cobas DPX Test PI

Transkrypt

cobas DPX Test PI

COBAS® TaqMan® HBV Test
For Use With The High Pure System
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
HBV HPS
48 Tests
48 Tests
P/N: 03500756 190
P/N: 03502295 001
PRZEZNACZENIE
Test COBAS® TaqMan® HBV, przeznaczony do użytkowania łącznie z zestawem High Pure System (HPS), jest
testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego w celu ilościowej oceny stężenia DNA wirusa zapalenia
wątroby typu B (HBV) w ludzkiej surowicy lub osoczu, z wykorzystaniem zestawu High Pure System Viral Nucleic
Acid Kit do ręcznego przygotowywania próbek oraz analizatora COBAS® TaqMan® 48 do automatycznej
amplifikacji i detekcji.
Test COBAS® TaqMan® HBV nie jest przeznaczony do przesiewowego badania krwi lub produktów krwiopochodnych
na obecność HBV, ani w roli testu diagnostycznego potwierdzającego obecność zakażenia wirusem HBV.
PODSUMOWANIE ORAZ OBJAŚNIENIE TESTU
Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest jednym z szeregu wirusów o znanej zdolności wywoływania wirusowego
zapalenia wątroby. Przeszło 2 miliardy ludzi na całym świecie uległo zakażeniu wirusem HBV, zaś spośród nich ponad
350 milionów osób to przewlekle zakażeni nosiciele1. Przewlekli nosiciele wykazują podwyższone ryzyko powikłań
odległych zakażenia, w tym przewlekłego zapalenia, marskości oraz pierwotnego raka wątrobowokomórkowego2,3,4.
Markery serologiczne są powszechnie stosowane w roli diagnostycznych i/lub prognostycznych wskaźników ostrego
lub przewlekłego zakażenia wirusem HBV. Najczęściej stosowanym markerem zakażenia HBV jest obecność jego
antygenu powierzchniowego (HBsAg). Chociaż u nosicieli może dochodzić do eliminacji antygenu HBsAg oraz do
wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko niemu, to jednak HBsAg nadal okazuje się być czynnikiem ryzyka
rozwoju w późniejszym okresie życia poważnych powikłań dotyczących wątroby5,6. Antygen e wirusa HBV (HBeAg)
jest generalnie wykorzystywany jako wtórny marker, wskazujący na czynną replikację wirusa HBV związaną
z postępującym schorzeniem wątroby. Okazuje się, że niezdolność do eliminacji antygenu HBeAg zwiększa ryzyko
wystąpienia krańcowych stadiów rozwoju choroby wątroby7,8. Różne szczepy wirusa HBV mogą albo wytwarzać
antygen HBeAg niemożliwy do wykrycia w surowicy, albo tracić zdolność produkcji HBeAg nawet wówczas, gdy
obecna jest czynna infekcja9. Zatem wykorzystywanie tego markera do monitorowania postępu choroby może mieć
ograniczoną użyteczność10. Według doniesień możliwość wykrycia DNA wirusa HBV w surowicy posiada wartość
prognostyczną, umożliwiającą rokowanie co do wyników ostrych i przewlekłych zakażeń wirusem HBV11,12,13,14.
Metoda ta może umożliwić wykrywanie DNA wirusa HBV po eliminacji antygenu HBsAg15 lub wykrywanie HBV
ubogiego w markery serologiczne16. Jednakże nie ustalono dotąd związku pomiędzy markerami serologicznymi
a poziomami DNA wirusa HBV. Skuteczność leczenia antywirusowego, stosowanego u pacjentów zakażonych HBV,
również można oceniać na podstawie badania markerów serologicznych lub pomiarów aktywności enzymów
wątrobowych. Jednak za najbardziej bezpośredni i rzetelny sposób pomiaru replikacji wirusa uważa się ilościową ocenę
stężenia DNA HBV w surowicy lub osoczu13,17,18,19. Wykazano, że szybki i trwały spadek poziomów DNA wirusa
HBV u pacjentów otrzymujących alfa-interferon, lamiwudynę lub gancyklowir jest czynnikiem predykcyjnym korzystnego
wyniku leczenia10,20,21,22,23,24. Monitorowanie poziomów DNA HBV pozwala przewidzieć rozwój oporności na
lamiwudynę25. Zatem ilościowy test służący do pomiaru stężenia DNA wirusa HBV jest cennym narzędziem, które można
wykorzystywać w połączeniu z badaniami innych markerów serologicznych podczas leczenia zakażenia HBV.
ZASADY PROCEDURY
Test COBAS® TaqMan® HBV oparty jest na dwóch głównych procesach: (1) manualnej obróbce próbki w celu
uzyskania DNA wirusa HBV; (2) zautomatyzowanej amplifikacji PCR docelowego DNA z użyciem swoistych dla HBV
komplementarnych primerów oraz detekcji rozszczepionych, znakowanych podwójnym barwnikiem fluorescencyjnym
detekcyjnych sond oligonukleotydowych, które umożliwiają ilościową ocenę amplifikowanego docelowego produktu
HBV (amplikonu) oraz HBV Quantitation Standard DNA, preparatu, który obrabia się, amplifikuje i poddaje detekcji
równocześnie z próbką.
Odczynnik Master Mix zawiera pary primerów i sondy swoiste zarówno dla DNA HBV, jak i standardowego DNA
preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Odczynnik Master Mix opracowano w celu zapewnienia równoważnego
oznaczenia ilościowego genotypów HBV od A do G. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się przy użyciu swoistych
dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla preparatu Quantitation Standard, podwójnie znakowanych sond
oligonukleotydowych, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu HBV i amplikonu HBV Quantitation Standard.
Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu.
1
04519337001-14PL
Doc Rev. 14.0
Oznaczanie ilościowe DNA wirusa HBV przeprowadza się za pomocą preparatu HBV Quantitation Standard. HBV
Quantitation Standard to niezakaźny, linearyzowany plazmid zawierający miejsca wiązania primerów identyczne
z posiadanymi przez docelowy DNA HBV, a także charakterystyczne miejsce wiązania sondy, które umożliwia
odróżnienie amplikonu HBV Quantitation Standard od docelowego amplikonu HBV. HBV Quantitation Standard
wchodzi w skład każdej próbki i kontroli ze znaną liczbą kopii; wraz z docelowym materiałem HBV jest poddawany
etapom: przygotowania próbki, amplifikacji PCR oraz detekcji. Analizator COBAS® TaqMan® 48 oblicza miano DNA
HBV w badanej próbce na podstawie porównania sygnału HBV z sygnałem HBV Quantitation Standard w każdej próbce
oraz kontroli. HBV Quantitation Standard rekompensuje wpływ hamowania oraz kontroluje proces przygotowywania
i amplifikacji, pozwalając uzyskać dokładne oznaczenie ilościowe DNA HBV w każdej próbce.
Przygotowanie próbki
Test COBAS® TaqMan® HBV polega na obróbce próbek osocza i surowicy oraz izolacji DNA wirusa HBV w drodze
podstawowego przygotowania wykonywanego ręcznie, opartego na wiązaniu kwasu nukleinowego przez włókna
szklane. Cząstki wirusa HBV zostają poddane lizie poprzez ich inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą
oraz chaotropowym buforem lizującym/wiążącym, który powoduje uwolnienie kwasów nukleinowych i ochronę
uwolnionego DNA HBV przed znajdującymi się w osoczu i surowicy cząsteczkami DNazy. Znana liczba cząsteczek
DNA preparatu HBV Quantitation Standard DNA jest wprowadzana do każdej próbki wraz z odczynnikiem
lizującym. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się izopropanol, po czym mieszaninę
wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane. W trakcie wirowania
cząsteczki DNA wirusa HBV i preparatu HBV Quantitation Standard ulegają związaniu na powierzchni włókien
szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego,
zostają usunięte w wyniku wirowania. Zaadsorbowany kwas nukleinowy jest wymywany i poddany elucji roztworem
wodnym. Materiały jednorazowego użytku umożliwiają równoległą obróbkę 12 próbek lub wielokrotności tej liczby.
Poddawana obróbce próbka, zawierająca DNA wirusa HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard, jest następnie
dodawana do mieszaniny do amplifikacji/detekcji. Następnie docelowy DNA wirusa HBV oraz preparatu HBV
Quantitation Standard zostają poddane amplifikacji i detekcji za pomocą analizatora COBAS® TaqMan® 48 oraz
odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem testowym.
Amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
Wybór docelowej sekwencji DNA dla HBV zależy od identyfikacji regionów w obrębie genomu HBV, które wykazują
największy konserwatyzm sekwencji pośród wszystkich genotypów. Zgodnie z tym, właściwy wybór odcinków
primerowych oraz sondy ma kluczowe znaczenie dla zdolności testu do detekcji istotnych klinicznie genotypów HBV.
Wykazano, że maksymalnym konserwatyzmem sekwencji DNA pośród genotypów odznacza się kolisty, częściowo
jednoniciowy obszar genomu HBV. Test COBAS® TaqMan® HBV wykorzystuje podczas amplifikacji PCR primery
definiujące sekwencję w obrębie wysoce konserwatywnego, przedrdzeniowego/rdzeniowego obszaru genomu HBV.
Amplifikacja sekwencji docelowej
Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (K-tubes), gdzie
zachodzi amplifikacja PCR. Zainstalowany w aparacie COBAS® TaqMan® 48 termocykler podgrzewa mieszaninę w celu
denaturacji dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych swoistych dla primerów w obrębie DNA kolistego
fragmentu genomu HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Podczas schładzania mieszaniny primery
wtapiają się w DNA docelowe. Termostabilna polimeraza DNA Thermus specie Z05 (Z05), w obecności jonów Mn2+
oraz nadmiaru trójfosforanów dezoksynukleotydów (dNTP), w tym dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny,
dezoksycytydyny i dezoksyurydyny (zamiast tymidyny), przedłuża przyłączone primery wzdłuż docelowej matrycy,
tworząc dwuniciową cząsteczkę DNA zwaną amplikonem. Analizator COBAS® TaqMan® 48 automatycznie powtarza
powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich zmierzając do podwojenia ilości amplikonu DNA.
Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze COBAS® TaqMan® 48. Amplifikacja zachodzi wyłącznie
w regionie genomu wirusa HBV znajdującym się pomiędzy primerami; cały genom HBV nie ulega zwielokrotnieniu.
Amplifikacja wybiórcza
Amplifikację wybiórczą badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej przy użyciu testu COBAS® TaqMan®
HBV uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny
(dUTP). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę26, lecz nie
DNA zawierającego dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie stwierdza się dezoksyurydyny, natomiast
jest ona zawsze obecna w amplikonie, ze względu na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród
trójfosforanów dezoksynukleotydu w odczynniku Master Mix; dlatego też dezoksyurydynę zawiera wyłącznie
amplikon. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase
przed amplifikacją docelowego DNA. Także jakiekolwiek nieswoiste produkty reakcji, powstałe po wstępnej aktywacji
odczynnika Master Mix przez jony manganu, pod działaniem enzymu AmpErase ulegają zniszczeniu, co powoduje
poprawę czułości i swoistości testu. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozkład DNA
zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy
w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu,
04519337001-14PL
2
Doc Rev. 14.0
w którym znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest
nieczynny w temperaturach powyżej 55°C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on
amplikonu docelowego, powstałego podczas amplifikacji.
Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS® TaqMan®
Test COBAS® TaqMan® HBV wykorzystuje technologię reakcji PCR czasu rzeczywistego27,28. Zastosowanie sond
podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym zapewnia ciągłą detekcję gromadzenia się produktu reakcji PCR
na podstawie monitorowania intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych, uwalnianych w trakcie
procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów, swoistych dla HBV i HBV Quantitation Standard,
znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W teście COBAS® TaqMan® HBV sondy dla HBV i HBV
Quantitation Standard są oznakowane różnymi fluorescencyjnymi barwnikami reporterowymi. Gdy podwójnie oznakowane
barwnikami fluorescencyjnymi cząsteczki sond są nienaruszone, fluorescencja reportera jest przytłumiona bliskością
wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega hybrydyzacji
z sekwencją docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę DNA Z05
aktywności 5' → 3' nukleazy. Z chwilą uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi dłużej zjawisko
wygaszania i aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego nasila się. Amplifikację DNA HBV oraz DNA HBV
Quantitation Standard mierzy się niezależnie od siebie, wykorzystując różne długości fal. Proces ten powtarza się zgodnie
z wyznaczoną ilością cykli, zaś w każdym cyklu następuje efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych
barwników reporterowych, umożliwiając niezależną identyfikację DNA HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard
DNA. Intensywność sygnałów odnosi się do ilości materiału wyjściowego na początku reakcji PCR.
