Część II

Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
MATERIAŁY POMOCNICZE
DO WYKŁADÓW Z PODSTAW BIOFIZYKI
IIIr. Biotechnologii
prof. dr hab. inż. Jan Mazerski
WYZNACZANIE MAS CZĄSTECZKOWYCH BIOPOLIMERÓW
Określenie masy cząsteczkowej było zawsze jednym z podstawowych zagadnień przy
charakteryzowaniu biopolimerów. Przy poszukiwaniu metod rozwiązania tego zagadnienia
napotykano wiele różnorakich przeszkód. Podstawową była sama masa cząsteczkowa, która dla
typowych białek zawiera się w przedziale od kilkunastu do kilkuset tysięcy daltonów. Żadna z
technik stosowanych przy oznaczaniu masy cząsteczkowej związków chemicznych nie może być
stosowana dla tak dużych cząsteczek. Rozpoczęto więc na przełomie XIX i XX w. poszukiwanie
specjalnych technik pozwalających na choćby przybliżone oszacowanie masy cząsteczkowej
biopolimerów.
Metody sedymentacyjne
Pierwsze próby dotyczyły zastosowania metod sedymentacyjnych opierających się na
wykorzystaniu różnic w gęstości rozpuszczalnika i biopolimeru.
Sedymentacja zawiesin makroskopowych
Podczas sedymentacji zawiesin makroskopowych w polu grawitacyjnym obserwujemy
charakterystyczny przebieg zjawiska: bezpośrednio po zakończeniu mieszania cząstki zawieszone
są w całej objętości - ich stężenie jest jednakowe w każdym naczynia.
upływ czasu
Po pewnym czasie, na skutek opadania cząstek zawiesiny górna część płynu nie zawiera zawiesiny,
a na dnie pojawia się osad. Pomiędzy zawiesiną i czystym płynem występuje ostra granica.
W miarę upływu czasu granica ta przesuwa się ku dołowi. Rośnie również grubość osadu na dnie.
Na szybkość sedymentacji ma wpływ:
•
różnica gęstości pomiędzy cząstkami zawiesiny a cieczą
•
lepkość płynu decydująca o tarciu pomiędzy cząstkami zawiesiny a płynem.
1
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
Zjawisko opadania makroskopowych cząstek zawiesiny można znacznie przyspieszyć umieszczając
roztwór w wirówce. Pojawiająca się podczas wirowania siła odśrodkowa może mieć wielokrotnie
większa wartość niż siła ciężkości.
Sedymentacja makrocząsteczek
W przypadku zawiesiny makrocząsteczek biologicznych różnica gęstości pomiędzy silnie
hydratowanym biopolimerem a roztworem wodnym jest tak mała, że w polu grawitacyjnym nie
obserwujemy zjawiska sedymentacji. Dochodzi do tego jeszcze efekt dyfuzji: aby pojawiła się
sedymentacja siłą działająca na cząsteczkę (ciężar lub siła odśrodkowa) musi przewyższać
przeciwnie skierowana siłę dyfuzji wynikającą z ruchów termicznych. Dopiero gdy poddamy
próbkę działaniu sił odśrodkowych setki lub tysiące razy większych niż siła grawitacyjna pojawia
się zjawisko sedymentacji. Uzyskanie dostatecznie dużych sił odśrodkowych wymaga zastosowania
wirówek o specjalnej konstrukcji, tzw. ultrawirówek. Współczesne ultrawirówki umożliwiają
uzyskanie sił odśrodkowych nawet 500 000 razy przekraczających siłę grawitacji.
W polu sił odśrodkowych makrocząsteczki mogą ulegać sedymentacji lub przeciwnie
skierowanej flotacji. Jeżeli gęstość makrocząsteczek jest większa od gęstości rozpuszczalnika, to
biopolimer sedymentuje. Biopolimery o gęstości mniejszej od gęstości rozpuszczalnika, np. lipidy,
ulegają flotacji, czyli kierują się w stronę menisku
Technika
ultrawirowania
znajduje
obecnie
szerokie
zastosowanie
w
badaniu
makrocząsteczek. Umożliwia ona m.in. wyznaczenie bezwzględnych mas cząsteczkowych
biopolimerów. Poza zastosowaniami analitycznymi ma też wielkie zastosowanie przy rozdzielaniu
organelli komórkowych, białek, kwasów nukleinowych, lipoprotein i lipopolisacharydów.
Podstawy teoretyczne
Podczas wirowania na cząsteczkę biopolimeru w roztworze działają 3 siły:
siła odśrodkowa F
[1]
F = mω2 r = ma = Vρa
gdzie: m – masa cząsteczki
W
T
F
ω - prędkość kątowa rotora
r – odległość od osi obrotu
a - przyspieszenie odśrodkowe
V – objętość cząsteczki
ρ - gęstość cząsteczki
2
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
przeciwnie skierowana siła wyporu W
[2]
W = Vρs ω2 r = Vρs a = m
ρs
a
ρ
gdzie: ρs - gęstość cieczy
tarcie dynamiczne T zależne od szybkości ruchu cząsteczki
[3]
T=f
dr
dt
gdzie: f – współczynnik tarcia
Przyjmując sferyczny kształt cząsteczki oraz laminarny przepływ cieczy można zastosować wzór
Stokesa:
[4]
T = 6πηd
dr
dt
gdzie: d - promień makrocząsteczki
η - lepkość cieczy
W roztworze szybko dochodzi do ustalenia się stanu równowagi, w którym siła tarcia równoważy
siłę odśrodkową pomniejszoną o siłę wyporu i cząsteczka porusza się ruchem jednostajnym.
