Obliczanie LD50 na podstawie danych eksperymentalnych 1

ObliczanieLD50napodstawiedanycheksperymentalnych
1.Wprowadzenie
W celu określenia toksyczności występującej naturalnie lub stanowiącej
zanieczyszczenie środowiska substancji chemicznej, z którą człowiek ma kontakt,
konieczne jest przeprowadzenie wielu badań na zwierzętach, uwzględniających
wszystkie kierunki jej ewentualnego działania toksycznego. Badania
toksykologiczne najczęściej przeprowadza się, wykorzystując zdrowe i dojrzałe
płciowo białe myszy, szczury, świnki morskie, koty, psy, lub kury. Podstawowym
kryterium wyboru zwierząt jest metabolizm substancji najbardziej podobny do jej
metabolizmu u człowieka. Przystępując do badań, należy określić płeć, wiek, masę
ciała zwierzęcia oraz ustalić drogę wprowadzania substancji do ustroju. Daną
substancjęmożnawprowadzaćdoorganizmu:








doustnie(p.o.‐peros),
inhalacyjnie(inh.–inhalation),
dożylnie(i.v.‐viaintervenosa),
skórnie(cutanous,derm),
podskórnie(s.c.‐viasubcutanea),
naskórnie(p.c.‐viapercutanea),
domięśniowo(i.m.‐viaintramuscularia),
dootrzewnowo(i.p.‐viaintraperitonealis).
Doświadczenia na zwierzętach są długotrwałe i składają się z kilku etapów.
Pierwszym z nich jest badanie toksyczności ostrej. Toksyczność ostra jest to
zdolnośćsubstancjidowywołaniaefektutoksycznegopojejpodaniu(wchłonięciu)
doorganizmuwdawcejednorazowejlubpojednorazowymnarażeniu.Toksyczność
ostrą określa się ilościowo, wyznaczając LD50 powodującą śmierć 50% zwierząt
użytychwdoświadczeniu.WedługOrganizacjiWspółpracyEkonomicznejiRozwoju
(OECD‐OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment)wyróżniasiętrzy
sposobybadańtoksycznościostrejsubstancjiiwyznaczaniaLD50:
1)metodęklasyczną,
2)metodęustalonejdawki(FD‐FixedDoseProcedure),
3)metodęklasostrejtoksyczności(ATC‐AcuteToxicClassMethod).
Podczas badania toksyczności ostrej substancji podanej drogą pokarmową
preferuje się stosowanie metody ustalonej dawki lub metody klas ostrej
toksyczności.
Metodaklasyczna
Poleganapodawaniugrupiezwierzątskładającejsięz5‐10samcówitakiej
samej liczby samic badanej substancji w 3‐6 różnych dawkach. Jako graniczny
1 poziomdawkowaniaprzyjmujesię2000mg/kgm.c.Wdoświadczeniuwykorzystuje
się przynajmniej 3 gatunki zwierząt, z których nie więcej niż jedno powinno być
gryzonieminiewięcejniżjednoptakiem.Substancjepodawanesątrzemadrogami:
p.o., i.v., s.c. Podczas eksperymentu systematycznie kontroluje się masę ciała,
zauważone zmiany w zachowaniu, wygląd skóry, sierści, oczu. Szczególną uwagę
zwracasięnaczasywystąpieniaitrwaniaobjawówtoksycznych(wymioty,ślinotok,
biegunki, senność, drżenie) oraz czas padnięć poszczególnych zwierząt.
Eksperymentprowadzisięprzez14dni.Pozakończeniudoświadczeniauśmiercasię
takżezwierzęta,któreprzeżyły,wceluwykonaniabadańmakro‐imikroskopowych
narządów. Uzyskane dane zestawia się w tabele, w których umieszcza się liczbę
zwierzątnapoczątkudoświadczenia,liczbęzwierzątwykazującychobjawyzatrucia
orazopisobjawówtoksycznych,liczbęiczaspadnięć,wynikisekcji.Danepowinny
byćwystarczającedoopisaniazależnościdawka‐odpowiedźiobliczeniaLD50.
