przykład owocnej współpracy między grupami badawczymi Politechniki Wrocławskiej, Uniwersytetu Wrocławskiego i Uniwersytetu Opolskiego. W nurt tych badań wpisuje się rozprawa doktorska mgr inż. Joanny Krzciuk-Guli, której promotorem jest dr hab. Rafał Latajka, prof. nadzw. PWr. Przedłożona do recenzji rozprawa doktorska to148 stronic tekstu. Układ pracy jest typowy dla tego typu opracowań. Zasadnicze rozdziały pracy to: Wstęp teoretyczny (40 stron), Cel pracy (1 strona), Część eksperymentalna (45 stron), Wyniki i dyskusja (40 stron). Rozprawę uzupełniają: Podsumowanie, Wykaz skrótów oraz literatury cytowanej (251 pozycji). Opis prowadzonych eksperymentów i dyskusja wyników uzyskanych przez Kandydatkę stanowi ponad 50% opracowania. Proporcje takie uznaję za właściwe. W przeglądzie literaturowym Kandydatka wyróżniała trzy podrozdziały, w których przedstawia zagadnienia odwołujące się bezpośrednio do Jej badań własnych. Najobszerniejszy z nich zawiera charakterystykę dehydropeptydów. Autorka szczegółowo relacjonuje wyniki badań, uzyskanych zarówno w macierzystym ośrodku jak i opublikowanych przez inne grupy badawcze, nad udziałem reszt dehydroaminokwasów (głównie ΔPhe) w indukowaniu struktur drugorzędowych krótkich peptydów. Stosunkowo duża ilość danych eksperymentalnych pozwala na wyciągnięcie uogólnionych wniosków odnośnie wpływu charakteru dehydroaminokwasów, ich liczby oraz umiejscowienia w łańcuchu peptydowym na preferencje konformacyjne dehydropeptydów. Dodatkowe możliwości w projektowaniu związków chemicznych o pożądanych strukturach przestrzennych stwarza też wykorzystanie trwałych izomerów (Z i E) dehydroaminokwasów. Zamieszczone w tablicach zależności między strukturami pierwszorzędowymi a zidentyfikowanymi kanonicznymi strukturami drugorzędowymi ułatwiają lekturę tekstu. W dalszej części tego podrozdziału Autorka podaje przykłady naturalnie występujących i syntetycznych dehydropeptydów – są to głównie związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Duży potencjał aplikacyjny mają także krótkie dehydropeptydy cechujące się zdolnościami do przejmowania struktur samoorganizujących się. Charakterystyka triazolamerów, związków chemicznych zawierających ugrupowania 1,4- i 1,5-dipodstawione pierścienie triazolowe Doktorantka przedstawiła w kolejnym podrozdziale przeglądu literaturowego. Ten typ mimetyków wiązań peptydowych jest w ostatniej dekadzie, dzięki opisanej metodzie cykloaddycji zwanej chemią „Click”, przedmiotem intensywnych badań wielu grup badawczych. W rozprawie Doktorantka prezentuje sposoby syntezy ugrupowań triazolowych oraz możliwości ich zastosowania w syntezie nowych polimerów o ograniczeniach swobody konformacyjnej. Podaje też przykłady ich aplikacji do kowalencyjnego łączenia związków o różnym charakterze chemicznym. Ostatnia część rozdziału poświęcona jest glikopeptydom przeciwdziałającym zamarzaniu wody. Ta interesująca grupa peptydów stanowi jeden ze składników umożliwiających przetrwanie organizmu w niskich temperaturach. Oprócz mechanizmu ich działania, znajdują się tu także 2 przykłady motywów glikopeptydów o takim działaniu. Badania nad grupą związków mają, oprócz aspektu poznawczego także walor aplikacyjny jako krioprotektanty w praktyce medycznej i przemyśle spożywczym, odpowiednio tkanek biologicznych i konserwacji żywności. Poziom merytoryczny tego rozdziału jest wysoki, Kandydatka przekonuje, że potrafi redagować tekst naukowy. Na równie wysoką ocenę zasługuje też strona językowa tej części rozprawy. Dostrzeżone tu niedociągnięcia są niewielkie. Z obowiązku recenzenta wymienię kilka: w języku polskim rysunek i tabela piszemy z małej litery, niefortunne określenie w podpisie rys. 16 „struktura sekwencji AFGP”, pochodna serynowa (str. 44), brak rysunków 20-23. Zagadnienia prezentowane w poprzednim rozdziale nawiązują bezpośrednio do badań własnych Doktorantki, tym samym w pełni uzasadniają cele badawcze rozprawy. Zostały one sformułowane bardzo syntetycznie (niepełna stronica tekstu). Dwa główne cele to badania konformacji, metodą NMR wspomaganą obliczeniami teoretycznymi, serii krótkich (zawierających od 3 do 6 wiązań peptydowych lub ugrupowań je imitujących) dehydroapeptydów i triazolamerów oraz