Warunek równowagi ma zatem postać:
[5]
F − W = V(ρ − ρs )ω2 r = 6πηd
dr
dt
Można go przekształcić do postaci:
[6]
⎛ ρ
Vρ⎜⎜1 − s
ρ
⎝
⎞
1 dr
⎟⎟ = 6πηd 2
.
ω r dt
⎠
Wielkością charakteryzującą ruch danej cząsteczki w danym rozpuszczalniku jest stała
sedymentacji S:
[7]
S=
1 dr
.
ω2 r dt
Jest ona równa przyrostowi prędkości sedymentacji cząsteczki w wyniku jednostkowego przyrostu
przyspieszenia odśrodkowego. Jednostką stałej sedymentacji jest 1 S (swedberg) = 10-13 s.
Korzystając ze współczynnika sedymentacji można wzór[6] zapisać w postaci:
[8]
⎛ ρ
Vρ⎜⎜1 − s
ρ
⎝
⎞
⎟⎟ = 6πηdS .
⎠
Masę pojedynczej cząsteczki biopolimeru, m, można wyrazić wzorem:
[9]
m = Vρ =
M
NA
3
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
gdzie: M - masa cząsteczkowa w gramach
NA - liczba Avogadro.
Podstawiając powyższą zależność do wzoru [6] i mnożąc obustronnie przez NA otrzymujemy:
[10]
⎛ ρ
M⎜⎜1 − s
ρ
⎝
⎞
⎟⎟ = 6πηdsN A
⎠
Ze wzoru tego można wyznaczyć masę cząsteczkową makrocząsteczki znając stałą sedymentacji s:
[11]
M=
6πηdsN A
⎛ ρs ⎞
⎜⎜1 − ⎟⎟
ρ⎠
⎝
Powróćmy jeszcze do równania [5]. Można je tak przekształcić, aby uzyskać wzór na szybkość
ruchu cząsteczek:
[12]
dr V(ρ − ρs )a
=
dt
6πηd
Uwzględniając sferyczny kształt cząsteczki można wyrazić objętość jako funkcję średnicy:
V = πd3/6. Prowadzi to do zmodyfikowanej postaci wzoru [12]:
[12a]
dr d 2 (ρ − ρs )a
=
dt
36η
Tak więc przy danym przyspieszeniu odśrodkowym, a, szybkość ruchu sferycznej cząsteczki
biopolimeru jest wprost proporcjonalna do kwadratu promienia i różnicy gęstości cząsteczki i
rozpuszczalnika oraz odwrotnie proporcjonalna do lepkości roztworu.
Cząsteczki niektórych biopolimerów istotnie odbiegają od kształtu sferycznego. W takiej sytuacji
wzór [12] przyjmuje postać:
[12b]
d 2 (ρ − ρs )a
dr
=k
36η
dt
gdzie: k - współczynnik kształtu.
Dla cząsteczek o kształcie dysku wartość k jest większa od 1, a dla cząsteczek o kształcie pręta lub
cygara mniejsza od 1.
Wirówki i ultrawirówki
Wirówki można umownie podzielić ze względu na uzyskiwaną liczbę obrotów na:
niskoobrotowe - do 5 000 obr/min,
średnioobrotowe - do 20 000 obr/min,
ultrawirówki - powyżej 20 000 obr/min.
4
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
Natomiast ze względu na przeznaczenie, wirówki można podzielić na:
analityczne; zwykle mają bardzo dużą liczbę obrotów i wyposażone są w układ do analizy
przemieszczania się cząsteczek podczas wirowania;
preparatywne; przystosowane do wirowania względnie dużych objętości roztworów;
specjalnego przeznaczenia; np. wirówki hematokrytowe.
Ponieważ jednym z ważnych parametrów podczas wirowania jest temperatura roztworu, więc
wirówki i ultrawirówki wyposażone są w układy termostatujące umożliwiają kontrolę temperatury
nawet z dokładnością do 0,1 stopnia. W ultrawirówkach i wirówkach średnioobrotowych rotor jest
ponadto umieszczony w komorze próżniowej, aby wyeliminowań nagrzewanie się rotora od tarcia o
powietrze. Jeżeli wirowanie odbywa się w próżni próbki muszą być hermetycznie zamknięte. W
zależności od budowy rotora hermetyzacja może dotyczyć całego jego wnętrza lub pojedynczych
próbek.