Metodaustalonejdawki(podaniedrogąpokarmową)
Badanie metodą ustalonej dawki składa się z dwóch etapów: wstępnego i
właściwego.Wbadaniuwstępnymbadasięskutkiróżnychdawek(5,50,500,2000
mg/kg m.c.) podawanych kolejno pojedynczym zwierzętom, preferowanym
gatunkiem jest szczur. Badanie to dostarcza informacji o zależności objawów
toksycznych od zastosowanej dawki i pozwala na oszacowanie minimalnej dawki
letalnej. Zazwyczaj w badaniu wstępnym nie przewiduje się użycia więcej niż 5
zwierząt.
W badaniu właściwym substancję należy podać drogą pokarmową grupie 5
samcówi5samicwjednejspośród4dawek:5,50,500i2000mg/kgm.c.Dawkę
powinno się dobrać tak, aby wywołała objawy widocznej toksyczności, ale nie
śmierć zwierzęcia. Po podaniu substancji trzeba dokonywać obserwacji
występujących objawów. Obserwacje powinny obejmować zachowanie, zmiany
masy ciała, skóry, sierści, oczu, błon śluzowych, jak również układu oddechowego,
krążenia i nerwowego. Szczególną uwagę zwraca się na występowanie drgawek,
ślinotoku, biegunki, letargu, senności, śpiączki. Jeżeli początkowa dawka wywoła
wyraźneobjawytoksyczne,alenieśmierćzwierzęcia,niemapotrzebyprowadzenia
dalszych badań. Jeżeli nie zaobserwowano wyraźnych objawów toksycznych przy
danym poziomie dawkowania, przechodzi się do badań z użyciem wyższej dawki
substancji, natomiast w razie śmierci zwierząt, substancję bada się, podając w
kolejnej,niższejdawce.Takaproceduraumożliwiawyznaczeniedawkiróżnicującej,
tj. najwyższej spośród wstępnie ustalonych, którą można podać bez obawy
wywołaniaśmiercizwierząt.Wmetodzietejjakoparametrkońcowyzamiastśmierci
zwierząt, przyjmuje się wyniki obserwacji wyraźnych objawów toksycznych.
Zarówno u zwierząt, które padną w czasie doświadczenia, jak i u tych, które
przeżyją,należywykonaćsekcję.Pozakończeniubadańsporządzasięsprawozdanie,
2 auzyskanewynikipowinnybyćprzedstawionewformietabel.Ocenęiinterpretację
wynikówpodanowtab.1.
Tabela1.Ocenaiinterpretacjawynikówwmetodzieustalonejdawki
Dawka
Wyniki
Interpretacja
[mg/kgm.c.]
