docPobierz dokument
download 
Reklamacja Transkrypt
Pobierz dokument
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 16.11.2005 05292431.3 (11) PL/EP (13) (51) 1659398 T3 Int.Cl. G01N 27/447 (2006.01) C07K 1/26 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 30.06.2010 Europejski Biuletyn Patentowy 2010/26 EP 1659398 B1 Tytuł wynalazku: Sposób analizy hemoglobiny za pomocą elektroforezy kapilarnej, zestaw do elektrofezy kapilarnej i zastosowanie spowalniacza przepływu w tym sposobie (30) Pierwszeństwo: 18.11.2004 FR 20040012263 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 24.05.2006 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/21 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.12.2010 Wiadomości Urzędu Patentowego 2010/12 (73) Uprawniony z patentu: SEBIA, Lisses, FR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1659398 T3 Frédéric Robert, Mennecy, FR Jean-Baptiste Clement, Etiolles, FR Denis Simonin, Evry, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Ewa Wojasińska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska 73 00-712 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). 2 Niniejszy [0001] wynalazek dotyczy sposobu rozdzielania hemoglobiny przez elektroforezę kapilarną jak i kompozycji buforowych przydatnych do tego rozdzielania, i zestawów do analizy hemoglobiny przez elektroforezę kapilarną. 5 [0002] Aby analizować hemoglobinę A2 i odmiany hemoglobiny, zwłaszcza, w płynach biologicznych, takich jak krew, w celach analitycznych, a zwłaszcza diagnostycznych, jak i w celu rozdzielenia hemoglobin przez elektroforezę, znane jest zastosowanie 10 technik elektroforezy kapilarnej (EC). Przez hemoglobiny, rozumie się tu każdą hemoglobinę, normalną lub nie, oraz odmiany tych hemoglobin. Jedną z korzyści elektroforezy kapilarnej jest to, że do analizy wymagane są tylko bardzo małe ilości cieczy biologicznych. Ponadto, rozdzielanie przez tę technikę może być bardzo szybkie, w 15 pomiarze gdzie mogą być użyte wysokie napięcia bez zbytniego ogrzewania próbki podczas rozdzielania. Zatem [0003] wybraną izoelektryczne pozwala 20 na różnymi formami stosowania 25 ogniskowanie uzyskanie automatyzacja tej powlekanymi, aby sprawia, trudno jest kapilarne zwiększonej analiza (CIEF). (Hempe) metody trudna i, zwanych też jest kapilar, powstrzymać ją przepływ stosować do przez Metoda rozdzielczości hemoglobiny powlekanych że techniką (7). ta między Jednak konieczność kapilarami elektroosmotyczny, analiz wykonywanych seryjnie. [0004] Inna technika zwana techniką «podwójnego powlekania dynamicznego» może być zastosowana zwłaszcza z zestawami handlowymi pod nazwą «Analis HbA2-CE zestaw» bądź «CEofix HbA2-CE 30 zestaw» pierwszym firmy przemywaniem Analis. kapilary Technika przez ta wiąże roztwór się z zawierający 3 polikation przy pH 4,7, a następnie drugim przemywaniem buforem do analizy zawierającym polianion, przy pH 8,7. W tej metodzie «podwójnego powlekania» bądź podwójnego pokrywania, ilość ładunków ujemnych obecnych na wewnętrznej 5 powierzchni kapilary jest też wyższa niż na kapilarze niepowlekanej, tak że przepływ elektroosmotyczny także jest ważniejszy. Ta metoda „podwójnego powlekania dynamicznego” nie 10 pozwala jednak frakcjami HbA2, HbC ilościową frakcji na i HbA2 wystarczające HbE. w Czyni to obecności rozdzielanie między niemożliwą analizę odmiany HbC lub HbE. Ponadto, jako że frakcje HbS i HbD mają to samo położenie elektroforetyczne, niezbędna jest analiza uzupełniająca w środowisku kwasu, aby oznaczyć typ odmiany obecnej w próbce. Na koniec, podwójne pokrywanie powinno być ponowione między 15 każdą analizą próbki, co czyni tę metodę kosztowną i trudną do stosowania do