Rodzaje rotorów
Rotor wirówki to odpowiedni blok lub konstrukcja przymocowana do osi wirówki, w której
umieszcza się probówki wirownicze. Podstawowe typy rotorów to:
rotor horyzontalny (pojemniki na probówki są uchylne)
rotor kątowy
rotor analityczny
W przypadku rotora horyzontalnego, Rys.1A, gilzy probówek wirówkowych są zawieszone
na osiach prostopadłych do osi rotora i podczas wirowania ustawiają się wraz z probówkami pod
kątem 90° do osi obrotu. Podczas wirowania cząstki poruszają się w polu siły odśrodkowej wzdłuż
promienia obrotu w kierunku dna probówki. W miarę oddalania się od menisku działa na nie coraz
większa siła odśrodkowa
Rotor kątowy wykonany jest z jednolitego bloku metalu w którym znajdują się gniazda do
umieszczenia probówek wirówkowych. Jeżeli wirowanie odbywa się w próżni, to rotor zamykany
jest hermetyczną pokrywę. W rotorze kątowym, Rys.1B, probówki wirówkowe nie zmieniają
swego położenia i ustawione są w stosunku do osi obrotu pod kątem α innym niż 90°, najczęściej
30°, 45° lub 60°. Cząsteczki poruszają się prostopadle do osi obrotu i osadzają się na bocznej
ścianie probówki. W rotorze tego typu różnice w odległościach cząsteczek od osi obrotu są
znacznie mniejsze niż w rotorze horyzontalnym, więc i różnice w sile odśrodkowej w różnych
miejscach probówki są mniejsze.
5
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
S
S
A)
B)
α
C)
Rys.1. Schemat budowy rotorów stosowanych w wirówkach laboratoryjnych i ultrawirówkach: A) rotor
horyzontalny (po lewej w spoczynku, po prawej w czasie wirowania), B) rotor kątowy, C) rotor
analityczny
Rotor analityczny wykonany jest z duraluminium, stali
lub tytanu i ma kształt spłaszczonej elipsoidy, Rys.1C. W
rotorze znajdują się dwa cylindryczne otwory, których osie są
równoległe do osi obrotu. Otwory te znajdują się symetrycznie
po obu stronach osi obrotu. Umieszcza się w nich dwie kuwety:
pomiarową z badanym roztworem i balastową o identycznej
Rys.2. Budowa kuwety analitycznej
masie jako przeciwwagę. Kuwety stosowane w rotorach
analitycznych mają specyficzną budowę, Rys.2.
Korpus kuwety analitycznej wykonany jest z metalu, wewnątrz niego znajduje się rdzeń wykonany
z tworzywa lub szkła ze zbiorniczkiem sektorowym. Zbiorniczek zamknięty jest z dwóch stron
przez okienka kwarcowe. Całość jest hermetycznie zamknięta. W połowie wysokości kuwety
znajduje się otwór do jej napełniania. Istnieje kilka podstawowych typów kuwet analitycznych.
Najprostsza jest kuweta jednosektorowa, Rys.3a. Kuweta
dwusektorowa, Rys.3b, ma dwa zbiorniczki. Jeden z nich jest
napełniany badanym roztworem, a drugi rozpuszczalnikiem. Taka
kuweta pozwala rejestrować sedymentację badanego roztworu na
Rys.3. Typy kuwet analitycznych
tle rozpuszczalnika.
W takich klasycznych kuwetach granice sedymentacji mogą być nieostre, co powoduje dużą
niepewność wyznaczenia współczynnika sedymentacji, zwłaszcza substancji o małych masach
6
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
cząsteczkowych. Zastosowanie kuwety ze sztuczną granicą sedymentacji, Rys.3c, pozwala
wyeliminować ten efekt. Jest to kuweta jednosektorowa z dwoma dodatkowymi zbiorniczkami
połączonymi ze sobą i z dnem kuwety kapilarnymi kanałami. W głównym zbiorniczku sektorowym
umieszcza się rozpuszczalnik, a w dodatkowych zbiorniczkach badany roztwór o większej gęstości.
Gdy rotor osiągnie 7-8 tys. obr/min badany roztwór przemieszcza się na dno kuwety wypierając
rozpuszczalnik w kierunku osi obrotu. Powstaje ostra granica sedymentacji, której położenie
zmienia się w trakcie wirowania.
We wszystkich typach kuwet analitycznych przesuwanie się granicy sedymentacji śledzi się
metodami optycznymi przez pomiar współczynnika załamania światła, który jest proporcjonalny do
stężenia substancji rozpuszczonej. Wykorzystywana może być metoda Pilpota-Svensona lub
metoda interferencyjna Rayleigha. W obu metodach stosuje się wąską, monochromatyczną wiązkę
światła.
Pierwszy z układów rejestruje wartość pochodnej współczynnika załamania światła, dn/dr, wzdłuż
promienia. Pochodna ta jest proporcjonalna do pochodnej stężenia badanej substancji dc/dr. Na
granicy sedymentacji występuje szybka zmiana stężenia, co na wykresie pochodnej przejawia się
c
dc/dr
występowaniem maksimum, Rys.4.
r
A)
B)
r
Rys.4. Profile sedymentacji: A) wartość pierwszej pochodnej dc/dr i B) stężenie c w funkcji odległości
od osi obrotu
Układ interferencyjny Rayleigha umożliwia bezpośrednio wyznaczenie współczynnika załamania
światła w każdym punkcie kuwety. Wymaga jednak grubszych kuwet, co z kolei prowadzi do
wydłużenia czasu wirowania nawet do kilkudziesięciu godzin.
