docBiałko opiekuĘcze GRP94 i jego rola w terapii nowotworów
download 
Reklamacja Transkrypt
Białko opiekuĘcze GRP94 i jego rola w terapii nowotworów
&ARM0RZEGL.AUK COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. "IAKOOPIEKUÊCZE'20IJEGOROLAWTERAPIINOWOTWORÌW #HAPERON'20ANDITSROLEINANTICANCERTHERAPY -ARZANNA#ECHOWSKA0ASKO :AKAD"IOCHEMII&ARMACEUTYCZNEJ 5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW"IAYMSTOKU +IEROWNIK:AKADU-ARZANNA#ECHOWSKA0ASKO Streszczenie Summary Indukcja białek chaperonowych, należących do rodziny GRP (białka regulowane przez glukozę), jest mechanizmem obronnym komórek, adaptującym je do stresu retikuloendoplazmatycznego. Jednym z nich jest białko GRP94. Specyficzne warunki stresowe, niedobór glukozy czy hipoksja, w mikrośrodowisku guzów litych mogą prowadzić do indukcji GRP. Poznano budowę GRP94 oraz niektóre czynniki i mechanizmy regulujące jego ekspresję. Podczas gdy wzmożona ekspresja GRP może zmniejszać uszkodzenie organów narażonych na stres RE, ich indukcja w komórkach nowotworowych i antyapoptotyczne działanie może pobudzać rozwój nowotworów i powodować ich oporność na leki. Wyjaśnienie funkcji GRP i regulacji ich syntezy otwiera nowe możliwości w leczeniu nowotworów oraz chorób związanych z zaburzeniami homeostazy siateczki endoplazmatycznej. The induction of chaperon proteins, which belong to GRPs (glucose-regulated proteins) family, is a mechanism which protects the cells against the endoplasmic reticulum stress. GRP94 is a member of GRPs family. Solid tumours are often placed under stress conditions, such as glucose starvation and hypoxia. These conditions result in enhanced expression of GRPs. The structure as well as some factors and mechanisms which regulate the expression of GRP94 were described. Whereas GRPs overexpression could limit damage in organs exposed to ER stress, the anti-apoptotic function of the GRPs also predicts that their induction in neoplastic cells could lead to cancer progression and drug resistance. The explanation of GRPs function and regulation of their synthesis create new therapeutic possibilities in neoplasm diseases and those induced by endoplasmic reticulum stress. Słowa kluczowe: białka chaperonowe, GRP94, siateczka endoplazmatyczna, terapia nowotworów Key words: chaperons, GRP94, endoplasmic reticulum, anti-cancer therapy ' Ö Formowanie struktury przestrzennej białka i jej stabilność jest w dużym stopniu uzależniona od ich interakcji z białkami opiekuńczymi (ang. molecular chaperones). Chaperony wiążą się w sposób odwracalny z niesfałdowanym fragmentem polipeptydu, który w innym przypadku mógłby służyć jako ośrodek agregacji lub błędnego fałdowania nowopowstałych cząsteczek. Białka, które wchodzą w interakcję z chaperonami, są określane jako ich substraty. Białka opiekuńcze wiążą się z częściowo sfałdowanymi łańcuchami umożliwiając im kontynuację zwijania się w sposób najbardziej korzystny energetycznie. Pomagają białkom w porządkowaniu ich struktury przestrzennej, a niektóre z nich chronią białka komórkowe przed skutkami działania czynników stresowych; hipertermii, głodu, niedotlenienia, infekcji, toksyn, promieniowania UV. [1,2] Białka opiekuńcze cechują się wysokim powinowactwem do hydrofobowych odcinków łańcuchów polipeptydowych i wykazują aktywność ATP-azową [1,3]. Występują one w cytosolu, w organellach cytoplazmatycznych, takich jak: mitochondria i siateczka endoplazmatyczna oraz w jądrze komórkowym [1,3-5]. Fałdowanie bądź renaturacja białek wymaga energii w postaci ATP. W jej uwalnianiu uczestniczy aktywność ATP-azowa chaperonów. Niedobór glukozy pobudza ekspresję różnych białek opiekuńczych w siateczce śródplazmatycznej, tzw. GRPs (glucose-regulated proteins) [6,7]. Jednym z nich jest białko GRP94 [8]. Wartość liczbowa, następująca po symbolu GRP, oznacza masę cząsteczkową tego białka, wyrażoną w kilodaltonach. Indukcja białek należących do rodziny GRP jest mechanizmem obronnym komórek, przystosowującym je do stresu retikuloendoplazmatycznego (stres RE), powodowanego głównie przez niedobór tlenu [5] i niedostatek glukozy, jako substratu energetycznego [9-11]. ¥J|ª-z` Dojrzałe szczurze białko GRP94 składa się z 782 reszt aminokwasowych. Monomeryczna postać tego białka powstaje po odcięciu sekwencji sygnałowej, złożonej z 21 reszt aminokwasowych. W białku tym można wyróżnić kilka domen strukturalnych (Ryc.1), ale ich znaczenie funkcjonalne nie zostało dotąd dostatecznie poznane. Sekwen- &ARM0RZEGL.AUK Ryc.1. Model struktury GRP94. Dwa monomery tego białka asocjują ze sobą za pomocą domeny