4. Utlenianie glukozy z udziałem komórek drożdży

Utlenianie glukozy z udziałem komórek
drożdży
Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu
Biotechnologia
Dla studentów kierunku Chemia specjalność Chemia Bioorganiczna
Materiały zostały wykonane w ramach realizowanego na Politechnice Śląskiej projektu nr UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01
pt.: „Unowocześnienie i rozszerzenie oferty edukacyjnej na kierunku Chemia na Wydziale Chemicznym Politechniki Śląskiej –
otwarcie specjalności Chemia Bioorganiczna” współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego
Funduszu Społecznego.
Utlenian glukozy z udziałem komórek drożdży
Utlenianie
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest:
• Zapoznanie się z hodowlą drożdży w bioreaktorze,
• Zapoznanie się z procesem utleniania glukozy i innych cukrów,
cukrów w obecności
enzymów z drożdży dostępnych handlowo oraz hodowanych w warunkach
laboratoryjnych (Kluyveromyces
(Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis ) oraz ich
ilościowym oznaczeniem.
oznaczeniem
PODSTAWY TEORETYCZNE
Każda komórka dąży do wytworzenia potrzebnej do życia energii. Jedną z form
pozyskania tej energii jest oddychanie komórkowe. Proces ten rozpoczyna się glikolizą,
g
czyli
przekształceniem monosacharydów w kwas pirogronowy.
Schemat 1
Schemat 1)
1) wymaga dostarczenia energii przez komórkę w
Pierwsza faza glikolizy (Schemat
postaci 2 cząsteczek ATP. Glukoza, która trafia do cytoplazmy zostaje wychwycona przez
enzym zwany
wany heksokinazą i ulega fosforylacji dzięki pierwszej cząsteczce ATP. Powstały
glukozo-6-fosforan
fosforan izomeryzuje do fruktozo-6-fosforanu
fruktozo fosforanu dzięki izomerazie fosfoglukozowej.
Pierścień piranozowy otwiera się do formy łańcuchowej, następuje izomeryzacja grupy
karbonylowej z atomu C-1
1 do atomu C-2,
C 2, aby ostatecznie ulec cyklizacji do formy
furanozowej. W ostatnim etapie pierwszej fazy glikolizy druga cząsteczka ATP przy obecności
enzymu fosfofruktokinazy fosforyluje fruktozo-6-fosforan
fruktozo
do fruktozo-1,6--bisfosforanu.
W drugiej fazie glikolizy (Schemat 2) szcześciowęglowy fruktozo-1,6
fruktozo 1,6-bisfosforan ulega
lizie na dwa produkty trójwęglowe: fosfodihydroksyaceton i aldehyd 3-fosfoglicerynowy
3
które pozostają ze sobą w równowadze chemicznej. Reakcję tą katalizuje enzym aldolaza.
aldol
1
Utlenian glukozy z udziałem komórek drożdży
Utlenianie
Schemat 2
Bezpośrednio do kolejnego etapu glikolizy wchodzi jedynie aldehyd 3-fosfoglicerynowy,
3
którego jest znacznie mniej niż fosfodihydroksyacetonu. Równowaga reakcji katalizowanej
przez
izomerazę
triozofosforanową
jest
mocno
przesunięta
w
stronę
fosfodihydroksyacetonu, jednak na skutek biegnącej reakcji aldehydu do 1,31,3
bisfosfoglicerynianu obie cząsteczki trójwęglowe zostają wykorzystane w kolejnych etapach
glikolizy.
Trzecia faza glikolizy (Schemat
Schemat 2)
2 to odzyskiwanie energii włożonej przez komórkę w
proces w pierwszej fazie (Schemat
Schemat 1).
1 Cząsteczka aldehydu 3-fosfoglicerynowego
fosfoglicerynowego pod
wpływem dehydrogenazy ulega przekształceniu w 1,3-bisfosfoglicerynian.