Podstawy oceny ilościowej w teście COBAS® TaqMan® HBV
Test COBAS® TaqMan® HBV zapewnia dokładne wyniki ilościowe w bardzo szerokim przedziale dynamiki, ponieważ
monitorowanie amplikonu przeprowadza się w trakcie fazy wykładniczej amplifikacji. Im wyższe jest miano HBV
w badanej próbce, tym wcześniej fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV wzrasta powyżej wyjściowego
poziomu fluorescencji (patrz Rysunek 1). Ponieważ ilość DNA preparatu HBV Quantitation Standard (QS) jest stała we
wszystkich próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV QS powinna pojawiać się w każdej próbce
w tym samym cyklu (patrz Rysunek 2). W przypadku, gdy na amplifikację i detekcję QS wpłynie obecność inhibitorów
lub niska wartość próbki, pojawienie się fluorescencji ulegnie opóźnieniu, pozwalając tym samym na odpowiednią
modyfikację obliczonej wartości miana docelowego DNA wirusa HBV. Pojawienie się swoistego sygnału
fluorescencyjnego jest rejestrowane jako krytyczna wartość progowa (Ct). Wartość Ct definiuje się jako liczbę cykli
cząstkowych, po której fluorescencja barwnika reporterowego przekracza ustaloną wcześniej wartość progową (ustalony
poziom fluorescencji) i zapoczątkowuje fazę wykładniczego wzrostu siły sygnału (patrz Rysunek 3). Większa wartość
Ct wskazuje na wyższe miano początkowe docelowego DNA wirusa HBV. 2-krotny wzrost miana koreluje ze
zmniejszeniem wartości Ct docelowego DNA HBV o 1, zaś 10-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem Ct o 3,3.
Rysunek 1 przedstawia krzywe wzrostu docelowego dla serii rozcieńczeń próbek wirusa, obejmującej przedział
5-krotnej wartości log10. W miarę wzrostu stężenia wirusów krzywe wzrostu przesuwają się w kierunku
wcześniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu leżąca najdalej na lewo odzwierciedla najwyższy poziom miana wirusa,
zaś krzywa wzrostu leżąca najdalej na prawo oznacza najniższy poziom miana wirusa.
Rysunek 1
9,00
8,00
Normalizowana fluorescencja
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
Miano najwyższe
2,00
Miano najniższe
1,00
0,00
-1,00
0
10
20
30
40
50
60
Liczba cykli
04519337001-14PL
3
Doc Rev. 14.0
Rysunek 2 przedstawia krzywe wzrostu preparatu Quantitation Standard dla próbek z serią rozcieńczeń wirusa,
obejmującą przedział 5-krotnej wartości log10. Ilość preparatu Quantitation Standard dodanego do każdej próbki jest
stała dla każdej reakcji. Wartość Ct dla preparatu Quantitation Standard jest podobna niezależnie od miana wirusa.
Rysunek 2
35,00
30,00
Miano najniższe
25,00
20,00
15,00
10,00
Miano najwyższe
5,00
0,00
-5,00
0
10
20
30
40
50
60
Liczba cykli
Rysunek 3 przedstawia na przykładzie, w jaki sposób wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla
każdej krzywej wzrostu. Liczbę cykli cząstkowych (Ct) oblicza się w chwili, gdy sygnał fluorescencyjny przekracza
ustalony poziom fluorescencji.
Rysunek 3
1
0,9
0,8
Wartość Ct = 27,1
Ustalony poziom
fluorescencji
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
Liczba cykli
Ocena ilościowa stężenia DNA HBV
Test COBAS® TaqMan® HBV ilościowo oznacza DNA wirusa HBV, wykorzystując drugą sekwencję docelową (HBV
Quantitation Standard), którą w znanym stężeniu dodaje się do każdej próbki testowej. Preparat HBV Quantitation
Standard jest niezakaźnym, linearyzowanym, plazmidowym konstruktem DNA, zawierającym fragmenty sekwencji
HBV z obszarami wiązania primerów, które są identyczne z obszarami wiązania na docelowej sekwencji HBV. Preparat
HBV Quantitation Standard wytwarza również produkt amplifikacji o tej samej długości łańcucha i składzie zasad, co
docelowy DNA wirusa HBV. Leżący w obrębie sondy detekcyjnej obszar wiązania HBV Quantitation Standard został
zmodyfikowany w celu różnicowania amplikonu HBV Quantitation Standard i amplikonu docelowego HBV.
04519337001-14PL
4
Doc Rev. 14.0
Podczas fazy wtapiania reakcji PCR w analizatorze COBAS® TaqMan® 48, próbki zostają oświetlone przefiltrowanym
światłem i wzbudzone, po czym rejestruje się wyniki emisji przefiltrowanej fluorescencji każdej próbki. Odczyty wyniku
każdej próbki poddaje się korekcji w celu wyeliminowania zmienności wywołanej działaniem instrumentów. Aparat
wprowadza odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje się metodę odczytów
wstępnych dla określenia, czy DNA HBV oraz DNA HBV Quantitation Standard reprezentują zestawy, które można uznać
za ważne; w sytuacji, gdy dane nie mieszczą się w ustalonych granicach, aparat opatruje je odpowiednimi oznaczeniami.
Po ukończeniu i pomyślnej ocenie odczytów wstępnych odczyty fluorescencji są następnie przetwarzane w celu obliczenia
wartości Ct dla DNA HBV i dla DNA preparatu HBV Quantitation Standard. Tablica stałych, swoistych dla danej serii
wartości kalibracji, dołączona do testu COBAS® TaqMan® HBV, jest wykorzystywana do obliczania wartości miana
próbek i kontroli na podstawie wartości Ct DNA HBV oraz DNA preparatu HBV Quantitation Standard. Test COBAS®
TaqMan® HBV jest wystandaryzowany według standardu WHO HBV International Standard for NAT Testing 97/74629,
zaś wyniki mian przedstawiane są w jednostkach międzynarodowych (IU/ml).
ODCZYNNIKI
Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
(P/N: 03502295 001)
48 testów
2 x 25 ml
LYS
(Bufor do lizy/wiążący)
Tris
50% (udział wagowy) chlorowodorek guanidyny
< 1% mocznik
19% (udział wagowy) Triton X-100
CAR
(RNA, liofilizowany)
2 x 2 mg
2 x 100 mg
PK
(Proteinaza K, liofilizowana)
≥ 64% (udział wagowy) proteinaza K, liofilizowana
IRB
(Bufor usuwający inhibitor)
1 x 33 ml
Tris
65% chlorowodorek guanidyny
(dodać 20 ml etanolu)
WASH
(Bufor do wymywania)
Tris
NaCl
(dodać 80 ml etanolu)
1 x 20 ml
ELB
(Bufor do elucji)
1 x 30 ml
RS
(zestaw statywów High Pure System Viral Nucleic Acid Rack Set)
Statyw do przeprowadzania lizy
Statyw z rurkami filtracyjnymi z mocowanym statywem na odpady
Statyw do elucji
Statyw z pokrywkami
4 x każdy
WR
(Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid Waste Rack)
8 x każdy
04519337001-14PL
5
Doc Rev. 14.0
(P/N: 03500756 190)
HBV HPS
48 testów
Odczynniki do przygotowywania próbki i odczynniki kontrolne
HBV QS
2 x 1,0 ml
(COBAS® TaqMan® Standard oznaczania HBV)
Bufor Tris-HCl
EDTA
< 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA, zawierający wstawkę. Wstawka DNA
zawiera sekwencje HBV wiążące primery oraz swoisty obszar wiążący sondę.
Barwnik amarantowy
< 0,005% Poly rA RNA (syntetyczny)
0,05% azydek sodu
HBV H(+)C
2 x 1,0 ml
[Kontrola HBV silnie (+)]
< 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA, zawierający sekwencje HBV.
Osocze ludzkie dające wynik ujemny, niereaktywne w testach licencjonowanych przez
US FDA w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu
HIV p24 oraz antygenu HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA niewykrywalnych
przy użyciu metod PCR
0,1% substancja konserwująca ProClin® 300
HBV L(+)C
2 x 1,0 ml
[Kontrola HBV słabo (+)]
< 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA, zawierający sekwencje HBV.
CTM (–) C
4 x 1,0 ml
[COBAS® TaqMan® kontrola ujemna (osocze ludzkie)]
Odczynniki do amplifikacji i detekcji
HBV MMX
2 x 24 testy
(Odczynnik COBAS® TaqMan® HBV Master Mix)
2 x 1,4 ml
Bufor Tricine
Wodorotlenek potasu
Octan potasu
Glicerol
< 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,001% preparat primerów sensownych i antysensownych przedrdzeniowych/rdzeniowych
obszarów HBV
< 0,001% preparat znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi sond oligonukleotydowych,
swoistych dla HBV oraz HBV Quantitation Standard
< 0,001% aptamer oligonukleotydowy
< 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna)
< 0,1% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) (bakteryjny)
0,09% azydek sodu
2 x 24 testy
CTM Mn2+
(COBAS® TaqMan® roztwór manganu)
2 x 1,0 ml
< 1,2% octan manganu
Kwas octowy lodowaty
0,09% azydek sodu
04519337001-14PL
6
Doc Rev. 14.0
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
A.
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
B.
Test ten przeznaczony jest do stosowania z osoczem ludzkim pobranym na antykoagulant EDTA oraz z ludzką
surowicą.
C.
Nie pipetować za pomocą ust.
D.
Nie jeść, nie pić oraz nie palić w laboratorium, w obszarach roboczych. Przy obchodzeniu się z próbkami
i odczynnikami z zestawów stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę
oczu. Dokładnie umyć ręce po obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami testowymi.
E.
Przy pobieraniu poszczególnych dawek odczynników z butelek, unikać skażenia bakteryjnego odczynników
lub ich zanieczyszczenia rybonukleazą.
F.
Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od DNazy.
G.
Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych serii lub różnych butelek tej samej serii.
H.
Nie mieszać ze sobą odczynników pochodzących z różnych zestawów.
I.
Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi,
federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
J.
Nie używać zestawu po upływie daty przydatności.
K.
Karty charakterystyki (ang. Safety Data Sheet, SDS) są dostępne na żądanie w miejscowym
przedstawicielstwie firmy Roche.
L.
Z próbkami należy obchodzić się tak, jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury
bezpieczeństwa, takie jak określone w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories30 oraz
w dokumencie CLSI M29-A331. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo
przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
UWAGA: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn sodu w stężeniu 5,25%.
Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 przyniesie 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
M.
PRZESTROGA: Odczynniki: CTM (–) C, HBV L(+)C oraz HBV H(+)C zawierają ludzkie osocze
otrzymane z krwi ludzkiej. Materiał źródłowy badano przy użyciu testów zatwierdzonych przez US FDA
i stwierdzono, że jest on niereaktywny pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia
wątroby typu B (HBsAg), przeciwciał przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a także antygenu HIV p24 Badanie
ujemnego osocza ludzkiego (Negative Human Plasma) przy zastosowaniu metod PCR nie wykazało
wykrywalnej obecności RNA wirusa HIV-1, RnA wirusa HCV lub DNA wirusa HBV. Nie ma znanych metod
testowych mogących zapewnić całkowitą pewność, że produkty pochodzące krwi ludzkiej nie przenoszą
czynników zakaźnych. Dlatego też każdy materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie
zakaźny. Z odczynnikami: CTM (–) C, HBV L(+)C oraz HBV H(+)C należy obchodzić się tak jak
z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak wymienione
w wytycznych Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories30 oraz w dokumencie CLSI
M29-A331. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem
0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
N.