7
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
Wyznaczanie stałej sedymentacji
Najczęściej stosowanym sposobem wyznaczania stałej sedymentacji jest metodą graficzną
bazująca na zależności uzyskanej po scałkowaniu równania [7]:
[13]
ln r = Sω2 t + const
gdzie: r położenie granicy sedymentacji po czasie wirowania t z prędkością kątową ω.
Wykonując wykres zależności ln(r) od ω2t powinniśmy otrzymać linię prostą. Nachylenie tej
prostej równe jest współczynnikowi sedymentacji S. Aby uzyskać możliwie dokładną wartość S
należy dokonać co najmniej kilku pomiarów położenia granicy sedymentacji. Wykorzystuje się w
tym celu rotory analityczne.
Określanie masy cząsteczkowej
W początkowym okresie rozwoju metod sedymentacyjnych aby określić wielkość jakiegoś
białka lub organelli komórkowej podawano jej stałą sedymentacji, np. rybosom 70 S. Z czasem
opracowano techniki pozwalające na mniej lub bardziej dokładne oszacowanie masy cząsteczkowej
na podstawie wyników pomiarów sedymentacyjnych. Dwie najpopularniejsze techniki omówimy
poniżej.
z zastosowaniem szybkości sedymentacji
Ze wzoru [11] wynika, że znając stałą sedymentacji S można wyznaczyć masę
cząsteczkową. We wzorze tym występują jednak kłopotliwe do eksperymentalnego wyznaczenia
wielkości η i d. Można je wyeliminować korzystając ze wzoru Einsteina na współczynnik dyfuzji
D:
[14]
D=
RT
6πηdN A
gdzie: R - stała gazowa,
T - temperatura w kelwinach.
Otrzymujemy wtedy I. równanie Svedberga:
[16]
M=
RTS
⎛ ρ
D⎜⎜1 − s
ρ
⎝
⎞
⎟⎟
⎠
Pomiary stałej sedymentacji S i współczynnika dyfuzji D oraz gęstości rozpuszczalnika ρs i
gęstości makrocząsteczki ρ pozwalają na wyznaczenie masy cząsteczkowej.
8
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
metodą równowagi sedymentacyjnej
Sedymentacja makrocząsteczek powoduje powstanie gradientu stężenia w roztworze. Po
pewnym czasie wirowania ustala się stan równowagi pomiędzy przeciwnie skierowanymi
procesami sedymentacji i dyfuzji, zwany równowagą sedymentacyjną. Stan równowagi
sedymentacyjnej występuje przy niewielkiej liczbie obrotów (zwykle poniżej 20 000 obr/min). W
stanie równowagi sedymentacyjnej substancja rozpuszczona wypełnia całą kuwetę, a jej stężenie
wzrasta od menisku do dna kuwety. Z warunku równowagi termodynamicznej wyprowadzić można
wzór na masę cząst. substancji rozpuszczonej:
2RT ln
[17]
M=
c2
c1
⎛ ρ ⎞
N A ⎜1 − s ⎟ ω2 ( r22 − r12 )
ρ⎠
⎝
Aby zastosować ten wzór należy określić stężenia makrocząsteczki c1 i c2 w odległości r1 i r2 od osi
obrotu. W praktyce doświadczenie nie jest jednak takie proste. Osiągnięcie równowagi
sedymentacyjnej wymaga zwykle kilkudziesięciu godzin wirowania.
Znacznie szybszą wersję omawianej metody zaproponował Archibald. W wersji tej nie jest
niezbędne osiągniecie stanu równowagi. Podczas dochodzenia do stanu równowagi w kuwecie
występują dwa przekroje, przez które nie przemieszczają się sedymentujące cząsteczki. Jest to
powierzchnia menisku (a) i dno kuwety (b). Warunek ten zachodzi niezależnie od tego czy został
osiągnięty stan równowagi czy jeszcze nie:
[18]
1 ⎛ dc ⎞
1 ⎛ dc ⎞ Sω2
=
⎜ ⎟
⎜ ⎟ =
ra ca ⎝ dr ⎠a rb cb ⎝ dr ⎠ b
D
Zależność tą można sprowadzić do układu dwóch równań z których można wyznaczyć m.cz.