masowych prób. [0005] Według WO 97/04308, w elektrochromatografii wolne poliaminy stosuje się do rozdzielania enancjomerów. Ponadto, US 5 447 612 opisuje, że można stosować pewne szczególne 20 układy buforowe dla utrzymywania gradientów pH wymaganych w ogniskowaniu izoelektrycznym. [0006] Ponadto, opisano rozdzielanie hemoglobin w wolnym roztworze, lecz nie odpowiadają one kryteriom dokładności, rozdzielczości bądź szybkości oczekiwanych dla usprawnienia 25 analiz hemoglobin w EC. US 5 536 382 proponuje metodę analizy składników próbki i opisuje zwłaszcza próbki krwi uprzednio mieszane ze specyficznym odczynnikiem znaczonym. W FSCE, opisano analizę glikozylohemoglobiny, przy czym znaczony odczynnik jest specyficzny dla hemoglobiny ludzkiej 30 A1C. Ishoka (1) (1992) opisuje rozdzielanie hemoglobin z 4 zastosowaniem buforu boranowego (100 mM), przy pH 9,98 i czasach migracji rzędu 50 minut, to znaczy niezgodnych z czasem trwania analiz hemoglobin, tak jak są one wykonywane obecnie. Ten sam typ bufora, w podobnych warunkach stężenia 5 i pH (Jenkins)(3), (4) i (5) pozwala tylko na niewystarczające rozdzielenie między frakcjami HbA, HbF i HbS. Sahin (2) opisuje warunki bardziej kwaśnego pH, lecz wyniki są bardzo niewystarczające dla rozdzielania między frakcjami HbA, HbF, HbS i HbA2 przy mniejszych stężeniach 10 boranu (20 mM), lub z barbitalem (50mM), przy pH 8,5, i również bardzo niewystarczające dla rozdzielania między frakcjami HbA, HbS i HbA2 dla bufora Tris (1M) przy pH 8,0. Ponadto, zastosowano kombinacje Tris/ arginina (Shihabi) (6), i nawet jeśli pozwalają one na rozdzielanie HbA/HbS, 15 frakcje HbC/HbE i HbA2 nie są rozdzielone. Na koniec, opisy patentowe US 5 202 006 i US 5 439 825, które opisują zastosowanie barbitalu lub etylobarbitalu pozwalają otrzymać jedynie słabe rozdzielenie między głównymi Hb, którymi są HbA, HbF, HbS i HbC. 20 [0007] Pozostaje zatem potrzeba metody analizy hemoglobiny, a zwłaszcza hemoglobiny A2, która pozwoliłaby na analizę w pojedynczym etapie, i bez podwójnego pokrywania, która mogłaby być zastosowana automatycznie i seryjnie, i która zapewniłaby 25 w szczególności zadowalający rozdział między formami HbA2, HbC, HbD, HbE, HbS, HbF i HbA. [0008] Obecnie zgłaszający wykazał, że stosując bufor obojniaczojonowy do analizy w połączeniu ze spowalniaczem przepływu, zwłaszcza w EC w wolnym roztworze, możliwe jest uzyskanie 30 znacznie ulepszonego rozdzielania frakcji wspomnianych powyżej, w pojedynczym etapie, unikając zatem 5 uzupełniającego rozdzielania, i bez podwójnego pokrywania, co upraszcza zastosowanie. Korzystnie, stosowanym sposobem jest elektroforeza kapilarna w wolnym roztworze (FSCE oznacza «Free Solution Capillary Electrophoresis»). 5 [0009] Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy rozdzielania przez elektroforezę kapilarną hemoglobin w próbkach biologicznych, sposobem, w którym przepuszcza się próbkę biologiczną obejmującą wspomniane hemoglobiny przez kapilarę zawierającą bufor do analizy, obejmujący co najmniej jeden etap, gdzie 10 wprowadza się próbkę do rurki kapilarnej zawierającej roztwór buforowy do analizy, i w którym bufor jest typu obojniaczojonowego i jest związany z co najmniej jednym spowalniaczem przepływu. Po tym etapie w ogólności następuje rozdzielanie hemoglobiny, przez migrację i detekcja różnych 15 odmian. [0010] Jako wynalazku bufor obojniaczojonowy, bufor stosuje obojniaczojonowy się według buforujący między wartościami pH 8 i 10, i obejmujący co najmniej aminową grupę 20 funkcyjną, i co najmniej jedną kwasową grupę funkcyjną, i co najmniej jedną hydroksylową grupę funkcyjną w położeniu Przez przeciwległym kwasową grupę do kwasowej funkcyjną, grupy