metody wykrywania zjawiska apoptozy w

Nowiny Lekarskie 2008, 77, 3, 223–226
MARCIN CHMIELEWSKI1, KRZYSZTOF LINKE1, MACIEJ ZABEL2
METODY WYKRYWANIA ZJAWISKA APOPTOZY
W KOMÓRKACH WĄTROBOWYCH IN SITU
METHODS OF APOPTOSIS DETECTION IN HEPATOCYTES IN SITU
1
Katedra i Klinika Gastroenterologii, Żywienia Człowieka i Chorób Wewnętrznych
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik: prof. dr hab. Krzysztof Linke
2
Katedra Histologii i Embriologii
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik: prof. dr hab. Maciej Zabel
Streszczenie
Wykrywanie apoptozy w komórkach i tkankach staje się coraz częstszym zjawiskiem badawczym nowoczesnej biologii, włączając w to badania
rozwoju embriologicznego, chorób i biologii nowotworzenia. Metody histochemiczne – ostatnio często stosowane na skrawkach tkankowych –
wykorzystują właściwości umierającej komórki. Właściwości te w procesie apoptozy są mniej lub bardziej specyficzne, stąd też ich interpretacja
i użyteczność bywa dyskusyjna i niejednoznaczna. Założyliśmy, że apoptoza istnieje w wątrobie, w której toczą się procesy patologiczne.
W związku z tym użyliśmy metody TUNEL i przeciwciał przeciw aktywnej postaci kaspazy-3-ej, aby udowodnić istnienie programowanej
śmierci komórkowej.
SŁOWA KLUCZOWE: apoptoza, wątroba.
Summary
Detection of apoptotic cell death in cells and tissues has become of paramount importance in many fields of modern biology, including studies
of embryonic development, degenerative disease and cancer biology. Histochemical methods have recently been extensively used in tissues.
Most of these methods exploit properties of dying cells that are more or less specific for apoptotic process. However, considerable confusion
exists over the interpretation of some these methods and their usefullness in all settings. We have taken into account apoptosis that exists in liver
during pathological changes. That is why both methods TUNEL and antibody anti-caspase-3 have been used to prove apoptosis.
KEY WORDS: apoptosis, liver.
Badania nad śmiercią komórki przeżywają w ostatnich latach ogromny rozwój. Jest to spowodowane m.in.
chęcią poznania procesów rządzących w organizmie
ludzkim. Programowana śmierć komórki przebiega według ściśle zaplanowanych mechanizmów. Wydaje się
uczestniczyć w wielu procesach patologicznych i dlatego
jej wykrycie stanowiłoby podstawę do dalszych rozważań medycznych, jak również biologicznych. Chęć obserwacji zjawiska apoptozy spowodowała rozwój badań
nad metodyką oceny śmierci komórkowej m.in. w preparatach tkankowych. Obecnie metody te są szeroko stosowane w badaniach szeregu patologii, fizjologii i embriologii [1], choć ich interpretacja opiera się na spekulacyjnych uzgodnieniach grona badaczy.
ZJAWISKO APOPTOZY
Apoptoza jest programowaną śmiercią komórki
i różni się od martwicy. Komórka ulega zmianom morfologicznym dobrze widocznym w mikroskopie elektronowym, a przy odpowiednim doświadczeniu można
dostrzec ją również w mikroskopie świetlnym. Do zmian
tych w pierwszej fazie zalicza się: obwodowe ułożenie
chromatyny jądrowej i jej kondensacja, rozpad jąderka
[2], zagęszczenie cytoplazmy, przerwanie połączeń mię-
dzykomórkowych. W drugiej zaś dochodzi do fragmentacji jądra i cytoplazmy komórki na tzw. ciałka apoptotyczne. Natomiast w trzeciej fazie dochodzi do degeneracji wszystkich struktur komórkowych. Ciałka apoptotyczne zazwyczaj są fagocytowane, bądź przez komórki sąsiednie, bądź przez makrofagi. Proces ten przebiega
zwykle bez reakcji zapalnej i trwa krótko (od kilku minut do kilkunastu godzin) [3]. Mechanizmy rządzące
przemianami komórkowymi są ściśle powiązane ze szlakami enzymatycznymi.