biopolimeru odpowiednio przy menisku i przy dnie kuwety:
[19a]
⎛ dc ⎞
RT ⎜ ⎟
⎝ dr ⎠a
Ma =
⎛ ρs ⎞ 2
⎜ 1 − ρ ⎟ ω ra ca
⎝
⎠
[19b]
⎛ dc ⎞
RT ⎜ ⎟
⎝ dr ⎠ b
Mb =
⎛ ρs ⎞ 2
⎜1 − ρ ⎟ ω rb c b
⎝
⎠
Dla roztworu zawierającego jeden rodzaj biopolimeru Ma = Mb. Jeżeli w roztworze znajduje się
mieszanina biopolimerów, to Ma ≠ Mb
9
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
Elektroforeza żelowa
Elektroforezą nazywamy ruch cząsteczek obdarzonych ładunkiem w roztworze w polu
elektrycznym. Siła F działająca na cząsteczkę w polu elektrycznym jest proporcjonalna do
natężenia pola elektrycznego E i ładunku cząsteczki Q:
[20]
F = EQ
Na skutek oporu hydrodynamicznego T cząsteczka porusza się podczas elektroforezy ze stałą
prędkością v. Podstawą rozdziału cząsteczek podczas elektroforezy jest różnica w prędkości
migracji. Rozdział elektroforetyczny może być prowadzony zarówno w roztworach (elektroforeza
swobodna, elektroforeza kapilarna) jak i w nośnikach: na bibule, płytkach cienkowarstwowych lub
w różnego rodzaju żelach.
Rozdział biopolimerów prowadzi się zwykle
na nośniku. Największe zastosowanie znajdują
przezroczyste żele o różnym stopniu usieciowania,
np. żele poliakryloamidowe. Podczas elektrolizy
żelowej, poza ładunkiem cząsteczki, szybkość
migracji zależy również od relacji pomiędzy
wielkością cząsteczki a wielkością porów w żelu.
Elektroforeza w obecności SDS
Prędkość migracji natywnych białek w żelu poliakryloamidowym zależy nie tyle od masy
czast. ile od ładunku i kształtu cząsteczki. W obecności soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS)
cząsteczki białka ulegają denaturacji i tworzą z SDS micelle o ładunku ujemnym.
SDS
denaturacja
SDS
micellizacja
Wykazano, że ładunek takiej micelli jest praktycznie niezależny od ładunku natywnego białka.
Tym samym szybkość migracji białek w żelu w obecności SDS powinna zależeć przede wszystkim
od wielkości cząsteczki, a pośrednio od m.cz.
10
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
Badania nad elektroforezą żelową 40 białek o znanych m.cz. w
obecności
SDS
wykazały,
że
ich
względna
ruchliwość
elektroforetyczna Rf:
[21]
Rf = odległość migracji białka/ odległość migracji
markera
jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu ich masy cząst.
W praktyce wykonuje się elektroforezę badanego białka w
mieszaninie z białkami wzorcowymi o znanych m.cz. oraz
markerem (np. błękitem bromofenolowym). Wykonując dla białek
wzorcowych wykres zależności logarytmu m.cz. od Rf otrzymuje się prostoliniową krzywą
wzorcową. Z uzyskanego wykresu lub równania regresji odczytuje się m.cz. badanego białka.
W pokazanym poniżej przykładzie mamy 2 badane białka o wartościach Rf odpowiednio 0,209 i
0,227. Na podstawie uzyskanej zależności można oszacować ich m.cz. na odpowiednio 79 000 i
50 000.
5,20
5,10
logM = -11,035Rf + 7,2025
5,00
4,90
log M
4,80
4,70
4,60
4,50
4,40
4,30
4,20
0,17
0,19
0,21
0,23
0,25
0,27
0,29
Rf
Technika elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS pozwala oszacować
masę cząsteczkową z dokładnością ±10% dla białek o m.cz. z zakresie 15 000 ÷ 100 000 Da. W
zakresie tym dostępne są handlowo zestawy białek wzorcowych.
Filtracja molekularna
W metodzie tej jako wypełnienie kolumn chromatograficznych wykorzystuje się żele
pęczniejące pod wpływem fazy ruchomej. Przy filtracji żelowej biopolimerów fazą ruchomą są
najczęściej bufory wodne. Najczęściej używanymi żelami są usieciowane polisacharydy.
W środowisku wodnym ziarna żelu pęcznieją, a w ich wnętrzu pojawiają się wypełnione
wodą pory. Stopień spęcznienia żelu zależy od stopnia usieciowania polisacharydu. Określa się go
11
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
przy pomocy tzw. indeksu retencji wody wyrażającego ile gramów wody wiąże się z 1 g suchego
żelu.
Jeżeli przez kolumnę wypełnioną spęczniałym żelem będziemy przepuszczać
mieszaninę substancji o zróżnicowanych wielkościach cząsteczek, to substancje o
dużych rozmiarach cząsteczek (żółte) przemieszczać się będą w kolumnie tylko w
przestrzeniach pomiędzy ziarnami żelu. Cząsteczki o mniejszych rozmiarach (zielone
i czerwone) wnikać będą do wnętrza ziaren. Im mniejsze są rozmiary cząsteczek, tym
dłużej będą one „błądzić” wewnątrz porowatych ziaren.
Rozdział substancji podczas filtracji żelowej opiera się więc na różnicy w
wielkości cząsteczek. Kolumnę będą opuszczały najpierw cząsteczki o największych
rozmiarach, potem cząsteczki średniej wielkości, a na końcu cząsteczki najmniejsze.
Zastosowanie filtracji żelowej biopolimerów jest bardzo szerokie. Można ją wykorzystać
do: i) preparatywnego rozdziału mieszanin makrocząsteczek, ii) usuwania z roztworów
biopolimerów substancji małocząsteczkowych, w tym soli, oraz do iii) oznaczania mas
cząsteczkowych.