Odczynniki: HBV MMX, HBV QS oraz CTM Mn2+ zawierają azydek sodu. Azydek sodu może wchodzić
w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi tworząc silnie wybuchowe
azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je
dużą ilością wody aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
O.
Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy, fartuchów laboratoryjnych oraz
jednorazowych rękawic. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi.
Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą objętością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie
środki może dojść do oparzeń. W razie rozlania powyższych odczynników, przed wytarciem plam należy
rozcieńczyć je wodą.
04519337001-14PL
7
Doc Rev. 14.0
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I OBCHODZENIA SIĘ
Odczynniki do przygotowywania próbki
A.
Po dostarczeniu przechowywać odczynniki z zestawu High Pure System Viral Nucleic Acid Reagents
w temperaturze 15–25°C.
B.
Przechowywać bufor do elucji (ELB) oraz bufor do lizy/wiążący (LYS) w temperaturze 15–25°C. Po otwarciu
przechowywać odczynniki ELB oraz LYS w temperaturze 15–25°C. Po otwarciu odczynniki ELB oraz LYS
należy zużyć w ciągu 30 dni lub przed upływem daty przydatności, zależnie od tego, która z dat jest
wcześniejsza.
C.
Po dodaniu buforu do elucji (ELB) w celu rozpuszczenia nośnika RNA oraz proteinazy K, przechowywać
niezużyty nośnik RNA (CAR) oraz niezużytą proteinazę K (PK) w temperaturze od -15 do -25°C. Po
rozpuszczeniu nośnik RNA oraz proteinazę K należy zużyć w ciągu 30 dni lub przed upływem daty przydatności,
zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza.
D.
Po dodaniu etanolu przechowywać bufor usuwający inhibitor (IRB) oraz bufor do wymywania (WASH)
w temperaturze 15–25°C. Wymienione odczynniki robocze zachowują stabilność przez 30 dni (lub do daty
przydatności, w zależności od tego, która z dat jest wcześniejsza).
E.
Roboczy roztwór do lizy/wiążący [bufor do lizy/wiążący w połączeniu z nośnikiem RNA, proteinazą K oraz
HBV QS] należy zużyć natychmiast po jego przygotowaniu. Wszelkie jego pozostałości należy wyrzucić.
A.
Nie zamrażać odczynników ani kontroli.
B.
Przechowywać odczynniki: HBV MMX, CTM (–) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS oraz CTM Mn2+
w temperaturze 2–8°C. Przed otwarciem odczynniki te zachowują stabilność do wskazanej daty przydatności.
Po otwarciu opakowania w celu pobrania porcji odczynnika wystarczającej na 12 próbek, przechowywać
pozostałą ilość odczynników: HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS oraz CTM Mn2+
w temperaturze 2–8°C. Po otwarciu odczynniki: HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS oraz
CTM Mn2+ zachowują stabilność w temperaturze 2–8°C przez 30 dni lub do upływu daty przydatności,
zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza. Po otwarciu opakowania wszelkie niezużyte partie odczynnika
CTM (–) C należy wyrzucić.
C.
Roboczy odczynnik Master Mix (przygotowany poprzez dodanie odczynnika CTM Mn2+ do HBV MMX)
należy przechowywać w temperaturze 2–8°C w zaciemnionym miejscu. Przygotowane próbki i kontrole
należy dodać do roboczego odczynnika Master Mix w ciągu 2 godzin od jego przygotowania.
D.
Poddane obróbce próbki i kontrole zachowują stabilność do 3 godzin w temperaturze 20–30°C, do 24 godzin
w temperaturze 2–8°C lub do 1 tygodnia w stanie zamrożenia do temperatury -20°C.
E.
Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 3 godzin od chwili dodania przygotowanych próbek badanych
i kontrolnych do roboczego odczynnika Master Mix.
MATERIAŁY DOSTARCZONE
Odczynniki do przygotowania próbki
A.
Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
(P/N: 03502295 001)
LYS
(Bufor do lizy/wiążący)
CAR
(Nośnik RNA)
PK
(Proteinaza K)
IRB
(Bufor usuwający inhibitor)
WASH
(Bufor do wymywania)
ELB
(Bufor do elucji)
RS
(Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Rack Set)
WR
(Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid Waste Rack)
04519337001-14PL
8
Doc Rev. 14.0
B.
(P/N: 03500756 190)
HBV HPS
HBV QS
(COBAS® TaqMan® Standard oznaczania HBV)
HBV H(+)C
[Kontrola HBV silnie (+)]
HBV L(+)C
[Kontrola HBV słabo (+)]
CTM (–) C
[COBAS® TaqMan® ujemna próba kontrolna (osocze ludzkie)]
HBV MMX
(Odczynnik COBAS® TaqMan® HBV Master Mix)
CTM Mn2+
(COBAS® TaqMan® roztwór manganu)
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
Przyrządy i oprogramowanie
• Analizator COBAS® TaqMan® 48
• Oprogramowanie AMPLILINK w wersji serii 3.3 lub 3.4
• Jednostka sterująca z oprogramowaniem AMPLILINK
• Podręczniki obsługi urządzeń i oprogramowania:
–
–
-
Instrukcja obsługi analizatora COBAS® TaqMan® 48 do użytku z oprogramowaniem AMPLILINK
w wersji serii 3.3 i 3.4
Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z urządzeniem COBAS®
AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48, analizatorem
COBAS® AMPLICOR® i aparatem cobas p 630
lub
Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.4
•
Plik definicji testu (Test Definition File, TDF). Nazwa i numer wersji TDF znajdują się na karcie
informacyjnej produktu, dołączonej do opakowania zestawu.
• Urządzenie do mocowania korka w probówkach K-tube (P/N: 03516539001)
• Narzędzie korkujące do tac K (P/N: 03339904001)
• Zasobnik K do analizatora COBAS® TaqMan® 48 (P/N: 28150397001)
• Zasobnik na tackę K (P/N: 03341488001)
• Uchwyt zasobnika K (P/N: 03287696001)
• Transporter do zasobników K (P/N: 03517519001)
Materiały jednorazowe
• Opakowanie zawierające probówki K 12 x 96 (P/N: 03137082001)
• Opakowanie zawierające tacki K, 24 sztuki (P/N: 03343146001)
Wymagania dotyczące wirówki
• Wirówka Sigma 4-15C Benchtop lub odpowiadający jej typ wirówki z płytką mikrotitracyjną,
umożliwiający wirowanie z przyspieszeniem 4600 x g
• Wirnik horyzontalny do wirówki Sigma P/N: 11118 (zawiera 2 koszyki P/N: 13218 oraz 2 uchwyty do
płytek P/N: 17978) bądź ich odpowiedniki
04519337001-14PL
9
Doc Rev. 14.0
INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZONE
• Izopropanol (> 99%) – odpowiadający specyfikacjom ACS lub lepszy
• Etanol (96–100%) - odpowiadający specyfikacjom ACS lub lepszy
• Regulowane pipetory*: (pojemność 250 µl i 1000 µl) z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego
wypierania wolnymi od DNazy
• Rękojeść pomocnicza do pipety: Drummond (P/N: 4-000-100) bądź odpowiednik
• Łaźnia wodna o temperaturze 50°C (± 2°C)
• Suchy blok grzejny o temperaturze 70°C (± 2°C)
• Jałowe, jednorazowe pipety serologiczne: 5, 10 i 25 ml
• Jałowe probówki stożkowe z polipropylenu; 15 ml i 50 ml: Corning (P/N: 430052 i P/N: 430290) bądź ich
odpowiedniki
• Jałowe probówki o pojemności 2,0 ml do mikrowirówki: Sarstedt (P/N: 72.693.005) bądź ich odpowiedniki
• Mieszadło wibracyjne
• Statywy do probówek
• Rękawice jednorazowe bezpudrowe
• Kalibrowane termometry do łaźni wodnej i suchego bloku grzejnego
*
Dokładność pipetorów musi wahać się w zakresie 3% podanej objętości. We wskazanych przypadkach używać należy pozbawionych
DNazy końcówek do pipet z barierą dla aerozoli lub wyrzutnikiem w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką
i amplikonem.
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
UWAGA: Ze wszystkimi próbkami i kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zdolnym do przenoszenia
czynników zakaźnych.
A.
Pobieranie próbek
Test COBAS® TaqMan® HBV jest przeznaczony wyłącznie do stosowania z próbkami surowicy lub osocza. Krew
powinno się pobierać do probówek BD SST Serum Separator Tubes lub do probówek zawierających EDTA jako
środek przeciwkrzepliwy.
Krew pełną przechowywać w temperaturze 2–25°C nie dłużej niż przez 1 dzień. Użycie osocza pobranego na EDTA
lub surowicy przyniesie wyniki testu, które w przybliżeniu będą równoważne. Rysunek 4 przedstawia wpływ rodzaju
macierzy na wyniki badania DNA HBV w próbkach pochodzących od pacjenta.
Rysunek 4
Porównanie rodzajów próbek: osocze z dodatkiem EDTA i surowica
Próbki osocza
Średni wynik (Log IU/ml DNA HBV, n=2)
10
12,00
10,00
8,00
6,00
y = 1,0139x - 0,0703
2
R = 0,9984
4,00
2,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Próbki surowicy
Średni wynik (Log10 IU/ml DNA HBV, n = 2)
04519337001-14PL
10
Doc Rev. 14.0
Oddzielić surowicę lub osocze od pełnej krwi w ciągu 1 dnia od pobrania przez odwirowanie (800–1600 x g przez
20 minut) w temperaturze pokojowej. Przenieść surowicę lub osocze do jałowej probówki polipropylenowej. Rysunek 5
przedstawia dane z badań dotyczących pobierania próbek.
Rysunek 5
Stabilność HBV w krwi pełnej z dodatkiem EDTA jako antykoagulantu lub w surowicy w probówkach Serum
Separator Tubes przed separacją na osocze lub surowicę
< 1 godzina 25-30 C
4,0
6 godzin 25-30 C
24 godzin 25-30 C
48 godzin 25-30 C
3,5
72 godzin 25-30 C
< 1 godzina 2-8 C
3,0
6 godzin 2-8 C
24 godzin 2-8 C
10
Średni wynik DNA HBV
Log IU/ml DNA HBV n=2)
4,5
48 godzin 2-8 C
2,5
72 godzin 2-8 C
2,0
Osocze-1 Osocze-2
Osocze-3 Osocze-4
Osocze-5 Surowica-1Surowica-2
Numer identyfikacyjny (ID) próbki
B.
Transport próbek
Transport krwi pełnej, surowicy lub osocza musi zachodzić zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi,
państwowymi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych32. Krew pełną należy transportować
w temperaturze 2–25°C i obrabiać w przeciągu 1 dnia od pobrania. Osocze lub surowica mogą być transportowane
w temp. 2–8°C lub zamrożone do temperatury od -20°C do -80°C.
C.
Przechowywanie próbek
Próbki surowicy lub osocza można przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 dni, w temperaturze 2–8°C do
7 dni lub zamrożone do temperatury od -20°C do -80°C co najmniej przez 6 tygodni. Zaleca się przechowywanie
próbek w objętościach 800–900 µl w jałowych polipropylenowych probówkach zakręcanych o pojemności 2,0 ml
(takich jak Sarstedt P/N: 72.694.006). Rysunek 6 przedstawia dane z badań dotyczących przechowywania próbek.
Rysunek 6
Stabilność HBV w osoczu z dodatkiem EDTA lub surowicy
Średni wynik DNA HBV
Log 10 IU/ml DNA HBV n=2)
4,5
Czas 0
1 dzień RT
4,0
3 dni RT
5 dni RT
3,5
7 dni RT
1 dzień 2-8 C
3,0
3 dni 2-8 C
5 dni 2-8 C
2,5
2,0
7 dni 2-8 C
6 tygodni -80 C
Osocze-1 Osocze-2 Osocze-3 Osocze-4 Osocze-5 Surowica-1 Surowica-2
Próbki surowicy i osocza można zamrażać i rozmrażać do 5 razy bez utraty DNA HBV. Rysunek 7 przedstawia dane
z badań dotyczących zamrażania i rozmrażania.