Dziś wiemy, że proces apoptozy jest skomplikowany, a reakcje enzymatyczne ściśle ze sobą skoordynowane. Skuteczna inicjacja programowanej śmierci komórkowej przez czynniki zewnętrzne i/lub wewnętrzne
doprowadza w efekcie końcowym do ostatecznych etapów apoptozy. Jest to faza, którą można podzielić na
trzy stadia: uwolnienia, uwypuklenia i kondensacji.
Stadium uwolnienia polega na przerwaniu połączeń
z komórkami sąsiadującymi. Doprowadza to do przybrania
przez komórkę kształtu najbardziej energooszczędnego,
a więc kulistego. Wzbudzona nukleaza CAD (Caspase
Acivated DNA-se) dokonuje cięcia DNA na odcinki 180
par zasad [4]. Fragmenty te ulegają dalszemu strawieniu
przez enzymy lizosomalne makrofagów tak, aby nie do-
224
Marcin Chmielewski i inni
prowadzić do wzbudzenia choroby autoimmunologicznej
przez pozostałości jądrowe.
W stadium uwypuklenia następuje seria skurczów
włókien aktynowych oddziaływujących z miozyną, co
doprowadza do uwypuklania się błony komórkowej.
W stadium kondensacji tworzą się ostatecznie ciałka
apoptotyczne [5].
Egzekucja apoptozy jest więc o tyle ważna metodologicznie, że jedynie w tym czasie jesteśmy pewni, że
komórka ulega programowanej śmierci. Wydaje się to
więc jasnym, że większość metod badawczych skupia się
na tej właśnie fazie.
METODA OPARTA NA ZASTOSOWANIU PRZECIWCIAŁ PRZECIW AKTYWNEJ POSTACI KASPAZY-3-CIEJ
Wiadomo, że w ostatnim etapie apoptozy następuje
wzbudzenie kaskady kaspaz. Do tej pory odkryto ich 14,
ale chyba najważniejszą z nich jest kaspaza-3. Ona to
bowiem uaktywnia bezpośrednio DFF (DNA Fragmentation Factor) doprowadzając do trawienia DNA. Rozkłada
PARP (Poly ADP-Ribose Polymarse) inaktywując możliwość naprawy uszkodzonego genomu. Jest końcowym
etapem przemian kaspaz i w związku z tym stanowi
prosty i właściwy punkt wykrywania apoptozy. Do jej
wykrywania używa się przeciwciał monoklonalnych
skierowanych selektywnie przeciwko wybranemu epitopowi antygenowemu aktywnej kaspazy-3. Wydaje się to
ważnym, ponieważ kaspaza-3 występuje w komórkach
niezmienionych apoptotycznie w formie prokaspazy.
Gdybyśmy więc dysponowali przeciwciałami nieselektywnymi tzn. takimi, które znakują zarówno kaspazę-3
i prokaspazę-3 znakowalibyśmy wszystkie niemal komórki. Doszłoby wtedy do zafałszowania wyników, a co
istotniejsze – do mylnego odczytu programowanej śmierci
komórkowej.
Bantel i wsp. uważają, że uszkodzenie wątroby w
przebiegu zakażenia wirusem C następuje głównie przez
indukcję apoptozy. Opierają się na badaniach immunohistochemicznych i Western-blot aktywacji kaskady kaspaz,
w tym przede wszystkim ksapazy-3-ciej. Autorzy wykazują, że kaspazy w przewlekłym zapaleniu wątroby na
podłożu wirusa C są aktywowane w znacznej ilości [6].
Aktywna postać kaspazy-3-ciej winna być znakowana głównie w cytoplazmie komórek zmienionych apoptotycznie z uwagi na jej duże stężenie w tej przestrzeni.
Logicznym jest fakt, że niekiedy jest ona obserwowana
również w jądrze komórkowym, ponieważ jest to enzym
uaktywniający bezpośrednio endonukleazy jądrowe.
Mamy więc do czynienia z dwoma, a nawet trzema obrazami histologicznymi: homogenne zabarwienie bądź
cytoplazmy, bądź jądra lub też obu struktur.
Prawdopodobnie użycie przeciwciał poliklonalnych
przeciw aktywnej kaspazie-3-ciej w badaniach immunocytochemicznych apoptozy komórkowej byłoby precyzyjniejsze ze względu na to, że jest to mieszanina przeciwciał skierowanych przeciw różnym epitopom jednego
białka. Wybarwianie takich przeciwciał głównych było-
by intensywniejsze, jak również bardziej obiektywne.