Dobór złoża
W handlu dostępne są złoża do filtracji żelowej o bardzo szerokim zakresie rozmiarów pór
wewnątrz spęczniałych ziaren żelu. Poniższa tabela zawiera przykładowe rodzaje złóż typu
Sefadeks. Złoża tego typu są najczęściej stosowane w filtracji molekularnej biopolimerów.
Rodzaj
Sefadeksu
G-10
G-15
G-25
G-50
G-75
G-100
G-150
G-200
Indeks retencji
wody
1
1,5
2,5
5
7,5
10
15
20
Roboczy zakres m.cz.
Peptydy i białka
Polisacharydy
< 700
< 700
< 1 500
< 1 500
1 000 - 5 000
100 - 5 000
1 500 - 30 000
500 - 10 000
3 000 - 70 000
1 000 - 50 000
4 000 - 150 000
1 000 - 100 000
5 000 - 400 000
1 000 - 150 000
5 000 - 800 000
1 000 - 200 000
Do filtracji molekularnej obiektów o jeszcze większych rozmiarach (kompleksy białkowe,
organelle komórkowe) otrzymano złoża typu Sefaroza lub Bio-Żel pozwalające na rozdział
biopolimerów o masach cząsteczkowych do 150 000 000 Da.
12
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
Oznaczanie mas cząsteczkowych
Rozdział substancji podczas filtracji molekularnej oparty jest na rozmiarach cząsteczek, a
nie na ich masie cząst. Jednakże w przypadku biopolimerów danego rodzaju (np. białek) ich
gęstość jest bardzo zbliżona. Tym samym cząsteczka o większej masie posiada również większe
rozmiary. Stwierdzono doświadczalnie, że dla filtracji molekularnej istnieje liniowa zależność
pomiędzy objętością wycieku z kolumny przy której pojawia się dany biopolimer a logarytmem
jego m.cz.
Ze względu na słabą powtarzalność parametrów rozdziału każdorazowo należy wykonać linię
kalibracyjną stosując białka wzorcowe o znanych m.cz.
Przykład
Chcemy oznaczyć masy cząst. heksokizaz typu I – IV z homogenatu wątroby szczura. Jako
białka wzorcowe stosujemy: dehydrogenazę Glc-6-P (110 000 Da), albuminę ludzką (67 000 Da),
pepsynę (35 000 Da) oraz trypsynę (24 000 Da).
Podczas filtracji molekularnej mieszaniny tych białek z badanymi heksokinazami na złożu Sefadeks
G-200 zaobserwowano 6 pasm o obj. elucji:
Pasmo
Obj. elucji
Białko
A
2,6 ml
dehydrogenaza
B
3,7 ml
heksokinazy I, II i III
C
4,4 ml
albumina
D
5,05 ml
heksokinaza IV
E
5,9 ml
pepsyna
F
6,85 ml
trypsyna
Na podstawie uzyskanych wyników sporządzono
zależność kalibracyjną przedstawioną na poniższym wykresie:
5,20
5,10
log M = 5,475 - 0,157 Ve
5,00
log M
4,90
4,80
4,70
4,60
4,50
4,40
4,30
2
3
4
5
6
7
8
obj. elucji
Dla białek tworzących pasma B i D o objętościach elucji odpowiednio 3,7 i 5,05 ml można
oszacować m.cz. odpowiednio 78 000 i 48 000 Da.
13
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
Spektrometria mas
Aż do końca lat ’70 XXw jedynymi metodami umożliwiającymi oszacowanie masy
cząsteczkowej biopolimerów były ultrawirowanie, elektroforeza i chromatografia. Wyniki
otrzymane przy pomocy tych metod były bardzo nieprecyzyjne (błąd względny wynosił średnio
10-100%) ponieważ zależały od innych niż masa cząsteczkowa właściwości: kształtu cząsteczki,
gęstości i hydrofobowości.
Jedyna bezpośrednia metoda pomiaru masy cząsteczkowej – spektrometria mas znajdowała się
jeszcze na bardzo wczesnych etapach rozwoju i ograniczona była do substancji lotnych. W latach
’70 pojawiła się metoda desorpcji polem (FD) pozwalająca na otrzymanie widm substancji
nielotnych o masach cząst. do ok. 2 000 Da. Rozwój metod jonizacji przez desorpcję, opartych na
emisji wcześniej istniejących jonów z powierzchni cieczy lub ciała stałego (desorpcja plazmą – PD,
bombardowanie szybkimi atomami – FAB, desorpcja laserowa – LD) umożliwił po raz pierwszy
wprowadzenie spektroskopii mas do analizy biopolimerów. Od tego czasu problemem stało się już
nie wytwarzanie jonów, lecz poprawna analiza ich masy. Jony o pojedynczym ładunku i dużej
masie są technicznie trudne do detekcji z dużą czułością i do analizy ich masy z dobrą
rozdzielczością.
Na początku lat ’90 pojawiły się dwie nowe metody jonizacji (rozpylanie w polu
elektrycznym, elektrosprej – ESI oraz desorpcja laserowa ze stałej matrycy – MALDI), dzieki
którym można było uniknąć tych niedogodności. Metody te umożliwiają bardzo precyzyjną analizę
biopolimerów o dużych masach.