chemiczna synteza glikopeptydów. Oba cele, choć o odmiennym charakterze oceniam wysoko. Istotnym niedopatrzeniem, utrudniającym lekturę rozprawy, jest brak listy związków będących przedmiotem badań. Dla porządku, Doktorantka dokonała analizy konformacyjnej 15 dehydropeptydów zawierających ΔPhe i ΔAla, a celem badań było ustalenie korelacji między położeniem reszt Val i His a preferencjami konformacyjnymi badanych peptydomimetyków. Doktorantka zsyntetyzowała i poddała badaniom jako związki referencyjne 4 peptydy (w rozprawie niefortunnie określane jako „naturalne analogi dehydropeptydów”) zbudowane z reszt aminokwasów proteinogennych. Grupa badanych triazolamerów zawierających ugrupowania 1,4- albo 1,5-dipodstawionego triazolu liczyła 7 związków. Syntetyzowane glikopeptydy to 3 związki chronione na N- i Ckońcach odpowiednio grupą acetylową i metyloamidową zawierające N-acetylo-Dgalaktozoaminę połączoną wiązaniem O-glikozydowym z łańcuchem bocznym reszty Thr. W kolejnym rozdziale zatytułowanym „Część doświadczalna” oprócz syntetycznego opisu stosowanych technik eksperymentalnych, Kandydatka dla wszystkich badanych związków podaje wartości przesunięć chemicznych 1H i 13C zidentyfikowanych na widmach NMR. Szkoda, że w rozprawie (lub suplementu do niej) nie zamieszono przynajmniej przykładów widm NMR z wpisaną analizą sekwencyjną. Zasadniczo nie mam zastrzeżeń do wyboru technik eksperymentalnych, aczkolwiek na str. 71 warunki analizy HPLC syntetyzowanych związków są niewłaściwe; kolumnę o średnicy 21,2 mm trudno uznać za 3 analityczną, zdziwienie budzi krótki czas realizacji gradientu (5 min. – tablica 8). Niestety w pracy nie zamieszczono nawet przykładowych chromatogramów, nie znalazłem również wartości czasów retencji badanych związków. Trudno uwierzyć, że wydajności syntez peptydów (po oczyszczaniu?) zawierały się w zakresie 90-95% (str. 74). Z dużym zainteresowaniem przeczytałem rozprawy, w którym Kandydatka opisuje syntezy glikopeptydów. Nie można zaliczyć ich do rutynowych, należy więc docenić starania Doktorantki uwieńczone sukcesem. Mojej wysokiej oceny nie obniża fakt, iż w swoich eksperymentach wykorzystała ścieżki syntetyczne opracowane na Uniwersytecie w Bielefeld. Procedury były wieloetapowe i wymagały od Doktorantki doświadczenia w posługiwaniu się technikami chemii organicznej. Do tego fragmentu rozprawy mam szereg uwag krytycznych. Oto niektóre z nich: odnośnik [5] na str. 64 to nie praca Bocka i współpr., czy badane triazolamery miały na C-końcach grupę benzyloksykarbonylową; może jednak ester benzylowy jak sugeruje rysunek 64?, określenia żargonowe np. „wykonano analityczne PRHPLC..”; czytając rozprawę można odnieść wrażenie, że Doktorantka za aminokwasy naturalne uważa jedynie proteinogenne (np. „naturalne analogi dehydropeptydów”, czy „sprzęganie naturalnego aminokwasu do naturalnego aminokwasu” (str. 73) – chociaż w tym wypadku do utworzenia wiązań peptydowych stosowano odpowiednie pochodne aminokwasów proteinogennych), roztwór żywicy (str. 88). Wyniki uzyskane przez Kandydatkę zawarte są w następnym rozdziale. Dla każdego z badanych peptydomimetyków konformacje obliczone z uwzględnieniem więzów strukturalnych uzyskanych z analizy widm 1HNMR, zostały na podstawie podobieństwa wartości kątów torsyjnych, pogrupowane w rodziny. Kolejny etap to identyfikacja kanonicznych struktur drugorzędowych. W większości z przebadanych związków Doktorantka znalazła tego typu struktury. Prosta korelacja między strukturami pierwszorzędowymi a preferencjami konformacyjnymi badanych peptydomimetyków nie jest możliwa, niemniej analiza uzyskanych wyników i wnioski, jakie na ich podstawie wyciąga mgr inż. Krzciuk-Gula uważam za prawidłowe. Wyniki zdają się wskazywać, że w krótkich peptydomimetykach rola strukturotwórcza reszt Val jest większa niż reszt His. Obecność wolnych N- i C-końców jest powodem większego uporządkowania struktury przestrzennej peptydomimetyków. Nieoczekiwanie peptydy zbudowane z aminokwasów proteinogennych o sekwencjach odpowiadających badanym dehydropeptydów posiadały lepiej zdefiniowaną strukturę przestrzenną, co prawdopodobnie związane było z charakteru rozpuszczalnika, w jakim rejestrowano widma NMR. Izomery Z dehydrofenyloalaniny