Natalia Kordala, Małgorzata Lewandowska, Magdalena Świątek

Natalia Kordala, Małgorzata Lewandowska, Magdalena Świątek

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 12 (3) 2013, 19-30
ISSN 1644–065X (print) ISSN 2083–8654 (on-line)
OCENA ZALEŻNOŚCI EFEKTÓW HYDROLIZY
ENZYMATYCZNEJ POLISACHARYDÓW MISKANTA
OLBRZYMIEGO I SŁOMY RZEPAKOWEJ OD WARUNKÓW
ICH WSTĘPNEJ OBRÓBKI AMONIAKIEM 1
Natalia Kordala, Małgorzata Lewandowska,
Magdalena Świątek, Włodzimierz Bednarski
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
Streszczenie. Przedmiotem badań było określenie wpływu obróbki wstępnej miskanta olbrzymiego i słomy rzepakowej za pomocą 15-procentowego roztworu amoniaku na proces
hydrolizy zawartych w nich polisacharydów. Efektywność jej działania oceniono na podstawie stężenia cukrów redukujących uwolnionych podczas hydrolizy enzymatycznej oraz
jej wydajności obliczonej w odniesieniu do sumy polisacharydów dostępnych w materiałach. Przeprowadzenie obróbki wstępnej w warunkach 80ºC/6 godz. skutkowało wzrostem
stężenia uwalnianych cukrów o 50% (miskant) i 18% (słoma rzepakowa) w odniesieniu
do hydrolizy materiałów po obróbce w warunkach 20°C/24 godz., w tym samym czasie hydrolizy. Niezależnie od wariantu obróbki wyższy stopień delignifikacji odnotowano w miskancie niż w słomie rzepakowej.
Słowa kluczowe: obróbka wstępna, amoniak, lignoceluloza, słoma rzepakowa, miskant
olbrzymi
WSTĘP
Postępujące wyczerpywanie się nieodnawialnych zasobów surowców paliwowych oraz
konieczność ochrony środowiska naturalnego skłaniają do upatrywania alternatywnych
źródeł energii, między innymi w biomasie roślinnej [Prendecka i in. 2005]. Rocznie powstaje jej na Ziemi 200 mld ton, z czego 90% stanowią odpady lignocelulozowe. Jest to
Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2010–2013 jako projekt badawczy.
© Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Adres do korespondencji – Corresponding author: Natalia Kordala, Katedra Biotechnologii Żywności, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, ul. Heweliusza 1, 10-718 Olsztyn, e-mail: [email protected]
20
N. Kordala i in.
w pewnym sensie, niedoceniana dotąd, strategiczna rezerwa energetyczna, eliminująca
ryzyko niepewności dostaw paliw importowanych oraz niepodlegająca fluktuacjom cen
na rynkach światowych [Piotrowski, Wiltowski 2004].
Ważnym kierunkiem biotechnologicznego wykorzystywania materiałów lignocelulozowych jest ich przerób na paliwa płynne, głównie na etanol. Produkcja etanolu z biomasy lignocelulozowej obejmuje cztery główne etapy: obróbkę wstępną, hydrolizę celulozy
i hemicelulozy, fermentację oraz odzysk i oczyszczanie etanolu.
Ze względu na cechy strukturalne kompleksu lignocelulozowego obróbka wstępna
jest niezbędnym etapem przed hydrolizą generującą cukry proste, wykorzystywane następnie w procesie fermentacji. Skuteczna obróbka wstępna przynosi obniżenie krystaliczności i wzrost porowatości celulozy oraz usunięcie ligniny [Schacht 2008]. Jej efekty
powinny usprawnić hydrolizę enzymatyczną, nie powodując strat polisacharydów ani
powstawania produktów ubocznych, wpływających hamująco na proces fermentacji etanolowej [Keshwani, Cheng 2009].
Biorąc pod uwagę zróżnicowany skład chemiczny biomasy lignocelulozowej, trudno
ustalić uniwersalny proces jej wstępnego przygotowania. Obecność ligniny i hemiceluloz
ogranicza dostęp enzymów celulolitycznych do celulozy, zmniejszając skuteczność ich
działania. Lignina, jako bariera fizyczna, utrudnia hydrolizę celulozy przez wiązanie enzymów celulolitycznych, wywołując ich inaktywację.
Obróbka wstępna ma kluczowe znaczenie w zapewnieniu dobrej wydajności uwalniania cukrów prostych z polisacharydów zawartych w surowcu. Stopień hydrolizy polisacharydów z pominięciem etapu jego wstępnego przygotowania osiąga wartość niższą
niż 20%, natomiast zastosowanie obróbki wstępnej zwiększa ją do 90% i wyższej [Balat
2011].