dimeryzacji tworząc dimer. Sekwencja N-końcowa i C-końcowy tetrapeptyd KDEL są odpowiedzialne za kierowanie GRP94 do siateczki śródplazmatycznej. N-końcowa domena jest miejscem miejscem wiązania nukleotydów, antybiotyków (geldanamycyna, radicicol) oraz oligosacharydów (CHO). Pierwsza z domen kwasowych jest odpowiedzialna za regulację wiązania leków. Aminokwasy od 421 do 448 tworzą 7 powtarzających się sekwencji, podobnych do tzw. „suwaka leucynowego”, które mogą być odpowiedzialne za interakcje białko-białko. Domena ta posiada trzy miejsca glikozylacji (XXX). Następna domena o nieznanej funkcji, od 559 do 609 aminokwasu, zawiera sekwencję KEKE, która prawdopodobnie odpowiada za interakcje między białkami [12]. Fragment C-końcowy, zbudowany z 60 aminokwasów, stanowi drugą domenę kwasową, homologiczną z domenami występującymi w wielu białkach jądrowych, także w czynnikach transkrypcyjnych, regulujących funkcję polimerazy RNA. cja aminokwasowa N-końcowej domeny GRP94 wykazuje wysoki stopień homologii do innego białka chaperonowego; HSP90. Jest ona miejscem wiązania nukleotydów, oligosacharydów oraz antybiotyków (geldanamycyna, radicicol). Po niej występuje domena kwasowa, która w GRP94 jest krótsza niż w homologicznej domenie HSP90. Jest ona odpowiedzialna za regulację wiązania leków. Aminokwasy od 421 do 448 tworzą 7 powtarzających się sekwencji, podobnych do tzw. „suwaka leucynowego”, które mogą być odpowiedzialne za interakcje białko-białko. Domena ta posiada trzy miejsca glikozylacji (Ryc.1). Następna domena o nieznanej funkcji, od 559 do 609 aminokwasu, zawiera sekwencję Met-Gln-Met-Gln, wyrażaną w jednoliterowym kodzie aminokwasowym, jako KEKE, która prawdopodobnie odpowiada za interakcje między białkami [12]. Fragment C-końcowy, zbudowany z 60 aminokwasów, stanowi drugą domenę kwasową, homologiczną z domenami występującymi w wielu białkach jądrowych, także w czynnikach transkrypcyjnych, regulujących funkcję polimerazy RNA. N-końcowa sekwencja sygnałowa i C-końcowy tetrapeptyd Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL w kodzie jednoliterowym) kierują GRP94 do siateczki endoplazmatycznej. Białko to występuje w postaci dimeru (Ryc.1) [13]. Asocjację monomerów składowych umożliwiają fragmenty C-końcowe, zwane domenami dimeryzacji (23 kDa), a ściślej 44aminokwasowy fragment tej domeny wykazuje autonomiczną aktywność dimeryzacji na drodze interakcji hydrofobowych [8]. | -yq-A¬oyRu|J¬]p-AoRz` GRP94 jest glikoproteiną, która posiada sześć potencjalnych miejsc glikozylacji. Są nimi atomy azotu zawarte w grupach amidowych reszt asparaginy (Asn), ale zazwyczaj tylko Asn196 jest glikozylowana [14]. W warunkach fizjologicznych GRP94 występuje w siateczce śródplazmatycznej. W łańcuchach oligosacharydowych dominuje mannoza. Są one wrażliwe na hydrolityczne działanie endoglikozydazy H. W warunkach fizjologicznych GRP94 jest w małym stopniu glikozylowane. Proces ten nasila się, kiedy ekspresja tego białka rośnie [15]. Glikozylacja GRP94 nie jest warunkiem jego zdolności do interakcji z substratami białkowymi. Zaobserwowano bowiem, iż nawet nieglikozylowane GRP94 może także asocjować z nowo powstającymi polipeptydami [16]. GRP94 może być fosforylowane. Miejscem wiązania fosforanu są reszty serylowe i treonylowe, natomiast reszty tyrozylowe nie ulegają fosforylacji. Nie jest poznany mechanizm enzymatyczny tego procesu. In vitro fosforylacja GPR94 jest katalizowana przez kinazę kazeinową II [17], jednak nie wykryto tego enzymu w siateczce śródplazmatycznej. Fosforylacja reguluje aktywność GRP94. Przykładem jest zanik zdolności fosforylowanego GRP94 do interakcji z lekkimi łańcuchami immunoglobulin [16]. 'lÔ®-ylRª-ylGRP94 jest białkiem zdolnym do wiązania dużej ilości wapnia, chociaż powinowactwo tego białka do Ca2+jest niewielkie. Jest ono jednym z głównych białek regulujących homeostazę wapnia w siateczce śródplazmatycznej. Posiada 15 miejsc wiązania Ca2+, z których 4 wykazują umiarkowane powinowactwo (KD ~2 μM) i 11 niskie powinowactwo (KD ~600 μM) [18]. Miejsca wiązania wapnia są rozmieszczone w kilku ujemnie naładowanych rejonach monomeru GRP94. Związanie wapnia z GRP94 moduluje strukturę i aktywność tego białka. In vitro, obecność Ca2+ w stężeniu 100 nM powoduje zmianę konformacji, polegającą na zmniejszeniu udziału struktury α-helikalnej z 40% do 34% [18]. Oczyszczone GRP94, in vitro, w obecności Ca2+wiąże kalmodulinę, hamując tą drogą jego interakcję z filamentami aktynowymi [19]. Jest prawdopodobne, że związanie wapnia reguluje interakcje GRP94 z białkami siateczki śródplazmatycznej także in vivo. 