doskonalenie warunków hydrolizy enzymatycznej polisacharydów

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2012 z. 570: 107–116
DOSKONALENIE WARUNKÓW HYDROLIZY
ENZYMATYCZNEJ POLISACHARYDÓW ZAWARTYCH
W SŁOMIE RZEPAKOWEJ1
Karolina Świątek, Małgorzata Lewandowska, Magdalena Świątek,
Włodzimierz Bednarski
Katedra Biotechnologii Żywności
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
Wstęp
Jednym z głównych problemów technologicznych podczas fermentacji surowców lignocelulozowych jest złożoność ich budowy, co powoduje, że niezbędne jest
ich przygotowanie, które decyduje o efektywności procesu. Destabilizacja struktury surowca powinna zapewnić wysoki poziom dostępu do celulozy i hemicelulozy, jak również brak lub minimalne pozostałości ligniny oraz inhibitorów, które zakłócają proces hydrolizy polisacharydów. Wyróżnia się cztery główne grupy
metod wstępnej obróbki surowców lignocelulozowych: fizyczne, fizykochemiczne,
chemiczne i biologiczne. W zależności od zastosowanej metody zachodzą różne
przemiany w obrębie kompleksu lignocelulozowego. Z uwagi na dużą różnorodność surowców lignocelulozowych oraz różnice w ich właściwościach fizycznych
i chemicznych niezbędne jest opracowanie takich sposobów postępowania, które
gwarantowałyby uzyskanie pożądanych rezultatów przy minimalnych nakładach
finansowych [DA COSTA SOUSA i in. 2009; KRISTENSEN 2009].
Ostatnio przeprowadzono wiele badań dotyczących oceny możliwości stosowania enzymów w procesach biokonwersji lignocelulozy. Enzymatyczna hydroliza
wstępnie przygotowanych materiałów lignocelulozowych obejmuje reakcje mające
na celu przekształcenie celulozy do glukozy oraz hemicelulozy do pentoz (ksylozy
i arabinozy) i heksoz (glukozy, galaktozy i mannozy). Konwersja celulozy i hemicelulozy katalizowana jest odpowiednio przez celulazy i hemicelulazy. Celulazy
odgrywają tu znaczącą rolę, ponieważ katalizują proces rozkładu celulozy do cukrów fermentujących. Enzymami biorącymi udział w hydrolizie celulozy są: endoglukanazy, egzoglukanazy oraz β-glukozydazy. Endoglukanazy katalizują losowo
rozkład wewnętrznych wiązań łańcucha celulozy, natomiast egzoglukanazy atakują
końce łańcucha, uwalniając cząsteczki celobiozy [KUMAR i in. 2008]. Degradacja
1
Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2010–2013 jako projekt badawczy.
108
K. Świątek i inni
celulozy jest utrudniona ze względu na występowanie wewnętrznych i zewnętrznych wiązań wodorowych, które stabilizują włókna celulozy [MALHERBE I CLOETE
2002]. Proces hydrolizy celulozy składa się z następujących etapów: adsorpcji celulazy na powierzchni celulozy, degradacji celulozy do cukrów prostych oraz desorpcji celulazy z powierzchni materiału poddawanego hydrolizie [KULIKOWSKA
i KLIMKOWSKI 2008].
Hemiceluloza może być rozkładana przez różne enzymy. Ksylan ulega hydrolizie pod wpływem enzymów, takich jak endoksylanaza i β-ksylozydaza, które powodują jego degradację do ksylooligosacharydów. Z kolei α-glukuronidaza, α-arabinofuranozydaza i esteraza acetyloksylanu odszczepiają boczne grupy
i łańcuchy heteroksylanu, natomiast za hydrolizę glukomannanu odpowiadają
β-mannanaza i β-mannozydaza. Efektywność hydrolizy polisacharydów substratów lignocelulozowych uwarunkowana jest ich skutecznym przygotowaniem oraz
precyzyjnym doborem kompleksu enzymów [KUMAR i in. 2009].