04519337001-14PL
11
Doc Rev. 14.0
4,5
4,0
Próba
kontrolna
1 F-T
3,5
2 F-T
3 F-T
10
Średni wynik (Log IU/ml DNA HBV, n=2)
Rysunek 7
Wyniki badania HBV po poddaniu próbki maksymalnie 5 cyklom zamrażania-rozmrażania
3,0
4 F-T
5 F-T
2,5
2,0
Osocze-1
Osocze-2
Osocze-3
Osocze-4
Surowica-1
Surowica-2
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
UWAGA: Szczegółowe instrukcje obsługi, informacje na temat drukowania wyników oraz interpretacji znaczników,
komentarzy i komunikatów o błędach zawierają: (1) Instrukcja obsługi analizatora COBAS® TaqMan®
48 do użytku z oprogramowaniem AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4; (2) Podręcznik oprogramowania
AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z urządzeniem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS®
TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR® i aparatem cobas
p 630 lub (3) Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.4.
UWAGA: Wszystkie odczynniki do amplifikacji i detekcji przed użyciem muszą być ogrzane do temperatury
otoczenia; należy wyjąć je z miejsca przechowywania o temperaturze 2–8°C co najmniej na 30 minut
przed użyciem.
UWAGA: Próbki surowicy i osocza należy przed użyciem ogrzewać do temperatury otoczenia przez 15–30 minut.
UWAGA: Tam, gdzie jest to wskazane, używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub wyrzutnikiem.
Zachować najdalej posuniętą ostrożność aby uniknąć zanieczyszczenia.
Wielkość przebiegu:
Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające dla czterech przebiegów po 12 oznaczeń każdy, które wykonywać
można oddzielnie lub równocześnie. W każdy z przebiegów testowych, liczących do 24 próbek i kontroli, należy
włączyć 1 powtórzenie kontroli: CTM (–) C, HBV L(+)C oraz HBV H(+)C (patrz rozdział Kontrola jakości).
Odczynniki do amplifikacji i detekcji pakowane są do butelek dwukrotnego użytku, wystarczających do wykonania
24 testów. Aby najwydajniej wykorzystać odczynniki, próbki badane i kontrolne należy poddawać obróbce w seriach
będących wielokrotnością 12.
Przygotowanie próbki i kontroli
UWAGA: Jeśli używa się zamrożonych próbek surowicy lub osocza, należy umieścić próbki w temperaturze
pokojowej aż do ich całkowitego rozmrożenia, a następnie przed użyciem wytrząsać na mieszadle
wibracyjnym przez 5–10 sekund.
UWAGA: Przed przystąpieniem do wykonywania testu pozwolić odczynnikom na ogrzanie się do temperatury
otoczenia. Przed rozpoczęciem reakcji oczyszczania materiału ogrzać suchy blok grzejny do temperatury
70°C (± 2°C) oraz łaźnię wodną do temperatury 50°C (± 2°C).
A.
Przygotowanie odczynników
UWAGA: Przygotować roboczy roztwór do lizy/wiążący jedynie wówczas, gdy wszystkie próbki i kontrole ogrzały
się już do temperatury otoczenia w ciągu 15–30 minut.
1.
Przygotować bufor usuwający inhibitor, przenosząc pipetą 20 ml 96–100% etanolu do odczynnika Inhibitor
Removal Buffer (bufor usuwający inhibitor) (IRB). Dokładnie wymieszać zawartość odwracając 5–10 razy.
Przygotowany w ten sposób bufor usuwający inhibitor stanowi zapas wystarczający na 48 testów.
04519337001-14PL
12
Doc Rev. 14.0
2.
Przygotować bufor do wymywania, przenosząc pipetą 80 ml 96–100% etanolu do odczynnika bufor do
wymywania (WASH). Dokładnie wymieszać zawartość odwracając 5–10 razy. Przygotowany w ten sposób
bufor do wymywania stanowi zapas wystarczający na 48 testów.
3.
Ogrzać bufor do elucji (ELB) do temperatury 70°C (± 2°C) w 2,0 ml zakręcanej probówce do wirówki. Można
w tym celu używać wielu probówek. Objętość elucji na jedną próbkę wynosi 75 µl. Należy ogrzać objętość
odczynnika zamieszczoną w poniższej tabeli, zgodnie z liczbą testów.
Liczba powtórzeń testów
4.
Odczynnik
12
24
Bufor do elucji (ml)
2,0
4,0
Przenieść za pomocą pipety do czystej, jałowej probówki objętość izopropanolu określoną w poniższej tabeli
w zależności od ilości testów.
Odczynnik
12
24
Izopropanol (ml)
5,0
10,0
5.
Przenieść za pomocą pipety 0,5 ml buforu do elucji (ELB) do nośnika RNA (CAR). Włożyć z powrotem
korek, odwrócić fiolkę i wytrząsać ją do chwili pełnego rozpuszczenia się nośnika RNA. Rozpuszczony nośnik
RNA wystarczy do wykonania 24 testów. Niezużyte partie rozpuszczonego nośnika RNA można
przechowywać w temperaturze od -15 do -25°C do 30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie
od tego, która z dat jest wcześniejsza.
6.
Przenieść za pomocą pipety 5,0 ml buforu do elucji (ELB) do proteinazy K (PK). Włożyć z powrotem korek,
odwrócić fiolkę i wytrząsać ją do chwili pełnego rozpuszczenia się proteinazy K. Rozpuszczona proteinaza
K wystarczy do wykonania 24 testów. Niezużyte partie rozpuszczonej proteinazy K można przechowywać
w temperaturze od -15 do -25°C do 30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która
z dat jest wcześniejsza.
7.
Przygotować roboczy roztwór do lizy/wiążący w następujący sposób — przenieść za pomocą pipety objętości
odczynników przedstawionych w poniższej tabeli, zgodne z liczbą próbek i kontroli przeznaczonych do
obróbki:
Odczynniki
12
24
Bufor do lizy/wiążący (ml)
7,0
14,0
Nośnik RNA (µl)
140
280
HBV QS (µl)
39
78
Proteinaza K (ml)
1,4
2,8
UWAGA: Objętość preparatu HBV QS jest swoista dla testu COBAS® TaqMan® HBV.
UWAGA: Jeśli zamierza się użyć zamrożonego uprzednio, rozpuszczonego nośnika RNA lub proteinazy K, należy je
rozmrażać w temperaturze pokojowej, zaś przed użyciem kilkakrotnie wymieszać przez odwracanie fiolki.
•
Dodać wskazaną objętość buforu do lizy/wiążącego do czystej, jałowej probówki o pojemności 50 ml.
•
Dodać do probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący wskazaną objętość rozpuszczonego nośnika RNA.
•
Wytrząsać naczynie z preparatem HBV QS przez 3–5 sekund, po czym dodać wskazaną objętość HBV QS
do probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący oraz rozpuszczony nośnik RNA.
•
Zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, odwracając 10–15 razy. NIE wytrząsać na mieszadle wytrząsanie spowoduje tworzenie się pęcherzyków w roztworze.
•
Dodać wskazaną objętość rozpuszczonej proteinazy K do probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący.
•
Zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, odwracając 10–15 razy. NIE wytrząsać na mieszadle - wytrząsanie
spowoduje tworzenie się pęcherzyków w roztworze. Rozpocząć rozdzielanie roboczego roztworu do
lizy/wiążącego natychmiast po dodaniu proteinazy K do buforu do lizy/wiążącego i wymieszaniu zawartości.
Niezużyte partie buforu do lizy/wiążącego (LYS) można przechowywać w temperaturze 15–25°C do 30 dni
lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza. Niezużyte partie
roboczego roztworu do lizy/wiążącego należy wyrzucić.
04519337001-14PL
13
Doc Rev. 14.0
B.
Przygotowanie próbki i kontroli
UWAGA: Do wykonania tej procedury zaleca się stosowanie regulowanych pipetorów z końcówkami z barierą
aerozolową.
UWAGA: Do wykonania czynności z etapów 1, 14, 16, 19 i 22 można używać pipety powtarzalnej z jałowymi końcówkami
typu „combi-tip” odpowiedniego rozmiaru. Należy jednak zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć
rozpryskiwania się odczynników i zanieczyszczenia krzyżowego próbek.
UWAGA: W trakcie całej procedury unikać rozlewania roztworu roboczego do lizy/wiążącego, próbki, kontroli
i izopropanolu na uszczelnienie znajdujące się między dołkiem a pokrywką na krawędzi każdego dołka.
UWAGA: Stosować dobrze dopasowane do dłoni użytkownika rękawice. Rękawice należy często zmieniać, szczególnie po
pracy z kontrolami dodatnimi i po otwieraniu pełnych probówek statywu do przeprowadzania lizy. Nigdy nie
dotykać wewnętrznej strony pokrywek (np. podczas otwierania lub zamykania).
UWAGA: Podczas pracy z kontrolami zestawu i próbkami klinicznymi należy przed przystąpieniem do ładowania kontroli
dodatnich załadować kontrole ujemne.
1.
Dodać pipetą 625 µl roboczego roztworu do lizy/wiążącego do każdego dołka statywu do przeprowadzania lizy
(I, przezroczysty). Nie dopuścić do powstawania kropelek na uszczelnieniu znajdującym się między dołkiem
a pokrywką na krawędzi każdego dołka. Delikatnie wcisnąć pokrywki na miejsce, nakrywając dołki. Nie zamykać
zatrzasku.
2.
Otwierając pojedynczo każdy dołek, ostrożnie dodawać pipetą do odpowiednich dołków po 500 µl próbki
bądź kontroli. Nie dopuścić do powstawania kropelek na uszczelnieniu znajdującym się między dołkiem
a pokrywką na krawędzi każdego dołka. Każdorazowo po dodaniu próbki lub kontroli wcisnąć pokrywkę
delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki,
a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek.
3.
Po dodaniu wszystkich próbek i kontroli wymieszać zawartość napełnionego statywu do przeprowadzania lizy,
wytrząsając go przez około 10 sekund. Unikać energicznego wytrząsania. Wzrokowo upewnić się, że wytrząsanie
przebiega we wszystkich dołkach, a ich zawartość jest dokładnie mieszana.
4.
Ostrożnie umieścić statywy do przeprowadzania lizy we wstępnie podgrzanej do temperatury 50°C (±2°C)
kąpieli wodnej, unikając rozchlapywania. Inkubować statyw do przeprowadzania lizy przez 10 minut. Podczas
inkubacji statyw do przeprowadzania lizy powinien być zanurzony w wodzie, ale nie może w niej pływać.
Należy się upewnić, że podczas inkubacji górna powierzchnia statywu do przeprowadzania lizy pomiędzy
dołkami pozostanie sucha. Po wyjęciu z kąpieli wodnej ostrożnie wytrzeć do sucha wierzch i spód statywu
do przeprowadzania lizy.
5.
W wirówce z płytką mikrotitracyjną odwirować statyw do przeprowadzania lizy przez 10–20 sekund
z przyspieszeniem 4600 x g. Wirówka może nie osiągnąć w tym czasie nastawionej prędkości obrotów. Potwierdzić
wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia
wycieku przerwać procedurę.
6.
Otwierać każdy dołek pojedynczo, delikatnie naciskając zawias zatrzaskowy, aby zwolnić mechanizm zatrzasku
i unieść pokrywkę dołka. Za pomocą pipety dodawać do każdego dołka po 250 µl izopropanolu. Każdorazowo po
dodaniu izopropanolu wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując,
delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek.
UWAGA: Objętość izopropanolu jest swoista dla każdego testu COBAS® TaqMan®.
7.
8.
9.
10.
Wzrokowo upewnić się, że wszystkie statywy są szczelnie zamknięte. Wymieszać próbki, trzykrotnie
odwracając statyw, a następnie wytrząsać go na mieszadle wibracyjnym przez około 10 sekund. Unikać
energicznego wytrząsania. Wzrokowo upewnić się, że wytrząsanie przebiega we wszystkich dołkach, a ich
zawartość jest dokładnie mieszana.
W wirówce z płytką mikrotitracyjną odwirować statyw do przeprowadzania lizy przez 10–20 sekund
z przyspieszeniem 4600 x g. Wirówka może nie osiągnąć w tym czasie nastawionej prędkości obrotów.
Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie
stwierdzenia wycieku przerwać procedurę.
Otwierać każdy dołek pojedynczo, delikatnie naciskając zawias zatrzaskowy, aby zwolnić mechanizm zatrzasku
i unieść pokrywkę dołka. Przenieść 750 µl próbki lub mieszaniny kontrolnej do odpowiednich dołków statywu
z rurkami filtracyjnymi (II, żółty) z przymocowanym statywem na odpady (biały). Każdorazowo po dodaniu
próbki lub mieszaniny kontrolnej wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu;
kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek.
Po dodaniu wszystkich próbek lub kontroli wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez
2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie
doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku
przerwać procedurę.
04519337001-14PL
14
Doc Rev. 14.0
11.
Otwierać dołki pojedynczo, delikatnie naciskając zawias zatrzaskowy, aby zwolnić mechanizm zatrzasku i unieść
pokrywkę dołka. Przenieść pozostałość próbki lub mieszaniny kontrolnej do odpowiednich dołków statywu
z rurkami filtracyjnymi. Każdorazowo po dodaniu próbki lub mieszaniny kontrolnej zamknąć pokrywkę dołka
delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki,
a następnie zamknąć zatrzask. We właściwy sposób wyrzucić statyw do wykonywania lizy.
12.
Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g
w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy
we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę.
13.
Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu na odpady przyciskając obie spinki na górnej powierzchni
statywu z rurkami filtracyjnymi . Wyrzucić w odpowiedni sposób statyw na odpady. Zastąpić zużyty statyw
na odpady nowym i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu na odpady.
14.
Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 400 µl buforu usuwającego
inhibitor (IRB), wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek dołka. Każdorazowo po dodaniu
buforu usuwającego inhibitor do dołków wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony
zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie
zamknąć pokrywkę.
15.
w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy
we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę.
16.
Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 700 µl buforu płuczącego (WASH),
wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek dołka. Każdorazowo po dodaniu buforu płuczącego
do wszystkich dołków wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując,
delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć pokrywkę.
17.
w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom
cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę.
18.
statywu z rurkami filtracyjnymi . Wyrzucić w odpowiedni sposób statyw na odpady. Zastąpić zużyty statyw
na odpady nowym i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu na odpady.
19.
Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 700 µl buforu płuczącego, wlewając
płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek dołka. Każdorazowo po dodaniu buforu płuczącego do
wszystkich dołków wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując,
delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć pokrywkę.
20.
21.
statywu z rurkami filtracyjnymi . Nałożyć statyw z rurkami filtracyjnymi na statyw do elucji (IIIA, niebieski)
i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu do elucji. Wyrzucić w odpowiedni sposób statyw na
odpady.
22.
Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 75 µl wstępnie podgrzanego
buforu do elucji (ELB) na środek każdego filtra, nie dotykając samego filtra.
UWAGA: Nie dodawać buforu do elucji przez wlewanie go po ściance dołka.
23.
24.
25.
26.
Każdorazowo po dodaniu buforu do elucji do wszystkich dołków wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem
w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć
zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek.
Inkubować statyw do elucji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 minuty od dodania buforu do elucji
do ostatniego dołka, wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu; kontynuując,
delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek.
Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu do elucji, przyciskając obie spinki na górnej powierzchni
statywu z rurkami filtracyjnymi. Zutylizować statyw z rurkami filtracyjnymi we właściwy sposób.
Nałożyć statyw z pokrywkami (IIIB, niebieski) na statyw do elucji (IIIA, niebieski). Docisnąć mocno i zapiąć
spinki na statywie do elucji. Wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu;
kontynuując, delikatnie nacisnąć środek pokrywki, a następnie zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć
wszystkie pokrywki.
04519337001-14PL
15
Doc Rev. 14.0
27.
Poddawane obróbce próbki i kontrole są stosowane bezpośrednio w reakcji PCR. Do amplifikacji należy użyć
po 50 µl poddawanych obróbce próbek i kontroli. Dodać obrabiane próbki i kontrole do roboczego odczynnika
Master Mix w ciągu 3 godzin od ukończenia przygotowania próbek i kontroli. Jeśli obrabianych próbek
i kontroli nie można wykorzystać w ciągu 3 godzin od ich przygotowania, można przechowywać obrabiane
próbki i kontrole w temperaturze 2–8°C do 24 godzin w zamkniętym statywie do elucji bądź zamrożone do
temperatury –20°C do 1 tygodnia w jałowych, polipropylenowych, zakręcanych probówkach o pojemności
2,0 ml (takich jak Sarstedt P/N: 72.694.006). Poddać obrabiane próbki i kontrole amplifikacji w ciągu 3 godzin
od ich dodania do roboczego odczynnika Master Mix.
Amplifikacja i detekcja
UWAGA: Zasobniki K/zasobnik na tackę K i uchwyty zasobnika K/zasobnika na tackę K należy przetrzeć tkaniną
niezostawiającą włókien, zwilżoną 70% roztworem izopropanolu.
C.
Przygotowanie odczynników
UWAGA: Odczynniki COBAS® TaqMan® HBV Master Mix (HBV MMX), roboczy Master Mix (Working MMX)
oraz roboczy Master Mix z poddaną obróbce próbką lub kontrolą są wrażliwe na światło. Chronić
wymienione odczynniki przed światłem.
UWAGA: Odczynniki COBAS® TaqMan® HBV Master Mix (HBV MMX) oraz roztwór manganu COBAS®
TaqMan® (CTM Mn2+) należy ogrzewać do temperatury otoczenia przez co najmniej 30 minut przed
przygotowaniem roboczego odczynnika Master Mix.
UWAGA: Przygotować roboczy odczynnik MMX po zakończeniu przygotowywania próbek i kontroli.
UWAGA: Roboczy odczynnik MMX należy zużyć w ciągu 2 godzin od jego przygotowania.
UWAGA: Po dodaniu poddanych obróbce próbek i kontroli do roboczego odczynnika Master Mix amplifikacja
powinna rozpocząć się w ciągu 3 godzin.
1.
Ogrzewać jedną fiolkę odczynnika HBV MMX oraz jedną fiolkę odczynnika CTM Mn2+ do temperatury
otoczenia przez co najmniej 30 minut.
2.
Umieścić zasobnik K/zasobnik na tacki K w uchwycie zasobnika K/zasobnika na tackę K.
3.
Włożyć nowe probówki K lub nową tackę K do zasobnika K/zasobnika na tackę K, nie dotykając bocznych
ścianek probówek K.
UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami
następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika K po umieszczeniu
w termocyklerze było równomierne. Nie ma potrzeby równoważenia termocyklera podczas stosowania
tacki K.
4.
5.
Jeśli jest taka potrzeba, zdjąć korki z probówek K za pomocą urządzenia do mocowania korków. Umieścić
korki w podręcznym uchwycie na probówki K.
Przygotować roboczy odczynnik MMX w następujący sposób:
W celu wykonania 24 testów dodać 191 µl odczynnika CTM Mn2+ do jednej fiolki z odczynnikiem HBV MMX.
Zamknąć buteleczkę i dokładnie wymieszać zawartość, odwracając 10 razy. Nie wytrząsać roboczego odczynnika
MMX na mieszadle wibracyjnym. Chronić roboczy odczynnik MMX przed światłem i zużyć w ciągu 2 godzin.
W celu wykonania 12 testów pobrać 660 µl odczynnika HBV MMX i wlać do 2 ml probówki. Dodać 90 µl
odczynnika CTM Mn2+ do 2 ml probówki zawierającej HBV MMX, zamknąć probówkę korkiem i dokładnie
wymieszać zawartość, odwracając probówkę 10 razy. Chronić roboczy odczynnik MMX przed światłem
i zużyć w ciągu 2 godzin. Przechowywać niezużyte partie odczynników: HBV MMX i CTM Mn2+
w oryginalnych fiolkach w temperaturze 2–8°C. Po otwarciu odczynniki HBV MMX i CTM Mn2+ zachowują
stabilność w temperaturze 2–8°C przez 30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która
z dat jest wcześniejsza.
UWAGA: Objętość odczynnika CTM Mn2+ jest swoista dla testu COBAS® TaqMan® HBV.
6.
Przenieść pipetą 50 µl roboczego odczynnika MMX do każdej probówki K lub do dołka tacki K.
UWAGA: Jeżeli poddane obróbce próbki i kontrole przed amplifikacją przechowywano w zamrożeniu, należy je
rozmrozić w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do etapu 7.
7.
Dodać po 50 µl każdej poddanej obróbce próbki i kontroli do odpowiednich probówek K lub dołków tacki K,
zawierających roboczy odczynnik MMX, wykorzystując do tego celu mikropipetor z końcówką z barierą
aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Ostrożnie wymieszać każdą próbkę i kontrolę, trzy razy nabierając do
mikropipetora i wypuszczając ponownie, nie doprowadzając przy tym do tworzenia się pęcherzyków.
8.
Powtórzyć czynności z etapu 7 w odniesieniu do każdej próbki i poddawanej obróbce kontroli aż do przeniesienia
każdej z nich do probówek K lub dołków tacek K. Do każdej próbki i kontroli użyć nowej końcówki. Sprawdzić
wzrokowo probówki w poszukiwaniu pęcherzyków, a w razie konieczności usunąć je. Za pomocą urządzenia do
mocowania korków/urządzenia korkującego do tacek K nałożyć korki na probówki K lub tackę K. Sprawdzić
wzrokowo, czy dodano odpowiednie objętości próbek.
04519337001-14PL
16
Doc Rev. 14.0
9.
Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 3 godzin od czasu dodania poddanych obróbce próbek i kontroli do
probówek K/tacki K zawierających roboczy odczynnik MMX.
D.
1.
Ładowanie i obsługa analizatora COBAS® TaqMan® 48
Włącz komputer stacji roboczej i zaloguj się do systemu operacyjnego Microsoft Windows, używając
odpowiedniej nazwy użytkownika i hasła.
2.
Włączyć analizator COBAS® TaqMan® 48. Upewnić się, że urządzenie uruchamia się i jest gotowe do użytku.
Jeśli zasobniki K lub zasobniki na tackę K z poprzednich przebiegów testowych znajdują się nadal
w którymkolwiek z termocyklerów, należy je wyjąć za pomocą transportera do zasobników K.
3.
Uruchomić na komputerze program AMPLILINK. Zalogować się, używając odpowiedniej nazwy użytkownika
i hasła.
4.
Aby wprowadzić numerację próbek przeznaczonych do analizy w nośniku K lub nośniku na tace K, należy
kliknąć ikonę Orders. Wybrać zakładkę Sample, następnie kliknąć przycisk New i za pomocą klawiatury lub
czytnika kodów kreskowych wprowadzić numer porządkowy próbki. Wybrać plik definicji testu dla testu
COBAS® TaqMan® HBV. Nazwy i numery wersji plików definicji testu znajdują się na karcie informacyjnej
produktu, dołączonej do opakowania zestawu. Powtórzyć opisaną procedurę w odniesieniu do każdej próbki.
Kliknąć przycisk Save.
UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami
następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika K po umieszczeniu
w termocyklerze było równomierne.
5.
Wprowadzić dane dotyczące kontroli jakości, wybierając zakładkę Quality Control w oknie Orders. Kliknąć
przycisk New i za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadzić dane zamieszczone na
dostarczonej wraz z zestawem karcie COBAS® TaqMan® HBV Test Controls Value Card. Wprowadzić
w odpowiednich polach: numer serii testu COBAS® TaqMan® HBV, datę przydatności do użycia, zakresy
wartości kontroli Low (+) i High (+) oraz swoiste dla każdej serii współczynniki kalibracji. Kliknąć
przycisk OK.
6.
Przypisać numer nośnika K/tacy K do przebiegu testowego, klikając zakładkę K-Carrier w oknie Orders.
W oknie K-Carrier kliknąć przycisk New. W okienku znajdującym się na prawo od napisu K-Carrier ID
wprowadzić za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych numer nośnika K/tacy K zamieszczony
na kodzie kreskowym nośnika K/tacy K. W przypadku używania tacy K sprawdzić okno K-Tray poniżej pola
K-Carrier ID. Z panelu testowego w dolnej części okna wybrać plik definicji testu dla testu COBAS®
TaqMan® HBV. Nazwy i numery wersji plików definicji testu znajdują się na karcie informacyjnej produktu,
dołączonej do opakowania zestawu.