'lÔ®-ylRqRp}ª" N-końcowy, 35 aminokwasowy fragment dojrzałego białka GRP94 wykazuje unikatową sekwencję, bez cech homologii z HSP90 (Fig.1), podczas gdy sekwencja 35-274 COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. jest wysoce homologiczna do fragmentu 9-236 ludzkiego HSP90 oraz do fragmentu 1-220 HSC82 drożdży [20,21]. W HSP90 ta domena odpowiadająca za fałdowanie białek, pośredniczy w wiązaniu trzech strukturalnie niepodobnych małych cząsteczek: ATP oraz leków przeciwnowotworowych: geldanamycyny i radicicolu. Wszystkie trzy cząsteczki wiążą się z tym samym miejscem w cząsteczce GRP94. Miejsce wiązania tworzy wiele helis, które są ułożone na powierzchni utworzonej przez strukturę pofałdowanej kartki. W GRP94 wszystkie reszty aminokwasowe, zaangażowane w tworzenie miejsc wiążących są wysoce konserwatywne, wiążą geldanamycynę i radicicol na drodze mechanizmu zależnego od ATP [22]. Zapotrzebowanie na wiązanie ATP/ leków jest różne pomiędzy HSP90 i GRP94. Podczas gdy w HSP90 N-końcowa domena jest wystarczająca do wiązania, w GRP94 dodatkowo konieczna jest pierwsza kwasowa domena (266-347) [22]. Ta różnica pomiędzy GRP94, a HSP90 może mieć znaczenie w przypadku kiedy lek musi rozróżnić te dwa białka. Wykazano, że związanie geldanamycyny przez GRP94 ma ważne funkcjonalne konsekwencje. Wykazano, że kompleks GRP94 z geldanamycyną i białkiem erbB2 – jednym z substratów tego chaperonu, rozpada się i substrat jest kierowany do degradacji w proteasomach [23,24]. Wiązanie radicicolu wywołuje podobny efekt na losy lekkich łańcuchów immunoglobulin, które są także substratem tego chaperonu. 'lÔ®-ylR7l-tRp Zasadniczą różnicą pomiędzy GRP94 a białkami opiekuńczymi takimi jak GRP78 czy kalneksyna jest fakt, że GRP94 wchodzi w interakcje ze ściśle określonymi substratami białkowymi. Podczas gdy GRP78 rozpoznaje i wiąże się z dużą liczbą białek, które podlegają fałdowaniu w siateczse śródplazmatycznej, kalneksyna rozpoznaje glikanową część wspólną dla wielu glikoprotein, GRP94 asocjuje ze ściśle określonymi kilkoma białkami: z łańcuchami immunoglobulin [25], z białkiem MHC klasy II [26], tyreoglobuliną [27], białkiem erbB2 [23], glikoproteinami herpes virus [28], z apolipoproteiną B [29], kolagenem [30], białkiem C [31] oraz białkiem BSDL [32]. Nie oddziaływuje natomiast z wieloma innymi glikoproteinami wirusowymi, nawet z białkiem MHC klasy I. Przypuszczalnie ta specyficzność substratowa jest funkcją struktur białkowych, które GRP94 rozpoznaje. Interakcje z łańcuchami lekkimi immunoglobulin jest relatywnie dobrze zbadana. Preferowanym substratem jest prekursor w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego, połączony wiązaniami siarczkowymi [33,34]. Asocjacja z GRP94 występuje przez większość czasu, kiedy łańcuchy lekkie immunoglobulin przebywają w siateczce śąródplazmatycznej, w przeciwieństwie do interakcji z GRP78, które występują w pierwszych kilku minutach po zsyntetyzowaniu immunoglobulin [33]. Podczas syntezy MHC klasy II, GRP94 wiąże się z prekursorem w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego [26]. W przypadku esterazy cholesterolowej GRP94 wiąże się mocno z natywnym białkiem i transportuje je. GRP94 wydaje się asocjować z prekursorem białka w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego czy z niekompletnie utworzonym oligomerem, ale nigdy z formą wczesną fałdującego się białka. Ta preferencja łączenia się ze sfałdowanym prekursorem białka jest również zgodna z preferencjami HSP90 do substratów podczas rozwijania ich struktury in vitro [35-37]. Podczas wiązania z białkiem w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego GRP94 uczestniczy w jego zatrzymywaniu w siateczce śródplazmatycznej, podobnie jak inne białka opiekuńcze, ale brak na to bezpośrednich dowodów. Inną cechą oddziaływań GRP94 z białkami jest fakt, że każdy z jego substratów białkowych wykazuje zdolność do interakcji zarówno z GRP78 jak i kalneksyną [26,27,30,33,38]. Spostrzeżenia te sugerują, iż w ochronie nowosyntetyzowanych białek i w ułatwianiu ich fałdowania współdziałają różne białka opiekuńcze. Przez analogię do HSP90 jest prawdopodobnym, że działanie GRP94 nasila się poprzez interakcje z innymi białkami opiekuńczymi. Ponadto, nie ma dowodów na istnienie w siateczce śródplazmatycznej homologów, zasocjowanych z HSP90 białek tj. p23, Hop, FKBP51 czy Cyp40 [39,40]. Podsumowując, GRP94 jest specyficznym białkiem opiekuńczym, zaangażowanym w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego prekursorów syntezowanego białka, który współpracuje z innymi białkami opiekuńczymi. Zatem, w świetle siateczki śrórplsazmatycznej występuje system chaperonów bardzo podobny w komórkach eukariotycznych, jak i u bakterii, gdzie GRP94 bierze udział w procesie fałdowania, jako „kończące” białko opiekuńcze [34]. Ważnym celem dalszych badań jest sprecyzowanie cech strukturalnych, które powodują wiązanie GRP94. 