LightCycler SeptiFast Test MG

Transkrypt

LightCycler® SeptiFast Test MG
Do stosowania z urządzeniem LightCycler® 2.0
(numer seryjny 1415001 oraz numery późniejsze)
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
DO STOSOWANIA Z:
LightCycler® SeptiFast Kit MG
54 Tests
SeptiFast Lys Kit MG
100 Tests
SeptiFast Prep Kit MG
10 Tests
SeptiFast Software Set v2.0
REF : 04 469 046 001
REF : 04 404 432 001
REF : 04 404 459 001
REF : 05 164 443 001
PRZEZNACZENIE
Test LightCycler® SeptiFast MG jest testem opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego in vitro, służącym do detekcji i identyfikacji
bakteryjnego i grzybiczego DNA mikroorganizmów wymienionych na liście głównej testu SeptiFast (Septi Fast Test Master List, SML); test
przeprowadza się za pomocą urządzenia LightCycler® 2.0 z ludzkiej krwi pobranej na K-EDTA.
Omawiany test stosuje się w odniesieniu do obrazu klinicznego uznanych analiz mikrobiologicznych i/lub innych wskaźników laboratoryjnych
jako pomoc w postępowaniu u osób, u których podejrzewa się posocznicę i inne bakteryjne/grzybicze zakażenia krwi.
PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU
Posocznica, wywoływana najczęściej przez bakteriemię i/lub fungemię, jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności
w szpitalach. Odpowiednie stosowanie antybiotyków oraz szybkie rozpoczęcie leczenia są czynnikami decydującymi o zmniejszeniu
zachorowalności i śmiertelności związanej z posocznicą.
Odsetek pacjentów leczonych początkowo niewłaściwymi antybiotykami w oddziałach intensywnej opieki medycznej jest znaczny i waha się
od 11% do 46% (1,2,3). W szpitalach potrzeba zwykle co najmniej 48 godzin, aby wykorzystując posiewy krwi, zidentyfikować patogen(y)
grzybiczy(e)/bakteryjny(e) i określić jego (ich) wrażliwość na leki (1).
Szybkie wykrycie patogenu za pomocą diagnostyki molekularnej może ułatwić szybkie rozpoznanie bakteriemii/fungemii i wcześniejsze
rozpoczęcie odpowiedniej antybiotykoterapii, równocześnie zmniejszając nadużywanie niewłaściwych antybiotyków o szerokim spektrum (4,5).
Test LightCycler® SeptiFast MG zaprojektowano do wykrywania mikroorganizmów odpowiedzialnych za mniej więcej 90% wszystkich
zakażeń krwi (1,6). Podczas gdy metody mikrobiologiczne wykrywają żywe mikroorganizmy, niniejszy test wykrywa zarówno żywe, jak
i martwe mikroorganizmy oraz wolny DNA drobnoustrojów. Wykrywane gatunki wymieniono na liście głównej testu SeptiFast (SML) w tabeli 1.
Gatunki te z powodzeniem wykrywano przy użyciu testu LightCycler® SeptiFast MG podczas badań wewnętrznych i/lub prób klinicznych.
Niektóre z tych gatunków to te, które najczęściej są leczone niewłaściwie: Enterococcus spp., E. coli, Candida spp., Klebsiella spp. (6).
Dodatkowo w przypadku niektórych wykrywanych gatunków z listy SML istotna jest ich wczesna identyfikacja, ponieważ wywołują one
zakażenia najtrudniejsze do leczenia: Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6).
W pojedynczej próbce można wykryć więcej niż jeden gatunek.
Z tego powodu wynik badania PCR w czasie rzeczywistym jest dodatkowym narzędziem ułatwiającym wczesną ocenę kliniczną.
Tabela 1: Lista główna testu SeptiFast (SML)
Gram (–)
Gram (+)
Grzyby
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
Klebsiella (pneumoniae/oxytoca)
CoNS1
Candida tropicalis
Serratia marcescens
Streptococcus pneumoniae
Candida parapsilosis
Enterobacter (cloacae/aerogenes)
Streptococcus spp.2
Candida glabrata
Proteus mirabilis
Enterococcus faecium
Candida krusei
Pseudomonas aeruginosa
Enterococcus faecalis
Aspergillus fumigatus
Acinetobacter baumannii3
Stenotrophomonas maltophilia
1
2
3
Koagulazoujemne Staphylococci (gatunki, które reprezentują grupę CoNS, wymieniono w tabeli 8).
Gatunki, które reprezentują grupę Streptococcus spp., wymieniono w tabeli 8.
Gatunki często określane jako A. calcoaceticus-A. baumannii (Acb complex) nie są wykrywane (8).
Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na konću tego dokumentu.
04822625001-08PL
1
Doc Rev. 8.0
ZASADY PROCEDURY
Test LightCycler® SeptiFast MG oparty jest na 3 głównych procesach:
• przygotowaniu próbki przez mechaniczną lizę i oczyszczeniu DNA;
• amplifikacji PCR (w czasie rzeczywistym) docelowego DNA w 3 równoległych reakcjach (bakterie Gram-dodatnie, bakterie
Gram-ujemne i grzyby) oraz wykrywaniu za pomocą swoistych sond do hybrydyzacji;
• automatycznym generowaniu wyniku po przeprowadzeniu analizy pików temperatur topnienia.
Przygotowanie próbki
Mechaniczna liza próbek jest przeprowadzana za pomocą zestawu SeptiFast Lys Kit MG oraz urządzenia MagNALyser. Za pomocą
zestawu SeptiFast Prep Kit MG poddane lizie próbki są inkubowane w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do
lizy, który uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony DNA przed DNAzami we krwi. Do każdej próbki jest dodawana określona objętość
kontroli wewnętrznej (IC – Internal Control) wraz z odczynnikiem lizującym. IC składa się z syntetycznych cząsteczek dwuniciowego DNA
z miejscami wiązania primerów, identycznymi jak te w docelowych gatunkach. IC zawiera unikatowe regiony wiążące sondę H,
które umożliwiają odróżnienie amplifikowanej IC od amplikonów swoistych dla docelowych organizmów. Po dodaniu buforu wiążącego
mieszanina jest przenoszona do kolumny wirującej z zawierającym włókno szklane wkładem filtrującym. Ludzki genomowy DNA
i bakteryjny/grzybiczy docelowy DNA wiążą się z powierzchnią włókna szklanego. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne
zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w dwóch etapach przepłukiwania. Po zakończeniu przepłukiwania
zaadsorbowane kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu w podwyższonej temperaturze. Eluaty są poddawane analizie PCR.
Amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym oraz detekcja
Wybór sekwencji docelowej
Jako region docelowy do różnicowania gatunków bakterii i grzybów wybrano region wewnętrznej wstawki transkrybowanej (ITS – internal
transcribed spacer). Zapewnia on wyższą czułość analityczną niż pojedyncze kopie genów, ponieważ w genomach bakterii i grzybów jest kilka
operonów. Co więcej, ITS jest bardziej swoisty gatunkowo niż rybosomalne RNA; z tego względu najlepiej nadaje się do różnicowania
gatunków. Znajduje się on między sekwencjami 16S i 23S rybosomalnego DNA wszystkich bakterii Gram (+) i Gram (–) oraz między
sekwencjami 18S i 5,8S rybosomalnego DNA wszystkich grzybów.
Amplifikacja
Przed amplifikacją PCR ryzyko skażenia amplikonów można zmniejszyć, używając enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza). Enzym ten
rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę, ale nie niszczy łańcuchów DNA zawierających dezoksytymidynę.
Przetwarzane próbki są dodawane do mieszaniny amplifikacyjnej zawierającej polimerazę Taq aktywowaną w wysokiej temperaturze
w kapilarach LightCycler® MG (100 µl), w których zachodzi amplifikacja PCR. Każda sekwencja docelowa określonych gatunków jest
amplifikowana przy użyciu ogólnych lub swoistych primerów. Mieszanina docelowych kwasów DNA jest jednocześnie amplifikowana
w kontrolach odczynników (RC – reagent control).
Wykrywanie produktów reakcji PCR w czasie rzeczywistym za pomocą sond H
Amplikon jest wykrywany z wykorzystaniem fluorescencji, za pomocą określonej pary sond H . Oznaczone barwnikiem
fluorescencyjnym sondy H hybrydyzują z wewnętrzną sekwencją amplifikowanego fragmentu podczas fazy hybrydyzacji cyklu
amplifikacji. Urządzenie LightCycler® 2.0 mierzy emitowaną fluorescencję w jednym z czterech różnych kanałów detekcji.
Po zakończeniu amplifikacji przeprowadzana jest analiza krzywej topnienia. Temperatura topnienia TM zależy od długości, sekwencji i stopnia
homologii między sondą a docelowym DNA. Sondy zaprojektowano w taki sposób, aby odróżnić gatunki wykrywane w jednym kanale za
pomocą ich wartości TM.
Automatyczna identyfikacja gatunków i kontroli
Temperatury topnienia (TM) próbek i kontroli są analizowane przez oprogramowanie przeznaczone do identyfikacji (SeptiFast Identification
Software), a następnie jest tworzony raport. Małe stężenia koagulazoujemnych gronkowców (Staphylococci; CoNS) i paciorkowców
(Streptococci), będące odzwierciedleniem skażenia procedury, nie są pokazywane jako wynik.
