docToksykometria
download 
Reklamacja Transkrypt
Toksykometria
Toksykometria Toksykometria – zajmuje się oceną toksycznego działania substancji. istnieje ok. 25 mln substancji chemicznych 70.000-100.000 związków chemicznych (spisy substancji TSCA, EINECS) ok. 1500 to substancje wielkotonażowe (10.000 ton/rok) ok. 2000 nowych substancji na rynku rocznie (leki, barwniki, rozpuszczalniki, składniki mas plastycznych, kosmetyki, pestycydy, środki dodawane do żywności lub paszy zwierzęcej) Cele badań toksykometrycznych wykrycie szkodliwego działania związku jakościowa i ilościowa charakterystyka związku ustalenie przyczyny zgonu badania toksykometryczne przeprowadzane są na zwierzętach i testach in vitro (względy etyczne) wyspecjalizowane laboratoria, personel, zwierzętarnie, aparatura badawcza wyjaśnienie mechanizmów działania toksycznego odpowiednie zabezpieczenie przy produkcji, transporcie, przechowywaniu, ujednolicenie metod i zakresu badań - Wytyczne do badań substancji chemicznych (OECD - Organization for Economic Cooperation and dystrybucji i użyciu określonej substancji Development, Organizacja Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju) określenie dopuszczalnych parametrów ekspozycji człowieka i środowiska naturalnego (dopuszczalne stężenia, dawki dzienne) Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna – aktywność biologiczna Etapy badań toksykometrycznych Ocena właściwości fizykochemicznych • Porównanie ze związkami podobnymi (struktura chemiczna – aktywność biologiczna) Ocena toksyczności ostrej • Działania drażniącego • Działania uczulającego • Badania dodatkowe (drogi podania, toksykokinetyka, metabolizm) Ocena efektów odległych • Genotoksyczność, rakotwórczość, teratotwórczość • Wpływ na płodność, rozrodczość i potomstwo Ocena toksyczności przewlekłej w teście 2-letnim (lub rocznym) Ocena toksyczności podostrej • 14, 21, 28 dni (przy powtarzanym dawkowaniu) • Ocena działania kumulatywnego Ocena toksyczności podprzewlekłej Aldehydy = dz. drażniące Nitrozwiązki aromatyczne i aminopochodne = dz. methemoglobinotwórcze Chloropochodne alifatyczne = uszkodzenia wątroby Związki fosforoorganiczne = inh. acetylocholinoesterazy (AChE) • 90 dni (przy powtarzanym dawkowaniu) Ocena działania neurotoksycznego 1 Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna – aktywność biologiczna Zależność aktywności działania toksycznego i kancerogennego od struktury chemicznej i właściwości fizykochemicznych związku (QSAR – quantitative structure activity relationship) Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna – aktywność biologiczna Ze wzrostem liczby atomów C w cząsteczce alkoholi alifatycznych rośnie siła ich narkotycznego działania (prawo Richardsona, 1869 r.), podobnie alkany, alkeny, chloropochodne węglowodory, ketony, estry. Budowa chemiczna Toksyczność węglowodorów alifatycznych rośnie ze wzrostem rozgałęzienia łańcucha Węglowodory nienasycone (benzen) są bardziej toksyczne niż nasycone Właściwości fizykochemiczne Aktywność chemiczna (cykloheksan) Aktywność biologiczna Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna – aktywność biologiczna Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna – aktywność biologiczna Toksyczność związków zwiększa się, gdy dodane podstawniki: Toksyczność związków zmniejsza się, gdy dodane podstawniki: -OH w związkach aromatycznych (fenol bardziej toksyczny niż benzen) -COOH w związkach łańcuchowych i pierścieniowych (zwiększa -NH2 dz. methemoglobinotwórcze -OH w związkach alifatycznych (glicerol bardzo mało toksyczny w porównaniu z propanolem) -CH3 w związkach pierścieniowych -NO2, -NO silne działanie utleniające -CN, -F prowadzi do syntezy letalnej rozpuszczalność i ułatwia wydalanie przez nerki) -SO3H zwiększa rozpuszczalność związków w wodzie, lepsze wydalanie przez nerki -SH, -CH3CO –CH3O –C2H5O, -N=N- Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna – aktywność