1,3 bisfosfoglicerynian. W rzeczywistości
etap ten zachodzi dwustopniowo: utlenianie
utlenianie pod wpływem NAD+ oraz fosforylacja grupy
karbonylowej.
W kolejnym etapie komórka odzyskuje dwie cząsteczki ATP dzięki kinazie
fosfoglicerynianowej. Każda z dwóch powstałych cząsteczek 1,3-bisfosfoglicerynianiu
1,3 bisfosfoglicerynianiu oddaje
resztę fosforanową ADP. Grupa fosforanowa
fosf
w powstałym 3-fosfoglicerynianie
fosfoglicerynianie zostaje
przeniesiona na atom C-2
2 pod wpływem fosfogliceromutazy i powstaje 2-fosfoglicerynian.
2 fosfoglicerynian.
2
Utlenian glukozy z udziałem komórek drożdży
Utlenianie
Następnie pod wpływem enzymu enolazy zachodzi dehydratacja i utworzenie enolu
(fosfoenolopirogronianu), który jest niezwykle
niezwykle stabilny w tej formie dzięki grupie
fosforanowej.
Ostatni etap trzeciej fazy glikolizy to przeniesienie grupy fosforanowej z enolu na
cząsteczkę ADP. Ponieważ nadal mamy do czynienia z dwoma takimi samymi cząsteczkami
uzyskanymi z jednej cząsteczki glukozy,
glukozy, ogólny zysk energetyczny całego szlaku
metabolicznego glikolizy to dwie cząsteczki ATP. Uzyskana forma enolowa pirogronianiu
przekształca się w bardziej trwałą formę ketonową.
Tak otrzymany kwas pirogronowy w procesie glikolizy może ulec 3 różnym przemianą
p
zgodnie ze Schematem 3:
Schemat 3
Pierwszy możliwy szlak przemian to tlenowy proces spalania substancji organicznej
zachodzący w mitochondriach komórkowych. Proces uzyskiwania energii może również
zachodzić beztlenowo. Pirogronian może przekształcić
przekształcić się w mleczan lub alkohol etylowy.
Pierwszy przypadek dotyczy zarówno bakterii jak i przekształcania glukozy w mięśniach, gdy
zabraknie tlenu w komórkach podczas wysiłku fizycznego. Drugi związany jest z
metabolizmem mikroorganizmów głównie drożdży, ale i niektórych bakterii.[2]
Każdy organizm dąży do regeneracji cząsteczki NAD+, aby cykl glikolizy mógł się
powtarzać (Schemat 4).
). Fermentacja alkoholowa jest jedną z metod beztlenowej regeneracji
tego koenzymu.
Schemat 4
3
Utlenianie glukozy z udziałem komórek drożdży
Powstały w procesie glikolizy pirogronian ulega dekarboksylacji pod wpływem działania
odpowiedniego enzymu, zwanego dekarboksylazą piogronianową. Powstały aldehyd octowy
ulega następnie redukcji do etanolu, dzięki czemu odtwarza się koenzym NAD+. Ostatni etap
jest katalizowany przez dehydrogenazę alkoholową.
Drożdże w podczas dostępu tlenu prowadzą tlenowy proces spalania substancji
organicznych (cukrów). Dopiero kiedy w roztworze zabraknie tlenu całkowicie przekształcają
formę zdobywania energii na proces beztlenowy, czyli fermentację alkoholową.