Jeśli uzyskano pozytywny wynik na obecność Staphylococcus aureus, należy rozważyć przeprowadzenie w dalszej kolejności badania
w kierunku oporności mecA. Szczegóły znajdują się w ulotce dołączonej do opakowania zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
(P/N: 04 488 814 001).
ODCZYNNIKI
P/N: 04 404 432 001 100 testów
LM (macierz lizująca)
szklane/ceramiczne kulki
100 x
04822625001-08PL
P/N: 04 404 459 001
10 testów
[1] LB (bufor lizujący)
< 50% tiocyjanian guanidyny
bufor Tris-HCl
20% Triton X-100
20 x 1500 µl
[2] PK(proteinaza K)
2% proteinaza K
glicerol
2 x 850 µl
[3] BB (bufor wiążący)
< 50% tiocyjanian guanidyny
bufor Tris-HCl
20% Triton X-100
10 x 1000 µl
2
Doc Rev. 8.0
P/N: 04 404 459 001
10 testów
[4] IRB (bufor usuwający inhibicję)
< 50% chlorowodorek guanidyny
bufor Tris-HCl
< 40% etanol
10 x 1800 µl
[5] WB (bufor płuczący)
< 0,2% chlorek sodu
bufor Tris-HCl
< 80% etanol
10 x 1600 µl
[6] EB (bufor do elucji)
bufor Tris-HCl
10 x 400 µl
BET (probówki do ekstrahowania krwi)
1 x 50
FC (kolumny filtracyjne)
2x5
P/N: 04 469 046 001
54 testy
[1a] RM 1a (mieszanina reakcyjna 1a)
3 U/µl polimeraza FastStart Taq
< 0,1% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza)
3 x 27 µl
[1b] RM 1b (mieszanina reakcyjna 1b)
< 1% Brij
< 0,1% roztwór magnezu
< 0,1% dNTP
bufor Tris-HCl
3 x 620 µl
[2] DM G+ (mieszanina detekcyjna dla bakterii Gram-dodatnich)
< 0,001% primer, sondy dla bakterii G+
< 1% Brij
bufor Tris-HCl
3 x 126 µl
[3] DM G– (mieszanina detekcyjna dla bakterii Gram-ujemnych)
< 0,001% primer, sondy dla bakterii G–
< 1% Brij
bufor Tris-HCl
3 x 126 µl
[4] DM F (mieszanina detekcyjna dla grzybów)
< 0,001% primer, sondy dla grzybów
< 1% Brij
bufor Tris-HCl
3 x 126 µl
[5] RC G+ (kontrola odczynników dla bakterii Gram-dodatnich)
< 0,001% kontrolny matrycowy DNA dla bakterii G+
EDTA
bufor Tris-HCl
1 x 330 µl
[6] RC G– (kontrola odczynników dla bakterii Gram-ujemnych)
< 0,001% kontrolny matrycowy DNA dla bakterii G–
EDTA
bufor Tris-HCl
1 x 330 µl
[7] RC F (kontrola odczynników dla grzybów)
< 0,001% kontrolny matrycowy DNA dla grzybów
EDTA
bufor Tris-HCl
1 x 330 µl
5 x 100 µl
[8] IC (kontrola wewnętrzna)
< 0,001% DNA w matrycy kontroli procedury dla bakterii G+, G–
i dla grzybów
EDTA
bufor Tris-HCl
[9] NC (kontrola ujemna)
< 35% glikol polietylenowy 10000
bufor Tris-HCl
10 x 1600 µl
SeptiFast Software Set v2.0
P/N: 05 164 443 001
1x
Oprogramowanie SeptiFast Identification Software v2.0
Makropolecenie SeptiFast Macro v2.0
SeptiFast mecA Macro v1.0
SeptiFast MCC Macro v1.0
Pliki testujące SeptiFast Proof Files v2.0
04822625001-08PL
3
Doc Rev. 8.0
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
Symbol bezpieczeństwa i ostrzeżeniea
NIEBEZPIECZEŃSTWO
H225: Wysoce łatwopalna ciecz i pary.
H302 + H332: Działa szkodliwie po połknięciu i w następstwie wdychania.
H315: Działa drażniąco na skórę.
H317: Może powodować reakcję alergiczną skóry.
H318: Powoduje poważne uszkodzenie oczu.
H334: Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie
wdychania.
H412: Działa szkodliwie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki.
EUH032: W kontakcie z kwasami uwalnia bardzo toksyczne gazy.
P210: Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, źródeł iskrzenia, otwartego
ognia i innych źródeł zapłonu. Nie palić.
P261: Unikać wdychania pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej cieczy.
P280: Stosować rękawice ochronne/ochronę oczu/ochronę twarzy.
P284: Stosować indywidualne środki ochrony dróg oddechowych.
P304 + P340 + P312: W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO DRÓG ODDECHOWYCH:
Wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeże powietrze i zapewnić mu warunki do
swobodnego oddychania. W przypadku złego samopoczucia skontaktować się
z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem.
P305 + P351 + P338 + P310: W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać
wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal
płukać. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub lekarzem.
P342 + P311: W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować
się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub lekarzem.
P370 + P378: W przypadku pożaru: Użyć suchego piasku, proszku chemicznego lub środka
pianotwórczego odpornego na działanie alkoholi do gaszenia.
a
Oznakowanie bezpieczeństwa produktu jest zasadniczo zgodne z wytycznymi GHS UE.
Ogólne ostrzeżenia i środki ostrożności
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Niniejszy test jest przeznaczony wyłącznie do stosowania z krwią ludzką pobraną do probówki zawierającej K-EDTA.
Nie pipetuj ustami.
Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów, stosuj
jednorazowe rękawice bez talku, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyj ręce po pracy z próbkami
i odczynnikami testowymi.
Nie łącz odczynników pochodzących z różnych serii.
Nie mieszaj odczynników z różnych zestawów, z wyjątkiem wymaganych do przygotowania mieszaniny głównej Master Mix.
Wyrzuć wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi i lokalnymi.
Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS – Material Safety Data Sheets) są dostępne na żądanie u miejscowego
przedstawiciela firmy Roche.
Z próbkami należy obchodzić się tak, jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak
określone w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) oraz w CLSI Document M29-A (9). Wszystkie
powierzchnie robocze i rękawiczki dokładnie oczyść i odkaź za pomocą odczynnika odkażającego do DNA (np. LTK-008™). Upewnij
się, że rękawiczki są odporne na działanie odczynnika odkażającego do DNA.
Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Unikaj
kontaktu wspomnianych odczynników ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą
ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania wspomnianych odczynników
należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą.
Unikaj kontaktu buforu do lizy (LB) i buforu wiążącego (BB) ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu,
natychmiast spłucz dużą objętością wody, w przeciwnym razie powstać mogą oparzenia. Przed wytarciem rozcieńcz rozlane
odczynniki wodą. Nie pozwól, by LB i BB zetknęły się z roztworem podchlorynu (wybielacza). Połączenie to może skutkować
wytworzeniem silnie trującego gazu.
Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy – należy ją rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym
i przemieszczać się jednokierunkowo w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności przedamplifikacyjne
obejmują przygotowanie odczynników i próbek. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej czynności
poprzedzającej proces amplifikacji; nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym
obszarze konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały
zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki
i kontroli lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA bądź innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia
używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
Obecność enzymu AmpErase w mieszaninie głównej (Master Mix) zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Jednakże zanieczyszczenia
materiałem pochodzącym z kontroli dodatnich oraz z dodatnich próbek klinicznych można uniknąć jedynie dzięki stosowaniu zasad
dobrej praktyki laboratoryjnej i starannemu przestrzeganiu procedur opisanych w niniejszej ulotce, dołączonej do opakowania zestawu.
04822625001-08PL
4
Doc Rev. 8.0
Szczegółowe ostrzeżenia i środki ostrożności dotyczące używania testu LightCycler® SeptiFast MG
DNA mikroorganizmów docelowych dla testu LightCycler® SeptiFast MG jest obecne w środowisku. Aby uniknąć uzyskania wyników fałszywie
dodatnich uzyskanych w następstwie wykrycia DNA pochodzącego z otoczenia (skażenie DNA), należy zapewnić przebieg procedury
w warunkach wolnych od skażającego DNA. W szczególności źródłem skażenia DNA może być użytkownik, ponieważ ludzka skóra i górne drogi
oddechowe są zasiedlone przez różne mikroorganizmy, które są także organizmami docelowymi dla testu LightCycler® SeptiFast MG
[np. Streptococci i koagulazoujemne Staphylococci (CoNS)]. Zalecane jest przestrzeganie poniższych zasad w celu uniknięcia skażenia DNA.
Odczynniki i materiały jednorazowe testu LightCycler® SeptiFast MG
• Odczynniki i materiały jednorazowe testu LightCycler® SeptiFast MG zostały opracowane w celu zmniejszenia do minimum skażenia
bakteryjnym DNA.
• Produkty MG zaprojektowano do stosowania podczas detekcji z bardzo dużą czułością kwasu nukleinowego bakterii i grzybów. W celu
eliminacji zanieczyszczeń DNA, które mogłyby interferować z takimi oznaczeniami, opracowano zastrzeżone technologie produkcji.