biologiczna Zwierzęta doświadczalne Zalecane stosowanie dwóch różnych gatunków zwierząt (jeden z nich nie może Właściwości fizykochemiczne wpływają na toksyczność (temperatura wrzenia benzenu 80oC, niższa niż homologów, np. toluenu, ksylenu), zbliżone wartości LD50 a ryzyko zatrucia benzenem największe Lipofilowość substancji (współczynnik podziału olej/woda) - Łazariew, 1944 r. Ułatwia transport do receptora (przenikanie przez bariery lipidowe), ale nadmierna lipofilowość powoduje zatrzymanie substancji w pierwszej napotkanej warstwie lipidowej. Po / w = być gryzoniem), najczęściej myszy i szczury W szczególnych przypadkach koty, psy, naczelne, jednodniowe kurczęta, kury, pstrągi, świnki morskie , chomiki Używa się obu płci (wpływ hormonów i różna aktywność enzymów) Zwierzęta zdrowe, młode, dojrzałe płciowo, o zbliżonej masie ciała (+/- 10%), aklimatyzowane do warunków doświadczalnych min. 5 dni Stabilne warunki klimatyczne (temp. 23 oC, wilgotność wzgl. 30-70 %), cykl Co Cw oświetlenia 12h/12h Swobodny dostęp do wody i karmy (kontrola zanieczyszczeń) Grupa kontrolna przebywa w tych samych warunkach 2 Drogi narażenia Ocena toksyczności ostrej Toksyczność ostra jest to zdolność substancji do wywołania efektu toksycznego po doustnie (p.o. - per os) jej podaniu (wchłonięciu) do organizmu w dawce jednorazowej lub po inhalacyjnie (inh. - inhalation) jednorazowym narażeniu. Toksyczność ostrą określa się ilościowo, wyznaczając dożylnie (i.v. - via intervenosa) LD50 powodującą śmierć 50% zwierząt użytych w doświadczeniu. skórnie (cutanous, derm) podskórnie (s.c. - via subcutanea) Daje odpowiedź na pytania: naskórnie (p.c. - via percutanea) 1. Jaka jest dawka potrzebna, aby zwierzę padło? domięśniowo (i.m. - via intramuscularia) 2. Jakie narządy ulegają uszkodzeniu? dootrzewnowo (i.p. - via intraperitonealis) 3. Czy substancja ma działanie drażniące, czy uczulające? Ocena toksyczności ostrej Ocena toksyczności ostrej Według OECD wyróżnia się cztery sposoby badań toksyczności ostrej substancji i Dokładne postępowanie w badaniach toksyczności ostrej jest opisane w Załączniku wyznaczania LD50: do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z 2003 roku, w którym czytamy „badania na 1) metodę klasyczną, zwierzętach przeprowadza się w sposób humanitarny, zgodnie z przepisami 2) metodę ustalonej dawki (FD - Fixed Dose Procedure, wytyczne OECD nr 420), dotyczącymi zwierząt laboratoryjnych oraz zgodnie z międzynarodowymi 3) metodę klas ostrej toksyczności (ATC - Acute Toxic Class Method, wytyczne OECD zaleceniami w tej dziedzinie. W przypadku istnienia kilku równoważnych metod nr 423), badań wybiera się spośród nich tę, która wymaga użycia najmniejszej liczby 4) metodę skokową (Up-Down-Up, wytyczne OECD nr 425). zwierząt”. Podczas badania toksyczności ostrej substancji podanej drogą pokarmową preferuje się stosowanie metody ustalonej dawki lub metody klas ostrej toksyczności. Metoda klasyczna Metoda klasyczna Polega na podawaniu grupie zwierząt składającej się z 5-10 samców i takiej samej Po zakończeniu doświadczenia uśmierca się także zwierzęta, które przeżyły, w celu liczby samic badanej substancji w 3-6 różnych dawkach. Jako graniczny poziom wykonania badań makro- i mikroskopowych narządów. Uzyskane dane zestawia się dawkowania przyjmuje się 2000 mg/kg m.c. W doświadczeniu wykorzystuje się w tabele, w których umieszcza się liczbę zwierząt na początku doświadczenia, przynajmniej 3 gatunki zwierząt, z których nie więcej niż jedno powinno być liczbę zwierząt wykazujących objawy zatrucia oraz opis objawów toksycznych, gryzoniem i nie więcej niż jedno ptakiem. Substancje podawane są trzema liczbę i czas padnięć, wyniki sekcji. Dane powinny być wystarczające do opisania drogami: p.o., i.v., s.c. Podczas eksperymentu systematycznie kontroluje się masę zależności dawka - odpowiedź i obliczenia LD50. ciała, zauważone zmiany w zachowaniu, wygląd