'lÔ®-ylRR ¬J}ª Liczne dowody sugerują, że GRP94 wiąże peptydy. Najbardziej przekonywujących dowodów dostarczają badania immunologiczne Srivastava i wsp. [41], Arnolda i wsp. [42] oraz elucja antygenu peptydowego pochodzącego z oczyszczonego GRP94 z komórek zainfekowanych wirusem pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej – VSV [43]. W innym układzie doświadczalnym Lammerta i wsp. [44] wprowadzono światłoczułe peptydy do cytosolu używając streptolizyny O. Peptydy te asocjowały tylko z kilkoma białkami siateczki śródplazmatycznej. Głównym akceptorem była izomeraza disiarczkowa oraz GRP94 [44]. Większość z tych peptydów posiada właściwości peptydów przenoszonych przez białka transportujące w siateczce śródplazmatycznej związane z prezentacją antygenu. Ponadto badano grupę białek, które były systematycznie mutowane w pozycji 2 i 9. GRP94 przyłączał się preferencyjnie do peptydów z aminokwasami pozbawionymi ładunku w tych pozycjach [45]. Te badania wykazały specyficzność wiązania peptydów przez GRP94. Peptydy wiążące się z GRP94 wchodzą do siateczki endoplazmatycznej zarówno przy udziale białek transportujących, związanych z prezentacją antygenu (TAP) jak i drogą niezależną od tych transporterów, co sugeruje że GRP94 włącza je do całkowitej puli peptydów siateczki śródplazmatycznej [44-46]. Nie znaleziono wspólnego fragmentu &ARM0RZEGL.AUK znajduje się miejsce wiązania peptydu. Prawdopodobnie występują inne czynniki zaangażowane in vivo, które ułatwiają te procesy. Obecny stan wiedzy na temat aktywności wiązania peptydów przez GRP94 nie pozwala określić zakresu substratów białkowych oraz ich preferencji do fałdowania prekursorów. Badania białka HSP90 wykazały, że posiada ono oddzielne miejsca wiązania peptydów, jedno na każdym końcu cząsteczki [49,50] oraz dodatkowo C-końcowa domena może wiązać białka zawierające powtarzający się fragment (tetratrico peptide repeat – TPR) [51]. Prawdopodobnie GRP94 jest zbudowany podobnie, posiada miejsce wiązania peptydów oddzielone od domeny interakcji z innymi białkami. |q-"ª\¥ypAo|k y|ª-yl¥z` Zasadniczym problemem w badaniach nad GRP94 i innymi białkami z grupy HSP90, jest relacja pomięRyc.2. Indukcja GRP i ochrona komórki. Stres retikuloendoplazmatyczny aktywuje transkrypcję genów wiązaniem substratu, GRP za pośrednictwem sekwencji ERSE, czego skutkiem jest wzrost ekspresji białek chaperonowych. dzy Pobudzanie promotora GRP może być wykorzystane do transkrypcji celowanej w terapii genowej. Eks- a wiązaniem i hydrolizą ATP. presja GRP może być blokowana na poziomie transkrypcji przez leki hamujące ich syntezę np. geniste- Wszystkie białka opiekuńina. Stabilność i translacja GRP może być także hamowana przez stosowanie wektorów z rybozymami, czewiążące peptydy, któczy antysensami. Hamowanie syntezy GRP w warunkach stresu retikuloendoplazmatycznego prowadzi rych działanie jest poznane do podwyższonej cytotoksyczności i apoptozy. w szczegółach, wykazują akw budowie tych peptydów, który wymusza wiązanie się tywność ATP-azową. Wykazano, że GRP94 wiąże [52,53] z GRP94. Nawet w przypadku kiedy średnio powinowac- i hydrolizuje ATP [54]. Jednak aktywność ATP-azowa GRP94 two GRP94 do peptydów jest 10 razy niższe niż do MHC jest niższa niż GRP78, a zdolność do wiązania ATP jest przyklasy I, nadmiar GRP94 (i innych białek wiążących peptydy najmniej 20 razy słabsza niż w przypadku GRP78 [53]. Pow świetle ER) działa jak „zlew” znacznie zmniejszający nadto wiązanie peptydów in vitro przez GRP94 jest niezależne pulę wolnych peptydów w świetle siateczki śródplazma- od ATP [55], asocjacja z łańcuchami immunoglobulin in vivo tycznej. Nie ma wyraźnych przesłanek, że GRP94 asocjuje jest utrzymywana nawet, gdy zawartość ATP w komórce jest z kompleksami białek TAP jak również nie jest bezpośred- bardzo niska [25]. Dlatego rola nukleotydów adeninowych nio przyciągany przez klasę I peptydów [47]. w funkcjonowaniu GRP94 jest ciągle nieznana. Wiązanie GRP94 przez peptydy in vitro powoduje zmiany konformacyjne, które wykazano przez rosnące wiązanie barwników hydrofobowych, fluorescencji Trp i wrażliwości na proteazy [48]. Obecne badania nie pozwalają na wyznaczenie powinowactwa GRP94 do peptydów, ale