Znane są różne metody obróbki wstępnej materiałów lignocelulozowych. Ze względu
na rodzaj zastosowanych czynników można je podzielić na: biologiczne, fizyczne, chemiczne i fizykochemiczne. Do chemicznych metod obróbki wstępnej zaliczają się m.in.
sposoby wykorzystujące katalizatory alkaliczne, takie jak tlenek wapnia, wodorotlenek
wapnia, amoniak czy też wodorotlenek sodu. Większość z tych związków oddziałuje na
acetylowe grupy hemiceluloz i estrowe wiązania pomiędzy ligniną a pozostałymi polimerami. Skutkuje to częściowym upłynnieniem kompleksu i usunięciem znacznej części
ligniny [da Costa Sousa i in. 2009, Li, Kim 2011]. Konsekwencją tych zmian jest zwiększenie dostępności celulozy dla enzymów hydrolitycznych. Do głównych zalet metod
opierających się na zastosowaniu alkaliów należą: możliwość przeprowadzenia procesu
w temperaturze pokojowej, mniejsza degradacja sacharydów w porównaniu ze sposobami wykorzystującymi kwas siarkowy, a także brak powstawania furfuralu i hydroksymetylofurfuralu (HMF). Omawiane metody są przydatne głównie do obróbki pozostałości
rolniczych (np. słomy) [Alvira i in. 2010].
Zastosowanie amoniaku na etapie wstępnego przygotowania materiałów lignocelulozowych skutkuje puchnięciem biomasy i wzrostem jej porowatości, obniżeniem stopnia
polimeryzacji i krystaliczności celulozy oraz skuteczną delignifikacją [Gupta i in. 2009,
Kim i in. 2008]. Spośród różnych sposobów wykorzystujących roztwory amoniaku można wyróżnić recyrkulacyjną perkolację w roztworze amoniaku – ARP (z ang. ammonia
recycled percolation), SAA (z ang. soaking in aqueous ammonia), czyli moczenie w wodnych roztworach amoniaku, oraz AFEX (z ang. ammonia fibre explosion). Proces ARP
polega na wielokrotnym przemywaniu biomasy lignocelulozowej umieszczonej w reakActa Sci. Pol.
Ocena zależności efektów hydrolizy...
21
torze kolumnowym roztworem amoniaku o stężeniu 5 ÷ 15% (w/w) pod zwiększonym
ciśnieniem i w podwyższonej temperaturze (160 ÷ 180ºC). W tych warunkach wodny
roztwór amoniaku reaguje przede wszystkim z ligniną, powodując jej depolimeryzację
i rozpad wiązań pomiędzy polisacharydami kompleksu [Binod i in. 2010, da Costa Sousa
i in. 2009]. W metodzie SAA stopień delignifikacji i wydajność hydrolizy enzymatycznej
kolejnego etapu zależne są od zastosowanych parametrów, tj. temperatury i czasu procesu
oraz stężenia amoniaku. Zastosowanie metody SAA umożliwia przeprowadzenie procesu
w niskiej temperaturze, co sprzyja zachowaniu hemicelulozy we frakcji stałej oraz wpływa na zwiększenie wydajności fermentacji i uproszczenie systemu biokonwersji [Kim
i in. 2008]. Natomiast procedura AFEX polega na traktowaniu biomasy amoniakiem pod
dużym ciśnieniem (1,12 ÷ 1,36 MPa). W procesie stosuje się dodatek tego związku w stężeniach: od 0,6 ÷ 2 g · g-1 s.s. materiału poddawanego obróbce cieplnej w zakresie temperatury: od pokojowej (w czasie 10 ÷ 60 dni) do 120ºC (kilka minut). Obniżenie ciśnienia
i rozprężenie amoniaku skutkują rozerwaniem wiązań między ligniną a polisacharydami
kompleksu oraz częściową dekrystalizacją celulozy. W warunkach metody AFEX pentozany nie ulegają depolimeryzacji, dlatego w kolejnym etapie konieczne jest stosowanie
zarówno celulaz, jak i hemicelulaz. Jednakże biomasa po tego typu obróbce może być
poddana hydrolizie enzymatycznej z pominięciem detoksykacji [Alvira i in. 2010, da
Costa Sousa i in. 2009, Sánchez, Cardona 2008].
W niniejszym opracowaniu przedstawiono wyniki badań zmierzających do oceny
skuteczności metody delignifikacji opartej na obróbce amoniakiem we wstępnym traktowaniu miskanta olbrzymiego (Miscanthus giganteus) i słomy rzepakowej (Brassica napus L. var. napus). Głównym celem badań było zwiększenie podatności polisacharydów
(celulozy i hemicelulozy) na proces hydrolizy enzymatycznej, której efekty oceniano na
podstawie stężenia wydzielonych cukrów, możliwych do wykorzystania przez drożdże
w procesie fermentacji alkoholowej. Ponadto, w surowcu natywnym oraz wstępnie traktowanym z udziałem amoniaku określono udział głównych frakcji lignocelulozy, w celu
wykazania strat polisacharydów oraz stopnia usunięcia ligniny w wyniku tego zabiegu.