• Unikaj otwierania i zamykania fiolek z odczynnikami, gdy nie jest to konieczne.
Odzież ochronna i rękawiczki
• Podczas całej procedury używaj rękawiczek bez talku.
• Unikaj ekspozycji skóry; noś rękawiczki zachodzące na rękawy fartucha laboratoryjnego.
• W przypadku skażenia rękawiczek natychmiast je zmień lub wyczyść odczynnikiem odkażającym do DNA (np. LTK-008™; rękawiczki
muszą być odporne na ten odczynnik).
• Nie dotykaj części dłoniowej i palców rękawiczek podczas ich zakładania.
Konserwacja wyciągu z przepływem laminarnym
• Po każdym przygotowaniu próbek czyść powierzchnie robocze wyciągu z przepływem laminarnym za pomocą odczynnika
odkażającego do DNA.
UWAGA: Upewnij się, że sprzęt jest odporny na działanie odczynnika odkażającego do DNA.
• Czyść wszystkie powierzchnie wewnątrz wyciągu z przepływem laminarnym (tj. jego ściany, przestrzenie pod płytką dolną, płytkę
podłogową) w regularnych odstępach czasu.
• Upewnij się, że w wyciągu z przepływem laminarnym nie ma próbek z DNA (jeśli jest on używany przez kilku użytkowników).
• Włącz lampę UV i strumień powietrza na co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem pracy.
• Wyłącz lampę UV podczas przystępowania do pracy.
Konserwacja stacji roboczej PCR
• Po każdym skonfigurowaniu reakcji PCR czyść powierzchnie przestrzeni roboczej stacji roboczej PCR za pomocą odczynnika
odkażającego do DNA.
• Czyść wszystkie przestrzenie wewnątrz stacji roboczej PCR w regularnych odstępach czasu.
• Włącz lampę UV na co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem pracy. Upewnij się, że podczas pracy lampa UV jest wyłączona.
UWAGA: Zmieniaj lampę UV wyciągu z przepływem laminarnym i stacji roboczej PCR zgodnie ze wskazówkami producenta.
Postępowanie z urządzeniami i materiałami eksploatacyjnymi
• Jeżeli to możliwe, swoiste materiały eksploatacyjne i urządzenia używane do przeprowadzenia testu LightCycler® SeptiFast MG
pozostawiaj pod wyciągiem z przepływem laminarnym.
• Przed przystąpieniem do pracy poddawaj wszystkie elementy działaniu światła UV przez co najmniej 30 minut.
• Używaj wyłącznie materiałów jednorazowych wolnych od DNA (patrz część „Materiały wymagane, lecz niedostarczane”). Wymienione
materiały mogą być używane tylko jeden raz.
• Do zamykania kapilar używaj narzędzia korkującego (w celu uzyskania wskazówek dotyczących postępowania zapoznaj się
z podręcznikiem użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0).
• W przypadku pęknięcia kapilary zapoznaj się z podręcznikiem użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0 (rozdział „Konserwacja”).
Środki ostrożności podczas pipetowania
• Fiolki z odczynnikami, pudełka z końcówkami do pipet oraz pudełka z kapilarami otwieraj tylko pod wyciągiem z laminarnym
przepływem powietrza.
• Nie używaj tych samych końcówek do pipet i kapilar poza wyciągiem z przepływem laminarnym.
• Nie dotykaj krawędzi ani gwintów otwartej fiolki. Podczas pipetowania dotykaj fiolki poniżej krawędzi.
• Nie dotykaj krawędzi otwartej kapilary.
• Ustaw w logicznym porządku wszystkie elementy używane podczas pracy pod wyciągiem z przepływem laminarnym (unikaj
pipetowania „na krzyż”).
• W przypadku rozlania zakończ dany etap pracy i niezwłocznie wyczyść przestrzeń roboczą za pomocą odczynnika odkażającego do
DNA (np. LTK-008™).
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
Zestaw SeptiFast Lys Kit MG
•
•
•
Należy przechowywać w temperaturze od 15° do 25°C.
Należy otwierać fiolki tylko jeden raz. Nie wolno stosować powtórnie.
Nie należy używać po upływie daty przydatności.
Zestaw SeptiFast Prep Kit MG
•
•
•
•
•
Należy przechowywać w temperaturze od 15° do 25°C (nie zamrażać ani nie przechowywać w lodówce).
Należy otwierać PK (fiolka 2) maksymalnie 3 razy.
Pozostałe fiolki należy otwierać tylko jeden raz i wyrzucać niezużyte odczynniki.
Nie wolno używać odczynników z różnych serii podczas jednego przebiegu procesu ekstrakcji.
•
•
•
Należy przechowywać w temperaturze od –15° do –25°C.
Przechowywać z dala od światła.
Należy przechowywać mieszaniny główne Master Mix (mieszaniny [1a], [1b] i [2] lub [3] lub [4]) w temperaturze od 2° do 8°C
maksymalnie przez 3 dni.
04822625001-08PL
5
Doc Rev. 8.0
•
•
•
•
•
Należy przechowywać RC (kontrolę odczynników) po użyciu w temperaturze od 2° do 8°C maksymalnie przez 10 dni lub zamrażać
w temperaturze od –15° do –25°C natychmiast po każdym użyciu.
Można otwierać RC maksymalnie 6 razy.
Pozostałe fiolki należy otwierać tylko jeden raz i wyrzucać niezużyte odczynniki.
Nie wolno używać odczynników z różnych serii podczas jednego przebiegu PCR.
MATERIAŁY DOSTARCZONE
P/N: 04 404 432 001 100 testów
P/N: 04 404 459 001 10 testów
P/N: 04 469 046 001 54 testy
SeptiFast Software Set v2.0 (dostarczane tylko raz)
P/N: 05 164 443 001
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
Wymienione materiały można nabyć w firmie Roche
Urządzenie LightCycler® 2.0 z oprogramowaniem 4.1
03 531 414 001
Kapilary LightCycler® MG (100 µl)
03 612 066 001
Wirówka LC 2.0 na obrotowy pojemnik
03 709 582 001
Urządzenie MagNALyser (230 V)
03 358 976 001
Zestaw LightCycler® Multicolor Compensation Set
04 484 355 001
Blok chłodzący SeptiFast
04 555 864 001
Wymieniony sprzęt można nabyć w innych firmach
Wirówka z horyzontalnym wirnikiem na probówki 15 ml; min. wirowanie
z przyspieszeniem 4200 g (np. firmy Eppendorf)
• 1x wirówka 5810
• 2x łączniki (1 para) z częściami dla probówek 15 ml ze stożkowym dnem
• 1x wirnik horyzontalny, min. wirowanie z przyspieszeniem 4200 x g
VWR International
521-0076
521-0061
521-0044
Wirówka (np. firmy Eppendorf)
• 1x MiniSpin®
VWR International
521-0012
2 miksery termiczne (np. firmy Eppendorf),
• w tym 2x mikser termiczny Comfort,
• 1x blok termiczny dla 24 fiolek 2,0 ml oraz
• 1x blok termiczny dla 8 fiolek 15 ml
VWR International
460-1112
460-1116
460-1120
Mikser obrotowy dla butelek/probówek (np. firmy Stuart Scientific)
• 1x mikser obrotowy
• 1x mieszadło wibracyjne
VWR International
445-5210
444-1372
Wolne od DNA fiolki i końcówki (np. materiały jednorazowe MG Disposables,
greiner bio-one)
• Końcówki filtrujące MG 5 ml
• Końcówki filtrujące MG 1 ml
• Końcówki filtrujące MG 100 µl
• Końcówki filtrujące MG 20 µl
• Pipeta do surowicy MG 1 ml
• Probówki MG 1,5 ml
greiner bio-one
Probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml, jałowe
Sarstedt
72.692.105 bądź
odpowiednik
Odczynnik odkażający do DNA (np. firmy biodelta GmbH)
• Zestaw LTK-008™
biodelta GmbH
200-000
Pipeta 1–5 ml (np. firmy Thermo Life Sciences)
• 1x pipeta Finnpette 1–5 ml
VWR International
613-2520
Pipeta 10–1000 µl (np. firmy Eppendorf)
• 2x zakres 100–1000 µl
• 2x zakres 10–100 µl
• 1x zakres 2–20 µl (wyłącznie do wykrywania genu mecA)
VWR International
613-3650
613-3649
613-3647
Wyciąg z przepływem laminarnym (np. firmy Cleanair)
• BioSafety Cabinet EF 4E
VWR International
135-0055
Stacja robocza PCR (np. firmy Safety Cabinet Solutions Ltd.)
• Biocap Passive DNA PCR Cabinet
VWR International
135-6576
940525MG
750289MG
772289MG
774289MG
700371MG
616202MG
Materiał do kontroli dodatniej
• Dostarczany przez inne firmy lub przygotowywany w laboratorium
użytkownika (patrz część „Propozycja przygotowania materiałów do
kontroli dodatniej”).
04822625001-08PL
6
Doc Rev. 8.0
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym.
Pobieranie próbek
Test LightCycler® SeptiFast MG jest przeznaczony do użytku wyłącznie z próbkami krwi z K-EDTA. Krew powinno się pobierać do jałowych
probówek zawierających K-EDTA jako antykoagulant.