umożliwiają wyjaśnienie mechanizmu wiązania peptydów. Jest bardzo ważnym wyznaczenie, dlaczego przyłączenie peptydu do GRP94 jest nieefektywne w porównaniu z białkami opiekuńczymi takimi jak GRP78, jaki mechanizm prowadzi do odłączenia peptydu i w jakiej części cząsteczki GRP94 o-p| ARq AiRul| R-ll y|ª| ª|}ª Podczas gdy wzmożona ekspresja GRP może zmniejszać uszkodzenie organów narażonych na stres ER, ich indukcja w komórkach nowotworowych i antyapoptotyczne działanie może pobudzać rozwój nowotworów i powodować ich oporność na leki (Ryc.2). W różnych liniach komórek nowotworowych i w guzach ludzkich, poziom GRP78 i GRP94 jest podwyższony i koreluje ze złośliwością guza [7,56]. Dodatkowo wykazano, że wzmożona indukcja GRP78 chroni ko- COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. mórki nowotworowe, podczas gdy zahamowanie ekspresji tego białka nasila apoptozę, hamuje wzrost guza i zwiększa podatność na działanie czynników cytotoksycznych [7,57]. Dlatego celowane hamowanie ekspresji i funkcji GRP w komórkach nowotworowych jest nowym kierunkiem w chemioterapii nowotworów. Genisteina, flawonoid o działaniu przeciwnowotworowym, zmniejsza syntezę GRP, hamuje wzrost guzów indukowanych karcynogenami u szczurów oraz komórek ludzkiej białaczki, przeszczepianych do myszy [58]. Wykazano także, że GRP94 asocjuje z erbB2 (także określany jako HER-2/neu), który ulega powszechnie ekspresji w raku sutka i jest związany ze złym rokowaniem [59]. Traktowanie komórek raka sutka geldanamycyną pobudza rozpad kompleksów GRP94-p185 i degradację p185. Indukcja GRP w wielu liniach ludzkich komórek nowotworowych nadaje im oporność na leki będące inhibitorami topoizomerazy II (np. etoposid) [60,61]. Bezpośrednie hamowanie syntezy GRP94 metodą wbudowywania antysensów skutkuje zwiększoną wrażliwością na cytotoksyczne działanie leku cytostatycznego - etoposidu [62]. Apoptozie wywołanej przez etoposid towarzyszy proteoliza GRP94 katalizowana przez kalpainę, która także trawi antyapoptotyczne białko Bcl -xL, przekształcając je w białko proapoptotyczne [62,63]. Specyficzne warunki stresowe w mikrośrodowisku guzów litych mogą prowadzić do indukcji GRP. Funkcja chaperonowa GRP jest konieczna do ich działania cytoprotekcyjnego. Prawdopodobnie zatrzymują one nowo syntetyzowane receptory czynników wzrostowych w siateczce śródplazmatycznej. Wynikający stąd niedobór receptorów błonowych prowadzi do zahamowania podziału komórek w fazie G1 i oporności na leki cytotostatyczne działające w fazie S cyklu komórkowego [60]. Inny mechanizm ochrony, w którym pośredniczą GRP, polega na ich interakcji z czynnikami proapoptotycznymi, co zmniejsza ich aktywność a w konsekwencji skuteczność farmakoterapii nowotworów. |q-ªluu¥y| R-ll Wykazano, że GRP94 towarzyszy wielu peptydom, zarówno tym, które powstają przez degradację białek prawidłowych, jak i białek nowotworowych, bakteryjnych, czy wirusowych [64]. Nowotworowy GRP94 przenosi peptydy antygenowe guza na powierzchnię komórki. W podobny sposób GPR94 syntetyzowany w komórkach zainfekowanych przez wirusy przenosi antygeny wirusowe na powierzchnię komórki. Procesy te noszą nazwę prezentacji antygenu. W warunkach prawidłowych GRP94 jest zlokalizowany wewnątrz komórki. Rozpad komórek nekrotycznych uwalnia kompleksy GRP94-peptyd, które są przenoszone na powierzchnię żywych komórek. Prezentacja antygenów peptydowych na powierzchni komórek prowadzi do stymulacji limfocytów T i odpowiedzi prozapalnej. Kompleksy GRP94 z peptydami wywołują odpowiedź immunologiczną specyficzną dla chronionych przez GRP94 antygenów peptydowych [65]. Nie obserwowano autoimmunizacji, co sugeruje, że odpowiedź immunologiczna jest skierowana przeciwko peptydom, a nie przeciwko GRP94. Wykorzystując wnioski z badań na zwierzętach podjęto próbę immunizacji pacjentów onkologicznych kompleksami GRP94-peptyd, pochodzącymi z ich własnych nowotworów. Ten eksperyment terapeutyczny stwarza perspektywę uzyskania specyficznej szczepionki, przydatnej w immunoterapii ludzkich nowotworów [65]. Ostatnio wykazano, że także inne białko z rodziny GRP, określane symbolem GRP170/ORP150, jest skuteczne jako szczepionka przeciwnowotworowa [66]. |u| |aRy¥U ª®RAlªy|ª| ª||ªRo R-llaRy|ªRo W agresywnych nowotworach na skutek niedokrwienia i braku składników odżywczych miejscowo rozwija się hipoksja i kwasica. W tych warunkach dochodzi do specyficznej aktywacji promotora genu GRP78. Użycie indukowanego przez stres promotora GRP78, jako nośnika w celu wprowadzenia terapeutycznego genu samobójczego, otwiera nowe możliwości terapii genowej