MATERIAŁ I METODY
W badaniach wykorzystywano dwa surowce lignocelulozowe: miskanta olbrzymiego
(Miscanthus giganteus) oraz słomę rzepakową (Brassica napus L. var. napus) w postaci
wysuszonej. Surowce poddano mieleniu (młyn tnący Retsch SM100), do poziomu rozdrobnienia 1–2 mm. W surowcach określono zawartość poszczególnych frakcji włókna,
stosując urządzenie FibertecTM 1020 (FOSS): neutralno-detergentowego (NDF) według
Van Soesta [Van Soest i in. 1991], kwaśno-detergentowego (ADF) oraz ligniny kwaśnodetergentowej (ADL) [PN-EN ISO 13906]. Zawartość celulozy wyznaczono z różnicy
pomiędzy udziałem frakcji ADF i ADL, natomiast hemicelulozy – z różnicy pomiędzy
udziałem frakcji NDF i ADF.
W celu przeprowadzenia obróbki wstępnej surowców odważono 10 g s.m. miskanta
lub słomy rzepakowej, po czym łączono z 90 ml 15% roztworu amoniaku. Zastosowano dwa warianty procesu: I – 20ºC/24 godz. lub II – 80ºC/6 godz. Po wyznaczonym
czasie próbki frakcjonowano metodą wirowania (RCF 4240/10 min/5ºC). Supernatant
odrzucano, a osad uzupełniono wodą i ponownie wirowano. Czynności te powtarzano do
Biotechnologia 12 (3) 2013
22
N. Kordala i in.
momentu uzyskania odczynu obojętnego we frakcji płynnej. Frakcję stałą przenoszono
następnie do kolb stożkowych o pojemności 300 ml, korygowano kwasowość środowiska
do pH 5,0 (za pomocą 99% kwasu octowego), uzupełniono wodą destylowaną do 100 g
i poddano hydrolizie enzymatycznej. Proces hydrolizy polisacharydów prowadzono
metodą wstrząsaną (inkubator Innova 40, New Brunswick Scientific), przy obrotach
250 obr ⋅ min-1; w temperaturze 40ºC z użyciem trzech preparatów enzymatycznych:
celulazy z Trichoderma longibrachiatum (SIGMA), ksylanazy z T. longibrachiatum
(SIGMA), celobiozy (Novozyme 188) w dawkach odpowiednio: 15 EGU1, 15 U2 oraz
30 CBU3 · g-1 s.s. materiału.
Podczas hydrolizy zastosowano dodatek azydku sodu (0,1%) celem wyeliminowania potencjalnych zakażeń mikrobiologicznych. W czasie reakcji okresowo pobierano
próbki do analizy, aby określić stężenia uwolnionych cukrów redukujących, przy użyciu
metody z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym [Miller 1959]. Wydajność hydrolizy obliczono
w odniesieniu do ilości polisacharydów (celulozy i hemicelulozy) w biomasie surowców
wstępnie traktowanych amoniakiem. Porównawczo przeprowadzono hydrolizę składników substratu natywnego (próba kontrolna).
WYNIKI I DYSKUSJA
Prowadzenie obróbki wstępnej surowców lignocelulozowych z wykorzystaniem metody
delignifikacji opartej na obróbce amoniakiem ma na celu zachowanie hemiceluloz (głównie ksylanu) we frakcji stałej, które po hydrolizie enzymatycznej mogą być wykorzystane
dzięki ko-fermentacji pentoz i heksoz, zwiększając wydajność etanolu [Kim i in. 2008].
Ten rodzaj wstępnego traktowania eliminuje powstawanie rozpuszczalnej frakcji cukrów,
które przy wysokich temperaturach obróbki wstępnej mogą być substratem do powstawania związków będących inhibitorami fermentacji (m.in. furfuralu, HMF).
Tabela 1. Skład chemiczny badanych surowców
Table 1. Chemical composition of the tested native substrates
Substrat
Substrate
Miskant olbrzymi
Miscanthus giganteus
Słoma rzepakowa
Rape straw
Celuloza
Celullose
[% s.s.]
Hemiceluloza
Hemicelullose
[% s.s.]
Lignina
Lignin
[% s.s.]
Suma polisacharydów
Total polysaccharides
[% s.s.]