Transport i przechowywanie próbek
Krew pełna musi być transportowana zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników
etiologicznych (10). Krew pełna musi być transportowana/przechowywana w temperaturze od –15° do –25°C lub od 2° do 8°C do 3 dni lub
w temperaturze od 15° do 25°C do 4 godzin.
Stabilność eluatów
Należy używać przygotowanych próbek bezpośrednio po oczyszczeniu DNA. Należy zachować jednakową objętość każdej próbki, aby móc
później przeprowadzić badanie na obecność genu mecA (jeżeli będzie to potrzebne; więcej informacji można znaleźć w zestawie LightCycler®
SeptiFast mecA Kit MG). Eluaty można przechowywać do 30 dni w temperaturze od –15° do –25°C, do 8 dni w temperaturze od 2° do 8°C
lub w temperaturze od 15° do 25°C do 4 godzin.
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
Konfiguracja urządzenia LightCycler® 2.0 i stacji roboczej PCR
Kompensacja kolorów
Przegląd ogólny: Obiekty kompensacji kolorów (ang. CCO) są generowane w urządzeniu LightCycler® 2.0 za pomocą zestawu Multicolor
Compensation Set. Przed użyciem obiekty kompensacji kolorów muszą zostać zakwalifikowane.
Przygotowanie eksperymentu Multicolor Compensation
• Używaj zestawu LightCycler® Multicolor Compensation (P/N: 04 484 355 001).
• Używaj buforu do elucji (ang. EB, 6. fiolka zestawu SeptiFast Prep Kit MG) (P/N: 04 404 459 001).
UWAGA: Łącznie potrzebne jest 70 µl buforu do elucji. Można wykorzystać pozostałość buforu do elucji (ang. EB, 6. fiolka zestawu
SeptiFast Prep Kit MG). Pozostałość buforu do elucji musi być przechowywana w temperaturze od -15 do -25°C, a termin
przydatności wynosi 6 miesięcy.
1.
2.
3.
4.
Weź jedną fiolkę buforu do elucji (ang. EB, 6. fiolka zestawu SeptiFast Prep Kit MG).
Rozmroź wszystkie fiolki oprócz fiolki 1 (CCB) LightCycler® Multicolor Compensation (MCC), delikatnie zamieszaj i krótko odwiruj.
Umieść sześć kapilar LightCycler® (20 µl) w pozycjach 1–6 obrotowego pojemnika na próbki LightCycler®.
Przygotuj rozcieńczenie odczynnika CC530 w proporcji 1:6 (2. fiolka zestawu LightCycler® MCC) z buforem do elucji (ang. EB, 6. fiolka
zestawu SeptiFast Prep Kit):
• Odpipetuj 50 µl buforu do elucji (6. fiolka zestawu SeptiFast Prep Kit MG) do jałowej probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml
i dodaj 10 µl odczynnika CC530 (2. fiolka). Delikatnie zamieszaj i krótko odwiruj.
5. Odpipetuj po 20 µl każdego składnika do oddzielnych kapilar w następującej kolejności:
• 1. pozycja wirnika: bufor do elucji (6. fiolka zestawu SeptiFast Prep Kit MG)
• 2. pozycja wirnika: CC530 (rozcieńczona 2. fiolka)
• 3. pozycja wirnika: CC610 (3. fiolka)
UWAGA: Nie zmniejszaj objętości. Nie zmieniaj kolejności kapilar w obrotowym pojemniku na próbki LightCycler®.
6. Uszczelnij każdą kapilarę korkiem. Odwiruj, używając wirówki LC 2.0 na obrotowy pojemnik, i przenieś obrotowy pojemnik na próbki
LightCycler® do urządzenia LightCycler® 2.0.
Uruchamianie i zapisywanie przebiegu testowego kompensacji kolorów (CCR)
W celu zainstalowania i korzystania z aplikacji SeptiFast MCC_Macro_v1.0 lub nowszej zapoznaj się z rozdziałem „Uruchamianie
makropolecenia Roche Macro” w podręczniku użytkownika A urządzenia LightCycler® 2.0.
UWAGA: Nie używaj pola <assay lot number> kreatora Macro. Zamiast tego w odpowiednim polu edytora próbki wprowadź
informację o numerze serii.
1. Zapisz przebieg testowy (np. pod poniższą nazwą: SeptiFast_CCR_RRMMDD-xx, gdzie RR oznacza rok, MM – miesiąc, DD – dzień,
a xx – numer przebiegu).
2. Raport zostanie utworzony automatycznie po zakończeniu przebiegu testowego.
3. Wydrukuj raport i zapisz kopię trwałą.
Walidacja przebiegu testowego:
• Jeżeli raport LightCycler® Multicolor Compensation Set jest oznaczony jako <User Developed or Modified Test Method>, przebieg
MCC jest nieważny. Powtórz przebieg testowy.
04822625001-08PL
7
Doc Rev. 8.0
Tworzenie obiektu CC (CCO)
1. Uaktywnij moduł analizy kompensacji kolorów; naciśnij przycisk <save CC object>.
2. Aby umożliwić jednoznaczną identyfikację przez oprogramowanie SeptiFast Identification Software (SIS), zapisz obiekt kompensacji
kolorów (CCO) w następujący sposób: SeptiFast_CCO_RRMMDD-xx (RR oznacza rok, MM – miesiąc, DD – dzień, a xx – numer
przebiegu, np. SeptiFast_CCO_050313-01).
UWAGA: Przed użyciem z testem LightCycler® SeptiFast MG lub testem LightCycler® SeptiFast mecA MG obiekt kompensacji
kolorów (CC) musi zostać zakwalifikowany.
Przeprowadź eksperyment testu LightCycler® SeptiFast w celu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)
Kwalifikacja obiektu kompensacji kolorów (CCO) wymaga przebiegu testu LightCycler® SeptiFast, spełniającego jedno z kryteriów akceptacji
obiektu RC oraz NC, opisanych w tabeli „Lista kontrolna kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 1”. Zaleca się
przeprowadzenie specjalnego eksperymentu testu LightCycler® SeptiFast, złożonego z obiektów RC i 5 NC w taki sposób, że do kwalifikacji
obiektu kompensacji kolorów (CCO) można wybrać jeden obiekt NC.
UWAGA: Jeśli ważny przebieg testu LightCycler® SeptiFast, spełniający kryteria SIS, jest już dostępny w urządzeniu LightCycler®
2.0, istnieje opcja kontynuowania – w części „Wybierz ważny przebieg testu LightCycler® SeptiFast w celu kwalifikacji obiektu
kompensacji kolorów (CCO)”.
• Użyj zestawu SeptiFast Lys Kit MG (P/N: 04 404 432 001).
• Użyj zestawu SeptiFast Prep Kit MG (P/N: 04 404 459 001).
• Użyj zestawu LightCycler® SeptiFast Kit MG (P/N: 04 469 046 001).
• Użyj wzoru „Lista kontrolna kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 1” (podanego w tej części).
1. Przeprowadź eksperyment testu LightCycler® SeptiFast, wykonując cały przebieg pracy (w tym przygotowanie próbki oraz PCR).
Eksperyment składa się z obiektu RC i NC dla wszystkich 3 oznaczeń. Zaleca się użycie 4 dodatkowych obiektów NC jako próbek od
1 do 4.
UWAGA: Szczegółowy opis przygotowania próbek i kontroli, przygotowania odczynników, przygotowania PCR i ładowania oraz
obsługi urządzenia LightCycler® 2.0 można znaleźć w odpowiednich częściach niniejszej ulotki dołączonej do opakowania.
UWAGA: Zapisz przebieg pod nazwą umożliwiającą jednoznaczną identyfikację (np. Qualification_YYMMDD-xx, gdzie RR oznacza
rok, MM – miesiąc, DD – dzień, a xx – numer przebiegu).
2. Dokonaj analizy przebiegu zgodnie z opisem przedstawionym w części „Wykrywanie największej wartości oraz automatyczna
identyfikacja gatunku” i wydrukuj raport oprogramowania SeptiFast Identification Software (SIS).
3. Wypełnij „Listę kontrolną kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 1”, aby dokonać oceny wyników pod względem FLAGS
i COMMENTS w polach RUN FLAGS lub ASSAY FLAGS oraz wyników w obszarze Specimen dla 4 obiektów NC próbki, znajdujących się
w raporcie SIS. Tej listy kontrolnej należy użyć w celu dokumentacji.
4. Wróć do przebiegu testu LightCycler® SeptiFast i dokonaj oceny obu modułów Abs Quant [G(+) 610 i 640] zgodnie z „Listą kontrolną
kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 1”. Tej listy kontrolnej należy użyć w celu dokumentacji. Rozpocznij od modułu
Abs Quant G(+) 610. Postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami dla modułu Abs Quant G(+) 640.
• Przewiń w dół do modułu analizy [Abs Quant G(+) 610 Module] i kliknij go.
• Powiększ okno analizy, klikając ramkę paska.
• Sprawdź pod kątem CP.
• W zależności od wyniku wprowadź T (Tak) lub N (Nie) do kolumny „CP lub CP w [ ]”.
• Skompletuj dokumentację, drukując ekran wyniku analizy oprogramowania LightCycler® (z menu File wybierz <print window>).
Należy zachować kopię wydruków. Potwierdź ten krok przez zaznaczenie kolumny „Print Window ” w tabeli „Lista kontrolna
kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 1”.