skóry, sierści, oczu. Szczególną uwagę zwraca się na czasy wystąpienia i trwania objawów toksycznych (wymioty, ślinotok, biegunki, senność, drżenie) oraz czas padnięć poszczególnych zwierząt. Eksperyment prowadzi się przez 14 dni. 3 Metoda ustalonej dawki (podanie drogą pokarmową) Metoda ustalonej dawki (podanie drogą pokarmową) Badanie metodą ustalonej dawki składa się z dwóch etapów: wstępnego i Po podaniu substancji trzeba dokonywać obserwacji występujących objawów. właściwego. Obserwacje powinny obejmować zachowanie, zmiany masy ciała, skóry, sierści, W badaniu wstępnym bada się skutki różnych dawek (5, 50, 500, 2000 mg/kg m.c.) oczu, błon śluzowych, jak również układu oddechowego, krążenia i nerwowego. podawanych kolejno pojedynczym zwierzętom, preferowanym gatunkiem jest Szczególną uwagę zwraca się na występowanie drgawek, ślinotoku, biegunki, szczur. Badanie to dostarcza informacji o zależności objawów toksycznych od letargu, senności, śpiączki. Jeżeli początkowa dawka wywoła wyraźne objawy zastosowanej dawki i pozwala na oszacowanie minimalnej dawki letalnej. toksyczne, ale nie śmierć zwierzęcia, nie ma potrzeby prowadzenia dalszych badań. Zazwyczaj w badaniu wstępnym nie przewiduje się użycia więcej niż 5 zwierząt. Jeżeli nie zaobserwowano wyraźnych objawów toksycznych przy danym poziomie W badaniu właściwym substancję należy podać drogą pokarmową grupie 5 dawkowania, przechodzi się do badań z użyciem wyższej dawki substancji, samców i 5 samic w jednej spośród 4 dawek: 5, 50, 500 i 2000 mg/kg m.c. Dawkę natomiast w razie śmierci zwierząt, substancję bada się, podając w kolejnej, niższej powinno się dobrać tak, aby wywołała objawy widocznej toksyczności, ale nie dawce. śmierć zwierzęcia. Ocena i interpretacja wyników w metodzie ustalonej dawki Metoda ustalonej dawki (podanie drogą pokarmową) Dawka Wyniki Interpretacja [mg/kg m.c.] mniej niż 100% przeżycia substancje, które mogą być bardzo toksyczne 100% przeżycia, lecz widoczna toksyczność substancje, które mogą być toksyczne wstępnie ustalonych, którą można podać bez obawy wywołania śmierci zwierząt. 100% przeżycia, brak widocznej toksyczności należy ocenić wynik po podaniu 50 mg/kg W metodzie tej jako parametr końcowy zamiast śmierci zwierząt, przyjmuje się mniej niż 100% przeżycia Taka procedura umożliwia wyznaczenie dawki różnicującej, tj. najwyższej spośród wyniki obserwacji wyraźnych objawów toksycznych. Zarówno u zwierząt, które 5 substancje, które mogą być bardzo toksyczne lub toksyczne; wynik należy ocenić po podaniu 5 mg/kg 50 100% przeżycia, lecz widoczna toksyczność substancje, które mogą być szkodliwe padną w czasie doświadczenia, jak i u tych, które przeżyją, należy wykonać sekcję. 100% przeżycia, brak widocznej toksyczności należy ocenić wynik po podaniu 50 mg/kg Po zakończeniu badań sporządza się sprawozdanie, a uzyskane wyniki powinny być mniej niż 100% przeżycia substancje, które mogą być bardzo toksyczne lub toksyczne; wynik należy ocenić po podaniu 50 mg/kg przedstawione w formie tabel. 500 2000 należy rozważyć, czy substancja nie stwarza ryzyka 100% przeżycia, lecz widoczna toksyczność wystąpienia istotnych objawów ostrego zatrucia 100% przeżycia, brak widocznej toksyczności wynik należy ocenić po podaniu 2000 mg/kg mniej niż 100% przeżycia wynik należy ocenić po podaniu 500 mg/kg 100% przeżycia, z widoczną lub niewidoczną toksycznością substancja nie stwarza ryzyka ostrego zatrucia Metoda klas ostrej toksyczności (podanie drogą pokarmową) Metoda klas ostrej toksyczności (podanie drogą pokarmową) W metodzie tej grupie zwierząt podaje się dożołądkowo substancję w jednej z Kolejne etapy postępowania (stosowanie dawek wyższych lub niższych) zależą od ustalonych dawek. Dawkę początkową wybiera się spośród trzech ustalonych liczby padłych i przeżywających zwierząt przy pierwszej dawce. Na podstawie poziomów, tj. 25, 200 i 2000 mg/kg m.c. Substancję bada się etapowo, wyników