45,3
27,1
9,8
72,4
49,2
12,2
14,9
61,4
Analiza frakcji włókna substratów lignocelulozowych stosowanych w eksperymencie wykazała różnice dotyczące zawartości poszczególnych polisacharydów oraz ligniny
(tab. 1). Biomasa miskanta zawierała ok. 45% celulozy w odniesieniu do suchej masy
1
2
3
1 EGU – ilość enzymu uwalniająca 1 μmol glukozy z celulozy w czasie 1 godz. (pH 5,0, temperatura 37°C, czas inkubacji 2 godz.)
1 U – ilość enzymu uwalniająca 1 μmol ksylozy z ksylanu w czasie 1 min (pH 4,5, temperatura
30°C)
1 CBU – ilość enzymu przekształcająca 1 μmol celobiozy do 2 μmoli glukozy w czasie 1 min
(pH 4,8, temperatura 50°C)
Acta Sci. Pol.
23
Ocena zależności efektów hydrolizy...
surowca, podczas gdy zawartość tego polimeru w biomasie słomy rzepakowej wynosiła
49% s.s. Zawartość procentowa hemiceluloz była ponad 2-krotnie wyższa w biomasie
miskanta niż w słomie rzepakowej. Dodatkowo, miskant charakteryzował się niższą o ponad 50% zawartością ligniny w porównaniu ze słomą, co powinno sprzyjać jego podatności na hydrolizę.
Tabela 2. Skład chemiczny oraz straty suchej masy surowców po obróbce amoniakiem
Table 2. Chemical composition and dry matter losses of the substrates after pretreatment
with ammonia
Substrat
Substrate
Miskant
olbrzymi
Miscanthus
giganteus
Słoma
rzepakowa
Rape straw
Straty s.s. po
Suma
obróbce
polisacharydów
Dry matter
Total polysaclosses after
charides
pretreatment
[% s.s.]
[%]
Parametry obróbki
wstępnej
Pretreatment
parameters
Celuloza
Celullose
[% s.s.]
Hemiceluloza
Hemicelullose
[% s.s.]
Lignina
Lignin
[% s.s.]
20°C/24 h
65,3
19,3
4,9
84,6
27,6
80°C/6 h
59,6
20,5
8,3
80,1
38,3
20°C/24 h
52,0
15,9
17,3
67,9
25,2
80°C/6 h
53,0
16,7
14,7
69,7
30,9
W wyniku obróbki wstępnej, z udziałem amoniaku, w badanych surowcach nastąpiły
straty masy w zakresie 25 ÷ 38%. Były one większe w surowcach traktowanych wyższą
temperaturą (80°C) niż inkubowanych w temperaturze pokojowej i wyniosły 39 i 23%,
odpowiednio dla miskanta i słomy rzepakowej. Mogło to być spowodowane większym
stopniem degradacji składników na skutek działania podwyższonej temperatury. Udział
poszczególnych komponentów w masie próby uległ zmianie w różnym stopniu i był uzależniony od wariantu obróbki (tab. 2). W miskancie traktowanym w warunkach wariantu
I (20°C/24 godz.) udział procentowy ligniny uległ ponad 2-krotnemu obniżeniu w porównaniu z surowcem natywnym. Biorąc pod uwagę straty masy, odnotowano stopień
delignifikacji na poziomie 63,9% (rys. 1). Słoma rzepakowa po obróbce w omawianych
warunkach charakteryzowała się wyższym udziałem ligniny (17,3%) w porównaniu z surowcem natywnym, natomiast obliczony stopień jej usunięcia względem masy wyjściowej wyniósł 13,4%. W II wariancie obróbki (80°C/6 godz.) udział ligniny w biomasie
miskanta uległ obniżeniu do 8,3%, a ubytek wagowy tej frakcji nie przekroczył 50%.
W tych warunkach słoma uległa delignifikacji w stopniu około 2,5-krotnie wyższym
w porównaniu z wariantem I (32,0% wobec 13,4%). Można zatem stwierdzić, że obróbka
z udziałem amoniaku w 20°C/24 godz. pozwoliła na uzyskanie korzystniejszych efektów
delignifikacji miskanta niż traktowanie omawianego materiału podwyższoną temperaturą
w krótszym czasie, natomiast w odniesieniu do słomy rzepakowej odnotowano odwrotną
zależność. Różnice w stopniu delignifikacji badanych surowców mogły być związane
z ich różną strukturą oraz składem chemicznym, a przez to podatnością na działanie zastosowanych czynników fizykochemicznych.
Biotechnologia 12 (3) 2013
24
N. Kordala i in.
Strata składnika [%]
The loss of the component
70
60
50
40
30
20
10
0
Słoma rzepakowa
Rape straw
Miskant olbrzymi
Miscanthus giganteus
Warianty obróbki wstępnej
The variants of the pretreatment
celuloza
cellulose
hemiceluloza
hemicellulose
lignina
lignin
Rys. 1. Straty głównych frakcji lignocelulozy w biomasie miskanta olbrzymiego i słomy rzepakowej po obróbce wstępnej amoniakiem (I – 20°C/24 godz.; II – 80°C/6 godz.)