Mieszanina reakcyjna przeciwciał poliklonalnych łączyłaby się z wieloma miejscami białka stanowiącego właściwy antygen. Znakowanie takie byłoby pewniejsze,
a efekt tła w preparatach histologicznych uległby redukcji. Tym samym prawdopodobieństwo znakowania innych białek byłoby minimalne albo wręcz niemożliwe.
W doświadczeniach własnych na hepatocytach, stosując
przeciwciała przeciw aktywnej kaspazie-3-ciej uwidoczniliśmy pojedyncze komórki, które weszły w przemiany programowanej śmierci komórkowej. Doświadczenia swe
opieramy na schorzeniach przewlekłych, gdzie dynamika
zmian apoptotycznych w tych patologiach jest niewielka,
a niejednokrotnie żadna. Można więc wstępnie powiedzieć,
że indeks apoptotyczny nie ma istotności statystycznej
w porównaniu ze zdrową wątrobą. Zastosowaliśmy metodę
immunocytochemii [7] na skrawkach parafinowych uwidaczniając aktywną kaspazę-3 za pomocą barwnej reakcji
DAB (DiAminoBenzydyna) (Ryc. 1.).
Przyłączenie swoistego
przeciwciała
Przyłączenie przeciwciała
biotynylowanego
Antygen w skrawku
Przyłączenie DAB
I reakcja z peroksydazą
Antygen w skrawku
Przyłączenie kompleksu
streptawidyna-biotynylowana
peroksydaza
Biotynylowana
peroksydaza
Streptawidyna
Swoiste
przeciwciało
Przeciwciało
biotynylowane
DAB (3,3’ DiAminoBenzydyna)
Ryc. 1. Schemat reakcji immunohistochemicznej.
Fig. 1. Immunohistochemical reaction scheme.
W metodzie tej stosuje się H2O2 hamując aktywność
endogennej peroksydazy, nakłada przeciwciała blokujące (korzystaliśmy z normalnych przeciwciał kozich
w rozcieńczeniu 1:20), aby doprowadzić do zlikwidowania miejsc niespecyficznie wiążących. Doprowadzaliśmy
do wiązania przeciwciał biotynylowanych z przeciwciałami głównymi, a następnie nakładaliśmy kompleks
streptawidyna-biotynylowana peroksydaza oraz DAB,
aby uzyskać reakcję barwną. Otrzymane przez nas preparaty miały barwę brązową w miejscach dużego wychwytu znacznika DAB w komórkach wątrobowych.
Pozostałe traktowaliśmy hematoksyliną w celu wybarwienia jąder komórkowych i ustanowienia tła całości
bioptatów wątrobowych.
Biopunktaty wątroby pobierane były standardowo
igłą Manghiniego 1,6 mm, a wycinki miały przeciętnie
2–3 cm długości. Ilość ta stanowi około 1/50 tys. masy
wątroby. Biopsja wykonywana była ściśle według norm
gastroenterologicznych ustanowionych przez AGA
(American Gastroenterology Association).
Wybiórczo zastosowaliśmy eksperymentalnie metodę ImmunoMax opierającą się na zastosowaniu tyrami-
225
Metody wykrywania zjawiska apoptozy w komórkach wątrobowych in situ
ny, która miała wspomóc reakcję barwną. Jednak ze
względu na dobre wyniki metod standardowych (praktycznie nie odbiegających od metody ImmunoMax),
zaniechaliśmy dalszego wykorzystywania tej rozszerzonej metody immunocytochemicznej. (Nota bene stosuje
się ją głównie w sytuacjach słabych reakcji barwnych,
gdy antygenu jest mało).
Zastosowaliśmy barwienie DAB na skrawkach mrożeniowych utrwalanych w formaldehydzie i w roztworze
aceton-alkohol w stosunku 1:1. Niestety, nie uzyskaliśmy
żadnej reakcji barwnej, co sugeruje, że zastosowanie
skrawków mrożeniowych dla tej metody nie ma uzasadnienia naukowego i jest praktycznie bezużyteczne.
Ze względu na krótki okres doświadczeń z przeciwciałami przeciw kaspazie-3-ej i jej niejasnym obrazem
morfologicznym w mikroskopie świetlnym, ustanowiliśmy kontrolę na skrawkach parafinowych sztucznie
wzbudzanych procesów apoptozy. Były to preparaty
jelita grubego, na których zauważyliśmy homogenne
wybarwianie cytoplazmy przeciwciałami typu antykaspaza-3 (Ryc. 2.).