Stężenie cukru w roztworze można oznaczyć:
• metodą Somogyi i Nelsona wykorzystującej, właściwości redukujące sacharydów,
które w środowisku zasadowym redukują jony miedzi(II) do jonów miedzi(I) w
obecności winianu sodowo-potasowego (odczynnik Somogyi) z wytworzeniem tlenku
miedzi CuO (ceglasty osad). W momencie dodania kwasu arsenomolibdenowego
(odczynnik Nelsona) do powstałego tlenku miedzi obserwuje się redukcję tego kwasu
co objawia się kolorem błękitnym, intensywność barwy można zmierzyć w zakresie
długości fali od 500-620 nm i jest ona proporcjonalna do ilości cukrów redukujących,
•
metodą polegającą w oparciu o pomiar intensywności zabarwienia alkalicznego
roztworu heksacyjanożelazianu(III) potasu, cukry redukujące reagują z alkalicznym
roztworem heksacyjanożelazianu(III) potasu (barwa intensywnie żółta) który
przeprowadzany jest w bezbarwny heksacyjanożelazian(II) potasu,
•
metodą Bernfelda, w której kwasem 3,5-dinitrosalicylowym utlenianiane są grupy
redukujące. Grupa 3-nitrowa soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS)
zostaje zredukowana w środowisku zasadowym do grupy aminowej, w wyniku czego
pojawia się pomarańczowe zabarwienie roztworu, który silnie absorbuje światło przy
długości fali 530 nm. Intensywność barwy jest pochodną ilości cukrów.
Drożdże są istotnym źródłem enzymów i mają szerokie zastosowanie w przemyśle
spożywczym i farmaceutycznym. W celu zwiększenia produkcji enzymów przez drożdże
zazwyczaj dodaje się do pożywki hodowlanej wodorofosforan amonu, siarczan amonu lub
siarczan potasu. Enzymy drożdży wykazują najwyższą aktywność w środowisku obojętnym i
lekko kwaśnym (pH=4 ˗ 7.3). Optymalna temperatura działania zależy od konkretnego
szczepu drożdży. Enzymy drożdżowe aktywne są w szerokim zakresie temperaturowym od
40°C do 85°C. Obecność jonów metali jedno- i dwuwartościowych wpływa na stabilizację ich
struktury i aktywność (enzymy drożdży Kluyveromyces lactis i Kluyveromyces fragilis są silnie
aktywowane przez jony manganu i kobaltu). Biokatalizatory z drożdży wykazują szeroki
zakres działania.
4
Utlenianie glukozy z udziałem komórek drożdży
PRZEBIEG ĆWICZENIA
Utlenianie glukozy i innych cukrów z udziałem komórek drożdży
Odczynniki:
• Pepton,
• Kwas bursztynowy,
• Chlorek wapnia,
• Wodorofosforan dipotasu,
• Siarczan amonu,
• Siarczan magnezu,
• Laktoza,
• 0,5% roztwór środka powierzchniowo-czynnego Triton X-100,
• Drożdże piwne, piekarskie, winne, hodowane w warunkach laboratoryjnych,
• 0,1 M NaHCO3,
• Chloroform,
• 0,1 M r-ry glukozy, galaktozy, maltozy, sacharozy,
• 0,1 M Bufor fosforanowy pH = 7,
• 2mM r-ry glukozy, galaktozy, maltozy, sacharozy,
• Odczynnik miedziowy,
• Odczynnik arsenomolibdenowy,
• Heksacyjanożelazian(III) potasu,
• Roztwór siarczanu cynku,
• Roztwór jodku potasu,
• 0,1M Tiosiarczan sodu.
Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny:
• Kolba stożkowa 1l,
• Kolby płaskodenne 100ml,
• Biureta,
• Probówki wirówkowe,
• Probówki szklane,
• Wirówka,
• Pipety automatyczne,
• Spektofotometr UV/VIS,
• Łaźnia wodna,
• Mieszadło magnetyczne,
• Bioreaktor.