UWAGA: Wymagane jest zaakceptowanie wyników poprzedniego przebiegu testowego, dokonanego przy
wprowadzonym tym samym numerze identyfikacyjnym zasobnika K.
7.
W opcji Worklist wybrać pierwszy wiersz w kolumnie Type (T). Zaznaczyć to pole w celu uzyskania dostępu
do menu rozwijanego i wybrać wymagany typ kontroli. Następnie dwukrotnie kliknąć pole z numerem
identyfikacyjnym próbki w tym samym wierszu. Wyświetli się okno LookUp Control ze wszystkimi
dostępnymi kontrolami. Po wybraniu kontroli w dolnej części po prawej stronie panelu Information wyświetlą
się odpowiednie wartości kalibracji i wartości kontrolne. Powtórzyć opisaną procedurę w odniesieniu do
wszystkich wymaganych kontroli.
8.
W celu wprowadzenia próbek na listę roboczą Worklist dwukrotnie kliknąć pierwszą pozycję (wiersz) okna
informacyjnego danej próbki. Spowoduje to wyświetlenie okna Lookup Sample, zawierającego numery
przypisane danej próbce. W celu zaznaczenia więcej niż jednego numeru porządkowego użyć klawiszy Shift
+ strzałka. Upewnić się, że wszystkie polecenia zostały przypisane plikowi definicji testu dla testu COBAS®
TaqMan® HBV. Nazwy i numery wersji plików definicji testu znajdują się na karcie informacyjnej produktu,
dołączonej do opakowania zestawu.
9.
Kliknąć przycisk Save, aby zapisać zlecenie dla danego zasobnika K/zasobnika na tackę K.
UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami następujące
pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika K po umieszczeniu w termocyklerze było
równomierne. Nie ma potrzeby równoważenia termocyklera podczas stosowania tacki K.
E.
Amplifikacja i detekcja
1.
Wybrać ikonę Systems w zakładce System; kliknąć przycisk Open, aby otworzyć termocykler. Gdy w oknie
Systems pokrywa termocyklera jest całkowicie uchylona i widoczny jest komunikat Ready to Load,
przyciągnąć i przytrzymać pokrywę termocyklera w celu otwarcia urządzenia. Za pomocą transportera
zasobników K/zasobników na tackę K umieścić w termocyklerze załadowany zasobnik K/zasobnik na tackę K
zawierający zamknięte probówki K/tackę K z roboczym odczynnikiem Master Mix, próbkami i kontrolami.
Zamknąć pokrywę termocyklera.
04519337001-14PL
17
Doc Rev. 14.0
2.
Kliknąć przycisk Start w oknie Systems poniżej ikony „TC” w celu zamknięcia pokrywy termocyklera
i uruchomienia aparatu.
3.
Analizator COBAS® TaqMan® 48 automatycznie wykonuje amplifikację i detekcję.
WYNIKI
Obliczanie wyników
Analizator COBAS® TaqMan® 48 automatycznie określa miano DNA HBV w próbce i kontroli. Miano DNA HBV
wyraża się w jednostkach międzynarodowych (IU)/ml. Współczynnik konwersji pomiędzy stężeniem HBV
w kopiach/ml i mianem HBV w jednostkach międzynarodowych/ml wynosi 5,82 kopii/IU według wytycznych WHO
HBV International Standard for NAT testing 97/74629.
Analizator COBAS® TaqMan® 48:
•
Określa wartość progową ilości cykli (Ct) dla DNA wirusa HBV oraz DNA preparatu HBV Quantitation
Standard.
• Określa miano DNA HBV na podstawie wartości Ct dla DNA HBV oraz DNA preparatu HBV Quantitation
Standard oraz swoistych dla danej serii współczynników kalibracji.
• Określa, czy miana obliczone w IU/ml dla kontroli HBV L(+)C i HBV H(+)C mieszczą się
w przypisanych im przedziałach.
Walidacja przebiegu testowego – oprogramowanie AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4
Sprawdzić okno wyników programu AMPLILINK lub wydruk w poszukiwaniu oznaczeń i komentarzy
świadczących o tym, że dany przebieg testowy jest ważny.
Przebieg testowy jest ważny, jeśli żadna z kontroli analizatora COBAS® TaqMan® HBV nie została opatrzona
znacznikiem błędu.
Przebieg jest nieważny, jeżeli kontrole testu COBAS® TaqMan® HBV są opatrzone którymkolwiek
z poniższych oznaczeń:
Próba kontrolna ujemna:
Oznaczenie
NC_INVALID
Wyniki
Interpretacja
Invalid
Wynik nieważny albo “ważny”, lecz
nie ujemny w kierunku obecności
docelowego HBV
Próba kontrolna HBV słabo dodatnia:
Oznaczenie
LPCINVALID
Wyniki
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny lub kontrola poza
zakresem wartości
Próba kontrolna HBV silnie dodatnia:
Oznaczenie
HPCINVALID
Wyniki
Interpretacja
Wynik nieważny lub kontrola poza
zakresem wartości
Invalid
Jeśli przebieg testowy jest nieważny, należy powtórzyć go w całości, wraz z przygotowaniem próbek i kontrolą,
amplifikacją oraz detekcją.
Interpretacja wyników:
Aby ocenić ważność przebiegu, należy sprawdzić poszczególne próbki na wydruku z wynikami w poszukiwaniu
oznaczeń lub komentarzy. Wyniki należy interpretować następująco:
⇒
Ważny przebieg może zawierać zarówno ważne jak i nieważne wyniki badania próbki, zależnie od tego jakimi
znacznikami i/lub komentarzami są one opatrzone.
04519337001-14PL
18
Doc Rev. 14.0
Wyniki badania próbek interpretuje się w następujący sposób:
Komentarz
Przyczyna
Target Not Detected
Wartość Ct dla HBV powyżej granicy testu lub brak wartości Ct dla HBV
uzyskanej. Podać wynik jako “nie wykryto DNA HBV”.
< 6.00E+00 IU/mL
Obliczona wartość w IU/ml jest poniżej zakresu testu. Podać wynik jako
“wykryto DNA HBV, mniej niż 6 IU/ml DNA HBV”.
≥ 6.00E+00 IU/mL i
< 2.90E+01 IU/mL
Obliczone wyniki w IU/ml są mniejsze niż dolna wartość graniczna zakresu
liniowego testu. Wyniki te charakteryzują się wysoką zmiennością i z tego
względu nie można ich uważać za dokładne. Należy je interpretować
z zachowaniem ostrożności.
≥ 2.90E+01 IU/mL i
≤ 1.10E+08 IU/mL
Obliczone wyniki o wartości 29 IU/ml lub wyższej albo o wartości
1,10E+08 IU/ml lub niższej mieszczą się w zakresie liniowym testu.
> 1.10E+08 IU/mL
Obliczona ilość w IU/ml jest powyżej zakresu testu. Podać wynik jako “wyższy
niż 1,10E+08 IU/ml DNA HBV”. Jeśli wyniki ilościowe są pożądane, oryginalną
próbkę powinno się rozcieńczyć HBV-ujemnym ludzkim osoczem lub surowicą,
w zależności od macierzy oryginalnej próbki, a następnie powtórzyć test.
Otrzymany wynik pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
UWAGA: Próbki o wynikach powyżej zakresu wartości testu, dające wynik nieważny, opatrzony oznaczeniem
„QS_INVALID”, także nie powinny być opisywane jako > 1,10E+08 IU/ml. Jeśli pożądane są wyniki
ilościowe, oryginalną próbkę należy rozcieńczyć HBV-ujemnym ludzkim osoczem lub surowicą
w zależności od macierzy oryginalnej próbki, po czym należy powtórzyć test. Otrzymany wynik należy
pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
KONTROLA JAKOŚCI
Do każdej serii testów zawierającej maksymalnie 24 próbek i kontroli należy włączyć co najmniej jedno powtórzenie
kontroli: CTM (–) C, HBV L(+)C i HBV H(+)C musi być włączone do każdego przebiegu testu. Tak jak
w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowy operator powinien rozważyć zastosowanie dodatkowych,
wewnętrznych kontroli za każdym razem, kiedy przeprowadzany jest test, do czasu osiągnięcia dużego stopnia
zaufania dotyczącego poprawności przeprowadzania testu. Nie ma wymagań co do położenia kontroli
w zasobniku K/tacce K. Sprawdzić czy w wydruku przebiegu obecne są znaczniki i komentarze.
Kontrola ujemna
Próba kontrolna CTM (–) C musi dawać wynik Target Not Detected, tj. wartość Ct dla DNA HBV powyżej
granicznej wartości testu lub brak uzyskanej wartości Ct dla DNA HBV, lecz jednocześnie ważny wynik oznaczania
wartości Ct dla preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Jeżeli próba kontrolna CTM (–) C nie spełnia tego
kryterium, wyniki całego przebiegu są nieważne. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek i kontroli,
amplifikację i detekcję). Jeśli wyniki kontroli CTM (–) C nadal stale są nieważne, należy skontaktować się
z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche celem uzyskania pomocy technicznej.
Kontrole dodatnie
Przypisane zakresy wartości kontroli: HBV L(+)C i HBV H(+)C są swoiste dla każdej serii kontroli i zostały
zamieszczone w karcie COBAS® TaqMan® HBV Test Controls Value Card, dostarczonej łącznie z zestawem. Te zakresy
są wprowadzane do jednostki sterującej z oprogramowaniem AMPLILINK.
Miano DNA HBV, wyrażone w IU/ml, dla obu kontroli: HBV L(+)C i HBV H(+)C musi mieścić się w przedziale
wartości zamieszczonym na karcie COBAS® TaqMan® HBV Test Controls Value Card, dostarczonej łącznie z zestawem.
Jeżeli jedna lub obie dodatnie kontrole nie spełniają tego kryterium, cały przebieg testu jest nieważny. Należy powtórzyć
cały proces (przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeżeli obliczone miano DNA HBV w jednej lub
obu dodatnich próbach kontrolnych stale mieści się poza przypisanym zakresem, należy zwrócić się do regionalnego
przedstawicielstwa firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
04519337001-14PL
19
Doc Rev. 14.0
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY
1.
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie
ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu,
należy przedsięwziąć wyjątkową ostrożność aby zapewnić czystość zestawów odczynników oraz mieszanin do
amplifikacji. Należy monitorować czystość wszystkich odczynników. Wyrzucić wszelkie podejrzane odczynniki.
OGRANICZENIA PROCEDURALNE
1.
Test ten został zatwierdzony do użytku wyłącznie w zastosowaniu z ludzką surowicą lub ludzkim osoczem
pobranym na środek antykoagulacyjny EDTA. Badanie innych rodzajów próbek może dawać wyniki
nieprawidłowe, fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie.
2.
Wiarygodne wyniki uzależnione są od właściwego pobrania próbki, transportu, przechowywania oraz procedur
obróbki.
3.
Obecność enzymu AmpErase w odczynniku COBAS® TaqMan® HBV Master Mix zmniejsza ryzyko skażenia
amplikonu. Jednak zanieczyszczenia materiałem pochodzącym z HBV-dodatnich kontroli i próbek klinicznych
można uniknąć jedynie dzięki stosowaniu zasad dobrej praktyki laboratoryjnej i uważnemu wykonywaniu
procedur opisanych w niniejszej ulotce dołączonej do opakowania zestawu.
4.
Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR.
5.
Niniejszego produktu można używać tylko łącznie z analizatorem COBAS® TaqMan® 48.
6.
Detekcja DNA HBV zależy od liczby cząsteczek wirusa obecnych w próbce, na którą wpływać mogą metody
pobierania próbek oraz czynniki związane z pacjentem (tj. wiek, obecność objawów i/lub faza zakażenia).
7.
Mutacje w obrębie wysoko konserwatywnego regionu genomu wirusa, z którym wiążą się startery i/lub sonda
używane w tym teście, chociaż rzadkie, mogą spowodować niedoszacowanie ilości lub niewykrycie wirusa.
8.
Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod użytkownik
przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu określenia ilościowych różnic
występujących pomiędzy nimi.
04519337001-14PL
20
Doc Rev. 14.0
SUBSTANCJE WPŁYWAJĄCE NA WYNIK TESTU
Wykazano, że zwiększone stężenie lipidów, bilirubiny, albumin i hemoglobiny w próbkach nie wpływa na wynik
oznaczenia ilościowego DNA HBV za pomocą niniejszego testu.
Wykazano, że następujące leki nie wpływają na wyniki oznaczenia ilościowego DNA HBV za pomocą niniejszego testu.
Nukleotydowe inhibitory polimerazy DNA
Dipivoxil adefoviru
Fumaran disoproxilu tenofoviru
Nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy
i polimerazy DNA
Lamiwudyna
Zidowudyna
Zalcitabina
Stavudina
Abakawir
Inhibitory proteazy HIV
Indinawir
Ritonawir
Nelfinawir
Sakwinawir
Amprenawir
Lopinawir/Ritonawir
Nienukleozydowe inhibitory odwrotnej
transkryptazy HIV
Newirapina
Efavirenz
Immunomodulatory
Interferon alfa-2a
Interferon alfa-2b
Inhibitor fuzji HIV
Enfuvirtide
Związki stosowane w leczeniu zakażeń CMV (wirusem cytomegalii)
Gancyklowir
Chlorowodorek valgancicloviru
Acyklowir
Chlorowodorek valacycloviru
04519337001-14PL
21
Doc Rev. 14.0
OCENA SKUTECZNOŚCI W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
Opis badania
Limit wykrywalności testu COBAS® TaqMan® HBV określono na podstawie analizy seryjnych rozcieńczeń próbek
klinicznych zawierających HBV (genotyp A i D), dokonanych z użyciem HBV-ujemnego osocza z dodatkiem EDTA
lub surowicy. Dokładność i liniowość testu COBAS® TaqMan® HBV określono na podstawie analizy seryjnych
rozcieńczeń próbek klinicznych zawierających HBV (genotyp A i D), dokonanych wyłącznie z użyciem HBVujemnego osocza ludzkiego z dodatkiem EDTA. Stężenie HBV w próbkach klinicznych, wyrażone w kopiach/ml,
określono przy pomocy testu COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR dla rozcieńczeń w granicach przedziału
wartości testu, a następnie pomnożono przez współczynnik rozcieńczenia. Stężenie w poszczególnych rozcieńczonych
próbkach przeliczono na IU/ml przy pomocy współczynnika konwersji pomiędzy jednostkami międzynarodowymi
WHO DNA HBV/ml a kopiami/ml, określonymi za pomocą testów: COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR
i COBAS® TaqMan® HBV.
A.
Granica wykrywalności
Opisane poniżej badania wykazują, że test COBAS® TaqMan® HBV jest w stanie wykryć DNA HBV w osoczu
z EDTA i w surowicy w tak niskich stężeniach, jak 5,9 IU/ml, przy wskaźniku dodatniości wyższym niż 95%.
Stężenie DNA HBV w osoczu z EDTA i surowicy, które można wykryć ze wskaźnikiem dodatniości wyższym niż
95% według wyników analizy probitowej, wynosi odpowiednio 4,8 IU/ml i 6,7 IU/ml.
Tabela 1
Limit wykrywalności testu COBAS® TaqMan® HBV dla próbek osocza z EDTA
Nominalne stężenie wejściowe
(DNA HBV IU/ml)
Liczba powtórzeń
Liczba wyników dodatnich
Odsetek dodatnich
12,9
120
120
100%
8,6
120
118
98%
6,0
120
119
99%
3,4
120
105
88%
1,7
120
99
83%
0,9
120
67
56%
0,4
120
57
48%
Probit 95% odsetka trafień
4,8 IU/ml [95% przedziały ufności 3,1-9,9 IU/ml]
Tabela 2
Limit wykrywalności testu COBAS® TaqMan® HBV dla próbek surowicy
Nominalne stężenie wejściowe
(DNA HBV IU/ml)
Liczba powtórzeń
Liczba wyników dodatnich
Odsetek dodatnich
12,9
120
120
100%
8,6
117
110
94%
6,0
114
111
97%
3,4
120
103
86%
1,7
114
73
64%
0,9
120
47
39%
0,4
120
28
23%
Probit 95% odsetka trafień
04519337001-14PL
6,7 IU/ml [95% przedziały ufności 4,7-11,1 IU/ml]
22
Doc Rev. 14.0
B.
Precyzja
Precyzję testu wewnątrz przebiegu, pomiędzy przebiegami oraz całkowitą oceniono z zachowaniem zgodności
z metodami zdefiniowanymi w wytycznych CLSI Guideline EP5-A „Evaluation of Precision Performance of Clinical
Chemistry Devices”33. Procedura ta pozwala na określenie precyzji zarówno wewnątrz przebiegu, jak i całkowitej
w wyniku badania wielodniowego, wykonywanego przez jednego operatora, a także przez wielu operatorów.
Przebieg, składający się z 3 powtórzeń dla każdej próbki, przeprowadzano codziennie przez 15 dni. Każda próbka
przeszła pełną procedurę testu COBAS® TaqMan® HBV, wliczając w to przygotowanie próbki, amplifikację
i detekcję. Dlatego też podana precyzja reprezentuje wszystkie aspekty procedury badawczej. Badanie
przeprowadzono z 3 seriami odczynników testu COBAS® TaqMan® HBV, zaś zbiorcze wyniki przedstawiono
w Tabeli 3 (DNA HBV IU/ml) i Tabeli 4 (DNA HBV log10 IU/ml).
Tabela 3
Precyzja testu COBAS® TaqMan® HBV (w IU/ml)
Próbka
1
Średni poziom
DNA HBV
Miano (IU/ml)
1,07E8
2
3
Współczynnik
wariancji (CV) w
jednym przebiegu
testowym
19%
10%
12%
7%
14%
Współczynnik
wariancji (CV)
różnych przebiegów
testowych
11%
14%
12%
14%
Całkowity
współczynnik
wariancji (CV)
23%
17%
17%
Ogółem liczba
Powtórzeń
132
134
134
5,33E7 1,04E7
4
5
6
7
8
9
10
1200
111
49
14
16%
14%
22%
27%
50%
16%
18%
18%
26%
17%
22%
16%
22%
24%
22%
34%
32%
54%
135
135
134
135
135
135
135
8,52E5 9,28E4 1,21E4
Tabela 4
Precyzja testu COBAS® TaqMan® HBV (w log10 IU/ml)
Próbka
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Średnie miano
DNA HBV
(Log10 IU/ml)
8,02
7,72
7,01
5,92
4,94
4,06
3,07
2,03
1,67
1,05
W jednym
0,07
przebiegu testowym
Odchylenie
standardowe
0,04
0,05
0,03
0,21
0,18
0,06
0,09
0,11
0,59
0,05
0,06
0,05
0,06
0,07
0,07
0,08
0,10
0,07
0,00
Całkowite odchylenie 0,08
Standardowe
0,07
0,07
0,07
0,22
0,19
0,10
0,13
0,13
0,59
W różnych
przebiegach
testowych
Odchylenie
standardowe
04519337001-14PL
23
Doc Rev. 14.0
C.
Zakres liniowy
Jak przedstawiono na Rysunku 8, stwierdzono, że test COBAS® TaqMan® HBV wykazuje liniowość od 29
(Log10 = 1,46) IU/ml DNA HBV do co najmniej 1,10E8 (Log10 = 8,04) IU/ml DNA HBV. Badanie przeprowadzono
przy użyciu 3 serii odczynników testu COBAS® TaqMan® HBV, z liczbą 131-135 powtórzeń na każdym poziomie.
Wynik dla zestawu High Pure System Viral Nucle
Acid Kit / Testu COBAS® TaqMan® HBV Test
Log10 (IU/ml DNA HBV)
Rysunek 8
Liniowość testu COBAS® TaqMan® HBV
D.
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
y = 1,0124x - 0,2358
2
R = 0,9989
Słupki błędu = 1 odchylenie standardowe
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Nominalne stężenie
Log10 (IU/ml DNA HBV)
Reprezentatywność
Postulowano podział genotypu HBV na 7 kategorii na podstawie dywergencji nukleotydów w obrębie genomu
przekraczającej 8%34,35. Genotypy te zostały oznaczone wielkimi literami alfabetu od A do G. Genotypy wirusa HBV
wykazują charakterystyczną dystrybucję geograficzną36.
Działanie testu COBAS® TaqMan® HBV w odniesieniu do różnych genotypów HBV poddano ocenie na podstawie
analizy 22 oczyszczonych, linearyzowanych, oznaczonych ilościowo plazmidów DNA zawierających reprezentatywne
sekwencje wstawkowe genotypów HBV od A do G (patrz Tabela 5). Ponadto badano również plazmid reprezentujący
częstą przedrdzeniową mutację G:A nukleotydu w pozycji 1896. Każdy plazmid DNA rozcieńczono do uzyskania
stężeń wynoszących 15, 1500, 1,5E5 i 1,5E8 kopii/PCR. Amplifikację każdej rozcieńczonej próbki prowadzono
wspólnie z preparatem QS DNA i poddano trzykrotnej analizie przy pomocy testu COBAS® TaqMan® HBV. Miana
wszystkich plazmidów porównano z mianem kontrolnego plazmidu DNA (pc).
W teście COBAS® TaqMan® HBV otrzymano równoważne wyniki dla wszystkich 23 plazmidów DNA (patrz
Rysunek 9); liczby kopii wszystkich genotypów oraz mutacji przedrdzeniowej pozostawały w dobrej zgodności ze
sobą oraz z kontrolnym plazmidem DNA.
04519337001-14PL
24
Doc Rev. 14.0
Tabela 5
Test COBAS® TaqMan® HBV
Badanie reprezentatywności – badanie typowanych plazmidów DNA
Oznaczenie plazmidu
04519337001-14PL
Genotyp
Pochodzenie próbki źródłowej
p8423-c1
A
Indie
p1115-c1
A
Burundi
p3952-c1
A
Kamerun
p4199-c2
A
Norwegia
p1764-c1
B
Chiny
p1767-c1
B
Chiny
p3958-c1
B
Wschodnia Azja
p830-c1
B
Wyspy Towarzystwa
p3982-c1
B
Wietnam
p1786-c1
C
Chiny
p11549-1
C
Bangladesz
p3872-c1
D
Iran
p1103-c1
D
Tunezja
p3953-c2
D
Północna Afryka
p18-c1
D
Szwecja
p30893-5
D
Szwecja
p4244-c1
D
Dania
p3217-c1
E
Senegal
p3963-c2
E
Nigeria
p9203-c1
F
Kolumbia
Wenezuela
p479-c1
F
p1009-c1
F
Hiszpania
p00042975-4
G
Stany Zjednoczone
pIT1896
Przedrdzeniowy
Włochy
25
Doc Rev. 14.0
Średni Log
10
liczby kopii DNA HBV/PCR
(n=3)
Rysunek 9
Działanie testu COBAS® TaqMan® HBV w odniesieniu do
genotypów HBV od A do G oraz mutacji przedrdzeniowej
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
A
B
C
D
E
F
G
Plazmid
Próba
kontrolna
Mutacja przedrdzeniowa
E.
Swoistość kliniczna
Swoistość kliniczną testu COBAS® TaqMan® HBV określono na podstawie analizy HBV-ujemnych próbek surowicy
oraz osocza z dodatkiem EDTA, pobranych od krwiodawców. Zbadano ogółem 220 próbek (110 oddzielnych próbek
osocza z EDTA i 110 próbek surowicy), niereaktywnych w kierunku antygenu HBsAg i przeciwciał anty-HBc.
Wszystkie próbki wykazały ujemny wynik testu w kierunku DNA HBV. Na podstawie powyższych wyników
swoistość kliniczna testu COBAS® TaqMan® HBV wynosi 100%.
F.
Swoistość Analityczna
Swoistość analityczną testu COBAS® TaqMan® HBV oceniono, dodając hodowli wirusa do HBV-ujemnego osocza
ludzkiego z EDTA lub analizując próbki pobrane od zakażonych pacjentów (listę zamieszczono w Tabeli 6). Żaden
z wirusów zawierających DNA lub RNA innych niż wirus HBV nie wykazał dodatniego wyniku testu w kierunku
DNA HBV.