Głównym źródłem handlowych preparatów celulaz są grzyby strzępkowe,
w szczególności celulolityczne szczepy należące do rodzaju Trichoderma. Najbardziej reprezentatywnymi przedstawicielami są T. viride, T. longibrachiatum, T. reesei. Produkowane obecnie na skalę przemysłową preparaty celulaz bazują głównie
na genetycznie zmodyfikowanych mutantach T. reesei. Grzyby z rodzaju Aspergillus, najczęściej wykorzystywane w produkcji przemysłowej, mogą być przydatne jako źródło pozyskiwania β-glukozydazy, ksylanazy i ksyloglukanazy. Również
grzyby z rodzaju Penicillium mogą być alternatywnym producentem enzymów
z grupy celulaz. Enzymy tych grzybów są mniej podatne na hamujący wpływ inhibitorów, charakteryzują się także mniejszym powinowactwem do ligniny [GUSAKOV 2011]. Innym ważnym źródłem enzymów celulolitycznych są bakterie, zarówno tlenowe, jak i beztlenowe. Bakterie razem z grzybami zajmują w przyrodzie
centralne miejsce w biodegradacji biomasy roślinnej, z uwagi na ich zdolność do
tworzenia odpowiednich nanokompleksów układów enzymatycznych. Przykładem
takich tlenowych promieniowców mogą być Cellulomonas i Thermobifida. Natomiast beztlenowce, takie jak Clostridium i Ruminococcus, mogą produkować specjalne kompleksy celulaz, zwane cellulosomami. Pomimo istotnych zalet, jak przeżywalność w wyższej temperaturze i lepsze przystosowanie do trudnych warunków,
bakterie nie mogą konkurować z mutantami grzybów, gdyż poziom ekspresji białka
tych mikroorganizmów jest za niski [WILSON 2009; GUSAKOV 2011].
Celem przeprowadzonych badań było określenie przydatności celulolitycznych preparatów enzymatycznych, skomponowanych w różnych zestawieniach, do
wydajnej hydrolizy polisacharydów słomy rzepakowej. Efekty hydrolizy oceniano
na podstawie stężenia wydzielonych cukrów, możliwych do wykorzystania przez
drożdże w procesie fermentacji alkoholowej.
Materiał i metody
Materiałem doświadczalnym była słoma rzepakowa (Brassica napus L. var. napus), pochodząca z Gospodarstwa Rolnego w Pacółtowie AUREPIO AGRA Sp. z o.o.,
w postaci wysuszonej, o zawartości 95,1% suchej masy. Surowiec poddano procesowi kilkustopniowego mielenia (młyn tnący Retsch SM100, 2007 r., Niemcy), do
poziomu rozdrobnienia 1–2 mm. Określono udział poszczególnych frakcji włókna
DOSKONALENIE WARUNKÓW HYDROLIZY ENZYMATYCZNEJ...
109
w słomie rzepakowej, stosując urządzenie FibertecTM 1020 (FOSS, 2011 r., Chiny);
oznaczono: zawartość włókna neutralno-detergentowego (NDF) według Van Soest’a
[VAN SOEST i in. 1991], zawartość włókna kwaśno-detergentowego (ADF) oraz zawartość ligniny kwaśno-detergentowej (ADL) [PN-EN ISO 13906]. Zawartość celulozy wyznaczono z różnicy pomiędzy udziałem frakcji ADF i ADL, natomiast zawartość hemicelulozy – z różnicy pomiędzy udziałem frakcji NDF i ADF.
Słomę rzepakową poddano chemicznej obróbce w warunkach: temperatura
121°C, czas 1 h, dodatek NaOH 0,1g·g–1 s.s. substratu (parametry te wyznaczono
na podstawie wcześniejszych badań przeprowadzonych w Katedrze Biotechnologii
Żywności). Materiał po obróbce i korekcie kwasowości środowiska do pH 5,0 (za
pomocą 99-procentowego kwasu octowego) poddano hydrolizie enzymatycznej.
Stężenie substratu lignocelulozowego w zawiesinie ustalono na poziomie 10% s.s.