słabo unaczynionych guzów czy chorób niedokrwiennych. Enzym, kodowany przez terapeutyczny gen samobójczy, umożliwia przekształcenie nieaktywnego proleku w aktywny lek, którego działanie zwiększa wrażliwość komórki nowotworowej na chemio- lub radioterapię, prowadząc w konsekwencji do jej śmierci. Promotor GRP78 cechuje się wyższą efektywnością niż promotory wirusowe w niszczeniu dużych guzów, np. doświadczalnych mysich nowotworów: włókniakomięsaka i raka sutka [67,68]. Dodatkowo promotor genu GRP78 jest zawsze pobudzany w przebiegu terapii laserowej (terapia fotodynamiczna), która pobudza rozwój stresu oksydacyjnego i niedokrwienie in vivo [69], umożliwiając kontrolowaną ekspresję genu terapeutycznego. -p ¬A®yR-Rp ¬7-J-Í y-J7l-tp-ul|lRp¥ÍA®¬ul Odkrycie GRP78 i GRP94 zapoczątkowało gwałtowny rozwój wiedzy na temat syntezy i funkcji GRP w hodowlach komórkowych. Współczesne badania skupiają się na fizjologicznej roli GRP in vivo i zmierzają do poznania ich roli w patomechanizmie i farmakoterapii chorób nowotworowych. Już wiadomo, że indukcja chaperonów w komórkach nowotworowych i ich antyapoptotyczne działanie może pobudzać rozwój nowotworów i powodować ich oporność na leki. Postęp w badaniach nad farmakologiczną regulacją syntezy GRPs otwiera nowy kierunek w leczeniu nowotworów oraz chorób związanych z zaburzeniami homeostazy siateczki endoplazmatycznej. Piśmiennictwo 1. Wójcik C, Moskalewski S. Wybrane procesy cytoplazmatyczne. W: Seminaria z cytofizjologii dla studentów medycyny, weterynarii i bologii. Red. Kawiak J, Zabel M Urban & Partner. Wrocław 2002, 214-215. 2. Widłak W. Odpowiedź na stres komórkowy I ekspresja genów Hsp 70 w męskich komórkach rozrodczych. Postepy Biochem 2006; 52: 289-295. &ARM0RZEGL.AUK 3. Marzec Ł i wsp.: Białka szoku termicznego 72 (Hsp72) w chorobach nerek. Nefrol Dial Pol 2007; 11: 78-82. 4. Little E i wsp.: The glucose- regulated proteins (GRP78 and GRP94): functions, gene regulation, and applications. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1994; 4: 1-18. 5. Cechowska-Pasko M, Bańkowski E, Chene P. The effect of hypoxia on the expression of 150 kDa oxygen-regulated protein (ORP 150) in HeLa cells. Cell Physiol Biochem 2006; 17: 89-96. 6. Lee AS. Mammalian stress response: induction of the glucose-regulated protein family. Curr Opin Cell Biol 1992; 4: 267–273. 7. Little E i wsp.: The glucose-regulated proteins (GRP78 and GRP94): functions, gene regulation, and applications. Crit Rev Eukaryotic Gene Expr 1994; 4: 1–18. 8. Wearsch PA, Nicchitta CV. Endoplasmic reticulum chaperone GRP94 subunit assembly is regulated through a defined oligomerization domain. Biochemistry 1996; 35: 16760–16769. 9. Cechowska-Pasko M, Bańkowski E, Chene P. Glucose effect on the expression of 150 kDa oxygen-regulated protein in HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun 2005; 337: 992-997. 10. Cechowska-Pasko M, Pałka J, Bańkowski E. Glucose-depleted medium reduces the collagen content of human skin fibroblast cultures. Mol Cell Biochem 2007; 305: 79-85. 11. Cechowska-Pasko M, Surażyński A, Bańkowski E. The effect of glucose deprivation on collagen synthesis in fibroblast cultures. Mol Cell Biochem 2009; 327: 211-218. 12. Realini C, Rogers SW, Rechsteiner M. KEKE motifs. Proposed roles in protein–protein association and presentation of peptides by MHC class I receptors. FEBS Lett 1994; 348: 109–113. 13. Wearsch PA, Nicchitta CV. Purification and partial molecular characterization of GRP94, an ER resident chaperone. Prot Expr Pur 1996; 7: 114–121. 14. Qu D, Mazzarella RA Green M. Analysis of the structure and synthesis of GRP94, an abundant stress protein of the endoplasmic reticulum. DNA Cell Biol 1994; 13: 117–124. 15. Lenny N, Green M. Regulation of endoplasmic reticulum stress proteins in COS cells transfected with immunoglobulin u heavy chain cDNA. J Biol Chem 1991; 266: 20532–20537. 16. Melnick J. Duke Univ, PhD thesis 1995. 17. Cala SE, Jones LR. GRP94 resides within cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles and is phosphorylated by casein kinase II. J Biol Chem 1994; 269: 5926–5931. 18. Van PN, Peter F, Soling HD. Four intracisternal calcium-binding glycoproteins from rat liver microsomes with high affinity for calcium. No indication for calsequestrin-like proteins in inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive calcium sequestering rat liver vesicles. J Biol Chem 1989; 264: 17494–17501. 19. Koyasu S i wsp.: HSP100, a 100-kDa heat shock protein, is a Ca2+-calmodulin-regulated actin-binding protein. J Biol Chem 1989; 264: 15083–15087. 