Fig. 1. The losses of the main lignocellulose fractions in biomass of Miscanthus giganteus and
rape straw pretreated with ammonia (I – 20°C/24 h; II – 80°C/6 h)
Wstępne traktowanie substratów amoniakiem przyczyniło się również do zmian
w udziale frakcji polisacharydów – celulozy i hemicelulozy. W słomie rzepakowej zaobserwowano straty celulozy w wysokości 21,0 i 25,6% (rys. 1), odpowiednio dla I i II
wariantu obróbki, natomiast jej udział nieznacznie się zwiększył w porównaniu z surowcem natywnym (tab. 1, 2). W miskancie odnotowano ubytek celulozy jedynie po obróbce
w warunkach wariantu II (18,9%), zaś jej bezwzględna zawartość w materiale zwiększyła
się o 44% (wariant I) i 32% (wariant II). Różnice te mogły być wynikiem odmiennej
struktury oraz stopnia krystaliczności frakcji celulozowej badanych surowców. Największe różnice w składzie substratów wynikające z obróbki odnotowano jednak w zakresie
udziału hemiceluloz. W miskancie wyniosły one 48,5 i 53,5%, odpowiednio dla wariantu
I i II, co skutkowało obniżeniem udziału hemicelulozy do około 20%. W słomie straty
omawianej frakcji były niewielkie i wyniosły 2,5% (wariant I) i 5,3% (wariant II), a jej
udział uległ zwiększeniu odpowiednio do 15,9 i 16,7%. Zróżnicowane straty frakcji hemicelulozowej obu badanych substratów mogły być skutkiem różnic w ilości i strukturze
tej frakcji, a także podatności na depolimeryzację w następstwie obróbki wstępnej.
Po przeprowadzeniu 72-godzinnej hydrolizy enzymatycznej substratów natywnych
(próba kontrolna) uzyskano stężenie uwolnionych cukrów redukujących w medium poreakcyjnym na poziomie 21,46 i 16,39 g · dm-3 hydrolizatu, odpowiednio dla miskanta
olbrzymiego i słomy rzepakowej (rys. 2, 3). Uzyskane wartości stanowiły odpowiednio
26,7 i 24,0% teoretycznej wydajności (obliczonej w odniesieniu do polisacharydów zawartych w surowcach natywnych, tab. 1). Hydroliza enzymatyczna substratów poddanych
obróbce amoniakiem w warunkach wariantu I pozwoliła uzyskać około 1,4-krotnie wyższą zawartość cukrów redukujących po 72 godz. procesu niż hydroliza polisacharydów
Acta Sci. Pol.
25
Ocena zależności efektów hydrolizy...
w substratach natywnych. Wydajność hydrolizy substratów traktowanych amoniakiem
w odniesieniu do polisacharydów dostępnych podczas procesu była około 1,7-krotnie
wyższa od wydajności w przypadku substratów natywnych (rys. 4). Proces przebiegał najefektywniej przez 24 godziny, po upływie których stężenie glukozy wyniosło
24,8 g · dm-3 w hydrolizacie miskanta i 17,2 g · dm-3 w hydrolizacie słomy. Wielkości
te stanowiły około 82% (miskant) i 76% (słoma) wartości uzyskanej po 72 godzinach
procesu (rys. 2, 3).
Badania przeprowadzone z udziałem surowców lignocelulozowych wstępnie traktowanych w warunkach wariantu II wykazały, że zastosowanie wyższej temperatury
obróbki pozwala na uzyskanie korzystniejszych rezultatów prowadzonej sekwencyjnie
hydrolizy enzymatycznej polisacharydów (rys. 2, 3). Tempo wzrostu stężenia uwolnionych cukrów redukujących było najszybsze podczas 24 godz. procesu, po czym następowało jego zwolnienie. Po 72 godz. hydrolizy stężenie uwolnionych cukrów wyniosło
45,73 g · dm-3 z miskanta oraz 26,82 g · dm-3 ze słomy. Zastosowanie warunków wariantu
II obróbki wstępnej pozwoliło na wzrost stężenia uwalnianych cukrów o 50% (miskant)
i 18% (słoma), w odniesieniu do hydrolizy materiałów po obróbce w warunkach wariantu I w tym samym czasie hydrolizy, tj. 72 godzin. Ponadto, ilość cukrów redukujących
uwolnionych po 72 godz. hydrolizy substratów wstępnie traktowanych w warunkach
wariantu II była ponad 2-krotnie (miskant) i 1,6-krotnie (słoma) większa w porównaniu
z ilością uzyskaną w przypadku substratów natywnych.