(w/w), co zapewniło możliwość mieszania medium w czasie reakcji. Reakcję prowadzono w czasie 72 h, w temperaturze 50°C, w kolbach stożkowych o pojemności
500 cm3, zawierających 100 g medium reakcyjnego, z zastosowaniem wytrząsania
(250 obr·min–1; inkubator Innova 40, New Brunswick, 2010 r., USA), przy użyciu
6 ustalonych kompozycji preparatów enzymatycznych (według tab. 1). Oceniano
dwa rodzaje celulaz: Celluclast 1.5L (Novozymes, nr kat. SIGMA C2730) i celulazę z Trichoderma longibrachiatum (nr kat. SIGMA C9748) oraz dwa preparaty ksylanaz: Pentopan Mono BG – ksylanaza z Thermomyces lanuginosus (Novozymes,
nr kat. SIGMA X2753) i ksylanazę z Trichoderma longibrachiatum (nr kat. SIGMA X2629). We wszystkich wariantach procesu hydrolizy zastosowano dodatek
celobiazy (Novozyme 188, Novozymes, nr kat. SIGMA C6105) w celu rozkładu
powstającej celobiozy (hamującej aktywność celulaz) do glukozy.
Tabela 1; Table 1
Kompozycje stosowanych preparatów enzymatycznych
The compositions of the enzyme preparations used
Nr; No
Kompozycje preparatów enzymatycznych
The compositions of the enzyme preparations
1
Celluclast 1.5L + celobioza
2
Celluclast 1.5L + Pentopan Mono BG + celobiaza
3
Celluclast 1.5L + ksylanaza z T. longibrachiatum + celobiaza
4
celulaza z T. longibrachiatum + celobiaza
5
celulaza z T. longibrachiatum + Pentopan Mono BG + celobiaza
6
celulaza z T. longibrachiatum + ksylanaza z T. longibrachiatum + celobiaza
Preparaty enzymatyczne stosowano w następujących dawkach: Celluclast
1.5L – 15 FPU·g–1 s.s. słomy, celulaza z Trichoderma longibrachiatum – 15 U·g–1
s.s. słomy, Pentopan Mono BG – 15 FXU·g–1 s.s. słomy, ksylanaza z T. longibrachiatum – 15 FXU·g–1 s.s. słomy, celobiaza (Novozyme 188) – 30 CBU·g–1 s.s. słomy. Aktywność enzymów była wyrażana następująco: 1 FPU – ilość enzymu uwalniająca 1 μmol glukozy z bibuły Whatman no. 1, w czasie 1 minuty, 1 U – ilość
enzymu uwalniająca 1 μmol glukozy z celulozy w czasie 1 h (warunki reakcji:
pH 5,0; temperatura 37°C, czas inkubacji 2 h), 1 FXU – ilość enzymu uwalniająca
1 μmol ksylozy z ksylanu w czasie 1 minuty (warunki reakcji: pH 4,5; tempera-
110
K. Świątek i inni
tura 30°C), 1 CBU – ilość enzymu przekształcająca 1 μmol celobiozy do 2 μmoli
glukozy w ciągu 1 minuty (warunki reakcji: pH 4,8; temperatura 50°C). Podczas
hydrolizy zastosowano dodatek azydku sodu (0,1%) celem wyeliminowania potencjalnych zakażeń mikrobiologicznych. W czasie reakcji okresowo pobierano próbki
do analizy. Efekty hydrolizy określano na podstawie stężenia uwolnionych cukrów
redukujących, oznaczonych przy użyciu metody z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym
[MILLER 1959]. Porównawczo przeprowadzono hydrolizę materiału natywnego.