rozumie funkcyjnej. się tu w szczególności grupę funkcyjną kwasu karboksylowego lub grupę funkcyjną 25 sulfonowego. Bufor obojniaczojonowy można utworzyć z jednej lub dwóch cząsteczek: w przypadku, gdy aminowa grupa funkcyjna cząsteczce bez cząsteczka jest nośnikiem 30 kwasu kwasowej kwasowej związana grupy jest grupy z umieszczona funkcyjnej, drugą funkcyjnej, na pierwszej ta cząsteczką, zwłaszcza pierwsza będącą kwasowej grupy funkcyjnej karboksylowej lub sulfonowej lub takiej jak 6 aminokwas. Można wymienić, tytułem przykładu, glicynę jako aminokwas. Według [0011] wynalazku, spowalniacze przepływu są typu diaminy lub poliaminy alifatycznej lub cyklicznej. Są one na 5 przykład wybrane spośród diamin lub poliamin alifatycznych i/lub diamin lub poliamin cyklicznych. Korzystne są diaminy lub poliaminy alifatyczne. Jako diaminę alifatyczną, można wymienić tytułem diaminobutan, 10 przykładu 1,5-diaminopentan, dimetylo-1,6-heksanodiaminę, butanodiaminę poliaminy i ich dietylenotriaminę, 1,4- 1,6-diaminoheksan, N,N'- N,N,N',N'-tetrametylo-1,4- pochodne alifatyczne, 1,3-diaminopropan, i można sperminę, sole dopuszczalne. wymienić tytułem Jako przykładu tetraetylenopentaminę, i ich pochodne i sole dopuszczalne. Spowalniacze przepływu mogą 15 być użyte jako mieszaninia. [0012] Jako sól dopuszczalną, można wymienić chlorowodorek lub podobne sole. Jako pochodne, można wymienić na przykład, pochodne powyższych związków, w których atom lub atomy węgla łańcucha alifatycznego są podstawione przez ugrupowanie lub 20 ugrupowania alkilowe i/lub atom lub atomy wodoru wolnych amin są podstawione przez ugrupowanie lub ugrupowania alkilowe. [0013] Roztwór buforowy do analizy może ponadto obejmować inne 25 dodatki, zwłaszcza inne dodatki mające na celu ulepszenie rozdzielania różnych hemoglobin. [0014] znanych Ponadto, z wynalazek ich dotyczy aktywności zastosowania spowalniacza związków przepływu elektroforetycznego, w EC w wolnym roztworze w połączeniu z co najmniej jednym buforem obojniaczojonowym. 7 [0015] Jak to wyniknie z poniższych przykładów, zastosowanie kombinacji według wynalazku pozwala na znacznie ulepszony rozdział hemoglobiny i odmian hemoglobiny. Stąd pozwala ono ulepszyć 5 dokładność ilościowej odmian, sposobami. Pozwala i precyzję względem również analizy analiz na jakościowej wykonywanych oznaczenie i znanymi ilościowe HbA2, nawet w obecności HbC lub HbE. Kombinacje [0016] przepływu 10 według bufor obojniaczojonowy-spowalniacz wynalazku są szczególnie przydatne do analizy próbek, gdzie są obecne hemoglobiny normalne lub odmiany typu HbA2, HbC, HbD, HbE, HbS, HbF i/lub HbA, w celu ich wykrycia lub oznaczenia ilościowego. Na [0017] koniec, przedmiotem wynalazku są zestawy do analizy za pomocą EC hemoglobiny A2 i odmian hemoglobiny w 15 próbce biologicznej, obejmujące co najmniej jeden roztwór buforowy do analizy zawierający co najmniej jeden bufor do analizy typu obojniaczojonowego i co najmniej jeden spowalniacz przepływu, i ewentualnie modyfikator pH. Zatem, zestawy mogą obejmować co najmniej jeden bufor do analizy i 20 spowalniacz roztwory przepływu do według przemywania rozcieńczania i/lub wynalazku, kapilar i i/lub rozcieńczalnik lub roztwór lub segmenty do rozcieńczalniki analizowanej próbki. Mogą one obejmować ponadto co najmniej jeden 25 roztwór spowalniacz lub przechowywane przed Zestaw spowalniacze oddzielnie, użyciem, ten hemolizujący. lub obejmuje by W zestawie lub inne były przechowywane ewentualnie, tym, dodatki mieszane w mogą i być bezpośrednio postaci ponadto, bufor mieszaniny. wskazówki do stosowania dla wykonania analizy i/lub nośnik oprogramowania 30 informującego. 