badań nie wylicza się dokładnie LD50, a jedynie zakres narażenia, w wykorzystując na każdym etapie troje zwierząt jednej płci. Występowanie którym spodziewane są zejścia śmiertelne, ponieważ padnięcia części zwierząt są śmiertelności lub jej brak na jednym etapie decyduje o etapie następnym, tzn. o zasadniczym parametrem ocenianym w tym badaniu. Metoda ostrej toksyczności tym, że: dostarcza informacji służących zarówno do szacowania zagrożenia, jak i do • nie ma potrzeby dalszego badania, klasyfikacji, a jej zaletą jest mała liczba zwierząt wykorzystanych w eksperymencie. • następny etap należy przeprowadzić z tą samą dawką, lecz na zwierzętach innej płci, • następny etap należy przeprowadzić na kolejnym wyższym lub niższym poziomie dawkowania. 4 Metoda skokowa Metoda oparta jest na ocenie śmiertelności zwierząt, którym pojedynczo podaje Po zakończeniu badań laboratoryjnych na zwierzętach i tabelarycznym zestawieniu się badaną substancję w 3 dawkach wzrastających lub malejących, w zależności od danych oblicza się LD50. W celu wyliczenia LD50 stosuje się metody: Blissa, Finneya, reakcji po podaniu poprzedniej dawki. Podobną metodę opracowani w 1943r. Lichfielda i Wilcoxona, Behrensa, Kraebera, Thompsona, Weila. Wartość LD50 jest Deichman i LeBlanc. podstawą do klasyfikacji substancji chemicznych. Dla substancji toksycznych gazowych w miejsce LD50 można ustalić medialne stężenie letalne (LC50) w powietrzu (w Europie wyrażane w mg/m3). Do doświadczeń wykorzystuje się komory inhalacyjne. Prawo Habera W pewnym zakresie stężeń zgon zwierzęcia można spowodować niższym stężeniem substancji w powietrzu, przedłużając czas ekspozycji. Zjawisko to znane jako prawo Habera określa wzór: E0 = C.t stężenie Prawo Habera E0 = C.t Dla wywołania efektu letalnego E0 potrzebne jest osiągnięcie odpowiedniego C1 iloczynu stężenia C i czasu ekspozycji t. Zgon nastąpi, gdy iloczyn ten osiągnie pewną stałą wartość. C2 Prawo Habera spełnione jest tylko dla krótkich odstępów czasu (rzędu godzin). Później wpływają już procesy biotransformacji i wydalania. t1 t2 czas Klasyfikacja działania toksycznego substancji chemicznych po podaniu dożołądkowym, stosowana w krajach UE (Dyrektywa RE 93/32/EWG 30.04.1992 r.) Klasyfikacja toksyczności trucizn wg Hodge’a i Sternera (USA) Stopień toksyczności 1 2 3 Nazwa Nadzwyczaj toksyczna Bardzo toksyczna Średnio toksyczna LD50 (g/kg m.c.) droga doustna; szczury Prawdopodobna LD50 (g/kg m.c.) LD50 (ppm) dawka śmiertelna droga droga inhalacyjna; dla dorosłego dermalna; szczury człowieka w króliki gramach ≤0,001 ≤0,005 ≤10 ≈0,065 0,05 0,043 100 4 0,5 0,34 1000 30 4 Słabo toksyczna 5,0 2,81 10 000 250 5 Praktycznie nietoksyczna 15,0 22,6 100 000 1000 6 Stosunkowo nieszkodliwa >15,0 >22,6 >100 000 >1000 Metoda klasyczna, metoda Metoda ustalonej dawki klas toksyczności ostrej (dawka różnicująca) (dawka p.o. dla szczura) [mg/kg m.c.] LD50 < 25 <5 25 < LD50 < 200 5 200 < LD50 < 2000 50 lub 500 2000 < LD50 2000** Klasa toksyczności (symbol)* bardzo toksyczna (T+) toksyczna (T) szkodliwa (Xn) mało szkodliwa I II III IV * stosowany na opakowaniach i kartach charakterystyki substancji ** substancja nie stwarza ryzyka ostrego zatrucia 5 Ocena toksyczności podostrej (test 28-dniowy) Ocena toksyczności podostrej (test 28-dniowy) W teście tym bada się substancje o spodziewanej małej toksyczności, produkowane w małych ilościach i mające ograniczone przeznaczenie. Badaną substancję podaje się doustnie codziennie w zróżnicowanych dawkach kilku grupom zwierząt, stosując jeden poziom dawkowania na grupę przez 28 dni. Należy testować na przynajmniej 10 zwierzętach (5 samcach i 5 samicach) na każdym etapie dawkowania, zalecanym gatunkiem jest szczur. Powinno się badać przynajmniej 3 grupy narażenia i grupę kontrolną. Przez okres podawania Zarówno zwierzęta, które padną w czasie doświadczenia, jak i te, które przeżyły, po uśmierceniu poddaje się