substancje,któremogąbyćbardzo
‐
mniejniż100%
toksyczne
100%przeżycia,lecz
5
substancje,któremegabyćtoksyczne
widocznatoksyczność
100%przeżycia,brak
‐
należyocenićwynikpopodaniu50mg/kg
widocznejtoksyczności
substancje,któremogąbyćbardzo
‐
mniejniż100%przeżycia
toksycznelubtoksyczne;wyniknależy
ocenićpopodaniu5mg/kg
100%przeżycia,lecz
50
substancje,któremogąbyćszkodliwe
widocznatoksyczność
100%przeżycia,brak
‐
należyocenićwynikpopodaniu50mg/kg
widocznejtoksyczności
substancje,któremogąbyćbardzo
‐
mniejniż100%przeżycia
toksycznelubtoksyczne;wyniknależy
ocenićpopodaniu50mg/kg
należyrozważyć,czysubstancjanie
100%przeżycia,lecz
500
stwarzaryzykawystąpieniaistotnych
widocznatoksyczność
objawówostregozatrucia
100%przeżycia,brak
wyniknależyocenić popodaniu2000
‐
widocznejtoksyczności
mg/kg
wyniknależyocenić popodaniu500
2000
mniejniż100%przeżycia
mg/kg
100%przeżycia,zwidoczna
substancjaniestwarzaryzykaostrego
‐
lubniewidoczna
zatrucia
toksycznością
Metodaklasostrejtoksyczności(podaniedrogąpokarmową)
Wmetodzietejgrupiezwierzątpodajesiędożołądkowosubstancjęwjednejz
ustalonych dawek. Dawkę początkową wybiera się spośród trzech ustalonych
poziomów, tj. 25, 200 i 2000 mg/kg m.c. Substancję bada się etapowo,
wykorzystując na każdym etapie troje zwierząt jednej płci. Występowanie
śmiertelnościlubjejbraknajednymetapiedecydujeoetapienastępnym,tzn.otym,
że:
 niemapotrzebydalszegobadania,
 następny etap należy przeprowadzić z tą samą dawką, lecz na zwierzętach
innejpłci,
 następny etap należy przeprowadzić na kolejnym wyższym lub niższym
poziomiedawkowania.
3 Kolejne etapy postępowania (stosowanie dawek wyższych lub niższych)
zależą od liczby padłych i przeżywających zwierząt przy pierwszej dawce. Na
podstawie wyników badań nie wylicza się dokładnie LD50, a jedynie zakres
narażenia,wktórymspodziewanesązejściaśmiertelne,ponieważpadnięciaczęści
zwierząt są zasadniczym parametrem ocenianym w tym badaniu. Metoda ostrej
toksycznościdostarczainformacjisłużącychzarównodoszacowaniazagrożenia,jak
i do klasyfikacji, a jej zaletą jest mała liczba zwierząt wykorzystanych w
eksperymencie.
Dokładne postępowanie w badaniach toksyczności ostrej jest opisane w
Załączniku do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z 2003 roku, w którym czytamy
"badania na zwierzętach przeprowadza się w sposób humanitarny, zgodnie z
przepisami dotyczącymi zwierząt laboratoryjnych oraz zgodnie z
międzynarodowymi zaleceniami w tej dziedzinie. W przypadku istnienia kilku
równoważnych metod badań wybiera się spośród nich tę, która wymaga użycia
najmniejszejliczbyzwierząt".
Po zakończeniu badań laboratoryjnych na zwierzętach i tabelarycznym
zestawieniu danych oblicza się LD50 W celu wyliczenia LD50 stosuje się metody:
Behrensa, Kraebera, Thompsona. Wartość LD50 jest podstawą do klasyfikacji
substancjichemicznych(tab.2).
Tabela2.Klasyfikacjasubstancjinapodstawietoksycznościostrej
Metodaklasyczna,metoda
Metodaustalonejdawki
klastoksycznościostrej
(dawkaróżnicująca)
(dawkap.o.dlaszczura)
[mg/kgm.c.]
Klasatoksyczności
(symbol)*
bardzotoksyczna
LD50<25
<5
25<LD50<200
5
toksyczna(T)
II
50lub500
szkodliwa(Xn)
III
2000**
małoszkodliwa
IV
200<LD50<2000
2000<LD50
(T+)
I
*stosowanynaopakowaniachikartachcharakterystykisubstancji
**substancjaniestwarzaryzykaostregozatrucia
Drugim etapem jest określenie toksyczności podostrej (test 28‐dniowy). W
teścietymbadasięsubstancjeospodziewanejmałejtoksyczności,produkowanew
małychilościachimająceograniczoneprzeznaczenie.Badanąsubstancjępodajesię
doustnie codziennie w zróżnicowanych dawkach kilku grupom zwierząt, stosując
jedenpoziomdawkowanianagrupęprzez28dni.Należytestowaćnaprzynajmniej
10zwierzętach(5samcachi5samicach)nakażdymetapiedawkowania,zalecanym
gatunkiem jest szczur. Powinno się badać przynajmniej 3 grupy narażenia i grupę
kontrolną. Przez okres podawania substancji prowadzi się dokładne obserwacje
4 ogólnezwierzątwceluuchwyceniaobjawówtoksycznych.Nazakończeniebadania
przeprowadza się oznaczania hematologiczne, biochemiczne, makroskopowe i
histopatologiczne.Zarównozwierzęta,którepadnąwczasiedoświadczenia,jakite,
które przeżyły, po uśmierceniu poddaje się sekcji. Uzyskane wyniki zbiera się w
formietabeliipoddajesięoceniestatystycznej.Nazakończeniebadaniasporządza
się dokładne sprawozdanie. Specyficznym parametrem kontrolnym w tej metodzie
są zmiany neurologiczne. Za pomocą tej metody można wykazać zmiany
immunologiczneoraztoksycznośćwobecnarządówrozrodczych.