Nie można zapomnieć o fakcie, że proces apoptozy
przebiega szybko, precyzyjnie i bez reakcji zapalnej.
W związku z tym jest słabo obserwowalny, a może być
w ogóle niezauważony, gdy nie stosuje się metod specyficznych. Uchwycenie apoptozy na poziomie kaskady
kaspaz jest prawie niemożliwe, a jednak w pojedynczych
przypadkach obserwowalne. Zjawisko kaskady kaspaz
jest łańcuchem zdarzeń, który przebiega szybko, bo
w zakresie kilkunastu minut do paru godzin.
METODA OPARTA NA ZASTOSOWANIU
TUNEL
Chyba najlepiej poznaną i przebadaną metodą wykrywania zjawiska apoptozy jest metoda TUNEL (Tdtmediated deoxyUridine triphosphate-biotin/digoxigenin
Nick End-Labeling) [8]. Opiera się ona na najistotniejszej cesze apoptozy, którą jest fragmentacja DNA na
stałe odcinki 180 par zasad. Tak małe fragmenty zawierają wolne końce 3’-OH i właśnie one są odpowiedzialne
za przyłączenie znakowanych nukleotydów. Reakcja
katalizowana jest przy udziale nukleotydylotransferazy
(TdT –Termainal deoxynucleotidyl Transferase), a nukleotydy znakowane są digoksygeniną (digoksynadUTP) (Ryc. 3.).
DNA
Rozcięcie DNA na odcinki
200-300 par zasad
TdT dołącza digoksyna-dUTP
Przeciwciała znakowane peroksydazą
wykrywają digoksygeninę
Wybarwienie za pomocą DAB
Ryc. 3. Schemat metody TUNEL.
Fig. 3. TUNEL method scheme.
Ryc. 2. Metoda z zastosowaniem przeciwciał antykaspaza-3.
Fig. 2. Anticaspase-3 staining method.
Zgodność obrazów kontrolnych na jelicie grubym
i badanych skrawków wątrobowych stanowiła podstawę
do orzekania o apoptozie komórkowej.
Niestety, przeciwciała monoklonalne przeciw kaspazie-3-ciej w naszych doświadczeniach doprowadziły do
wybarwiania białek cytoplazmatycznych o nieznanym
pochodzeniu. Prowadziło to do zamazania obrazu mikroskopowego, jednak dobrze odróżnialnego w większych
powiększeniach od właściwych zmian apoptotycznych.
Otrzymywane obrazy, fałszywie wybarwiane, miały
charakter ziarnistości komórkowych, a nie homogennej
masy cytoplazmatycznej komórek zmienionych apoptotycznie i znamiennie się odróżniały.
W doświadczeniach własnych stosowaliśmy metodę
TUNEL na skrawkach mrożeniowych wątroby, utrwalanych w roztworach acetonu z alkoholem w stosunku 1:1.
Stosowaliśmy roztwór enzymu w buforze zawierającym
znakowane nukleotydy. Dodawaliśmy przeciwciała znakowane peroksydazą przeciwko digoksygeninie, a następnie
wykrywaliśmy je za pomocą substratu DAB uzyskując
brązową barwę jąder zmienionych apoptotycznie. Dzieje się
to dlatego, że głównie w tych jądrach jest wystarczająco
duże stężenie fragmentów z wolnym końcem 3’-OH DNA.
Pozostałe jądra hepatocytów w skrawkach in situ wybarwialiśmy przy pomocy hematoksyliny, która jest roztworem
zasadowym łatwo łączącym się z kwasami jądrowymi
(Ryc. 4.).
226
Marcin Chmielewski i inni
zastosowanie kilku starannie dobranych metod stanowi
podstawę orzekania o zachodzących zjawiskach apoptozy. Co wydaje się być najbardziej zaskakujące to to, że
te najstarsze metody są często najlepsze i najbardziej
specyficzne. Zwykła ocena zmian morfologii jądra komórkowego, całości komórki w mikroskopie daje nam
niepodważalną podstawę o zachodzących zjawiskach
programowanej śmierci komórkowej. Wydaje się więc,
że połączenie oceny morfologicznej z nowoczesnymi
technikami histochemicznymi i metodą TUNEL prowadzi do najbardziej obiektywnych interpretacji zmian
zachodzących w tych komórkach.