w pozycjach 2 i 3 ograniczają swobodę konformacyjną, podczas gdy izomer E umiejscowiony na C-końcu 4 wywiera efekt przeciwny. Jak już podkreślałem, badane triazolamery to interesująca grupa peptydomimetyków. Ugrupowania 1,4-dipodstawionego triazolu są mimetykami wiązań peptydowych o geometrii trans, podczas gdy 1,5-dipodstawionego imitują geometrię cis. Obecność pochodnych 1,4-dipodstawionych w łańcuchu głównym nie prowadzi do wyraźnego ograniczenia swobody konformacyjnej, niemniej uporządkowanie struktury wydaje się rosnąć wraz z wielkością cząsteczek peptydomimetyku. W wypadku peptydmimetyku zawierającego ugrupowania 1,5-dipodstawionego triazolu, geometria ich łańcuchów głównych jest lepiej zdefiniowana, przyjmując konformacje skrętne. Podsumowując tę część stwierdzam, że Doktorantka uzyskała interesujące, oryginalne wyniki, które uzupełniają wiedzę na temat preferencji konformacyjnych dwóch ważnych klas peptydomimetyków. Wykazała, że niektóre z motywów strukturalnych przyjmują dobrze zdefiniowaną strukturę. Dzięki temu stwarzają uzasadnione nadzieje na ich wykorzystanie w projektowaniu folderów imitujących konformacje biomolekuł o zakładanej aktywności biologicznej. Badania konformacji peptydomimetyków nie należą do rutynowych, wymagają między innymi parametryzacji niestandardowych ugrupowań. Dzięki współpracy w ramach macierzystej jednostki Kandydatka bardzo dobrze poradziła sobie z tym problemem. Szkoda tylko, że w rozprawie nie zamieściła szczegółów (wartości kątów, rozkład ładunków) struktur np. dipodstawionych pochodnych triazolu. Niedosyt budzi też brak opisu analizy sekwencyjnej (podano jedynie wartości przesunięć chemicznych). Nie podano nawet liczby więzów strukturalnych wykorzystanych w obliczeniach. To bardzo istotna informacja uwiarygadniająca wartość obliczonych konformacji. Na szczęście, wyniki dla trzech pierwszych dedydropeptydów zostały już opublikowane (Beilstein J. Org. Chem., 2014, 10, 660), o czym Kandydatka nie wspomina. W suplemencie do pracy zestawiono zidentyfikowane efekty NOE i obliczone na ich podstawie odległości międzyprotonowe. Z pracy dowiedzieć się można, że w obliczeniach jako więzy wykorzystano również wartości wicynalnych stałych sprzężeń (3JHN-Hα). Takiej informacji nie znalazłem w rozprawie. Syntetyzowane przez Kandydatkę glikopeptydy zawierały na C-końcach ugrupowanie metyloamidowe powstałe w wyniku N-metylowania odpowiedniego amidu. Nie można jednak tego zabiegu nazwać „metylowaniem C-terminalnej aminy” (str. 131). Zamieszczony ma końcu rozprawy wykaz skrótów nie zawiera wszystkich stosowanych w tekście, niektóre z nich odwołują się tylko do terminów angielskich, a np. podane rozwinięcie skrótu RP-HPLC jest błędne. Na podstawie lektury rozprawy doktorskiej mgr inż. Joanny Krzciuk-Guli, uważam, że jest Ona dobrze wykształconym chemikiem, zarówno od strony teoretycznej jak też 5 praktycznej. Wysoko oceniam zarówno zakres badań przeprowadzonych przez Doktorantkę, jak też ich objętość. Na tej podstawie wnioskuję, że opanowała metody syntezy i analizy konformacyjnej związków organicznych. Kandydata przygotowała interesującą rozprawę doktorską, a uzyskane przez Nią wyniki wnoszą istotny wkład w badania zależności preferencji konformacyjnej peptydomiemetyków od ich struktury pierwszorzędowej. Ogólna ocena rozprawy byłaby wyższa gdyby Doktorantka poświęciła więcej uwagi jej redakcji. Zdaję sobie jednak sprawę, że rozprawa doktorska to zwykle pierwsze duże opracowanie przygotowane samodzielnie przez kandydata. Doświadczenie nabyte w trakcie redakcji rozprawy to także jeden z ważniejszych celów, nie do przecenienia w przyszłej pracy zawodowej. Uwagi krytyczne recenzenta mają więc pomóc doktorantowi w doskonaleniu swoich umiejętności i z taką intencją zostały też zamieszczone. Z pełnym przekonaniem stwierdzam, że recenzowana rozprawa doktorska spełnia wszystkie kryteria ustawowe (Ustawa z dnia 14 marca 2003 r., Dz.U.03.65.595 wraz z późniejszymi zmianami (Dz. U. z 2014r. poz. 1852) i zwyczajowe, dlatego wnoszę do Rady Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej o dopuszczenie mgr inż. Joanny Krzciuk-Guli do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Gdańsk, dnia 22 stycznia 2016 roku 6