Trzecim etapem jest określenie toksyczności podprzewlekłej (test 90‐
dniowy). Badanie to dostarcza informacji o możliwym zagrożeniu dla zdrowia,
mogącymbyćnastępstwempowtarzanej,przedłużonejekspozycjiobejmującejokres
dojrzewania i wzrostu, aż do okresu dojrzałości. Badaną substancję podaje się
doustniecodzienniewstopniowanychdawkachkilkugrupomzwierzątprzez90dni;
jednadawkadlakażdejgrupy.Należytestowaćnaprzynajmniej20zwierzętach(10
samcach i 10 samicach) na każdym etapie dawkowania; zalecanym gatunkiem jest
szczur. Powinno się stosować przynajmniej 3 grupy narażenia i grupę kontrolną.
Podczastrwaniaeksperymentuprowadzisięogólneobserwacjezwierząt,kontroluje
się ich masę ciała, zmiany w wyglądzie i zachowaniu. Prowadzi się także
systematycznie badania krwi, moczu, a także wybranych narządów i tkanek. Na
zakończenie badania przeprowadza się oznaczania hematologiczne, biochemiczne
orazhistopatologiczne.Zarównozwierzęta,którepadnąwczasiedoświadczenia,jak
i te, któreprzeżyły, po uśmierceniu poddaje się sekcji. Otrzymanewynikipowinny
być zebrane w formie tabeli i poddane ocenie przy użyciu odpowiedniej metody
statystycznej, następnie sporządza się sprawozdanie z badań. Test 90‐dniowy
powinien wskazać narządy krytyczne i możliwość kumulacji oraz pozwolić na
oszacowanienajwyższejdawkilubpoziomuekspozycji,przyktórymnieobserwuje
sięszkodliwychobjawówwynikającychzpodawaniasubstancjitestowanej(NOAEL
‐ No Observed Adverse Effect Level). Badanie powinno pozwolić na identyfikację
substancji chemicznych mogących wywoływać efekty neurotoksyczne,
immunologiczne i reprodukcyjne oraz na uzyskanie informacji na temat wielkości
dawek,którepowinnybyćstosowanewnastępnymetapiebadań.
Kolejnymetapemjestokreślenietoksycznościprzewlekłej.Celemtychbadań
jest poznanie działania toksycznego w wyniku długotrwałej ekspozycji, określenie
narządów krytycznych, w których substancja jest kumulowana oraz wstępne
określenieewentualnegodziałaniarakotwórczegobadanejsubstancji.Eksperyment
prowadzi się przez przynajmniej 12 miesięcy, a w wypadku łącznego badania
toksyczności przewlekłej i działania rakotwórczego 2 lata na 3 grupach zwierząt;
równocześnie powinna być stosowana grupa kontrolna. Każdej grupie podaje się
inną dawkę substancji badanej. Zakres systematycznych obserwacji i badań jest
podobnydobadańprowadzonychpodczasustalaniatoksycznościpodprzewlekłej.