5. Sprawdź, czy zostały spełnione kryteria akceptacji zgodne z „Listą kontrolną kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 1”.
6. Wybierz jeden z obiektów NC bez CP i kontynuuj postępowanie opisane w części „Kwalifikacja obiektu CC (CCO)”.
UWAGA: Przebieg testu LightCycler® SeptiFast, spełniający wszystkie kryteria akceptacji, może zostać użyty jako plik LightCycler®
SeptiFast.ixo, przeznaczony do wszystkich kolejnych kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO). Przebieg testu LightCycler®
SeptiFast, niespełniający wszystkich kryteriów akceptacji, nie może zostać użyty do kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów
(CCO). W takim przypadku należy powtórzyć eksperyment testu LightCycler® SeptiFast Test z zupełnie nowymi obiektami NC.
04822625001-08PL
8
Doc Rev. 8.0
Kwalifikacja obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 1 (sprawdzenie przebiegu testu LightCycler® SeptiFast i wybór jednego
z obiektów NC)
Zaleca się utworzenie kopii tej listy kontrolnej w celu dokumentacji.
Operator’s Name / Date:
LightCycler® SeptiFast Test run (*.ixo-file):
Patrz część „Przeprowadź eksperyment testu LightCycler® SeptiFast w celu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)”, krok 2 i 3:
• Analizuj przebieg testu LightCycler® SeptiFast.
• Eksportuj przebieg testu LightCycler® SeptiFast do oprogramowania SIS.
• Oszacuj wyniki dla FLAGS lub COMMENTS w polach Run Flags i Assay Flags raportu oprogramowania SIS.
Run Flags
(T/N)
Assay Flags
(T/N)
1. kryterium akceptacji: „Nie (N)” w polach Run Flags i Assay Flags.
UWAGA: W przypadku „TAK (T)” w polach Run Flags i Assay Flags powtórz przebieg pracy testu LightCycler® SeptiFast z zupełnie
nowymi obiektami NC.
•
Oszacuj wyniki w obszarze Specimen raportu oprogramowania SIS dla 4 obiektów NC próbki (dotyczy tylko przebiegu testowego
przeznaczonego do testu LightCycler® SeptiFast z 4 obiektami NC).
2. kryterium akceptacji: „: no analyte detected” w kolumnie Results, dotyczącej obiektów NC próbki.
UWAGA: Obiekty NC próbki z wykrytym analitem nie mogą zostać wykorzystane do dalszej analizy.
•
Print SIS
Report

Wydrukuj raport SIS w celu dokumentacji.
Patrz część „Przeprowadź eksperyment testu LightCycler® SeptiFast w celu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)”, krok 4–6:
• Wróć do przebiegu testowego testu LightCycler® SeptiFast , aby przeanalizować oba moduły Abs Quant [G (+) 610 i 640].
CP lub CP w [ ]
(T/N)
Próbka
Abs Quant
G(+) 610
Abs Quant
G(+) 640
#NC#
Dotyczy tylko przebiegu testowego przeznaczonego do LightCycler®
SeptiFast z 4 obiektami NC próbki:
Próbka 1-NC
Próbka 2-NC
Próbka 3-NC
Próbka 4-NC
Print Window
610 
Print Window
640 
3. kryterium akceptacji: „Nie (N)” w kolumnie „CP lub CP w [ ]” dla obu modułów Abs Quant G(+) 610 i Abs Quant G(+) 640 w co
najmniej jednym obiekcie NC.
UWAGA: Jeśli żaden obiekt NC nie spełnia kryteriów akceptacji, należy powtórzyć przebieg pracy testu LightCycler® SeptiFast
z zupełnie nowymi obiektami NC.
Spełnione kryteria akceptacji 1, 2 i 3:
TAK
NIE
Przebieg testowy można
zastosować do kwalifikacji
obiektu kompensacji kolorów
(CCO)
Przebiegu testowego nie
można zastosować do
kwalifikacji obiektu
kompensacji kolorów (CCO)
Obiekt NC wybrany do kwalifikacji (nazwa próbki):
04822625001-08PL
9
Doc Rev. 8.0
Wybierz ważny przebieg testu LightCycler® SeptiFast w celu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)
Procedura alternatywna dla części „Przeprowadź eksperyment testu LightCycler® SeptiFast w celu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów
(CCO)”. Dotyczy tylko sytuacji, gdy ważny przebieg testu LightCycler® SeptiFast, spełniający kryteria ważności opisane w części
„Przeprowadź eksperyment testu LightCycler® SeptiFast w celu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)”, jest już dostępny
w urządzeniu LightCycler® 2.0.
• Zastosuj wzór „Lista kontrolna kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 1” (zawarty w części „Przeprowadź
eksperyment testu LightCycler® SeptiFast w celu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)”).
1. Wybierz wcześniej przeprowadzony przebieg testu LightCycler® SeptiFast. Ważność tego przebiegu zostanie potwierdzona przez
odpowiedni raport SIS.
2. Zastosuj nowy obiekt kompensacji kolorów (CCO) ważnego przebiegu testu LightCycler® SeptiFast.
• Otwórz wybrany plik ważnego przebiegu testu LightCycler® SeptiFast. Otwórz moduł przebiegu testowego.
• Wybierz nowy obiekt kompensacji kolorów (CCO) z menu <Color Compensation (On)> w następujący sposób (patrz rys. 1):
• Kliknij <Color Compensation (On)>.
• Kliknij <Select Color Compensation…>.
Rysunek 1. Zastosowanie obiektu kompensacji kolorów (CCO)
•
Otwiera się okno dialogowe (<Select Object>). Odszukaj i wybierz nowy obiekt kompensacji kolorów (CCO). Kliknij przycisk
<OK>. Otwiera się kolejne okno dialogowe (<Color Compensation Channels>). Nie wolno wyłączać żadnego z kanałów. Kliknij
przycisk <OK>.
• Postępuj w ten sam sposób w stosunku do wszystkich modułów określania 12 Tm (3 testy, 4 kanały) i 2 modułów bezwzględnej
kwalifikacji.
3. Analizuj przebieg testowy LightCycler® SeptiFast zgodnie z opisem podanym w części „Przeprowadź eksperyment testu LightCycler®
SeptiFast w celu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)”, kroki 2 i 3.
4. Oszacuj oba moduły Abs Quant [G(+) 610 i 640] w sposób opisany w części „Przeprowadź eksperyment testu LightCycler® SeptiFast
w celu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)”, kroki 4 i 6.
5. Zapisz przebieg testowy z nowo zastosowanym obiektem kompensacji kolorów (CCO). Otwiera się okno dialogowe (<Change Log>).
Wprowadź powód dokonania zmiany (np. zastosowanie nowego obiektu kompensacji kolorów (CCO)).
Kwalifikacja obiektu CC (CCO)
1. Otwórz plik przeznaczony do testu LightCycler® SeptiFast.
2. Zakwalifikuj obiekt kompensacji kolorów (CCO), stosując wybrany obiekt NC (patrz „Lista kontrolna kwalifikacji obiektu kompensacji
kolorów (CCO) – część 1”).
3. Oszacuj wszystkie moduły określania TM zgodnie z „Listą kontrolną kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 2”. Tej listy
kontrolnej należy użyć w celu dokumentacji. Postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami dla modułów określania TM i zakresów
docelowych TM. Rozpocznij od modułu określania TM G(+) 640:
• Kliknij moduł analizy [np. Określanie G(+) 640].
• Aby uzyskać ogólny przegląd, uaktywnij wybrany obiekt NC wraz z #RC#. (Automatyczne skalowanie spowoduje dostosowanie
do największej wartości.)
• Edytuj wartość początkową za pomocą odpowiednich „Wartości początkowych obiektu kompensacji kolorów (CCO)”, podanych
w kolumnie „Wartość początkowa kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)” tabeli „Lista kontrolna kwalifikacji obiektu
kompensacji kolorów (CCO) – część 2” (patrz rys. 2).
UWAGA: Każdy docelowy zakres wartości TM wymaga nowego, innego ustawienia wartości początkowej w celu sprawdzenia
obiektu NC.
• Aktywuj tylko wybrany obiekt NC (patrz rys. 3). Automatyczne skalowanie spowoduje dostosowanie do największych wartości tła
fluorescencji obiektu NC. Wartość początkowa może nie być już widoczna.
Rysunek 2. Krzywe wartości topnienia obiektów RC i NC (przegląd ogólny)
RC
NC
Wartość początkowa kwalifikacji
obiektu kompensacji kolorów (CCO)
04822625001-08PL
10
Doc Rev. 8.0
Rysunek 3. Ekran wyniku analizy oprogramowania LightCycler® dla obiektu NC
Wartość początkowa
kompensacji kolorów (CCO)
NC
Zakres wartości docelowych TM
Wybierz dwa przyciski TM, aby zaznaczyć dolne i górne granice zakresu wartości docelowych TM. Informacje na temat
edytowania wartości w oknach słupków Tm można znaleźć w tabeli „Lista kontrolna kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów
(CCO) – część 2”, kolumna „Zakres wartości docelowych TM”.
• Sprawdź maksymalną wysokość wartości fluorescencji wybranego obiektu NC w części „Zakres wartości docelowych TM”.