Jonizacja biopolimerów
Obecnie w spektrometrii mas biopolimerów stosuje się powszechnie trzy techniki
wytwarzania jonów. Zostaną one omówione poniżej.
FAB
Technika bombardowania szybkimi atomami (FAB, ang. Fast Atom Bombardment) może
być stosowana dla roztworów zawierających jony w nielotnych rozpuszczalnikach. W praktyce
używa się najczęściej glicerynę, tioglicerynę, alkohol m-nitrobenzylowy (NBA) lub w trybie
rejestracji jonów ujemnych trietanoloaminę. Metoda ta nie może więc być stosowana dla substancji
niepolarnych takich jak np. lipidy obojętne.
Wiązka szybkich atomów (najczęściej argonu, niekiedy ksenonu) otrzymywana jest pośrednio z
wykorzystaniem jonów argonu. Jony są przyspieszane w polu elektrycznym o różnicy potencjałów
14
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
rzędu kilku do kilkunastu kV i trafiają do komory zderzeniowej, w której na skutek zderzeń z
zawartymi w niej atomami argonu przekazują im swój pęd lub ładunek. Proces zachodzący w
komorze zderzeniowej można opisać równaniem:
Ar+szybki + Arpowolny = Ar+powolny + Arszybki
Emiter elektronów
komora
Wiązka
anoda
Wychwyt
Ar
jonów
zderzeniowa
Wiązka szybkich
jonów
jonów
Roztwór
biopolimeru
Jony pozostałe w wiązce są usuwane podczas przejścia pomiędzy elektrodami.
Szybka
wiązka
obojętnych
atomów
uderzając
w
roztwór
analizowanej substancji wytwarza falę uderzeniową, która powoduje
wyrzucenie z roztworu jonów i cząsteczek obojętnych. Wyrzucone
jony są przyspieszane w polu elektrycznym i kierowane do
analizatora. Metoda FAB nie powoduje lub prawie nie powoduje
jonizacji. Z roztworu są bowiem wyrzucane jony już wcześniej w nim istniejące. W zależności od
budowy chemicznej analizowanych substancji oraz pH roztworu w metodzie FAB zbierane mogą
być jony o ładunku dodatnim (wynik protonowania cząsteczki) lub ujemnym (wynik
oddysocjowania protonu od cząsteczki).
W widmach masowych otrzymywanych techniką FAB obserwuje się przede wszystkim jony
o m/z = [M+H]+ lub [M-H]-, czyli tzw. pozorne jony molekularne. Jeżeli cząsteczka posiada więcej
niż jedno miejsce jonizacji, np. n, to występują również jony [M+nH]n+ lub [M-nH]n-.
Ponieważ w metodzie FAB występują głównie jony molekularne, więc można ją zastosować
do mieszanin bez potrzeby ich rozdzielania. Jest to szczególnie wygodne w przypadku analizy
15
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
produktów enzymatycznego trawienia dużych białek. Poniższy rysunek pokazuje widmo FAB
peptydów uzyskanych podczas trawienia przeciwciała monoklonalnego.
Jest to doskonała metoda wytwarzania pozornych jonów molekularnych substancji
polarnych o dużych masach cząsteczkowych, szczególnie peptydów i polinukleotydów. W
rutynowych pomiarach górny zakres mas metody FAB ograniczony jest do ok. 10 000 Da. Dla
większych mas (biopolimery) stosuje się jedną z poniżej opisanych metod jonizacji.
MALDI
Jonizacja przez desorpcję laserową z wykorzystaniem matrycy (MALDI, ang. Matrixassociated Laser Desorption/Ionization) polega na zmieszaniu analizowanej substancji z
roztworem małych cząsteczek organicznych zwanych matrycą i odparowaniu rozpuszczalnika.
Cząsteczki matrycy muszą silnie absorbować promieniowanie laserowe (zwykle w zakresie UV).
Pod wpływem wiązki laserowej dochodzi do lokalnego wzbudzenia elektronów w cząsteczkach
matrycy. Jony powstałe przez przeniesienie protonów z fotowzbudzonej matrycy do analizowanej
cząsteczki ulegają następnie desorpcji polem elektrycznym.
+
Desorpcja
polem elektrycznym
m* + B => [m-H]- + [BH]+
Metoda MALDI posiada wiele korzystnych cech. Należą do nich przede wszystkim:
16
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
•
zastosowanie matrycy ogranicza tworzenie agregatów i ułatwia tworzenie jonów
molekularnych
•
nie ma potrzeby dostrajania długości fali wiązki laserowej do zakresu absorpcji
analizowanej substancji
•
ponieważ proces desorpcji nie zależy od rozmiarów analizowanej cząsteczki można
zdesorbowac i zjonizować biopolimery o m.cz. do ok. 1 000 000 Da
•
metoda charakteryzuje się znaczną czułością – możliwa jest analiza pikomolowych
ilości białka
Poniższy rysunek przedstawia widmo masowe przeciwciała monoklonalnego o m.cz. ok. 150 kDa
uzyskane techniką MALDI.