Tabela 6
Swoistość analityczna próbek
Wirus dodany do osocza
Próbki pochodzące od zakażonych pacjentów (n)
Adenowirus typ 7
Pacjenci zakażeni wirusem cytomegalii (2)
Cytomegalowirus AD-169
Pacjenci zakażeni wirusem Epsteina-Barra (2)
Wirus Epsteina-Barra (RAJI – komórki
chłoniaka Burkitta)
Pacjenci zakażeni wirusem zapalenia wątroby typu A (2)
Wirus zapalenia wątroby typu A PA 21
Pacjent zakażony wirusem zapalenia wątroby typu C
genotypu 4 (1)
Wirus opryszczki zwykłej typ 1, MacIntyre
Pacjent zakażony wirusem zapalenia wątroby typu C
genotypu 6a (1)
Wirus opryszczki zwykłej typ 2, MS
Pacjenci zakażeni wirusem HIV-1 (2)
Komórki HTLV-1
Wirus grypy typu A/Hong Kong/8/68
Wirus grypy typu B/R75
Varicella-Zoster Ellen
Wirus gorączki Zachodniego Nilu
04519337001-14PL
26
Doc Rev. 14.0
G.
Działanie w porównaniu z testem COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR
Działanie testów: COBAS® TaqMan® HBV i COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR porównano na podstawie
analizy próbek surowicy i osocza, pobranych od osób zakażonych wirusem HBV. Próbki otrzymano z firm: Teragenix
(Fort Lauderdale, FL) i Serologicals Corporation (Norcross, GA). Ogółem poddano dwukrotnej analizie przy użyciu
obydwu testów 65 próbek, porównując następnie uśrednione wyniki. Próbki wykazujące wyniki powyżej zakresu
liniowego przed analizą zostały rozcieńczone, zaś ich wyniki pomnożono przez współczynnik rozcieńczenia w celu
uzyskania wielkości miana oryginalnej próbki. Miana wyrażone w IU/ml, uzyskane przy pomocy testu COBAS®
TaqMan® HBV, przeliczono na kopie/ml poprzez pomnożenie przez współczynnik konwersji, wynoszący
5,82 kopii/IU DNA HBV. Próbki, które zawierały co najmniej 500 kopii/ml na podstawie badania z użyciem obu
testów, poddano liniowej analizie regresji. Wyniki uzyskane za pomocą testów COBAS® TaqMan® HBV i COBAS®
AMPLICOR® HBV MONITOR wykazały wysoki stopień korelacji, jak przedstawiono na Rysunku 10.
Rysunek 10
Korelacja wyników badania próbek osocza i surowicy za pomocą testu COBAS® TaqMan® HBV i testu
the COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR
u pacjentów zakażonych wirusem HBV
9,0
Średni Log 10 liczby kopii DNA HBV/ml
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit / COBAS®
TaqMan® HBV Test
10,0
y = 0,9327x + 0,4855
2
R = 0,977
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR Test
Średni Log10 liczby kopii DNA HBV/ml
04519337001-14PL
27
Doc Rev. 14.0
PIŚMIENNICTWO
1.
Lee. W. 1997. Hepatitis B Virus Infection. New England Journal of Medicine. 337:1733-1745.
2.
Beasley, R.P. 1988. Hepatitis B virus - the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer. 61:1942-1956.
3.
Wong, D.H.K., Cheung, A.M., Orourke, K., et al. 1993. Effect of alpha-interferon treatment in patients with
hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 119:312-323.
4.
Zuckerman, A.J. and Lavanchy, D. 1999. Treatment options for chronic hepatitis: antivirals look promising.
British Medical Journal. 319:799-800.
5.
McMahon, B.J. 1998. Chronic carriers of Hepatitis B Virus who clear hepatitis B surface antigen: Are they
really „off the hook”? Hepatology. 28:265-267.
6.
Huo, T., Wu, J., Lee, P., et al. 1998. Sero-clearance of hepatitis b surface antigen in chronic carriers does not
necessarily imply a good prognosis. Hepatology 28:231-236.
7.
Niederau, C., Heintges, T., Lange, S., et al. 1996. Long-term follow-up of HBeAg-positive patients treated
with interferon alfa for chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 334:1422-1427.
8.
Fattovich, G., Giustina, G., Realdi, G., et al. 1997. Long term outcome of hepatitis B e antigen-positive
patients with compensated cirrhosis treated with interferon alfa. Hepatology. 26:1338-1342.
9.
Brown, J.L., Carman, W.F. and Thomas, H.C. 1992. The clinical significance of molecular variation within
the hepatitis B virus genome. Hepatology. 15:144-148.
10.
Hoofnagle, J.H. 1990. Alfa-interferon therapy of chronic hepatitis B. Current status and recommendations.
Hepatology. 11:S100-S107.
11.
Krogsgaard, K., Kryger, P., Aldershvile, J., et al. 1985. Hepatitis B virus DNA in serum from patients with
acute hepatitis B. Hepatology. 5:10-13.
12.
Jardi, R., Buti, M., Rodriguez-Frias, F., et al. 1996. The value of quantitative detection of HBV-DNA amplified
by PCR in the study of hepatitis B infection. Journal of Hepatology. 24:680-685.
13.
Niitsuma, H., Ishii, M., Miura, M., et. al. 1997. Low-level hepatitis B viremia detected by polymerase chain
reaction accompanies the absence of HBe antigenemia and hepatitis in hepatitis B virus carriers. American
Journal of Gastroenterology. 92:119-123.
14.
Ranki, M., Schatzl, H.M., Zachoval, R., et al. 1995. Quantification of hepatitis B virus DNA over a wide
range from serum for studying viral replicative activity in response to treatment and in recurrent infection.
Hepatology. 21:1492-1499.
15.
Mason, A.L., Xu, L., Guo, L., et al. 1998. Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection in the liver
after clearance of serum hepatitis B surface antigen. Hepatology. 27:1736-1742.
16.
Saito, T., Shinzawa, H., Uchida, T., et al. 1999. Quantitative DNA analysis of low-level hepatitis B viremia
in two patients with serologically negative chronic hepatitis B. Journal of Medical Virology. 58:325-331.
17.
Brunetto, M.R., Oliveri, F., Rocca, G., et al. 1989. Natural course and response to interferon of chronic
hepatitis B accompanied by antibody to hepatitis B e antigen. Hepatology. 10:198-202.
18.
Saracco, G., Mazella, G., Rosina, F., et al. 1989. A controlled trial of human lymphoblastoid interferon in
chronic hepatitis B in Italy. Hepatology. 10:336-341.
19.
Perillo, R., Schiff, R., Davis, G., et al. 1990. A randomized controlled trial of interferon alpha-2b alone and
after prednisone withdrawal for the treatment of chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine.
323:295-301.
20.
Perez, V., Tanno, H., Villamil, F., et al. 1990. Recombinant interferon alfa-2b following prednisone withdrawal
in the treatment of chronic type B hepatitis. Hepatology. 11:S113-S117.
21.
Lai, C.-L., Ching, C.-K., Tung, S.K.-M., et al. 1997. Lamivudine is effective in suppressing Hepatitis B Virus
DNA in Chinese Hepatitis B surface antigen carriers: A placebo-controlled trial. Hepatology. 25:241-244.
22.
Nagata, I., Colucci, G., Gregorio, G.V., et al. 1999. The role of HBV DNA quantitative PCR in monitoring
the response to interferon treatment in chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology. 30:965-969.
23.
Hadziyannis, S.J., Manesis, E.K. and Papakonstantinou, A. 1999. Oral ganciclovir treatment in chronic
hepatitis B virus infection: a pilot study. Journal of Hepatology. 31:210-214.
24.
Marcellin, P., Chang, T.-T., Lim, S.G., et al. 2003. Adefovir dipivoxil for the treatment of Hepatitis B e
antigen-positive chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 348:808-816.
04519337001-14PL
28
Doc Rev. 14.0
25.
Puchhammer-Stöckl, E., Mandl, C.W., Kletzmayr, J., et al. 2000. Monitoring the virus load can predict the
emergence of drug-resistant hepatitis B virus strains in renal transplant patients during lamivudine therapy.
Journal of Infectious Diseases. 181:2063-2066.
26.
Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over
contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
27.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of
specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413-417.
28.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K. and Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Research
6:986-994.
29.
Saldanha, J., Gerlich, W., Lelie, N., Dawson, P., Heermann, K., Heath, A. and the WHO Collaborative Study
Group. 2001. An international collaborative study to establish a World Health Organization international
standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques. Vox Sanguinis 80:63-71.
30.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories.
HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
31.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally
Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005.
32.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
33.
CLSI. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guidelines. CLSI
Document EP5-A Wayne, PA: CLSI, 1999.
34.
Okamoto, H., Tsuda, F., Sakugawa, H., Sastrosowignjo, R.I., Imai, M., Miyakawa, Y. and Mayumi, M. 1988.
Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes. Journal
of General Virology 69:2575-2583.
35.
Norder, H., Hammas, B., Löfdahl, S., Couroucé, A.M. and Magnius, L.O. 1992. Comparison of the amino
acid sequences of hepatitis B surface antigen and genomic classification of the corresponding hepatitis B virus
strains. Journal of General Virology 73:1201-1208.
36.
Norder, H., Hammas, B., Lee, S.-D., Bile, K., Couroucé, A.M., Mushahwar, I.K. and Magnius, L.O. 1993.
Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the
primary structure of the surface antigen. Journal of General Virology 74:1341-1348.
04519337001-14PL
29
Doc Rev. 14.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 13.0
06/2015
Zaktualizowano wersje oprogramowania AMPLILINK, tytuły podręczników, terminologię
i wersję systemu operacyjnego.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy
Roche.
Doc Rev. 14.0
12/2015
Zaktualizowano rozdział POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE
PRÓBEK, usuwając niedokładne informacje dotyczące probówek do pobierania krwi.
Zaktualizowano opisy na stronie z ujednoliconymi symbolami, znajdującej się na końcu ulotki
dołączonej do opakowania.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy
Roche.
04519337001-14PL
30
Doc Rev. 14.0
"
Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Kit wyprodukowano dla:
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Test COBAS® TaqMan® HBV wyprodukowano dla:
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Distributed by
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
68305 Mannheim, Germany
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877-273-3433)
Znaki towarowe i patenty
Patrz http://www.roche-diagnostics.us/patents
©2015 Roche Molecular Systems, Inc.
12/2015
(03584933001-16ENGL)
Doc Rev. 14.0
04519337001-14PL
04519337001-14
31
Doc Rev. 14.0
Na etykietach produktów diagnostycznych Roche PCR stosuje się obecnie
następujące oznaczenia.
Oprogramowanie pomocnicze
Wyrób do diagnostyki in vitro
Autoryzowany Przedstawiciel we
Wspólnocie Europejskiej
Dolna granica przypisanego zakresu
Arkusz kodów kreskowych
Wytwórca
Kod partii
Przechowywać z dala od światła
Zagrożenie biologiczne
Zawartość wystarczająca na
<n> testów
Numer katalogowy
Przestrzegać zakresu temperatury
Sprawdź w instrukcji obsługi
Plik definicji testów
Zawartość zestawu
Górna granica przypisanego zakresu
Dystrybucja przez
Termin ważności
Wyłącznie do oceny działania
w badaniach IVD
Numer pozycji handlu globalnego
Ten produkt spełnia wymogi dyrektywy Wspólnoty Europejskiej 98/79/WE
dotyczącej diagnostycznych urządzeń medycznych do stosowania in vitro.
Linia pomocy technicznej dla klientów w Stanach Zjednoczonych 1-800-526-1247
04519337001-14PL
32
Doc Rev. 14.0

cobas DPX Test PI

Transkrypt

Podobne dokumenty

Prace Polskiej Grupy Ekspertów HBV

Odcinek 42. Wirusowe zapalenie wątroby typu B – część I

Działalność Polskiej Grupy Ekspertów HBV

informacja dot programu wzw

HBV/HCV - h-cube project