• W zależności od wyniku wprowadź T (Tak) lub N (Nie) do kolumny „Maksymalna wysokość wartości fluorescencji poniżej
wartości początkowej kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO)”.
• Skompletuj dokumentację, drukując ekran wyniku analizy oprogramowania LightCycler® (z menu File wybierz <print window>).
Należy zachować kopię wydruków. Potwierdź ten krok przez zaznaczenie kolumny „Print Window ” w tabeli „Lista kontrolna
kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 2”.
4. Powtarzaj krok 3 do momentu, aż wszystkie zakresy wartości docelowych TM we wszystkich modułach określania TM, podane w tabeli
„Lista kontrolna kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 2”, zostaną przeanalizowane i udokumentowane przez
wypełnioną listę kontrolną i wydruki.
5. Sprawdź, czy zostały spełnione kryteria akceptacji zgodne z „Listą kontrolną kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 2”.
Obiekt kompensacji kolorów (CCO), spełniający kryteria akceptacji, jest ważny i może być używany przez okres sześciu miesięcy.
Nowe przebiegi kompensacji kolorów i kwalifikacji należy przeprowadzać co sześć miesięcy.
Rozwiązywanie problemów
Jeśli kryteria akceptacji podane w tabeli „Lista kontrolna kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 2” nie są spełnione, obiekt
kompensacji kolorów (CCO) jest nieważny i nie może być używany. Eksperyment MCC należy powtórzyć, a dla każdego obiektu kompensacji
kolorów (CCO) przeprowadzić nowy proces kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO). Jeśli trzeci z kolei obiekt kompensacji kolorów
(CCO) nie spełni kryteriów kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO), należy skontaktować się z miejscowym przedstawicielem
firmy Roche.
•
04822625001-08PL
11
Doc Rev. 8.0
Lista kontrolna kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) – część 2
Zaleca się utworzenie kopii tej listy kontrolnej w celu dokumentacji.
Operator’s Name / Date:
Przebieg testu LightCycler® SeptiFast, wykorzystywany do procesu kwalifikacji obiektu kompensacji kolorów (CCO) (*plik .ixo):
Obiekt NC wybrany do kwalifikacji (nazwa próbki):
Obiekt kompensacji kolorów (CCO) (* plik.ixo):
Patrz część „Kwalifikacja obiektu CC (CCO)”, kroki 1–4:
• Zakwalifikuj obiekt kompensacji kolorów (CCO), wykorzystując wybrany obiekt NC.
Próbka
Wartość początkowa
kompensacji
kolorów (CCO)
Zakres wartości
docelowych TM
NC
0,029
49,03–56,04
NC
0,037
59,07–63,07
Określanie TM G(+) 670
NC
0,061
49,32–53,42
NC
0,031
60,33–64,33
NC
0,039
55,48–62,37
NC
0,004
63,81–68,06
NC
0,256
48,88–53,38
NC
0,223
55,50–60,00
NC
0,107
49,51–53,51
Moduł określania TM
Określanie TM G(–) 640
Określanie TM G(–) 670
Określanie TM F 670
Maksymalna
wysokość wartości
poniżej wartości
początkowej
kompensacji kolorów
(CCO)
(T/N)
Print Window

Kryterium akceptacji: „TAK (T)” w kolumnie „Maksymalna wysokość wartości poniżej wartości początkowej kwalifikacji obiektu
kompensacji kolorów (CCO)” dla wszystkich modułów określania TM i wartości początkowej kwalifikacji obiektu kompensacji
kolorów (CCO) w wybranym obiekcie NC.
TAK
NIE
Obiekt kompensacji kolorów
(CCO) jest ważny i może być
używany przez okres sześciu
miesięcy.
Obiektu kompensacji kolorów
(CCO) nie można używać. Patrz
Rozwiązywanie problemów.
Instalacja oprogramowania SeptiFast Identification Software v2.0 (SIS):
Aby zainstalować aktualizacje, sprawdź, czy wraz z produktem dostarczono dodatkową informację.
1. Zaloguj się w stacji danych LightCycler® jako administrator.
2. Włóż płytę CD z oprogramowaniem SeptiFast Software Set do czytnika stacji danych LightCycler®.
UWAGA: Jeśli konfiguracja programu nie rozpoczyna się automatycznie, rozpocznij ręczną instalację oprogramowania SIS, klikając
plik setup.exe, znajdujący się na płycie CD należącej do zestawu oprogramowania SeptiFast.
3. Aby przeprowadzić pierwszą instalację: Jeżeli dotychczas nie zainstalowano oprogramowania szkieletowego Microsoft .NET 1.1,
zostaniesz poproszony o jego zainstalowanie na początku konfigurowania programu SIS. Oprogramowanie szkieletowe Microsoft
.NET 1.1 musi być zainstalowane. W przeciwnym przypadku oprogramowanie SIS nie będzie działać prawidłowo.
04822625001-08PL
12
Doc Rev. 8.0
4. Aby rozpocząć instalację oprogramowania SIS, naciśnij przycisk <OK>; następnie postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora
instalacji.
5. Wybierz opcję <just me>, jeżeli tylko jeden użytkownik będzie korzystał ze stacji danych LightCycler®; wybierz opcję <everyone>,
jeżeli ze stacji danych LightCycler® będzie korzystać więcej niż jedna osoba.
6. W oknie <Setup succeeded> zatwierdź dokonane czynności, naciskając przycisk <OK> (oprogramowanie SIS można uruchomić,
klikając odpowiednią ikonę na pulpicie).
7. Folder danych przeznaczony dla plików *.ixo: <C:\Export to SIS>, jest tworzony automatycznie.
Sprawdzanie, czy oprogramowanie SIS zainstalowano prawidłowo (do pracy z testem LightCycler® SeptiFast MG i zestawem LightCycler® SeptiFast mecA
Kit MG):
1. Wszystkie pliki testujące są automatycznie kopiowane z płyty CD z oprogramowaniem SeptiFast Software Set do folderu <C:\Export
to SIS>.
2. Kliknij dwukrotnie ikonę SIS na pulpicie, następnie naciśnij przycisk <Start>.
3. Wybierz plik testujący z folderu <C:\Export to SIS> (odpowiednio SeptiFast Proof v2.0.ixo lub SeptiFast mecA Proof v2.0).
4. Wybierz „NO” jako odpowiedź na pytanie, czy raport LightCycler® zawiera oznaczenie <User Developed or Modified Test Method>.
5. Plik zostanie automatycznie zanalizowany, a dane zostaną wyświetlone.
6. Wydrukuj raport.
7. Otwórz i wydrukuj właściwe pliki PDF (odpowiednio SeptiFast Proof v2.0.pdf lub SeptiFast mecA Proof v2.0.pdf).
8. Wydrukowany raport i wydrukowany plik proof.pdf muszą być ze sobą zgodne. Jeśli tak nie jest, proszę skontaktować się
z miejscowym przedstawicielem firmy Roche.
9. Wykonaj czynności z punktów 3–8 dla drugiego pliku testującego.
Odinstalowywanie programu SIS:
1.
2.
3.
4.
5.
Zaloguj się w stacji danych LightCycler® jako administrator.
Kliknij <Start> na pasku zadań stacji danych LightCycler®.
Wybierz pozycje <Settings – Control Panel – Add/Remove Programs>.
Pojawi się lista aktualnie zainstalowanych programów; kliknij pozycję <SIS>.
Wybierz <Remove> i potwierdź, klikając <Yes>.
Instalowanie makropoleceń SeptiFast Macro:
1. Zainstaluj makropolecenia z płyty CD z oprogramowaniem SeptiFast Software Set v2.0.
2. Informacje na temat instalowania makropoleceń znajdują się w podręczniku użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0 („do stosowania
w diagnostyce in vitro”).
Przygotowanie wyciągu z przepływem laminarnym oraz stacji roboczej PCR
1. Dokładnie wyczyść i odkaź wyciąg z przepływem laminarnym oraz stację roboczą PCR (np. za pomocą LTK-008™).
2. Włącz na co najmniej 30 minut: lampę UV i przepływ powietrza w wyciągu z przepływem laminarnym, lampę UV w stacji roboczej PCR.
3. Wyłącz lampę UV podczas przystępowania do pracy.
4. Otwórz zestaw LightCycler® SeptiFast Kit MG i wyjmij:
• 1 fiolkę IC oraz 1 fiolkę NC; pozostaw je do rozmrożenia w temperaturze od 2° do 8°C w statywie do przygotowywania próbki (element
niedostarczony);
• 1 fiolkę RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G–, DM F, RC G+, RC G–, RC F; fiolki pozostaw do rozmrożenia w bloku chłodzącym SeptiFast
w temperaturze od 2° do 8°C podczas przygotowywania próbek.
5. Włącz: mikser termiczny 1 (dla probówek 15 ml) i nastaw go na 56°C; mikser termiczny 2 (dla probówek 2,0 ml) i nastaw go na 70°C.
6. Włóż odpowiednią liczbę fiolek z EB (1 fiolka na próbkę/NC) do miksera termicznego 2 (70°C).
7. Umieść probówki z krwią lub fiolki z próbkami w mikserze obrotowym do butelek i mieszaj przez 30 minut. Przetwarzaj natychmiast.
Przygotowanie próbki i kontroli
UWAGA: Wszystkie etapy postępowania wykonuj pod wyciągiem z przepływem laminarnym.