5 ObliczanieLD50napodstawiedanycheksperymentalnych
MetodaBehrensa
Założeniem tej metody jest łączne traktowanie zwierząt ze wszystkich grup,
mimo podawania im różnych dawek substancji. Przyjmuje się, że: jeżeli zwierzę
przeżywawyższądawkę,toprzeżyłobywszystkieniższedawki;jeżelizwierzępadaprzy
niższejdawce,topadałobyprzywszystkichwyższychdawkach.Obliczeniazestawiasię
tabelarycznie(tab.1).Następnieobliczasięśmiertelność(%)popodaniukażdejdawki.
Śmiertelnośćwyliczasię,dzielącwyliczonąliczbęzwierzątpadłychprzydanejdawcei
niższych przez całkowitą liczbę zwierząt poddanych działaniu danej dawki i mnoży
przez100.LD50przedstawiasięgraficznie.
Tabela1.SposóbobliczaniaLD50metodąBehrensa
Liczbazwierzątw
doświadczeniu
Dawka
przeżywających
padłych
Wyliczonaliczbazwierząt
przeżywających padłychprzy
danądawkęi
danejdawce
wyższe
iniższych
Całkowita
dladanej
dawki
Śmiertelność
[%]
MetodaKraebera
Założeniem tej metody jest łączne traktowanie zwierząt ze wszystkich grup,
mimo podawania im różnych dawek substancji, wśród których powinna być dawka
powodująca śmierć wszystkich zwierząt oraz dawka niedziałająca. Wyniki obserwacji
zestawiasiętabelarycznie(tab.2),anastępniewyliczasięLD50zewzoru:
LD
D
∑ ∙
,
gdzie:
Dmax‐dawka,popodaniuktórejpadływszystkiezwierzęta,
z‐połowasumypadłychzwierzątprzydwóchnastępującychposobiedawkach,
d‐różnicawartościliczbowychdwóchnastępującychposobiedawek,
n‐liczbazwierzątwgrupie.
Tabela2.SposóbobliczaniaLD50metodąKraebera
Dawka
Liczbazwierzątprzeżywających
Liczbazwierzątpadłych
z
d
z.d
Suma
1 MetodaThompsona
Wmetodzietejbadasię4grupyzwierząt,po5lub6sztukwkażdejistosujesię4
poziomy dawkowania. Zwierzęta z każdej grupy otrzymują wzrastającą w postępie
geometrycznymdawkęsubstancji.Obliczeniawykonujesięwedługwzoru:
logLD50=logDmin+(logM)(f+1),
gdzie:
Dmin–najmniejszastosowanadawka,
M‐mnożnikróżnicującypoziomdawkowania(liczbawskazująca,ilerazykolejnadawka
jestwiększaodpoprzedniej),
f ‐ współczynnik odczytany z tabel Weila zależny od liczby zwierząt w grupie i
śmiertelnościpopodaniuposzczególnychdawek(tab.3).
Tabela3.WspółczynnikisłużącedowyliczeniaLD50zewzoruThompsona
n=5
n=6
r
f
r
f
r
f
0,0,4,5
0,70000
0,1,5,4
0,75000
1,3,4,5
0,25000
0,1,3,4
0,87500
0,2,3,5
0,80000
1,4,4,4
0,00000
0,2,4,5
0,30000
0,2,3,4
1,00000
2,0,6,5
0,33333
1,0,4,5
0,62500
0,2,5,6
0,16667
2,2,3,5
0,66667
1,1,5,5
0,12500
1,0,6,6
0,40000
2,3,3,5
0,33333
1,1,3,4
0,83333
1,1,4,4
1,00000
3,1,5,5
0,00000
1,2,3,3
0,75000
1,2,4,4
0,66667
3,2,4,5
0,00000
1,2,3,4
0,50000
1,2,4,6
0,40000
3,3,3,4
0,00000
2,0,4,4
0,75000
1,2,5,4
0,33333
3,2,2,4
1,00000
2,1,4,4
0,25000
1,2,5,6
0,20000
4,2,2,6
0,50000
n‐liczbazwierzątwgrupie,r‐liczbazwierzątpadłychpopodaniukolejnychdawek
Przebiegćwiczenia
Podczasćwiczenianależywykonaćnastępująceczynności:
1. Na podstawie danych otrzymanych od prowadzącego zajęcia obliczyć trzema
metodami LD50 wskazanej substancji. Uzyskane wyniki przedstawić w formie
tabelarycznejdlametodyBehrensa(tab.1)idlametodyKraebera(tab.2).