Wyniki i dyskusja
Efektywność hydrolizy enzymatycznej surowców lignocelulozowych uzależniona jest od ich rodzaju, stopnia dojrzałości, składu chemicznego oraz sposobu wstępnej obróbki. Rozdrabnianie prowadzi do zmniejszenia wielkości cząstek
i częściowego zniszczenia krystalicznej struktury celulozy, co ułatwia dostęp enzymów do kompleksu polisacharydów, a także powoduje zwiększenie wrażliwości
substratu na działanie czynników chemicznych. Redukcja wielkości cząstek słomy
pszennej do wartości 53–149 μm pozwala na zwiększenie wydajności uwalniania
glukozy i ksylozy po 24-godzinnej hydrolizie enzymatycznej odpowiednio o 39%
i 20% w porównaniu z próbami odniesienia (cząstki o długości 2–4 cm) [PEDERSEN i MEYER 2009; DA COSTA SOUSA i in. 2009]. Wstępne traktowanie lignocelulozy alkaliami, takimi jak: wodorotlenek wapnia, amoniak czy wodorotlenek sodu,
powoduje degradację wiązań łączących ligninę z pozostałymi polimerami, co jest
przyczyną częściowego upłynnienia kompleksu, a także usunięcia części ligniny.
Wymienionym zmianom towarzyszy również zwiększenie dostępności celulozy dla
enzymów hydrolitycznych [ALVIRA i in. 2010]. We wcześniej prowadzonych badaniach własnych ustalono warunki wstępnej obróbki badanego substratu oraz parametry prowadzenia hydrolizy enzymatycznej.
Doświadczenia opisane w niniejszej pracy dotyczyły doboru najefektywniej
współdziałającej kombinacji preparatów enzymatycznych, charakteryzującej się
wydajnym uwalnianiem cukrów fermentujących ze słomy rzepakowej. Udział podstawowych frakcji (celulozy, hemicelulozy i ligniny) w suchej masie słomy rzepakowej wynosił odpowiednio: 49,2; 12,2 i 14,9%, przy czym łączna zawartość celulozy i hemicelulozy – polisacharydów stanowiących potencjalne źródło cukrów
fermentujących – kształtowała się na poziomie 61,4%.
Przeprowadzenie 72-godzinnej hydrolizy substratu natywnego (próba kontrolna) pozwoliło na uzyskanie stężenia uwolnionych cukrów redukujących na poziomie 10,68–16,39 g·dm–3 hydrolizatu, a największe ich stężenie osiągnięto przy
zastosowaniu kompozycji, w której składzie znalazła się ksylanaza z T. longibrachiatum – zarówno w skojarzeniu z celulazą Celluclast 1.5L (rys. 1), jak i z celulazą
z T. longibrachiatum (rys. 2). Zastosowanie wymienionych kombinacji pozwoliło
na uzyskanie wydajności hydrolizy polisacharydów w odniesieniu do wartości teoretycznej, wyznaczonej na podstawie stężenia celulozy i hemicelulozy w materiale
natywnym, na poziomie odpowiednio 22,0 i 24,0%. Najmniej korzystne okazało się
zastosowanie kompozycji Celluclast 1.5L i celobiaza: po 72 h procesu ich stężenie
w hydrolizacie wynosiło 10,68 g cukrów·dm–3, co dowodzi istotnej roli enzymów
degradujących hemicelulozę podczas biokonwersji kompleksu lignocelulozowego
(rys. 1).
111
–3
Stężenie uwolnionych cukrów redukujących (g·dm )
–3
The concentration of released reducing sugars (g·dm )
DOSKONALENIE WARUNKÓW HYDROLIZY ENZYMATYCZNEJ...
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
6
12
18
24
1
Rys. 1.
Fig. 1.