Propozycja przygotowania materiałów do kontroli dodatniej
• Po rozpoczęciu procedury przygotowania próbek należy wykonać wszystkie etapy.
• Materiały do kontroli dodatniej można zakupić w innych firmach.
• Jeżeli materiały te są przygotowywane w laboratorium użytkownika, należy wybrać dobrze opisane izolaty kliniczne (opierając się na
lokalnej częstości występowania i znaczeniu klinicznym). Wyizolowane kolonie powinny zostać ponownie zawieszone i dodane do
ujemnej próbki krwi, aby uzyskać stężenie ok. 300 CFU/ml.
• Jako kontroli dodatniej można użyć materiału ATCC 33592 (metycylinoopornego S. aureus), który umożliwia zastosowanie eluatu jako kontroli
dodatniej dla testu LightCycler® SeptiFast MG oraz dla zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG (P/N: 04 488 814 001).
• Szczep hodowano przez 18–24 godzin w temperaturze od 28° do 37°C na agarze z krwią (krew owcza 5%) i ponownie zawieszono
w buforze, uzyskując roztwór równoważny 0,5 wzorcowi McFarlanda (~1,5 x 108 CFU/ml). Zawiesinę tę następnie dodaje się do
ujemnej próbki krwi, aby osiągnąć ostateczne stężenie 300 CFU/ml.
Procedura lizy wstępnej z użyciem zestawu SeptiFast Lys Kit MG
UWAGA: Dokładnie przeczytaj podręcznik użytkownika urządzenia MagNALyser.
1. Użyj jednej odpowiednio oznaczonej fiolki LM na każdą próbkę lub NC.
2. Otwórz fiolkę i przenieś 1500 µl próbki krwi lub NC.
3. Zamknij szczelnie probówkę.
UWAGA: Nie podpisuj probówek na szczycie korka.
4. Dokonaj wstępnej lizy próbek w urządzeniu MagNALyser (70 sekund przy prędkości 7000 obr./min).
5. Pozostaw fiolki poza urządzeniem na 10 minut. Nie wiruj w wirówce!
Przygotowanie próbki z użyciem zestawu SeptiFast Prep Kit MG
UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być przejrzystymi roztworami. Jeżeli powstały osady, ogrzej roztwór (maks. do 37°C).
Delikatnie wstrząśnij, aż osady rozpuszczą się.
1. Dodaj 150 µl PK do BET 1.
2. Dodaj 1 ml poddanej wstępnej lizie próbki lub NC do BET 1. Unikaj pipetowania stałej macierzy lizującej lub piany.
04822625001-08PL
13
Doc Rev. 8.0
3.
4.
5.
6.
Zamknij i mieszaj przez chwilę na mieszadle wibracyjnym.
Dodaj 10 µl IC. Do każdej próbki lub NC używaj nowej końcówki do pipety.
Dodaj zawartość 2 fiolek LB, zamknij korkiem i natychmiast dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym.
Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 56°C, delikatnie mieszając (np. za pomocą miksera termicznego firmy Eppendorf przy
prędkości 500 obr./min).
UWAGA: Całość cieczy w BET 1 musi być pokryta przez urządzenie inkubujące.
7. Dodaj zawartość 1 fiolki BB, zamknij korkiem i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym.
8. Połóż FC na BET 2. Nie dotykaj wewnętrznej strony i otworu FC.
9. Odpipetuj połowę mieszaniny przygotowawczej próbki z BET 1 na filtr FC (ok. 2,7 ml).
10. Zamknij korkiem i odwiruj układ BET 2-FC przez 1 minutę z przyspieszeniem 1900 x g.
11. Odpipetuj pozostałą mieszaninę przygotowawczą próbki z BET 1 na filtr FC (ok. 2,7 ml). Do każdej próbki lub NC używaj nowej
końcówki do pipety.
12. Zamknij korkiem i odwiruj układ BET 2-FC przez 3 minut z przyspieszeniem 1900 x g.
13. Połóż FC na BET 3. Wyrzuć BET 2 z zawartością.
14. Dodaj zwartość jednej fiolki IRB na filtr FC w BET 3.
16. Dodaj zwartość jednej fiolki WB na filtr FC w BET 3.
18. Połóż FC na BET 4. Wyrzuć BET 3 z zawartością.
19. Odwiruj BET 4 przez 1 minutę z przyspieszeniem 4200 x g.
20. Połóż FC na BET 5. Wyrzuć BET 4.
21. Odpipetuj 300 µl wstępnie ogrzanego EB (70°C) na środek FC.
22. Zamknij korkiem i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
23. Odwiruj przez 2 minuty z przyspieszeniem 4200 x g.
24. Wyrzuć FC. Przenieś eluat do fiolek 1,5 ml (np. pipetą do surowicy firmy greiner bio-one). Unikaj kontaktu ze ścianą probówki.
Przygotowanie odczynników przy użyciu zestawu LightCycler® SeptiFast Kit MG
UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie wszystkich etapów postępowania w stacji roboczej PCR w innym pomieszczeniu niż to,
w którym przygotowywano próbki.
1. Wyjmij blok chłodzący SeptiFast z fiolkami zawierającymi odczynniki z lodówki, odkaź odczynnikiem do odkażania DNA
(np. LTK-008™) i przenieś do stacji roboczej PCR.
2. Mieszaj przez chwilę rozmrożone odczynniki (z wyjątkiem RM 1a) na mieszadle wibracyjnym i odwiruj wszystkie odczynniki (jeżeli
powstały osady, przez 5 minut rozgrzewaj roztwór do temperatury 37°C i mieszaj delikatnie, aż osady rozpuszczą się).
3. Umieść fiolki z rozmrożonymi odczynnikami i fiolki z eluatami we wskazanych położeniach w bloku chłodzącym SeptiFast.
4. Otwórz fiolki RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G– i DM F.
5. Odpipetuj 600 µl RM 1b do RM 1a, wymieszaj delikatnie, pipetując w górę i w dół.
6. Odpipetuj 200 µl mieszaniny reakcyjnej z 1a do każdej fiolki DM G+, DM G– i DM F, aby stworzyć mieszaninę główną Master Mix
MM G(+), MM G(–) i MM F; wymieszaj delikatnie, pipetując w górę i w dół.
Przygotowanie reakcji PCR
1. Włóż wymaganą liczbę kapilar do bloku chłodzącego SeptiFast, 3 kapilary na RC (pozycje 1, 2, 3), 3 kapilary na eluaty NC (pozycje
4, 5, 6), 3 kapilary na każdy eluat próbki (pozycje 7 i kolejne).
2. Odpipetuj po 50 µl odczynnika MM G(+) do każdej kapilary w górnym rzędzie.
3. Odpipetuj po 50 µl odczynnika MM G(–) do każdej kapilary w środkowym rzędzie.
4. Odpipetuj po 50 µl odczynnika MM F do każdej kapilary w środkowym rzędzie.
5. Otwórz fiolkę z eluatem pierwszej próbki. Rozpocznij od fiolki po prawej stronie bloku chłodzącego SeptiFast.
6. Odpipetuj po 50 µl eluatu próbki do każdej z trzech kapilar powyżej, zawierających odczynniki MM G(+), MM G(–) i MM F.
UWAGA: Po każdym pipetowaniu zmień końcówkę.
7. Zamknij te trzy kapilary za pomocą urządzenia korkującego (część urządzenia LightCycler® 2.0; więcej informacji na temat jego
używania znajduje się w podręczniku użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0).
8. Postępuj z elauatami pozostałych próbek tak, jak to opisano w punktach 5–7. Na końcu odpipetuj eluat NC do kapilar w pozycjach 4, 5 i 6.
9. Otwórz odczynnik RC G+.
10. Odpipetuj 50 µl do kapilary w pozycji 1.
11. Zamknij kapilarę, następnie zamknij odczynnik RC G+.
12. Odpipetuj odczynniki RC G– i RC F odpowiednio do kapilar w pozycjach 2 i 3 tak, jak to opisano w punktach 9–11.
13. Przenieś wszystkie kapilary zgodnie z ich numerami do obrotowego pojemnika na próbki LightCycler®.
14. Odwiruj obrotowy pojemnik na próbki LightCycler® za pomocą wirówki LC 2.0.
15. Umieść obrotowy pojemnik na próbki LightCycler® w urządzeniu LightCycler® 2.0.
Przechowywanie niezużytych odczynników i eluatów.
1. Opatrz etykietką wszystkie niezużyte mieszaniny główne Master Mix MM G(+), MM G(–) i MM F; na etykietkach określ liczbę
pozostałych do wykonania reakcji i umieść datę. Umieść fiolki w równoważnych pozycjach bloku chłodzącego SeptiFast.
2. Mieszanina główna Master Mix MM może być przechowywana w temperaturze od 2° do 8°C do 3 dni. W celu przeprowadzenia
kolejnego przebiegu można dopełnić objętość mieszaniny głównej Master Mix (MM) świeżą MM, aby powstała wymagana objętość
roztworu roboczego. Tak powstały roztwór musi zostać natychmiast użyty.