stħǏenieglukozy[gͼdm–3]
Stężenie glukozy [g · dm-3]
Glucose concentration
glucoseconcentration[gͼdm–3]
50
50
45
45
40
40
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
55
00
00
20°C/24h
20°C/24 h
24
24
48
72
72
80°C/6h
80°C/6 h
Czas [h]
czas[h]
Time
substrat natywny
time[h]
substratnatywny
native substrate
[native substrate]
Rys. 2. Postęp hydrolizy enzymatycznej polisacharydów miskanta olbrzymiego natywnego
(symbole puste) oraz po obróbce wstępnej amoniakiem (20°C/24 godz. lub 80°C/6 godz.)
(symbole pełne) w trakcie 72 godz. doświadczenia, wyrażony stężeniem cukrów redukujących w hydrolizacie
Fig. 2. Enzymatic hydrolysis rate of untreated (empty symbols) and ammonia pretreated Miscanthus giganteus polysaccharides (20°C/24 h or 80°C/6 h) (filled symbols) during 72-hour
experiment, expressed as reducing sugars concentration in hydrolysate
Biotechnologia 12 (3) 2013
26
N. Kordala i in.
35
Stężenie glukozy [g · dm-3]
Glucose concentration
30
25
20
15
10
5
0
0
24
48
72
Czas [h]
Time
20°C/24 h
substrat natywny
native substrate
80°C/6 h
Rys. 3. Postęp hydrolizy enzymatycznej polisacharydów słomy rzepakowej natywnej (symbole
puste) oraz po obróbce wstępnej amoniakiem (20°C/24 godz. lub 80°C/6 godz.) (symbole
pełne) w trakcie 72 godz. doświadczenia, wyrażony stężeniem cukrów redukujących w hydrolizacie
Fig. 3. Enzymatic hydrolysis rate of untreated (empty symbols) and ammonia pretreated rape
straw polysaccharides (20°C/24 h or 80°C/6 h) (filled symbols) during 72-hour experiment, expressed as reducing sugars concentration in hydrolysate
100
90
83,4
80
70
Wydajność [%]
Efficiency
60
50,1
50
44,4
40,4
40
30
26,7
24,0
20
10
0
natywny
native
20°C/24 h
Miskant olbrzymi
Miscanthus giganteus
80°C/6 h
natywna
native
20°C/24 h
80°C/6 h
Słoma rzepakowa
Rape straw
Rys. 4. Porównanie wydajności 72-godzinnej hydrolizy enzymatycznej polisacharydów miskanta olbrzymiego i słomy rzepakowej natywnych oraz po obróbce wstępnej amoniakiem
(20°C/24 godz. lub 80°C/6 godz.)
Fig. 4. The comparison of the efficiency of 72-hour enzymatic hydrolysis of polysaccharides of
untreated and ammonia pretreated Miscanthus giganteus and rape straw (20°C/24 h or
80°C/6 h)
Acta Sci. Pol.
Ocena zależności efektów hydrolizy...
27
Wydajność procesu hydrolizy polisacharydów z miskanta traktowanego w warunkach
wariantu II (83,4%) była prawie 2-krotnie wyższa w porównaniu z substratem traktowanym amoniakiem w temperaturze pokojowej (wariant I) pomimo niższego stopnia delignifikacji, odpowiednio: 63,9 i 47,9% (wariant I i II). W wyniku 72-godzinnej hydrolizy polisacharydów ze słomy rzepakowej traktowanej amoniakiem uzyskano 1,7-krotnie
(wariant I) oraz 2-krotnie (wariant II) wyższą wydajność procesu niż z udziałem substratu
natywnego. Traktowanie słomy rzepakowej amoniakiem w wyższej temperaturze skutkowało wyższym stopniem delignifikacji (wariant I i II – 13,4 i 32,0%), w przeciwieństwie do miskanta olbrzymiego (rys. 1). W rezultacie 72-godzinnej hydrolizy substratów
wstępnie traktowanych amoniakiem w temperaturze 20°C osiągnięto zbliżoną wydajność
procesu dla obu substratów, natomiast zastosowanie wyższej temperatury obróbki wstępnej skutkowało uzyskaniem prawie 2-krotnie wyższej wydajności hydrolizy miskanta
niż słomy rzepakowej.
Najkorzystniejsze rezultaty procesu hydrolizy składników miskanta olbrzymiego,
traktowanego amoniakiem w warunkach wariantu II, świadczą o większym stopniu przemian w obrębie kompleksu lignocelulozowego oraz zwiększonej dostępności polisacharydów dla enzymów hydrolitycznych w wyniku obróbki w podwyższonej temperaturze.