30
36 42 48
Czas; Time [h]
2
3
1
54
2
60
66
72
78
3
Postęp hydrolizy enzymatycznej słomy rzepakowej natywnej (symbole puste)
oraz po obróbce wstępnej (NaOH – 0,1 g·g s.s. materiału, temperatura – 121°C,
czas – 1 h) (symbole pełne), z zastosowaniem trzech kombinacji preparatów
enzymatycznych (nr 1, 2 i 3 według tabeli 1), w czasie 72 h eksperymentu, wyrażony stężeniem cukrów redukujących w hydrolizacie
Enzymatic hydrolysis rate of untreated (empty symbols) and pretreated rape
straw (addition of NaOH 0,1 g·g–1 d.m. of substrate, temperature 121°C, time
1 h) (filled symbols), with the use of three combinations of enzyme preparations (no. 1, 2, 3 according to table 1), during 72-hour experiment, expressed as
reducing sugars concentration in hydrolysate
Hydroliza enzymatyczna wstępnie przygotowanej słomy rzepakowej, prowadzona z udziałem każdej z proponowanych kompozycji preparatów enzymatycznych, pozwoliła uzyskać trzykrotnie większą zawartość cukrów redukujących po
72 h procesu niż hydroliza substratu natywnego. Już w początkowym etapie procesu zauważono wysoką skuteczność stosowania kompozycji preparatów enzymatycznych – celulazy z Trichoderma longibrachiatum, ksylanazy z T. longibrachiatum i celobiazy (rys. 2). Zastosowanie tej kombinacji spowodowało uwolnienie
32,27 g cukrów·dm–3 hydrolizatu juý po 12 h procesu, by w końcowym etapie osiągnąć największą z odnotowanych we wszystkich doświadczeniach wartość: 48,82 g
cukrów redukujących·dm–3.
Najniższe stężenie cukrów fermentujących w hydrolizacie (33,42 g·dm–3) uzyskano w doúwiadczeniu z udziaůem kompleksu preparatów Celluclast 1.5L i celobiaza (rys. 1). W eksperymencie z udziałem kompozycji preparatów celulazy i ksylanazy z Trichoderma longibrachiatum z celobiazą uzyskano wydajność hydrolizy
polisacharydów słomy rzepakowej na poziomie 71,6% (rys. 3), co oznacza zwiększenie jej efektywności średnio o 45% w porównaniu z rezultatami doświadczenia
z zastosowaniem preparatów Celluclast 1.5L i celobiaza. Można więc stwierdzić,
że najskuteczniej działającym kompleksem enzymów okazał się zestaw celulaz
i hemicelulaz z T. longibrachiatum i celobiazy, co świadczy o ich synergistycznym
działaniu.
112
–3
Stężenie uwolnionych cukrów redukujących (g·dm )
–3
The concentration of released reducing sugars (g·dm )
K. Świątek i inni
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
6
12
18
24
4
Rys. 2.
Fig. 2.
30
5
36 42 48
Czas; Time [h]
6
4
54
5
60
66
72
78
6
Postęp hydrolizy enzymatycznej słomy rzepakowej natywnej (symbole puste)
oraz po obróbce wstępnej (NaOH – 0,1 g·g–1 s.s. materiału, temperatura – 121°C,
czas – 1 h) (symbole pełne), z zastosowaniem trzech kombinacji preparatów enzymatycznych (nr 4, 5 i 6 wg tabeli 1), w czasie 72 h eksperymentu, wyrażony
stężeniem cukrów redukujących w hydrolizacie
Enzymatic hydrolysis rate of untreated (empty symbols) and pretreated rape
straw (addition of NaOH 0,1 g·g–1 d.m. of substrate, temperature 121°C, time
1 h) (filled symbols), with the use of three combinations of enzyme preparations (no. 4, 5, 6 according to table 1), during 72-hour experiment, expressed as
reducing sugars concentration in hydrolysate
Na rysunku 3 przedstawiono wyniki ilustrujące efektywność 72-godzinnej hydrolizy enzymatycznej słomy rzepakowej. Jak wspomniano wcześniej, najkorzystniejszą z przebadanych kompozycji enzymów okazała się kombinacja preparatów,
które pochodziły z grzybów T. longibrachiatum. Szczególnie istotną rolę można
przypisać preparatowi ksylanaz, którego zestawienie z celulazami preparatu Celluclast 1.5L (kompozycja 3) skutkowało korzystnym stopniem hydrolizy polisacharydów, tj. 67,1%.
Prawdopodobnie w preparacie ksylanazy z T. longibrachiatum aktywne są
również inne hemicelulazy, które sprzyjają kompleksowej hydrolizie badanego
surowca lignocelulozowego. Dodatkowo należy zaznaczyć, że wstępna obróbka
alkaliami sprzyja poprawie podatności na hydrolizę kompleksu polisacharydów zawartych w substracie.