2.Wynikiotrzymaneprzezposzczególnegrupyzestawićtabelarycznie.
3.Wyjaśnićnastępującepojęcia:dawkaróżnicująca,ksenobiotyki,efektsubletalny.
4. Uzupełnij zdanie: Gdy istnieje wyraźna różnica między wartościami LD50
dwóchróżnych substancji, to ta, która ma wartość ………….., jest uważana za
potencjalniesilniejszątruciznę.
2 Tabela4.DanedoobliczeńLD50
Substancja
Liczba
Gatunek zwierząt Płeć
wgrupie
Chlorek
fenylortęci
szczur
6
M/F
Faloidyna
mysz
6
M/F
Patulina
szczur
5
M/F
Tlenekkadmu
szczur
6
M/F
Difenyl
szczur
6
M
Difenyl
królik
6
M
Chlorfenwinfos
królik
5
M
Chlorfenwinfos
królik
5
F
Fosamidon
szczur
6
F
Fosamidon
szczur
6
M
Paration
szczur
6
F
Paration
szczur
6
M
Amygdalina
mysz
6
M/F
Dawka[mg/kgm.c.]
Metody:Behrensa,
MetodaThompsona
Krabera
13,6(6),15,0(5),16,5
16,5(3),18,2(3),20,0
(3),18,2(3),20,0(3),
(3),22,0(2)
22,0(2),24,2(0)
1,00(6),1,20(5),1,44
1,73(4),2,07(4),2,49
(4),1,73(4),2,07(4),
(3),2,99(1)
2,49(3),2,99(1)
30,0(4),37,5(4),46,9
37,5(4),46,9(3),58,6
(3),58,6(2),73,2(2),
(2),73,2(2)
91,6(0)
153(6),176(5),202
176(5),202(5),232(2),
(5),232(2),267(2),
267(2)
307(0)
1666(6),2000(5),
2400(4),2880(4),
2880(4),3456(3),4147
3456(3),4147(2),
(2),4976(1)
4976(1)
1666(5),2000(4),
2400(3),2880(2),
1666(5),2000(4),
3456(2),4147(0),
2400(3),2880(2)
4976(0)
180(5),207(4),238
207(4),238(3),274(2),
(3),274(2),315(1),
315(1)
362(0)
300(5),345(4),387
345(4),387(4),456(2),
(4),456(2),525(1),
525(1)
603(1),693(0)
3,00(6),3,21(5),3,43
3,21(5),3,43(4),3,68
(4),3,68(2),3,93(2),
(2),2,93(2)
4,20(1),4,50(0)
11,0(6),11,8(5),12,6
12,6(4),13,5(3),
(4),13,5(3),14,4(3),
14,4(3),15,4(1)
15,4(1),16,5(0)
3,00(6),3,21(5),3,43
3,21(5),3,43(4),3,68
(4),3,68(2),3,93(2),
(2),3,93(2)
4,20(1),4,50(0)
11,0(6),11,8(5),12,6
12,6(4),13,5(3),14,4
(4),13,5(3),14,4(3),
(3),15,4(1)
15,4(1),16,5(0)
200 (6),230(5),264,5
264,5(5),304,2(2),350
(5),304,2(2),350
(2),402(2)
(2),402(2)
(x)–liczbazwierzątprzeżywających
3