Ponadto, mogą być one spowodowane różnym składem obu substratów, a w szczególności niższą zawartością ligniny (której wysoka koncentracja obniża skuteczność hydrolizy w wyniku wiązania enzymów) oraz wyższej zawartości polisacharydów w miskancie
w porównaniu ze słomą rzepakową.
Kim i in. [2008] w przetwarzaniu plew jęczmiennych za optymalne warunki obróbki
uznali: stężenie amoniaku – 15% (w/w), temperaturę procesu – 75°C, czas – 48 godz.,
stosunek frakcji stałej do płynnej – 1:12 (w/w). Zastosowanie wymienionych parametrów
podczas wstępnego traktowania pozwoliło na zachowanie 67% ksylanu i usunięcie 61%
ligniny oraz doprowadziło do hydrolizy w kolejnym etapie celulozy w 83% i ksylanu –
w 63%.
W badaniach Ko i in. [2009] za najbardziej korzystne parametry obróbki wstępnej
słomy ryżowej z wykorzystaniem metody SAA uznano: stężenie amoniaku – 21% (w/w),
temperaturę – 69°C, czas – 10 godz., stosunek frakcji stałej do płynnej – 1:6 (w/w).
W ustalonych warunkach uzyskano stopień delignifikacji równy około 60%, a wydajność hydrolizy enzymatycznej polisacharydów wyniosła 70% teoretycznej wydajności
glukozy.
Proces wstępnego traktowania biomasy pustych owocostanów palmy olejowej przez
moczenie w roztworze amoniaku przeprowadzili Jung i in. [2011]. Po obróbce w warunkach: stężenie amoniaku 21% (w/w), temperatura 60°C, czas 12 godz., a następnie 96-godzinnej hydrolizie enzymatycznej uzyskano wydajność uwalniania glukozy na poziomie
19,5% oraz 41,4%, przy dawkach celulazy odpowiednio 15 oraz 60 FPU. W powyższych
warunkach stwierdzono również zmniejszenie zawartości ligniny o 41,1% oraz zachowanie 78,3% glukanu we frakcji stałej.
Zhu i in. [2006] wykazali, że wspieranie obróbki alkalicznej słomy pszennej promieniowaniem mikrofalowym skutkuje niższymi stratami cukrów oraz wyższym stopniem
hydrolizy materiału. Ogrzewanie mikrofalowe, jako metodę pomocniczą dla obróbki
wstępnej amoniakiem (28% w/w) wytłoczyn sorga w produkcji etanolu, wykorzystali
również Chen i in. [2012]. Najlepsze wyniki, w odniesieniu do ilości uwolnionej glukozy (4,2 g/10 g s.s.) oraz wydajności etanolu (2,1 g/10 g s.s.) uzyskano po obróbce
Biotechnologia 12 (3) 2013
28
N. Kordala i in.
w warunkach 130°C przez 1 godz. We frakcji stałej pozostało około 90% celulozy i 73%
hemicelulozy. Najkorzystniejszy stopień delignifikacji (46%) odnotowano w temperaturze 160°C. Stwierdzono ponadto, że stężenia furfuralu, kwasów organicznych i glicerolu
były bardzo niskie, dzięki czemu nie wpływały hamująco na enzymy w czasie hydrolizy
ani na aktywność drożdży podczas fermentacji etanolowej sacharydóaw – pochodnych
lignocelulozy prowadzonej w systemie sekwencyjnym [Chen i in. 2012].
PODSUMOWANIE
Wyniki przeprowadzonych doświadczeń wskazują, że wstępne traktowanie miskanta
olbrzymiego i słomy rzepakowej 15% roztworem amoniaku powoduje częściową delignifikację oraz podwyższenie procentowego udziału polisacharydów w surowcach
i zwiększa ich podatność na hydrolizę enzymatyczną. Obróbka wstępna w temperaturze
80°C, w czasie 6 godz. pozwoliła na uzyskanie korzystniejszych rezultatów hydrolizy enzymatycznej polisacharydów obu surowców, w porównaniu z traktowaniem amoniakiem
w temperaturze 20°C i w czasie 24 godz. Można zatem stwierdzić, że proces obróbki chemicznej w podwyższonej temperaturze skutkuje większym stopniem przemian w obrębie
kompleksu lignocelulozowego, sprzyjając poprawie efektów hydrolizy enzymatycznej.
PIŚMIENNICTWO
Alvira P., Tomás-Pejó E., Ballesteros M., Negro M.J., 2010. Pretreatment technologies for an effi
effi-cient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresour. Technol., 101, 4851–4861.
Balat M., 2011. Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical pathway: A review. Ener. Conv. and Manag., 52, 858–875.
Binod P., Sindhu R., Singhania R.R., Vikram S., Devi L., Nagalakshmi S., Kurien N., Sukumaran
R.K., Pandey A., 2010. Bioethanol production from rice straw: An overview. Bioresour. Technol., 101, 4767–4774.