8 [0018] Inne cechy charakterystyczne i korzyści z wynalazku staną się widoczne z lektury szczegółowego opisu, który nastąpi, przykładów i załączonych figur. [0019] Figura 1 przedstawia elektroferogram normalnej krwi 5 ludzkiej HbA2) (HbA, analizowanej przez elektroforezę kapilarną stosując roztwór buforowy według wynalazku. [0020] Figury 2 do 5 przedstawiają, każda, elektroferogram krwi analizowanej przez elektroforezę kapilarną stosując ten sam roztwór buforowy. Krew obejmuje odpowiednio następujące 10 odmiany: fig. 2: HbF i HbS ; fig. 3: HbC ; fig. 4: HbE ; fig. 5: HbS i HbD-Los Angeles. 15 Figury 6a, elektroferogram krwi [0021] elektroforezę buforowe b, d przedstawiają, β-talasemicznej, kapilarną oparte c, na każda, analizowanej stosując cztery różne czterech różnych przez roztwory spowalniaczach przepływu. 20 Figury 7a, elektroferogram krwi [0022] b, c, obejmujący d przedstawiają, HbF i HbS, każda, analizowanej przez elektroforezę kapilarną stosując cztery różne roztwory buforowe oparte na czterech różnych spowalniaczach przepływu. 25 [0023] Warunki wykonania elektroforezy kapilarnej EC są znane specjaliście z dziedziny techniki. Mogą one obejmować zwykle przemywanie przemywanie rozcieńczanie roztworem lub kapilar buforowym rozcieńczania roztworem do przemywającym, analizy, próbki, ewentualne iniekcję próbki, 9 migrację i detekcję. Etapy te mogą być wykonane przez automaty. [0024] Warunkami wykonania elektroforezy kapilarnej są na przykład 5 warunki odpowiednie do zastosowania automatu Capillarys (SEBIA). [0025] Jako bufor obojniaczojonowy przydatny według wynalazku, można wymienić bufory typu « Tris » zawierające liczne ugrupowania przykładu, 10 bufory hydroksylowe Tris propanodiol), i zwłaszcza tytułem (2-amino-2-[hydroksymetylo]-1,3- Trycyna metylo]metyloglicyna), (N-tris[hydroksy-1TAPS (kwas N- tris[hydroksymetylo]metylo-3-aminopropanosulfonowy), (kwas TABS N-tris[hydroksymetylo]metylo-4-aminobutanosulfonowy), lub też AMPD (2-amino-2-metylo-1,3-propanodiol) lub Bis Tris 15 Propan (1,3-bis[tris(hydroksymetylo)metyloamino]propan), przy czym te dwa ostatnie i Tris powinny być połączone z aminokwasem. [0026] Inne cząsteczki o mniejszej liczbie ugrupowań hydroksylowych również nadają się, zwłaszcza takie jak AMPSO 20 (kwas 3-[(1,1-dimetylo-2-hydroksymetylo)amino]-2-hydroksy- propanosulfonowy), bicyna (N,N-bis[2-hydroksyetylo]glicyna), HEPBS (kwas N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[4- butanosulfonowy]). [0027] 25 Spośród buforów obojniaczojonowych wymienionych powyżej, korzystna jest trycyna. [0028] Bufory te są znane i dostępne w handlu. Mogą ponadto być użyte jako mieszaniny. [0029] Jako spowalniacz przepływu, spośród już wymienionych, korzystne są 1,4-diaminobutan (DAB), 1,5-diaminopentan, 1,6- 30 diaminoheksan, dietylenotriamina (DETA) i N,N,N',N'- 10 tetrametylo-1,4-butanodiamina. Spowalniacze mogą również być użyte jako mieszaniny. [0030] W połączeniu z trycyną, korzystny jest chlorowodorek 1,4-diaminobutanu. 5 [0031] Przez próbkę według wynalazku, rozumie się próbkę biologiczną do analizy to znaczy wszelki płyn biologiczny obejmujący czerwone ciałka pochodzące od pacjentów zdrowych lub chorych. krwią, 10 Zatem, normalną odwirowaną lub ludzkie lub nie, całkowitą. płyny biologiczne przemywaną, Ponadto, mogą być zdekantowaną, krew może być hemolizowana. [0032] Oprócz ludzkich próbek biologicznych, można analizować próbki pochodzenia zwierzęcego. Próbki mogą także być 15 pochodzenia syntetycznego, i sposób według wynalazku może zatem mieć na przykład na celu kontrolę produkcji. [0033] Próbka może być uprzednio rozcieńczona, na przykład odpowiednim roztworem do rozcieńczania, roztworem hemolizującym lub roztworem buforowym do analizy. [0034] 20 Metody EC stosujące kombinacje bufor obojniaczojonowy/spowalniacz przepływu według wynalazku są szczególnie przydatne do analiz krwi i rozdzielania hemoglobiny i jej odmian w próbkach ludzkich. [0035] Według wynalazku, pH roztworu buforowego do analizy jest zawarte między 8 i 11, korzystnie między 8 i 10. 