20. Stebbins CE i wsp.: Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex: targeting of a protein chaperone by an antitumor agent. Cell 1997; 89: 239–250. 21. Prodromou C i wsp.: A molecular clamp in the crystal structure of the N-terminal domain of the yeast Hsp90 chaperone. Nat Struct Biol 1997; 4: 477–482. 22. Schulte TW i wsp.: Interaction of radicicol with members of the HSP90 family of molecular chaperones. Mol Endocrinol 1999; 13: 1435-1448. 23. Chavany C i wsp.: p185erbB2 binds to GRP94 in vivo. Dissociation of the p185erbB2/GRP94 heterocomplex by benzoquinone ansamycins precedes depletion of p185erbB2. J Biol Chem 1996; 271: 4974–4977. 24. Mimnaugh EG, Chavany C, Neckers L. Polyubiquitination and proteasomal degradation of the p185c-erbB-2 receptor protein-tyrosine kinase induced by geldanamycin. J Biol Chem 1996; 271: 22796–22801. 25. Melnick J, Aviel S, Argon Y. The endoplasmic reticulum stress protein GRP94, in addition to BiP, associates with unassembled immunoglobulin chains. J Biol Chem 1992; 267: 21303–21306. 26. Schaiff WT i wsp.: HLA-DR associates with specific stress proteins and is retained in the endoplasmic reticulum in invariant chain negative cells. J Exp Med 1992; 176: 657–666. 27. Kuznetsov G, Chen LB, Nigam SK. Several endoplasmic reticulum stress proteins, including ERp72, interact with thyroglobulin during its maturation. J Biol Chem 1994; 269: 22990–22995. 28. Ramakrishnan M i wsp.: Conformation-defective herpes simplex virus 1 glycoprotein B activates the promoter of the grp94 gene that codes for the 94-kD stress protein in the endoplasmic reticulum. DNA Cell Biol 1995; 14: 373–384. 29. Linnik KM, Herscovitz H. Multiple molecular chaperones interact with apolipoprotein B during its maturation. The network of endoplasmic reticulum-resident chaperones (ERp72, GRP94, calreticulin, and BiP) interacts with apolipoprotein b regardless of its lipidation state. J Biol Chem 1998; 273: 21368–21373. 30. Ferreira LR i wsp.: Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. J Cell Biochem 1994; 56: 518–526. 31. Katsumi A i wsp.: Protein C Nagoya, an elongated mutant of protein C, is retained within the endoplasmic reticulum and is associated with GRP78 and GRP94. Blood 1996; 87: 4164–4175. 32. Bruneau N, Lombardo D, Bendayan M. Participation of GRP94-related protein in secretion of pancreatic bile saltdependent lipase and in its internalization by the intestinal epithelium. J Cell Sci 1998; 111: 2665–2679. 33. Melnick J, Dul JL, Argon Y. Sequential interaction of the chaperones BiP and GRP94 with immunoglobulin chains in the endoplasmic reticulum. Nature 1994; 370: 373–375. 34. Melnick J, Argon Y. Molecular chaperones and the biosynthesis of antigen receptors. Immunol Today 1995; 16: 243–250. 35. Wiech H i wsp.: Hsp90 chaperones protein folding in vitro. Nature 1992; 358: 169–170. 36. Jakob U i wsp.: Transient interaction of Hsp90 with early unfolding intermediates of citrate synthase. Implications for heat shock in vivo. J Biol Chem 1995; 270: 7288–7294. 37. Freeman BC, Morimoto RI. The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. Embo J 1996; 15: 2969–2979. 38. Ferreira LR i wsp.: Hsp47 and other ER-resident molecular chaperones form heterocomplexes with each other and with collagen type IV chains. Connect Tissue Res 1996; 33: 265–273. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 39. Johnson JL, Toft DO. A novel chaperone complex for steroid receptors involving heat shock proteins, immunophilins, and p23. J Biol Chem 1994; 269: 24989–24993. 40. Chen S i wsp.: Differential interactions of p23 and the TPR-containing proteins Hop, Cyp40, FKBP52 and FKBP51 with Hsp90 mutants. Cell Stress Chaperones 1998; 3: 118–129. 41. Suto R, Srivastava PK. A mechanism for the specific immunogenicity of heat shock protein-chaperoned peptides. Science 1995; 269: 1585–1588. 42. Arnold D i wsp.: Cross-priming of minor histocompatibility antigen-specific cytotoxic T cells upon immunization with the heat shock protein gp96. J Exp Med 1995; 182: 885–889. 43. Nieland TJ i wsp.: Isolation of an immunodominant viral peptide that is endogenously bound to the stress protein GP96/ GRP94. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 6135–6139. 44. Lammert E i wsp.: The endoplasmic reticulum-resident stress protein gp96 binds peptides translocated by TAP. Eur J Immunol 1997; 27: 923–927. 45. Spee P, Neefjes J. TAP-translocated peptides specifically bind proteins in the endoplasmic reticulum, including gp96, protein disulfide isomerase and calreticulin. Eur J Immunol 1997; 27: 2441–2449. 