MCINTOSH I VANCOV [2010] badali wpływ wstępnego traktowania alkaliami
słomy sorgo (Sorghum bicolor) na efektywność hydrolizy enzymatycznej tak przetworzonego materiału. Doświadczenia hydrolizy poprzedzono obróbką substratu,
stosując zmienne parametry w zakresie: stężenia NaOH (od 0 do 2,0% (w/v)), temperatury (60 i 121°C) oraz czasu jej trwania (30, 60 i 90 min). Reakcję hydrolizy
enzymatycznej polisacharydów prowadzono przez 48 h w warunkach: temperatura 50°C, pH 5,0, wytrząsanie (150 rpm), z zastosowaniem kombinacji preparatów
oferowanych przez firmę Novozymes: celulazy (NS50013), ksylanazy (NS50030)
i β-glukozydazy (NS50010). Stężenie rozdrobnionej słomy w zawiesinie ustalono
DOSKONALENIE WARUNKÓW HYDROLIZY ENZYMATYCZNEJ...
80
Wydajność; Yield (%)
60
50
71,6
67,1
70
55,2
49,3
49,0
113
50,6
40
30
20
15,7
17,6
1
2
20,6
24,0
3
4
5
Nr kompozycji; No of composition
6
22,0
19,0
10
0
hydroliza natywnego surowca; hydrolysis of untreated substrate
obróbka z udziałem NaOH; pretreatment with NaOH
Rys. 3.
Fig. 3.
Porównanie wydajności 72-godzinnej hydrolizy enzymatycznej słomy rzepakowej natywnej i po obróbce z udziałem NaOH, przeprowadzonej z zastosowaniem sześciu kompozycji preparatów enzymatycznych. Wydajność hydrolizy
celulozy i hemicelulozy obliczono w odniesieniu do wartości teoretycznej wyznaczonej na podstawie zawartości celulozy i hemicelulozy w materiale natywnym (61,4%)
The comparison of the efficiency of 72-hour enzymatic hydrolysis of untreated
and pretreated (NaOH) rape straw, conducted with the use of six compositions
of enzyme preparations. The efficiency of cellulose and hemicellulose hydrolysis was calculated in relation to the theoretical value determined based on the
content of cellulose and hemicellulose in the native substrate (61,4%)
na poziomie 5% s.s. Zaobserwowano, że zastosowanie, oprócz celulazy, preparatów ksylanazy i β-glukozydazy pozwoliło na zwiększenie skuteczności hydrolizy
polisacharydów słomy sorgo, przy jednoczesnym 4-krotnym zmniejszeniu dawki
celulazy. Maksymalną wydajność hydrolizy celulozy i hemicelulozy (95%) uzyskano przy zastosowaniu enzymów w następujących dawkach: celulaza – 5,0 FPU·g–1
substratu, β-glukozydaza – 7,5 CBU·g–1 substratu, ksylanaza – 1,5 FXU·g–1 substratu.
LU i in. [2010] przeprowadzili badania z wykorzystaniem słomy kukurydzianej, którą poddano wstępnej obróbce metodą eksplozji pary, a w dalszej kolejności neutralizowano lub przepłukiwano wodą. Cytowani autorzy oceniali również
wpływ stężenia substratu w środowisku reakcyjnym na wydajność uwalniania cukrów fermentujących. Hydrolizę prowadzono przez 96 h, w temperaturze 50°C,
pH 4,8, z zastosowaniem wytrząsania, stosując mieszankę kwaśnych celulaz (Global Green Tech, Chiny). Stężenie substratu lignocelulozowego w zawiesinie ustalono w zakresie 10–30% s.s. (w/w). Zaobserwowano, że koncentracja substratu w medium reakcyjnym ma niewielki wpływ na efektywność konwersji polisacharydów
słomy. Najkorzystniejsze rezultaty uzyskano przy zastosowaniu stężenia substratu
na poziomie 30%, co pozwoliło na otrzymanie 103,3 g glukozy·dm–3 hydrolizatu
(stopień konwersji celulozy do glukozy wyniósł 72,5%) [LU i in. 2010].