sekcji. Uzyskane wyniki zbiera się w formie tabeli i poddaje się ocenie statystycznej. Na zakończenie badania sporządza się dokładne sprawozdanie. Specyficznym parametrem kontrolnym w tej metodzie są zmiany neurologiczne. Za pomocą tej metody można wykazać zmiany immunologiczne oraz toksyczność wobec narządów rozrodczych. substancji prowadzi się dokładne obserwacje ogólne zwierząt w celu uchwycenia objawów toksycznych. Na zakończenie badania przeprowadza się oznaczania hematologiczne, biochemiczne, makroskopowe i histopatologiczne. Ocena toksyczności podprzewlekłej (test 90-dniowy) Ocena toksyczności podprzewlekłej (test 90-dniowy) Badanie to dostarcza informacji o możliwym zagrożeniu dla zdrowia, mogącym być Zarówno zwierzęta, które padną w czasie doświadczenia, jak i te, które przeżyły, po następstwem powtarzanej, przedłużonej ekspozycji obejmującej okres dojrzewania i uśmierceniu poddaje się sekcji. Otrzymane wyniki powinny być zebrane w formie tabeli i wzrostu, aż do okresu dojrzałości. Badaną substancję podaje się doustnie codziennie w poddane ocenie przy użyciu odpowiedniej metody statystycznej, następnie sporządza się stopniowanych dawkach kilku grupom zwierząt przez 90 dni; jedna dawka dla każdej grupy. sprawozdanie z badań. Test 90-dniowy powinien wskazać narządy krytyczne i możliwość Należy testować na przynajmniej 20 zwierzętach (10 samcach i 10 samicach) na każdym kumulacji oraz pozwolić na oszacowanie najwyższej dawki lub poziomu ekspozycji, przy etapie dawkowania, zalecanym gatunkiem jest szczur. Powinno się stosować przynajmniej 3 którym nie obserwuje się szkodliwych objawów wynikających z podawania substancji grupy narażenia i grupę kontrolną. Podczas trwania eksperymentu prowadzi się ogólne testowanej (NOAEL - No Observed Adverse Effect Level). Badanie powinno pozwolić na obserwacje zwierząt, kontroluje się ich masę ciała, zmiany w wyglądzie i zachowaniu. identyfikację substancji chemicznych mogących wywoływać efekty neurotoksyczne, Prowadzi się także systematycznie badania krwi, moczu, a także wybranych narządów i immunologiczne i reprodukcyjne oraz na uzyskanie informacji na temat wielkości dawek, tkanek. które powinny być stosowane w następnym etapie badań. Na zakończenie badania przeprowadza się oznaczania hematologiczne, biochemiczne oraz histopatologiczne. Ocena toksyczności przewlekłej Ocena toksyczności przewlekłej Celem tych badań jest poznanie działania toksycznego w wyniku długotrwałej ekspozycji, Te długotrwałe doświadczenia prowadzi się w celu ustalenia stężeń, przy których określenie narządów krytycznych, w których substancja jest kumulowana oraz wstępne wielokrotnie narażenie nie wywoływałoby efektów toksycznych. Należy tu wyznaczyć: określenie ewentualnego działania rakotwórczego badanej substancji. Eksperyment • prowadzi się przez przynajmniej 12 miesięcy, a w wypadku łącznego badania toksyczności efektów NOAEL (ang. No Observed Adverse Effect Level) - najwyższy poziom niewywołujący przewlekłej i działania rakotwórczego 2 lata na 3 grupach zwierząt; równocześnie powinna • być stosowana grupa kontrolna. Każdej grupie podaje się inną dawkę substancji badanej. efekty Zakres systematycznych obserwacji i badań jest podobny do badań prowadzonych podczas Dzięki nim można wyznaczyć normy: ustalania toksyczności podprzewlekłej. • NDS (Najwyższe Dopuszczalne Stężenie) Dzięki ocenie toksyczności przewlekłej można poznać mechanizmy i efekty działania • NDSCh (Najwyższe Dopuszczalne Stężenie Chwilowe) toksycznego oraz określić narządy krytyczne. • NDD (Najwyższa Dopuszczalna Dawka) • ADI (ang. Acceptable Daily Intake) – dopuszczalne dzienne pobranie z żywnością LOAEL (ang. Lowest Observed Adverse Effect Level) – najniższy poziom wywołujący 6 Ocena efektów odległych Ocena efektów odległych Efekt odległy - efekt toksyczny pojawiający się po pewnym czasie (okres utajenia) od zakończenia narażenia jednorazowego lub wielokrotnego