5
Utlenianie glukozy z udziałem komórek drożdży
Wykonanie ćwiczenia
1. Hodowla drożdży
Tabela 1. Skład pożywki
Lp.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Składnik
Ekstrakt drożdżowy
Pepton
Kwas bursztynowy (CH2COOH)2
Chlorek wapnia CaCl2
Wodorofosforan dipotasu K2HPO4
Siarczan amonu (NH4)2SO4
Siarczan magnezu MgSO4
Laktoza C12H22O11
Masa [g/l]
2,5
5,0
6,0
0,3
8,7
4,0
0,5
20
Do kolby stożkowej o pojemności 1000 ml dodać składniki pożywki (patrz Tabela 1) i 1000 ml
wody destylowanej. Następnie sterylizować pożywkę i elementy aparatury bioreaktora w
temperaturze 121°C przez 30 minut. Ostudzoną pożywkę przelać do szklanego zbiornika
bioreaktora. Do szklanej probówki zawierającej skos agarowy z wyhodowanymi drożdżami
dodać 8 ml 0,5% roztworu środka powierzchniowo-czynnego Triton X-100. Roztwór drożdży
wprowadzić do zbiornika bioreaktora.
Hodowlę drożdży prowadzić przez 24 h w bioreaktorze BIOSTAT B PLUS w odpowiednio
ustalonych warunkach (Tabela 2).
Tabela 2. Warunki fermentacji w bioreaktorze
Parametr
Temperatura
pH
Obroty mieszadła
Natlenienie
Ustalona wartość
30°C
6.7
400 obr/min
24%
Koncentrację drożdży sprawdzić na podstawie pomiaru absorbcji przy długości fali λ=650 nm.
Po zakończonej hodowli otrzymane roztwory zwirować (6000 obr/min, 10 min, 40°C) w celu
uzyskania osadu drożdży.
2. Liza komórek
2.5g osadu drożdży („zwykłe”) zawiesić w 15ml 0,1M NaHCO3 i sonifikować w łaźni
ultradźwiękowej w temperaturze do 50°C przez 30 min. Zawiesinę odwirować przez 60min.
przy 18 000 x g.
2.5g osadu drożdży (hodowlane) zawiesić w 15ml chloroformu i mieszać na mieszadle
magnetycznym przez 30min. Zawiesinę odwirować przez 60min. przy 18 000 x g.
3. Przygotowanie mieszanin do analizy
Przygotować 10 probówek ponumerowanych kolejno i napełnić je 1ml buforu oraz 1ml
ekstraktu drożdżowego.
Umieścić w łaźni wodnej ogrzanej do temperatury 40°C i po 10 minutach dodawać po kolei
do nich w przerwach 45 sekundowych 1 ml 0,1M cukru. Mieszaniny inkubować przez 20 min.
6
Utlenianie glukozy z udziałem komórek drożdży
Po 20 min. inkubacji przenieść (również w odstępach 45 sekund) mieszaniny do wrzącej łaźni
wodnej w celu denaturacji białka a następnie odwirować je przez 20 min. przy 5 tyś.
obrotów/min.
Analiza
0,1M Bufor fosforanowy pH = 7
0,1 M Cukru
Ekstrakt
drożdżowy
1. Analiza z
cukrem
1ml
1ml
-
2. Analiza z
ekstraktem
1ml
-
1ml
3. Analiza
badana
1ml
1ml
1ml
4. Oznaczanie cukrów redukujących metodą Somogyi-Nelsona
Przenieść po 0,5 ml supertanantu, otrzymanego po odwirowaniu roztworów z probówek
wirówkowych, do wcześniej przygotowanych czystych probówek.
Do probówki oznaczonej jako próba zerowa odmierzyć 0,5 ml wody destylowanej, a do
probówki oznaczonej jako wzorzec cukru odmierzyć 0,5 ml roztworu wzorcowego cukru o
stężeniu 2 mM.
Do wszystkich probówek dodać 0,5 ml odczynnika miedziowego, zamieszać i ogrzewać we
wrzącej łaźni wodnej przez 15 min., a następnie ochłodzić i dodać po 0,5 ml odczynnika
arsenomolibdenowego i wymieszać. Każdą próbkę rozcieńczyć przez dodanie 1ml wody
destylowanej i po wymieszaniu zmierzyć absorbancję przy długości fali 660nm wobec próby
ślepej.
Sporządzić również wykres krzywej wzorcowej dla ilościowego oznaczania cukru.