W widmach uzyskanych tą techniką najsilniejszy jon odpowiada zwykle jonowi molekularnemu.
Pojawić się mogą również jony odpowiadające cząsteczce wielokrotnie zjonizowanej (M2+, M3+)
oraz jony agregatów biopolimeru o różnym stopniu zjonizowania, np. 2M+, 3M2+, 2M3+ itp. Na
szczęście ich intensywność jest zwykle dużo mniejsza niż jonu molekularnego.
ESI
Rozpylanie w polu elektrycznym, czyli elektrosprej polega na wprowadzeniu strumienia
cieczy w silne pole elektryczne (różnica potencjałów 3÷6 kV) pod ciśnieniem atmosferycznym.
Pole powoduje akumulacje ładunków na powierzchni cieczy opuszczającej kapilarę. Strumień
cieczy ulega rozbiciu na drobne, silnie naładowane kropelki. Odparowywanie rozpuszczalnika
powoduje kurczenie się kropelek aż do momentu, gdy odpychanie elektrostatyczne przewyższy siły
spójności cieczy. Spowoduje to rozerwanie kropel na mniejsze kropelki.
17
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
Takie kaskadowe rozdrabnianie roztworu trwa tak długo, aż pole
elektryczne na ich powierzchni stanie się dostatecznie duże, aby
spowodować desorpcje jonów substancji rozpuszczonej.
Jeżeli analizowana cząsteczka posiada więcej niż jedno miejsce
zdolne do jonizacji, to najczęściej powstają jony o ładunku
wielokrotnym. Widma masowe ESI biopolimerów stanowią
najczęściej serie pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie
naładowanym pozornym jonom molekularnym [M+zH]z+. Widma
takie nie zawierają praktycznie jonów fragmentacyjnych.
Otrzymanie jonów wielokrotnie naładowanych pozwala na
analizowanie cząsteczek o bardzo dużych masach cząst. za
pomocą analizatorów o znacznie niższym nominalnym zakresie
mas. Należy bowiem pamiętać, że spektrometry mas nie mierzą
masy jonu, lecz stosunek masy do ładunku m/z.
Analiza widm masowych
W widmach masowych uzyskanych metodą FAB lub MALDI obserwuje się bezpośrednio
jony molekularne. Dopóki analizujemy peptydy lub produkty hydrolizy białek o m.cz. rzędu kilku
tysięcy Da możemy stosować typowe analizatory i detektory. Przy cząsteczkach o większych
masach należy zastosować oprzyrządowanie specjalne pozwalające określić stosunek m/z z
zadawalającą rozdzielczością.
Problemy tego typu nie pojawiają się przy jonizacji metoda elektrospreju. W metodzie tej
powstają jony wielokrotne, dla których stosunek m/z przypada w klasycznym zakresie. Jednakże
jednoznaczne ustalenie m.cz. na podstawie widma ESI wymaga specjalnego podejścia. Załóżmy, że
jon o zmierzonym stosunku m/z = µ1 posiada ładunek z1. Dla jonu takiego obowiązuje zależność:
18
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
z1µ1 = M + z1mH
w której mH oznacza masę protonu a M m.cz. analizowanego biopolimeru. Jest to jedno równanie o
2 niewiadomych: z1 i M. Aby uzyskać drugie równanie pozwalające na określenie obu
niewiadomych rozważmy j-ty kolejny pik w kierunku wzrastającego stosunku m/z. Dla tego piku
zmierzona wartość stosunku m/z = µ2 i niesie on ładunek z2 = z1-j:
(z1-j)µ2 = M + (z1-j)mH
Powstały układ równań można rozwiązać ze względu na obie niewiadome:
z1 = j
µ2 − mH
µ 2 − µ1
M = z1 ( µ1 − m H )
Na powyższym rysunku przedstawiono widmo ESI dla lizozymu z faga λ. Można na nim
zidentyfikować co najmniej 9 pików o masach: 892,4, 939,2, 991,5, 1049,8, 1115,5, 1189,6,
1274,0, 1372,5 i 1486,6. Do układu równań użyjmy dwóch skrajnych pików: j = 8. Otrzymamy
wtedy:
z1 = 8
1486, 6 − 1, 0073
= 20, 001 ≅ 20
1486, 6 − 892, 4
M = 20 ( 892, 4 − 1, 0073) = 17.827,9
Analogiczne obliczenia przeprowadzić można dla kolejnych pików. Otrzymamy wtedy następujące
wyniki:
z1 = 20
⇒
M = 17 827,9
z1 = 19
⇒
M = 17 825,7
z1 = 18
⇒
M = 17 828,9
z1 = 17
⇒
M = 17 829,5
z1 = 16
⇒
M = 17 831,9
z1 = 15
⇒
M = 17 828,9
z1 = 14
⇒
M = 17 821,9
z1 = 13
⇒
M = 17 829,4
z1 = 12
⇒
M = 17 827,1
Po uśrednieniu powyższych wyników otrzymamy:
wartość średnią m.cz.
M= 17 827,9 Da
odch. standardowe M
=
2,8 Da
19
Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów
20