25 [0036] Roztwory buforowe do analizy według wynalazku mogą ponadto obejmować co najmniej jeden związek modyfikujący pH. Jako modyfikator pH, można stosować związek wybrany spośród wodorotlenku litu, wodorotlenku sodu, wodorotlenku potasu, wodorotlenku rubidu, wodorotlenku cezu, wodorotlenku fransu, 11 wodorotlenku mono-, di-, tri- lub tetra-alkiloamoniowego mającego 1 do 8 atomów węgla w części alkilowej. [0037] Według wynalazku, bufory są stosowane w roztworach buforowych do analizy w typowych warunkach i stężeniach, 5 tzn. rzędu 20 do 500 mM, korzystnie 100 do 250 mM. Spowalniacze [0038] przepływu są użyte w roztworach buforowych, w stężeniach zawartych między około 0,01 i 50 mM, korzystnie około 0,10 i 20 mM. [0039] Ponadto, roztwór buforowy może obejmować dodatek lub 10 dodatki właściwe do modyfikowania siły jonowej. [0040] Jako takie związki, można wymienić sole takie jak siarczany, chlorki, na przykład, i ich mieszaniny. [0041] Roztwór hemolizujący pozwala na wykonanie hemolizy czerwonych 15 ciałek zawierających hemoglobinę A2 i odmiany hemoglobiny. Jest również przydatny do rozcieńczenia próbki przed analizą w EC. Może pozwolić, stosownie do swojego składu, na całkowitą lizę czerwonych ciałek stosując słaby dodatkowy ruch mechaniczny (wirowanie, mieszanie, ...). [0042] Roztwór hemolizujący obejmuje bufor do analizy, taki 20 jak te dodatki już do wymienione lizy (bufory komórkowej, jak obojniaczojonowe), na przykład typowe Triton X100 i/lub saponinę i ewentualnie inne dodatki mające na celu doprowadzenie do pozytywnego wpływu na rozdzielczość między pewnymi 25 wymienić bliskimi roztwór hemoglobinami. hemolizujący Tytułem przykładu, «Hydragel można hémoglobine» (Sébia). [0043] pH roztworu hemolizującego jest zawarte między 8 i 11, korzystnie między 8 i 10. [0044] Roztwory buforowe według wynalazku są wytworzone w 30 sposób typowy dla kompozycji buforu do analizy, tzn. przez 12 dodanie składników rozcieńczenia, przypadku, w do postaci ciekłej, dopuszczalnego nośnik jest lub nośnika. wodą, stałej W do typowym destylowaną lub demineralizowaną. 5 [0045] Z punktu widzenia materiałów użytych do kapilar, są one typowe stosować dla elektroforezy kapilarę wewnętrzna może ze kapilarnej. stopionej wynosić od 5 Zatem, krzemionki. do 2 Jej μm. 000 można średnica Korzystnie, stosuje się według wynalazku kapilarę o średnicy wewnętrznej 10 mniejszej od 200 μm, korzystnie mniejszej od 100 μm. Stosuje się korzystnie kapilarę poddawanej obróbce. dostosować charakter o wewnętrznej Specjalista kapilary i powierzchni będzie jej wiedział wielkość nie jak do potrzeb niepokrytych stanowi analizy. 15 [0046] Zastosowanie takich kapilar jedną z korzyści wynalazku. [0047] Hemoglobiny mogą być analizowane przy długości fali około 200 nm, na krwi hemolizowanej otrzymanej wychodząc ze krwi przemytej, zdekantowanej lub odwirowanej. Niemniej, aby 20 uniknąć interferencji analizowane hemolizowanej przy protein długości otrzymanej osocza, fali są około wychodząc ze one 415 nm, krwi korzystnie na krwi przemytej, zdekantowanej, odwirowanej lub całkowitej. Przykłady 25 Materiały i metody A) Elektroforeza kapilarna [0048] Elektroforeza kapilarna próbek klinicznych jest wykonana na aparacie EC wyposażonym w kapilarę ze stopionej krzemionki o średnicy wewnętrznej 25 mikronów. 