na substancję chemiczną. Efekty takie mogą występować w organizmie bezpośrednio narażonym na czynnik toksyczny lub dopiero w następnych pokoleniach. Czynniki chemiczne mogą uszkadzać materiał genetyczny komórki. W wyniku takiego uszkodzenia komórka replikuje DNA i syntetyzuje białka w sposób odmienny od normalnego dla danego gatunku lub osobnika. Działanie genotoksyczne nowotwory teratogeneza zmiany fenotypu Uszkodzenie może następować w komórce somatycznej i wtedy zmiany ujawnią się u tego samego osobnika (nowotwory) lub w komórce aparatu rozrodczego i wtedy zmiany zostaną przekazane potomstwu. Efekty genotoksyczne w okresie embrionalnym i płodowym mogą ujawnić się w postaci zniekształceń anatomicznych (działanie teratogenne). Ocena działania mutagennego Działanie mutagenne ujawniające się pod wpływem związku chemicznego (zmiany materiału genetycznego - mutacje indukowane): • mutacje genowe (zmiany sekwencji nukleotydów w genie), •mutacje (aberracje) chromosomowe (poprzeczne „złamanie” chromosomu i ponowne połączenie fragmentów w cyklu komórkowym), •uszkodzenia DNA. Ocena działania rakotwórczego Działanie rakotwórcze można stwierdzić dwiema metodami: •przez ocenę zależności między częstością występowania nowotworów a obecnością substancji rakotwórczej w środowisku (nie do zaakceptowania, ponieważ wyniki uzyskuje się post factum); •przez odpowiednie badania laboratoryjne na zwierzętach (wadą tej metody jest długi okres eksperymentów i ich wysokie koszty). Ok. 90% związków rakotwórczych wykazuje także działanie mutagenne w prostych testach bakteryjnych, opracowano ponad 100 testów stosowanych do oceny genotoksyczności, które przeprowadza się m.in.: bakteriach, grzybach, roślinach, owadach, ssakach, hodowlach tkankowych in vitro. OECD zaleca w swych Wytycznych 15 testów. Substancje nowe należy badać na 2 gatunkach zwierząt Badania powinny trwać 18 mies. (myszy, chomiki) lub 2 lata (szczury) Należy używać grup zwierząt (wyjściowo po 100 szt. każdej płci), tak aby po 2 latach liczyły one minimum 25 sztuk. Stosuje się 3 poziomy dawkowania (ustalone na podstawie toksyczności podostrej). Ocena działania rakotwórczego Ocena działania rakotwórczego Na podstawie danych z badań epidemiologicznych, doświadczalnych i uzupełniających, ocenianą substancję, mieszaninę substancji lub proces technologiczny zalicza się do jednej z niżej podanych grup czynników: Grupa 1. Czynniki rakotwórcze dla ludzi. Do grupy tej klasyfikowane są czynniki jedynie wtedy, gdy istnieje wystarczający dowód rakotwórczości u ludzi. Grupa 2. Czynniki prawdopodobnie lub przypuszczalnie rakotwórcze dla ludzi. Do grupy tej klasyfikowane są zarówno czynniki, w stosunku do których wykazano prawie wystarczający dowód ich rakotwórczości u ludzi, jak i czynniki, dla których brak jest danych o ich rakotwórczości u ludzi, ale istnieje wystarczający dowód rakotwórczości u zwierząt doświadczalnych. Czynniki te są klasyfikowane do grupy 2A (prawdopodobnie rakotwórcze) lub 2B (przypuszczalnie rakotwórcze). Grupa 3. Czynniki nie dające się sklasyfikować pod względem rakotwórczości u ludzi. W grupie tej umieszcza się te czynniki, których nie można zaliczyć do innej grupy. Grupa 4. Czynniki prawdopodobnie nierakotwórcze dla ludzi. Do grupy tej zalicza się czynniki, w stosunku do których istnieją dowody wskazujące na brak działania rakotwórczego u ludzi i zwierząt doświadczalnych. W niektórych przypadkach mogą być również zaliczone do tej grupy czynniki, dla których istnieje niewystarczający dowód lub brak jakichkolwiek danych o rakotwórczości u ludzi, natomiast istnieje dowód wskazujący na brak działania rakotwórczego u zwierząt doświadczalnych, uzupełniony szerokim zakresem innych odpowiednich danych. 