Chen C., Boldor D., Aita G., Walker M., 2012. Ethanol production from sorghum by a microwaveassisted dilute ammonia pretreatment. Bioresour. Technol., 110, 190–197.
da Costa Sousa L., Chundawat S.P.S., Balan V., Dale B.E., 2009. “Cradle-to-grave” assessment of
existing lignocellulose pretreatment technologies. Curr. Opin. Biotechnol., 20, 339–347.
Gupta R., Lee Y.Y., 2009. Pretreatment of hybrid poplar by aqueous ammonia. Biotechnol. Progr.,
25, 357–364.
Jung Y.H., Kim I.J., Han J.-I., Choi I.-G., Kim K.H., 2011. Aqueous ammonia pretreatment of oil
palm empty fruit bunches for ethanol production. Bioresour. Technol.,102, 9806–9809.
Keshwani D.R., Cheng J.J., 2009. Switchgrass for bioethanol and Rother value-added applications:
A review. Bior. Tech., 100, 1515–1523.
Kim T.H., Taylor F., Hicks K.B., 2008. Bioethanol production from barley hull using SAA (soaking
in aqueous ammonia) pretreatment. Bioresour. Technol., 99, 5694–5702.
Ko J.K., Bak J.S., Jung M.W., Lee H.J., Choi I.-G., Kim T.H., Kim K.H., 2009. Ethanol production
from rice straw using optimized aqueous-ammonia soaking pretreatment and simultaneous saccharification and fermentation processes. Bioresour. Technol., 100, 4374–4380.
Li X., Kim T.H., 2011. Low-liquid pretreatment of corn stover with aqueous ammonia. Bioresour.
Technol., 102, 4779–4786.
Acta Sci. Pol.
Ocena zależności efektów hydrolizy...
29
Miller G.L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal.
Chem., 31 (3), 426–428.
Piotrowski K., Wiltowski T., 2004. Biomasa – kłopotliwe pozostałości czy strategiczne rezerwy
czystej energii? Czysta Energia, 12, 16–17.
Polska Norma PN_EN ISO 13906. 2009. Pasze. Oznaczanie zawartości włókna kwaśnodetergentowego (ADF) i ligniny kwaśnodetergentowej (ADL).
Prendecka M., Rogalski J., Szczodrak J., 2005. Enzymatyczna hydroliza mannanów roślinnych.
Biotechnol., 68, 61–78.
Sánchez Ó.J., Cardona C.A., 2008. Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresour. Technol., 99, 5270–5295.
Schacht C., Zetzl C., Brunner G., 2008. From plant materials to ethanol by means of supercritical
fluid technology. J. of Supercrit. Fluids, 46, 299–321.
Van Soest P.J., Robertson J.B., Lewis B.A., 1991. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber
and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition. J. of Dairy Sci., 74, 3583–3597.
Zhu S., Wu Y., Yu Z., Chen Q., Wu G., Yu F., Wang C., Jin S., 2006. Microwaveassisted alkali pretreatment of wheat straw and its enzymatic hydrolysis. Biosyst. Eng., 94, 437–442.
THE EVALUATION OF THE DEPENDENCE OF THE EFFECTS
OF ENZYMATIC HYDROLYSIS OF MISCANTHUS GIGANTEUS
AND RAPE STRAW POLYSACCHARIDES ON THE CONDITIONS
OF AMMONIA PRETREATMENT
Abstract. The object of the study was to determine the effect of the pretreatment of Miscanthus giganteus and straw rape with a 15% solution of ammonia on the availability of
polysaccharides in substrates for hydrolysis. Its effectiveness was assessed on the basis
of the concentration of reducing sugars released during enzymatic hydrolysis and its efficiency calculated in relation to the total polysaccharides available in materials. Carrying
out the pretreatment under conditions of 80°C/6 h resulted in an increase in released sugars
concentration by 50% (Miscanthus) and 18% (straw), with regard to the hydrolysis of the
materials pretreated under conditions of 20°C/24 h, at the same hydrolysis time. Regardless
of the pretreatment variant a higher degree of delignification was reported for Miscanthus
than rape straw.
Key words: pretreatment, ammonia, lignocellulose, rape straw, Miscanthus giganteus
Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 30.09.2013
Do cytowania – For citation: Kordala N., Lewandowska M., Świątek M., Bednarski W.,
2013. Ocena zależności efektów hydrolizy enzymatycznej polisacharydów miskanta
olbrzymiego i słomy rzepakowej od warunków ich wstępnej obróbki amoniakiem. Acta
Sci. Pol. Biotechnol., 12 (3), 19–30.
Biotechnologia 12 (3) 2013