13 [0049] Detekcja jest wykonana w optymalnych warunkach blisko 415 nm. [0050] Próbki są umieszczane w aparacie Capillarys (SEBIA) i automatycznie wstrzykiwane przez iniekcję hydrodynamiczną. 5 Rozdzielanie próbek jest wykonywane w mniej niż 8 minut z zastosowaniem pola elektrycznego około 550 V/cm. Kapilara jest przemywana przed każdą analizą zasadą sodową (0,25 M), a następnie roztworem buforowym do analizy. [0051] 10 Bufory do analizy : [0052] Produkty chemiczne użyte są klasy do analizy. • Bufor trycyna 200 mM -1,4-diaminobutan 15 mM (A) jest wytworzony przez rozpuszczenie 35,84 g trycyny w około 900 ml wody demineralizowanej, następnie dodanie 2,32 g chlorowodorku 1,4-diaminobutanu (DAB). pH doprowadza się do 15 9,37 w 22°C za pomocą około 38,3 ml NaOH (5M) i objętość roztworu buforowego doprowadza do 1 l wodą demineralizowaną. • Bufor trycyna 200 mM -1,5-diaminopentan 15 mM (B) jest wytworzony przez rozpuszczenie 35,84 g trycyny w około 900 ml 20 wody demineralizowanej, następnie dodanie 2,62 g chlorowodorku 1,5-diaminopentanu. pH doprowadza się do 9,40 w 22°C za pomocą około 38,4 ml NaOH 5M i objętość roztworu buforowego doprowadza do 1 l wodą demineralizowaną. • Bufor trycyna 200 mM -dietylenotriamina 20 mM (C) jest wytworzony przez rozpuszczenie 35,84 g trycyny w około 900 25 ml wody demineralizowanej, następnie dodanie 2,06 g dietylenotriaminy (DETA). pH doprowadza się do 9,40 w 22°C za pomocą około 32,4 ml NaOH (5M) i objętość roztworu buforowego doprowadza do 1 l wodą demineralizowaną. • 30 Bufor trycyna 200 mM - N,N,N',N'-tetrametylo-1,4- butanodiamina 8 mM (D) jest wytworzony przez rozpuszczenie 14 35,84 g trycyny następnie w około 900 dodanie 1,15 g ml wody demineralizowanej, N,N,N',N'-tetrametylo-1,4- butanodiaminy. pH doprowadza się do 9,19 w 22°C za pomocą około 5 34,7 ml NaOH 5M i objętość roztworu buforowego doprowadza do 1 l wodą demineralizowaną. B) Próbki kliniczne: [0053] Dla EC, krew ludzka, zdekantowana lub odwirowana, jest rozcieńczona do 1/6 w roztworze hemolizującym. Jest on wytworzony przez rozpuszczenie 1,00 g Triton X100, 2,50 g 10 saponiny, 3,63 g Tris w około 900 ml wody demineralizowanej. pH doprowadza doprowadza do się 1 l do 8,70 wodą w 22,0°C i objętość demineralizowaną. Użyte roztworu produkty chemiczne są klasy do analizy. Przykłady 1 do 5 15 [0054] Roztwór buforowy do analizy Trycyna/ DAB.2HCl jest wytworzony jak powyżej. [0055] Elektroforeza została wykonana według powyższej metody na krwi ludzkiej. [0056] Przykład 1: Analiza normalnej krwi ludzkiej z HbA w 20 piku głównym i HbA2 jako frakcją mniejszą. (Figura 1) [0057] Przykład 2: Analiza chorej krwi ludzkiej, która pokazuje słabszą frakcję HbA, zwiększoną frakcję HbF, silną frakcję HbS i normalną frakcję HbA2. Dotyczy to heterozygoty HbS pochodzącej z choroby - drepanocytozy. (Figura 2) 25 [0058] Przykład 3 : Analiza chorej krwi ludzkiej wykazująca heterozygotyczność A/C. Frakcja HbC wychodzi tuż przed frakcją HbA2, od której jest dobrze rozdzielona. Ten dobry rozdział czyni możliwym oznaczenie ilościowe A2, co pozwala na ukierunkowanie diagnostyki w przypadku β-talasemii, to 30 znaczy zwiększonej frakcji HbA2. (Figura 3) 15 [0059] Przykład 4: Analiza krwi ludzkiej wykazującej heterozygotyczność A/E. Frakcja HbE wychodzi tuż po frakcji HbA2, od której jest całkowicie rozdzielona. Nie ma zatem trudności, by ująć ilościowo HbA2 w obecności HbE. (Figura 5 4) [0060] Przykład 5: Analiza mieszaniny krwi wykazującej heterozygotyczność A/S i krwi wykazującej heterozygotyczność A/D Los Angeles. Frakcje HbS i HbD są częściowo rozdzielone, co 10 pozwala na rozróżnienie jednego od drugiego bez konieczności analizy uzupełniającej. (Figura 5) [0061] Przykład 6 : Analiza krwi ludzkiej β-talasemicznej, to