7 Ocena działania teratogennego Ocena działania teratogennego Działanie teratogenne - działanie genotoksyczne związku na komórki somatyczne embrionu i płodu prowadzące do zaburzeń w rozwoju różnych narządów o charakterze deformacji makroanatomicznych przy takich dawkach substancji, które nie wywołują jeszcze wyraźnych efektów toksycznych u matki. Upośledzenie umysłowe nie są zaliczane do efektów teratogennych, jeżeli nie towarzyszą im zniekształcenia anatomiczne. Działanie embriotoksyczne - obejmuje wszelkie niekorzystne zmiany, jakie związek chemiczny może wywołać u embriona lub płodu. Ocena działania teratogennego Wykorzystuje się szczury, myszy, chomiki lub króliki Dobiera się samice młode, ale dojrzałe płciowo Aplikuje się 3 poziomy dawek o dużej rozpiętości, np.: 1/250, 1/50 i 1/5 LD50 Związek podaje się z karmą, wodą pitną lub za pomocą sondy do żołądka w okresie organogenezy (u myszy i szczurów między 6. a 15. dniem ciąży, u chomika między 6. a 14. dniem, u królika zaś - między 6. a 18. dniem). W okresie podawania związku obserwuje się zwierzęta, jak w badaniu ostrym i 28-dniowym. W ostatnim dniu przed porodem płody wyjmuje się przez cesarskie cięcie i ocenia: liczbę płodów, ich płeć, masę ciała, masę płodu z łożyskiem, długość ciemieniowo-siedzeniową ciała, długość ogona, zaburzenia rozwojowe (deformacje makroskopowe i deformacje szkieletu). Ocena toksycznego wpływu na płodność, rozrodczość i potomstwo Talidomid (popularny w latach 60. XX w. środek przeciwwymiotny, przeciwbólowy, usypiający, hipnotyczny) - wykazuje efekty przy dawce ok. 0,5-1,0 mg/kg m.c., spowodował upośledzenie ok. 12.000 noworodków (niedorozwój kończyn, zwłaszcza górnych) Badania tego typu to doświadczenia wielogeneracyjne. OECD zaleca obecnie testy jedno- lub dwupokoleniowe. Badanie wykonuje się na szczurach, przy czym oprócz grupy kontrolnej są jeszcze grupy z 3 poziomami ekspozycji ustalonymi w badaniu toksyczności przewlekłej. W skład jednej grupy wchodzi 10 samców i 20 samic. Po dwóch miesiącach eksponowania (jeden pełny cykl spermatogenezy, dwa pełne cykle rui) zwierzęta kojarzy się w obrębie grupy (po 2 samice na 1 samca). Badania mają na celu stwierdzenie wpływu ksenobiotyków na czynności gruczołów płciowych, cykl rujowy, kojarzenie, procent zapłodnień, okres trwania ciąży, poród, masę. talidomid enancjomer S (silny mutagen) Ocena działania neurotoksycznego Jako miarę zaawansowania w rozwoju przyjmowano dawniej stosunek masy mózgu do masy ciała. Wskaźnik taki, wyrażony w procentach, wynosi u lwa 0,11-0,14, u psa ok. 0,2, u goryla ok. 0,8, a u człowieka ok. 2,2-2,5. W przypadku myszy jest on jednak jeszcze wyższy i wynosi 3,2. Obecnie wskaźnik ten zastąpiono tzw. współczynnikiem cefalizacji (Kc), który jest potęgową funkcją masy ciała: Kc = E ma Gatunek szczur świnia kot pies nietoperz szympans delfin człowiek Współczynnik cefalizacji, Kc 0,07 0,14 0,29 0,29-0,44 0,67 0,74 2,25 2,8 Im wyższy współczynnik cefalizacji gatunku, tym łatwiejsze jest przenoszenie wyników na człowieka, ale tym większe są zastrzeżeniu natury etycznej. gdzie: E - masa mózgu, m - masa ciała, a - wykładnik potęgowy ustalony na ok. 0,56. 8 Ocena działania neurotoksycznego Efekty neurotoksyczne u ludzi, wywołane zatruciami, przejawiające się zaburzeniami funkcji układu nerwowego, mogą mieć charakter przejściowy i ustąpić po zmniejszeniu stężenia substancji toksycznej w mózgu (efekt narkotyczny). Długotrwałe utrzymywanie w tkance nerwowej stężeń toksycznych lub systematyczne powtarzanie ekspozycji na związki może wywołać głębsze zmiany o charakterze organicznym. Jeżeli zmiany organiczne są wywołane jednorazową ekspozycją znacznego stopnia, pojawiają się one z pewnym opóźnieniem (efekt opóźniony). Zmiany organiczne w tkance nerwowej mogą dotyczyć zarówno o.u.n. (mózg, rdzeń kręgowy) lub jego określonych ośrodków, jak i obwodowego układu nerwowego i układu autonomicznego. Anatomicznie mogą się ujawniać uszkodzenia aksonu (aksjonopatie) oraz mieliny. Zmiany w układzie nerwowym są zwykle trudno odwracalne lub nieodwracalne (jeśli zmiany są poważne). Ocena działania neurotoksycznego