Ocena apoptozy winna przebiegać z dużą ostrożnością, a pewność interpretatorów powinna być obarczona
dużą dozą sceptycyzmu. Powtarzanie starych prawd o za
chodzących zjawiskach, w szczególności przez teoretyków, budzi kontrowersje.
Piśmiennictwo
Ryc. 4. Barwienie jądra za pomocą metody TUNEL.
Fig. 4. TUNEL staining of cell nucleus.
Powszechnie znany jest fakt, że metoda ta ma swoich
zwolenników, jak również i przeciwników. Tłumaczy się
to tym, że w jądrach zmienionych martwiczo występują
fragmenty DNA 180 par zasad z wolnym końcem
3’-OH. Dzieje się to wówczas, gdy materiał jądrowy
martwiczo zmienionej komórki ulega cięciu przez uaktywnione nukleazy [9]. Cięcie to jednakże jest chaotyczne i nieskoordynowane, co doprowadza do występowania odcinków 3’-OH, ale stanowczo w mniejszym
stężeniu. Sam obraz morfologii komórkowej przemawia
za zmianami martwiczymi, ponieważ jądro komórkowe
jest duże, chromatyna ulega rozmyciu, a błona jądrowa
w wielu miejscach jest przerwana. Jądra hepatocytów
zmienionych pod wpływem programowanej śmierci
komórkowej są małe, ze skondensowaną obwodowo
chromatyną, a w etapie końcowym ulegają podziałowi
i fagocytozie.
Obserwując, więc preparaty in situ winniśmy oceniać
oprócz zabarwienia również jego natężenie, rozmieszczenie jądrowe i kształt morfologiczny komórki. W wielu przypadkach może bowiem dojść do zafałszowania
wyników. Do podobnej konkluzji doszli Negoescu i wsp.,
którzy badając zachowanie komórek hodowlanych w
różnych utrwalaczach wykazali różniące się wyniki [10].
Co prawda zmiana kształtu komórki stanowi jeden z końcowych etapów apoptozy, ale wówczas, gdy ona współistnieje łącznie z jedną z metod immunohistochemicznych
prawdopodobieństwo stwierdzenia zjawiska apoptozy jest
większe.
WNIOSKI
Choć metody wykrywania apoptozy są stale modyfikowane, a ich odkrywanie jakoby nie miało końca, dziś
możemy powiedzieć, że pojedyncze testy nie zapewniają
nam maksymalnej specyficzności i czułości. Dopiero
1. Willingham M.C.: Cytochemical methods for the detection
of apoptosis. J. Histochem. Cytochem., 1999, 47(9), 1101-09.
2. Wyllie A.H., Kerr J.F.R., Currie A.R.: Cell death: the
significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol., 1980, 68, 251-306.
3. Bursch W., Taper H.S., Lauer B. et al.: Determination
of length of the histological stages of apoptosis in normal
liver and in altered hepatic foci of rats. Carcinogenesis, 1990,
11, 847-53.
4. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H. et al.: A caspaseactivated Dnase that degrades DNA during apoptosis and its
inhibitor ICAD. Nature, 1998, 391, 43-50.
5. Wójcik C.: Seminaria z cytofizjologii. Apoptoza. Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner, 2002, 4,88-101.
6. Bantel H., Lugering A., Poremba C. et al.: Caspase activation
correlates with the degree of inflammatory liver injury in
chronic hepatitis C virus infection. Hepatology, 2001, 34,
758-767.
7. Zabel M.: Immunocytochemia. Wydawnictwo Naukowe
PWN, 1999, 6, 135-157.
8. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A.: Identification
of programmed cell death in situ via specific labeling
of nuclear DNA fragmentation. J. Cell. Biol., 1992, 119,
493-501.
9. Kerr J.F.R., Harmon B.V.: Definition an incidence of apoptosis: an historical perspective. In apoptosis In: the molecular basis of cell death (Tornet L.D., Cope F.O., eds), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1992, 5-29.
10. Negoescu A., Lorimier P., Labat-Moleur F. et al.: TUNEL:
Improvement and evaluation of the method for in situ
apoptotic cell identification. Biochemica, 1997, 2, 12-17.
Adres do korespondencji:
Dr n. med. Marcin Chmielewski
Katedra i Klinika Gastroenterologii, Żywienia Człowieka
i Chorób Wewnętrznych UM w Poznaniu
ul. Przybyszewskiego 49
60-355 Poznań
tel. 061 8691343, fax. 061 8691686
e-mail: [email protected]