znaczy wykazującej zwiększony procent funkcji HbA2 i małą frakcję HbF. [0062] Cztery roztwory buforowe do analizy A, B, C i D są 15 wytworzone jak powyżej. Elektroforeza [0063] została wykonana według metody opisanej powyżej. [0064] Figura 6a) podaje wynik z buforem A (Trycyna/DAB.2HCl). Figura 6b) pokazuje wynik z buforem B 20 (Trycyna/1,5-diaminopentan.2HCl). Figura 6c) podaje wynik z buforem C (Trycyna/ DETA). Figura 6d) podaje wynik z buforem D (Trycyna/N,N,N',N'-tetrametylo-1,4-butanodiamina). Porównanie [0065] tych czterech figur pozwala na obserwację, we wszystkich przypadkach, dobrego rozdzielania 25 każdej frakcji jak i dobrego ogniskowania małych frakcji HbF i HbA2. [0066] Przykład 7: Analiza krwi ludzkiej wykazującej heterozygotyczność drepanocytarną (HbS/HbA). [0067] 30 Cztery /DAB.2HCl; B roztwory : buforowe do analizy (A trycyna/1,5-diaminopentan.2HCl : trycyna : C : 16 trycyna/DETA ; D : trycyna/N,N,N',N'-tetrametylo-1,4- butanodiamina) są wytworzone jak powyżej. [0068] Elektroforeza została wykonana według metody opisanej powyżej. 5 [0069] Kolejność figur odpowiada wymienionym już buforom. Można tam znów zaobserwować porównywalne profile bez względu na użyty bufor. Literatura [0070] 10 1. Noriaki Ishioka et al., Biomedical Chromatography, vol. 6, 224-226 (1992). 2. Ahmet Sahin et al., Journal of Chromatography A, 709 (1995) 121-125. 3. Margaret A. Jenkins, Michael D. Guerin, Journal 15 of Chromatography B, 682 (1996) 23-34. 3 4. Margaret A. Jenkins, Jean Hendy, Ian L. Smith, J. CAP. ELEC. 004 : 3 (1997) 137-143. 5. Margaret A. Jenkins, Sujiva Ratnaike, Clinica Chimica Acta 289 (1999) 121-132. 20 6. Zak K. Shihabi et al., Electrophoresis, 21 (2000), 3 749-752. 7. James M. Hempe, Randall D. Craver, Electrophoresis, 21 (2000) 743-748. 17 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób biologicznych roztworze rozdzielania przez (FSCE), w hemoglobin elektroforezę którym próbkę w kapilarną próbkach w zawierającą wolnym wspomniane hemoglobiny przepuszcza się przez kapilarę zawierającą bufor 5 do analizy, wprowadza roztwór obejmujący się co próbkę najmniej co najmniej do rurki jednego jeden etap, kapilarnej buforu do w którym zawierającej analizy, znamienny tym, że hemoglobinami są hemoglobina A2 i hemoglobiny C, D, E, S, F i/lub A, i tym że bufor jest typu obojniaczojonowego 10 i jest związany z co najmniej jednym spowalniaczem przepływu wybranym, spośród diamin alifatycznych, poliamin alifatycznych, ich dopuszczalnych pochodnych i soli; i ich mieszanin. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje 15 ponadto rozdzielanie hemoglobin przez migrację i detekcję tych hemoglobin. 3. Sposób według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że próbka jest próbką krwi, normalnej lub nie, przemywanej, zdekantowanej, odwirowanej lub całkowitej. 20 4. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że próbka jest próbką krwi hemolizowanej. 5. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że bufor obojniaczojonowy jest utworzony z jednej lub dwóch cząsteczek, i obejmuje co najmniej jedną aminową grupę 25 funkcyjną, co najmniej jedną kwasową grupę funkcyjną i co najmniej jedną hydroksylową grupę funkcyjną w położeniu przeciwnym do kwasowej grupy funkcyjnej. 6. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że bufor obojniaczojonowy jest wybrany spośród trycyny, 18 TAPS, TABS, AMPSO, bicyny lub HEPBS, lub kombinacją Tris, AMPD lub Bis-Tris-propan z aminokwasem. 7. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że buforem jest trycyna. 8. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienny 5 tym, że spośród wspomniany spowalniacz 1,3-diaminopropanu, diaminopentanu, jest wybrany 1,4-diaminobutanu, 1,6-diaminoheksanu, sperminy, 10 przepływu 1,5- dietylenotriaminy, N,N'-dimetylo-1,6-heksanodiaminy, tetraetylenopentaminy, N,N,N',N'-tetrametylo-1,4- butanodiaminy i ich dopuszczalnych pochodnych lub soli, i ich mieszanin. 9. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienny tym, 15 że spośród wspomniany spowalniacz 1,4-diaminobutanu, diaminoheksanu, przepływu jest wybrany 1,5-diaminopentanu, dietylenotriaminy, 1,6- N,N,N',N'-tetrametylo- 1,4-butanodiaminy i ich dopuszczalnych pochodnych lub soli, i ich mieszanin. 10. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 9, znamienny 20 tym, że spowalniaczem przepływu jest 1,4-diaminobutan. 11. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 10, znamienny tym, że spowalniaczem przepływu jest 1,4-diaminobutan w postaci chlorowodorku. 12. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 11, znamienny 25 tym, że stężenie buforu w roztworze buforowym wynosi od 20 mM do 500 mM. 13. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że stężenie buforu w roztworze buforowym wynosi od 100 mM do 250 mM. 19 14. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 13, znamienny tym, że stężenie spowalniacza przepływu w roztworze buforowym wynosi od 0,01 do 50 mM. 15. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 14, znamienny 5 tym, że stężenie spowalniacza przepływu w roztworze buforowym wynosi od 0,10 mM do 20 mM. 16. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 15, znamienny tym, że roztwór buforowy obejmuje ponadto modyfikator pH. 17. 10 Sposób modyfikator pH według jest zastrz. wybrany 16, znamienny spośród tym, wodorotlenku że litu, wodorotlenku sodu, wodorotlenku potasu, wodorotlenku rubidu, wodorotlenku cezu, wodorotlenku fransu i wodorotlenku mono-, di-, tri- lub tetraalkiloamoniowego mającego od 1 do 8 atomów węgla w części alkilowej. 18. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 17, znamienny 15 tym, że kapilara jest niepokryta. 19. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 18, znamienny tym, że kapilara jest ze stopionej krzemionki. 20. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 19, znamienny 20 tym, że pH roztworu buforowego do analizy jest zawarte między 8 a 10. 21. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 20, w którym próbka jest uprzednio rozcieńczającym, 25 roztworem odpowiednim hemolizującym roztworem lub roztworem przepływu wybranego buforowym do analizy. 22. spośród Zastosowanie diamin dopuszczalnych sposobie 30 rozcieńczona spowalniacza alifatycznych, poliamin alifatycznych, pochodnych soli, ich elektroforezy i kapilarnej w i wolnym mieszanin, roztworze, ich w by rozdzielić hemoglobinę, w kombinacji z co najmniej jednym 20 buforem obojniaczojonowym w roztworze buforowym, przy czym hemoglobinami są: hemoglobina A2 i hemoglobiny C, D, E, S, F i/lub A. 23. 5 Zastosowanie według zastrz. 22, w którym bufor obojniaczojonowy jest obecny w stężeniu około 20 do 500 mM, i spowalniacz jest obecny w stężeniu około 0,01 do 50 mM. 24. Zestaw do analizy hemoglobiny przez elektroforezę kapilarną w wolnym roztworze, obejmujący co najmniej jeden roztwór 10 jeden buforowy bufor do do analizy analizy typu zawierający (1) co obojniaczojonowego najmniej i (2) co najmniej jeden spowalniacz przepływu wybrany spośród diamin alifatycznych, poliamin alifatycznych, ich dopuszczalnych pochodnych i soli, i ich mieszanin. 25. Zestaw do analizy według zastrz. 24, znamienny tym, 15 że obejmuje ponadto modyfikator pH. 26. znamienny Zestaw tym, do że analizy obejmuje według ponadto zastrz. roztwór 24, albo 25, hemolizujący. SEBIA Zastępca: 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