Objawy zaburzeń toksycznych w układzie nerwowym: •zmiany samopoczucia, zmiany pobudliwości, spadek energii, popędu seksualnego, bóle głowy, bezsenność itp. •spadek siły mięśniowej, zaburzeń koncentracji i inteligencji •zmiany w układzie sensorycznym (wzroku, słuchu) i ruchowym (ataksja). Ocena działania neurotoksycznego Ocena działania neurotoksycznego Efekty neurotoksyczne rozpoznane u ludzi, a wywołane niedotlenieniem mózgu (anoksja) są typowe dla zatrucia tlenkiem węgla. Następstwa uszkodzenia osłonki mielinowej występują m.in. przy zatruciu ołowiem (neuropatie obwodowe). Alkohol, akryloamid, disiarczek węgla, estry kwasu fosforowego i fosfonowego uszkadzają aksony (aksonopatie). Uszkodzenia ciała (perykarionu) komórek nerwów obwodowych to efekt działania m.in. organicznych związków rtęci. Silne toksyny naturalne, m.in. botulina, tetrodotoksyna, batrachotoksyna i in. powodują zaburzenia w płytkach ruchowych nerwów motorycznych. Przykładem substancji, której atak jest skierowany na wybrane ośrodki o.u.n., jest metylortęć. Metody badawcze stosowane w ocenie neurotoksyczności u zwierząt laboratoryjnych to testy: behawioralne (pomiar spontanicznej aktywności ruchowej (dostarczają informacji o ogólnym stanie zdrowia zwierzęcia), badanie prostych reakcji bezwarunkowych (pozwalają ocenić reaktywność układu nerwowego, ustalić, czy zaburzenia dotyczą sfery ruchowej, czuciowej i określają, jaki rodzaj czucia jest upośledzony) oraz warunkowe reakcje instrumentalne). Ocena działania neurotoksycznego Metody obliczeniowe w ocenie toksyczności morfologiczne (pozwalają wykryć zmiany morfologiczne tkanki nerwowej w odpowiednio przygotowanych preparatach histopatologicznych). Efekt - zmiana biologiczna wywołana działaniem związku toksycznego. Kiedy efekt ulega zwiększeniu lub zmniejszeniu ze wzrostem dawki (stężenia biologicznego) danej substancji mówimy o istnieniu zależności typu dawka-efekt. Zależność taką ustala się na podstawie pomiarów wielkości efektu u różnych osobników, którym podano różne dawki substancji (charakter statystyczny). elektrofizjologiczne (rejestruje się i analizuje zjawiska elektryczne zachodzące w tkankach i narządach. Do oceny stanu czynnościowego nerwów obwodowych stosuje się pomiar szybkości przewodzenia bodźców. Technikę potencjałów wywołanych wykorzystuje się do wykrywania zaburzeń czucia i lokalizowania miejsc uszkodzenia w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym. Najbardziej popularne są badania elektroencefalograficzne). biochemiczne (służą głównie do wyjaśnienia mechanizmów działania toksycznego związku na układ nerwowy. Metody te pozwalają na wykorzystanie oznaczeń biochemicznych, histochemicznych i immunochemicznych do dokładnego umiejscowienia skutków działania ksenobiotyku). Dawka 9 Metody obliczeniowe w ocenie toksyczności Efekt jakościowy (tak/nie) np. efekt letalny (zwierzę padło lub nie), efekt kancerogenezy (nowotwór powstał lub nie). Czasami określa się tak zmiany biochemiczne, ale tylko ogólnie, np. proteinuria wystąpiła lub nie itd. Efekty tego typu nazywa się efektami kwantalnymi. Mogą one również się nasilać ze wzrostem dawki, jednak można je oznaczać nie u poszczególnych osobników, a wyłącznie w populacji (w grupie). Metody obliczeniowe w ocenie toksyczności Zależność dawka-odpowiedź określa zatem odsetek populacji wykazującej reakcję pozytywną w zależności od wielkości dawki (poziomu substancji w ustroju). Typowe zależności dawka-odpowiedź mają charakter asymetrycznej litery „S”. Ten typ krzywej obrazuje efekt kumulatywny: odsetek populacji reagującej na daną dawkę obejmuje sumę odpowiedzi na daną dawkę i wszystkie dawki mniejsze. Natężenie występowania efektu kwantalnego wyraża się jako odsetek osobników, które wykazały pozytywny efekt (np. efekt letalny u 30% zwierząt). Tak wyrażoną reakcję populacji nazywa się odpowiedzią. Dawka Zależność typu dawka-odpowiedź Dawka Krzywa wrażliwości 10