5. Oznaczanie cukrów redukujących roztworem heksacyjanożelazianu(III) potasu
Przenieść po 0,5 ml supertanantu, otrzymanego po odwirowaniu roztworów z probówek
wirówkowych, do wcześniej przygotowanych czystych kolb na 100ml.
Następnie do kolb dodać 15ml roztworu heksacyjanożelazianu(III) potasu, zatkać korkami, i
umieścić we wrzącej łaźni wodnej ogrzewając przez 15 min. Kolby ochłodzić w zimnej
wodzie, dodać 45ml roztworu siarczanu cynku a następnie po wymieszaniu dodać 10ml
roztworu jodku potasu. Wydzielony jod zmiareczkować 0.1M tiosiarczanem sodu.
Jednocześnie wykonać próbę zerową.
Ilość grup aldehydowych w danej objętości próbki można obliczyć ze wzoru:
R=[(V0-VA) * CM *10]/VP
V0 – objętość tiosiarczanu z miareczkowania próby ślepej,
VA - objętość tiosiarczanu z miareczkowania próby analizowanej,
CM – stężenie molowe tiosiarczanu sodu,
VP – objętość próbki.
7
Utlenianie glukozy z udziałem komórek drożdży
PRZYGOTOWANIE DO ZAJĘĆ
1. Przeczytaj uważnie instrukcję i dokładnie przeanalizuj czynności oraz techniki
laboratoryjne opisane w części eksperymentalnej. Powtórz metodę sporządzania krzywej
wzorcowej i oznaczania stężenia za jej pomocą.
2. Zapoznaj się z zagrożeniami związanymi z stosowanymi odczynnikami oraz poszczególnymi
czynnościami wykonywanymi na zajęciach (karty charakterystyk).
3. Zwróć uwagę czy znasz następujące pojęcia: enzym, bioreaktor, reakcja enzymatyczna,
reakcje utleniania-redukcji, prawo Lamberta-Beera, liczba redukcyjna, absorbancja.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
W celu opracowania sprawozdania należy:
a) Na podstawie zmierzonej wartości absorbancji roztworu wzorcowego cukru obliczyć
stężenie cukru w badanych mieszaninach.
b) Określić ilość grup aldehydowych w analizowanych mieszaninach.
c) Jakie mogą wystąpić różnice w reakcji stosując jako substrat cukier prosty
i disacharyd.
d) Czy występują różnice między drożdżami „zwykłymi” a hodowlanymi.
e) Sformułować obserwacje wynikające z przeprowadzonych doświadczeń.
LITERATURA
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z Biochemii, PWN, Warszawa (1999)
F. Nowotny, Biochemia węglowodanów, PWRiL, Warszawa (1968)
Mohd R.Y., Saroj M., Subhash Ch., ß-Glucosidase catalyzed synthesis of octyl-ß-Dglucopyranoside using whole cells of Pichia etchellsii in micro aqueous media, Journal
of Biotechnology, 2010, 150, 490-496
L.Włodek, Biochemia, Ćwiczenia praktyczne dla studentów wydziału
farmaceutycznego, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków (2000)
B. Filipowicz, W. Ostrowski, Ćwiczenia z chemii ogólnej i fizjologicznej, PZWL,
Warszawa (1983)
R. Dylewski, Technologia chemiczna-surowce, WPŚl., Gliwice (1997)
S. M. Roberts, K. Wiggins, G. Casy, S. Phythian, C. Todd, Preparative
Biotransformations Whole Cell and Isolated Enzymes in Organic Synthesis, John Wiley
& Sons., (1996)
J. M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, PWN, Warszawa (2005)
R.K. Murray, D.K. Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell, Biochemia Harpera, PZWL,
Warszawa (2012)
K. Drauz, H. Waldman, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Weinheim: Wiley-VCH.
(1995),
U. T. Bornscheuer, R.J. Kazlauskas, Hydrolases in Organic Chemistry, Weinheim:
Wiley-VCH. (1999).
8