SAHA i in. [2005] przeprowadzili hydrolizę enzymatyczną słomy pszennej
uprzednio traktowanej 0,75% roztworem kwasu siarkowego. Zastosowano kompleks enzymów: celulazę z Triochoderma reesei, β-glukozydazę z Aspergillus niger
i ksylanazę z Trichoderma longibrachiatum. Proces hydrolizy prowadzono w tem-
114
K. Świątek i inni
peraturze 45°C, przy pH 5,0, w czasie 72 h. Wymieniony zestaw enzymów okazał
się najkorzystniejszy ze wszystkich zastosowanych w doświadczeniu, czego dowodzi uzyskany stopień konwersji celulozy do glukozy na poziomie 81% (565 mg
cukrów redukujących·g–1 surowca).
Porównując badania przeprowadzone w ramach niniejszej pracy, można
stwierdzić, że zastosowanie najkorzystniejszej kompozycji enzymów pozwoliło na
uzyskanie koncentracji monosacharydów w hydrolizacie w ilości 488 mg·g–1 surowca.
Wnioski
Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, iż preparaty celulaz: Celluclast
1.5L i celulaza z Trichoderma longibrachiatum są przydatne w procesie hydrolizy
enzymatycznej surowców lignocelulozowych. Większą skutecznością charakteryzuje się preparat otrzymany z gatunku T. longibrachiatum.
Istotny wpływ na przebieg hydrolizy ma zastosowanie preparatów ksylanaz.
W badaniach zastosowano preparaty ksylanaz: Pentopan Mono BG i ksylanazę
z T. longibrachiatum, z których ta ostatnia odegrała kluczową rolę w uzyskaniu
wysokiego poziomu wydajności hydrolizy polisacharydów. Jej wysoką skuteczność potwierdza korzystne stężenie monosacharydów w mediach poreakcyjnych
(45,7–48,8 g·dm–3), a także różnica pomiędzy efektami działania kompozycji enzymatycznych bez udziału ksylanaz oraz kompozycji enzymatycznych z ich udziałem. Za najkorzystniejszą kompozycję enzymów uznano: celulazę z Trichoderma
longibrachiatum, ksylanazę z T. longibrachiatum i celobiazę, co dowodzi ich skutecznego synergistycznego działania.
Preparaty enzymatyczne pozyskiwane z T. longibrachiatum pozwalają na
uzyskanie wysokiego stopnia konwersji polisacharydów surowca lignocelulozowego do cukrów fermentujących. Przedstawione rezultaty badań potwierdziły również konieczność stosowania obróbki wstępnej w biotechnologicznym przetwarzaniu słomy rzepakowej.
Literatura
ALVIRA P., TOMÁS-PEJÓ E., BALLESTEROS M., NEGRO M.J. 2010. Pretreatment
technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology 101: 4851–4861.
DA COSTA SOUSA L., CHUNDAWAT S.P.S., BALAN V., DALE B.E. 2009. ‘Cradle-to-grave’ assessment of existing lignocellulose pretreatment technologies. Curr.
Opin. Biotechnol. 20: 339–347.
GUSAKOV A.V. 2011. Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production. Trends
in Biotechnology 29 (9): 419–425.
KRISTENSEN J. B. 2009. Enzymatic hydrolysis of lignocelluloses. Substrate interactions and high solids loadings. Forest & Landscape Research 42: 7.
DOSKONALENIE WARUNKÓW HYDROLIZY ENZYMATYCZNEJ...
115
KULIKOWSKA D., KLIMOWSKI K. 2008. Produkcja bioetanolu z odpadów lignocelulozowych – możliwości i ograniczenia. Cz. II. Hydroliza i fermentacja. Gaz, Woda
i Technika Sanitarna 2: 24–28.
KUMAR R., SINGH S., SINGH O.V. 2008. Bioconversion of lignocellulosic biomass:
biochemical and molecular perspectives. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35: 377–
–391.