46. Arnold D i wsp.: Influences of transporter associated with antigen processing (TAP) on the repertoire of peptides associated with the endoplasmic reticulum-resident stress protein gp96. J Exp Med 1997; 186: 461–466. 47. Lammert E i wsp.: Expression levels of stress protein gp96 are not limiting for major histocompatibility complex class I-restricted antigen presentation. Eur J Immunol 1996; 26: 875–879. 48. Wearsch PA, Voglino L, Nicchitta CV. Structural transitions accompanying the activation of peptide binding to the endoplasmic reticulum Hsp90 chaperone GRP94. Biochemistry 1998; 37: 5709–5719. 49. Scheibel T, Weikl T, Buchner J. Two chaperone sites in Hsp90 differing in substrate specificity and ATP dependence. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 1495–1499. 50. Young JC, Schneider C, Hartl FU. in vitro evidence that hsp90 contains two independent chaperone sites. FEBS Lett 1997; 418: 139–143. 51. Young JC, Obermann WM, Hartl FU. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. J Biol Chem 1998; 273: 18007–18010. 52. Clairmont CA, Maio A De, Hirschberg CB. Translocation of ATP into the lumen of rough endoplasmic reticulumderived vesicles and its binding to luminal proteins including BiP (GRP 78) and GRP 94. J Biol Chem 1992; 267: 3983–3990. 53. Dierks T i wsp.: A microsomal ATP-binding protein involved in efficient protein transport into the mammalian endoplasmic reticulum. EMBO J 1996; 15: 6931–6942. 54. Li Z, Srivastava PK. Tumor rejection antigen gp96/grp94 is an ATPase: implications for protein folding and antigen presentation. EMBO J 1993; 12: 3143–3151. 55. Wearsch PA, Nicchitta CV. Interaction of endoplasmic reticulum chaperone GRP94 with peptide substrates is adenine nucleotide-independent. J Biol Chem 1997; 272: 5152–5156. 56. Fernandez PM i wsp.: Overexpression of the glucose-regulated stress gene GRP78 in malignant but not benign human breast lesions. Breast Cancer Res Treat 2000; 59: 15–26. 57. Jamora C, Dennert G, Lee AS. Inhibition of tumor progression by suppression of stress protein GRP78/BiP induction in fibrosarcoma B/C10ME. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 7690–7694. 58. Zhou Y, Lee AS. Mechanism for the suppression of the mammalian stress response by genistein, an anticancer phytoestrogen from soy. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 381–388. 59. Chavany C i wsp.: p185erbB2 binds to GRP94 in vivo. Dissociation of the p185erbB2/GRP94 heterocomplex by benzoquinone ansamycins precedes depletion of p185erbB2. J Biol Chem 1996; 271: 4974–4977. 60. Tomida A, Tsuruo T. Drug resistance mediated by cellular stress response to the microenvironment of solid tumors. Anticancer Drug Des 1999; 14: 169–177. 61. Belfi CA i wsp.: Increased sensitivity of human colon cancer cells to DNA cross-linking agents after GRP78 up-regulation. Biochem Biophys Res Commun 1999; 257: 361–368. 62. Reddy RK, Lu J, Lee AS. The endoplasmic reticulum chaperone glycoprotein GRP94 with Ca2+-binding and antiapoptotic properties is a novel proteolytic target of calpain during etoposide-induced apoptosis. J Biol Chem 1999; 274: 28476–28483. 63. Nakagawa T, Yuan J. Cross-talk between two cysteine protease families. Activation of caspase-12 by calpain in apoptosis. J Cell Biol 2000; 150: 887–894. 64. Binder RJ, Han DK, Srivastava PK. CD91: a receptor for heat shock protein gp96. Nat Immunol 2000; 1: 151–155. 65. Janetzki S i wsp.: Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived heat shock protein gp96 preparations: a pilot study. Int J Cancer 2000 88: 232–238. 66. Wang XY i wsp.: Characterization of heat shock protein 110 and glucose regulated protein 170 as cancer vaccines and the effect of fever-range hyperthermia on vaccine activity. J Immunol 2001 166: 490–497. 67. Gazit G i wsp.: Use of the glucose-starvation inducible GRP78 promoter in suicide gene therapy of murine fibrosarcoma. Cancer Res 1999; 59: 3100–3106. 68. Chen X i wsp.: Eradication of murine mammary adenocarcinoma through HSVtk expression directed by the glucose-starvation inducible GRP78 promoter. Breast Cancer Res Treat 2000; 59: 81–90. 69. Gomer CJ i wsp.: Glucose regulated protein induction and cellular resistance to oxidative stress mediated by porphyrin photosensitization. Cancer Res 1991; 51: 6574–6579. Adres do korespondencji: Marzanna Cechowska-Pasko Zakład Biochemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku ul. Mickiewicza 2A 15-089 Białystok tel. 085 748 56 91 e-mail: [email protected]