KUMAR R., MAGO G., BALAN V., WYMAN C.E. 2009. Physical and chemical characterizations of corn stover and poplar solids resulting from leading pretreatment
technologies. Bioresour. Technol. 100: 3948–3962.
LU Y., WANG Y., XU G., CHU J., ZHUANG Y., ZHANG S. 2010. Influence of High Solid
Concetration on Enzymatic Hydrolysis and Fermantation of Steam-Exploded Corn
Stover Biomass. Appl. Biochem. Biotechnol. 160: 360–369.
MALHERBE S., CLOETE T.E. 2002. Lignocellulose biodegradation: Fundamentals
and applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 1: 105–
–114.
MCINTOSH S., VANCOV T. 2010. Enhanced enzyme saccharification of Sorghum bicolor straw using dilute alkali pretreatment. Bioresour. Technol. 101: 6718–6727.
MILLER G.L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31 (3): 426–428.
PEDERSEN M., MEYER A.S. 2009. Influence of substrate particle size and wet oxidation on physical surface structures and enzymatic hydrolysis of wheat straw. Biotechnol. Prog. 25: 399–408.
SAHA B.C., ITEN L.B., COTTA M.A., WU Y.V. 2005. Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Proc. Biochem.
40: 3693–3700.
VAN SOEST P.J., ROBERTSON J.B., LEWIS B.A. 1991. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition.
Journal of Dairy Science 74: 3583–3597.
WILSON D.B. 2009. Cellulases and biofuels. Curr. Opin. Biotechnol. 20: 295–299.
Słowa kluczowe:
lignoceluloza, słoma rzepakowa, hydroliza enzymatyczna,
ksylanaza
Streszczenie
Przeprowadzono badania, których celem było określenie wpływu różnych
kompozycji preparatów celulolitycznych na efektywność procesu hydrolizy enzymatycznej polisacharydów słomy rzepakowej po wstępnej obróbce alkalicznej.
Skuteczność ich działania oceniono na podstawie stężenia cukrów prostych uwolnionych w trakcie reakcji enzymatycznej oraz wydajności obliczonej w odniesieniu
do sumy polisacharydów zawartych w surowcu natywnym. Najkorzystniejszym ze-
116
K. Świątek i inni
stawem okazała się kombinacja preparatów pochodzących z grzybów Trichoderma
longibrachiatum. Wykazano istotne znaczenie ksylanaz z T. longibrachiatum, których obecność sprzyjała poprawie efektywności hydrolizy polisacharydów o 37–
45% w porównaniu z doświadczeniami bez ich udziału. Wyniki przeprowadzonych
badań potwierdziły również konieczność stosowania obróbki wstępnej podczas
przetwarzania substratów lignocelulozowych.
THE IMPROVEMENT OF THE CONDITIONS
OF ENZYMATIC HYDROLYSIS OF LIGNOCELLULOSIC
SUBSTRATE POLYSACCHARIDES
Karolina Świątek, Małgorzata Lewandowska, Magdalena Świątek,
Włodzimierz Bednarski
Chair of Food Biotechnology
University of Warmia and Mazury, Olsztyn
Key words:
lignocellulose, rape straw, enzymatic hydrolysis, xylanase
Summary
Research evaluating the impact of different compositions of cellulolytic preparations on the efficiency of enzymatic hydrolysis of polysaccharides of alkali pretreated rape straw was carried out. The effectiveness of the used compositions was
assessed based on the amount of reducing sugars released during the enzymatic reaction and the yield calculated in relation to the sum of polysaccharides contained
in the native substrate. The combination of the preparations derived from the fungus
Trichoderma longibrachiatum was the most favorable. It was stated that xylanases
from T. longibrachiatum were essential, allowing to improve the efficiency of hydrolysis of polysaccharides by 37–45% compared to experiments without their participation. The results of the conducted research also confirmed the necessity of the
pretreatment step in the processing of lignocellulosic substrates.
Mgr inż. Karolina Świątek
Katedra Biotechnologii Żywności
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski
ul. Heweliusza 1
10-718 OLSZTYN
e-mail: [email protected]