3. Opatrz eluaty próbek i NC etykietkami z numerem przebiegu oraz datą i przechowuj zgodnie z zaleceniami.
4. Wyrzuć wszystkie puste fiolki na odczynniki.
04822625001-08PL
14
Doc Rev. 8.0
Ładowanie i obsługa urządzenia LightCycler® 2.0
UWAGA: Zaleca się, aby w pokoju, w którym pracuje urządzenie LightCycler® 2.0, nie oczyszczano DNA ani nie przygotowywano
roztworów roboczych.
1. Uruchom makropolecenie SeptiFast „SeptiFast_2.0_04469046001” (więcej informacji można znaleźć w podręczniku użytkownika
urządzenia LightCycler® 2.0 w rozdziale „Uruchamianie makropolecenia Roche Macro”).
UWAGA: Jeżeli użytkownik jest wylogowany, nie rozpoczynaj przebiegu testowego. Rozpocznij nowy przebieg z nową nazwą.
UWAGA: Nie używaj pola <assay lot number>. Jeżeli chcesz dodać numer serii oznaczenia do wykonywanego przebiegu, umieść tę
informację w odpowiednim polu w edytorze próbki.
2. Zapisz przebieg testowy z nazwą umożliwiającą jednoznaczną identyfikację (np. nazwisko użytkownika i data).
3. Zmniejsz liczbę próbek domyślnej listy załadunkowej, jeżeli wymaganych jest mniej niż 7 próbek. Wykasuj wszystkie 3 kapilary jednej
próbki z listy, nie tylko 1 lub 2 z 3 równoległych oznaczeń. Jeżeli przypadkowo wykasowano zbyt dużo kapilar, nie dodawaj ich, lecz
rozpocznij procedurę od nowa.
4. Można wpisać szczegółowe dane pacjenta w <nawiasach> zamiast używać ustawień standardowych [np. G(+) <Nazwisko_01>
zamiast G(+) <próbka 1>]. Tekst musi być identyczny w 3 równoległych oznaczeniach z listy próbki, aby zapewnić właściwe
rozpoznawanie przez oprogramowanie SIS. Można również pozostawić ustawienia standardowe i użyć opcji <Run Note>, aby
wpisywać dane wówczas, gdy jest to potrzebne.
5. Po dodaniu wszystkich informacji dotyczących próbki kontynuuj pracę z kreatorem zestawu i uruchom urządzenie LightCycler® 2.0.
UWAGA: Niektóre znaki specjalne, np. ' oraz < > ´ ` i € mogą powodować problemy z konwencją nazewnictwa podczas
wpisywania nazwy w polu nazwy.
UWAGA: Nie zmieniaj pierwszych członów nazw G(+), G(–), F.
Nie zmieniaj nazw kontroli odczynników [np. G(+) #RC#] i kontroli ujemnych [np. G(+) #NC#].
6. Po zakończonym przebiegu testowym sprawdź poziom płynu w kapilarach (wyniki dla danej kapilary będą nieważne, jeżeli objętość jej
zawartości jest zmienna).
Wykrywanie największej wartości oraz automatyczna identyfikacja gatunku
Ogólne objaśnienie modułów analizy
UWAGA: Nie rozpoczynaj analizy danych podczas pracy aparatu LightCycler® 2.0.
• Ręczne określanie TM wymaga 12 modułów określania TM (3 oznaczenia, 4 kanały). Moduły bezwzględnego oznaczania ilościowego
nie wymagają żadnej obsługi ręcznej poza kontrolą wzrokową.
• Ręczne określanie TM może zostać przeprowadzone dla nie więcej niż 6 największych wartości przy użyciu pasków TM (można
zaznaczyć maksymalnie 6 największych wartości dla danej krzywej próbki bądź próby kontrolnej).
• Ustawienia paska TM każdego modułu analizy są wstępnie definiowane w makropoleceniu SeptiFast Macro.
• W oknie największej wartości temperatury topnienia przedstawiono wszystkie krzywe wybranych wykresów.
• Można zaznaczyć lub usunąć zaznaczenie pasków TM bez tworzenia znacznika.
• Wartości początkowe każdego modułu analizy są wstępnie definiowane w makropoleceniu SeptiFast Macro.
• Nie zmieniaj ani nie usuwaj oznaczenia wartości początkowych. Jeśli doszło do przypadkowej zmiany, wpisz prawidłowe wartości
z tabeli 3: Wartości początkowe.
• Jeżeli aktywowana jest więcej niż jedna kapilara, ustawienia pierwszej kapilary są wyświetlone w polu wyboru.
• Przesunięcie pasków ma wpływ na wszystkie aktywowane kapilary.
UWAGA: Nie zmieniaj następujących ustawień: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>,
<Peak Area> ani <Peak Width>.
• Można wybrać ustawienie <Display – Peak Height>.
• Największe wartości są definiowane jako maksymalne wartości powyżej wartości początkowej. Ramiona nie stanowią największych
wartości.
• Wyjątkami są odczynnik RC G-, kanał 610 (np. Rysunek 4, Wykres 2) oraz 670, a także odczynnik RC F, kanał 705.
• Na wykresie 1 dwie największe wartości po lewej stronie są wartościami najbardziej odbiegającymi w górę i muszą zostać zaznaczone
paskami.
• Na wykresie 2 jedna z największych wartości (np. druga) jest pokazana jako ramię, ale także musi być zaznaczona.
• Na wykresach 3 i 4 brakuje jednej z największych wartości. Aktywować należy tylko dwa paski (zamiast trzech).
Rysunek 4: RC G–, kanał 610
Wykres 1
•
Wykres 2
Wykres 3
Wykres 4
Dostosuj każdy pasek TM w taki sposób, aby znajdował się w miejscu wartości najbardziej odbiegającej w górę (od wartości
początkowej), uwzględniając zakresy TM z tabeli 2.
04822625001-08PL
15
Doc Rev. 8.0
•
Zaznaczone największe wartości poza określonym zakresem TM nie zostaną odnotowane w raporcie programu SIS.
Tabela 2: Zakresy TM dla ważnych największych wartości
CH 610
•
CH 640
CH 670
CH 705
Niska TM
[°C]
Wysoka TM
[°C]
Niska TM
[°C]
Wysoka TM
[°C]
Niska TM
[°C]
Wysoka TM
[°C]
Niska TM Wysoka TM
[°C]
[°C]
G(+)
48
53
49
64
49
59
45
65
G(–)
52
66
55
69
48
65
57
62
F
56
61
44
58
49
62
51
62
Wartości początkowe są wstępnie zdefiniowane zgodnie z poniższą tabelą. Nie mogą one być zmieniane. (Jeżeli doszło do ich
przypadkowej zmiany, wpisz poprzednie wartości zgodnie z tabelą; w przeciwnym razie przebieg testowy zostanie oznaczony).
Tabela 3: Wartości początkowe
CH 610
CH 640
CH 670
G(+)
0,159
0,027
0,061
CH 705
0,027
G(–)
0,234
0,001
0,236
0,065
F
0,196
0,033
0,111
0,059
Dostosowywanie pasków TM
1. Po zakończeniu przebiegu kreator badania informuje: <Analyses have been created>.
2. Zminimalizuj okno (nie naciskaj przycisku <Finish>).
3. Upewnij się, że wartości TM i wartości początkowe są widoczne.
4. Kliknij na module analizy [np. Określanie TM G(+) 610].
5. Uaktywnij wszystkie pozycje oznaczenia, aby uzyskać ogólny przegląd [np. G(+)].
6. Kliknij tylko pozycję G(+) #RC#.
7. Dostosuj paski TM do wartości najbardziej odbiegających w górę od wartości początkowej; uwzględnij tylko ważne zakresy TM (patrz
tabela 2: Zakresy TM dla ważnych największych wartości).
Jeżeli powyżej wartości początkowej nie ma żadnej największej wartości, pasek TM musi zostać usunięty (dezaktywuj pole wyboru
w odpowiednim oknie). W procesie określania TM dla konkretnej kapilary ostatecznie tylko wartości najbardziej odbiegające w górę muszą
być oznaczone paskami TM (płaskie wykresy, nachylenia ani ramiona nie mogą zostać oznaczone z wyjątkiem wymienionych tu
drobnoustrojów). W niektórych przypadkach małe stężenia E. faecium (G+, CH 705, TM 51,8–55,9) i C. albicans (F, CH 640, TM 53,4–57,5)
mogą wyglądać jak ramiona największych wartości odpowiednich kontroli wewnętrznych (G+, CH 705, TM 45,5–49,6; F, CH 640,
TM 44,8–48,0). Zaznacz te ramiona paskami TM w pozycji TM 53,9 (G+, CH 705) oraz TM 55,5 (F, CH 640).
8. Uaktywnij następną pozycję [np. G(+) #NC#] wraz z G(+) #RC#, aby otrzymać ogólny przegląd. (Automatyczne skalowanie spowoduje
dostosowanie do największej wartości).
9. Aktywuj tylko wybraną pozycję [np. G(+) #NC#]. (Automatyczne skalowanie spowoduje dostosowanie do największych wartości tła
kontroli ujemnej. Wartość początkowa może nie być już widoczna).
10. Kontynuuj wykrywanie największych wartości tak, jak to opisano w punktach 5–7.
11. Po zakończeniu analizy jednego oznaczenia [np. określanie TM G(+) 610] przejdź do następnego oznaczenia tak, jak to opisano
w punktach 4–10.
Kończenie określania TM
1. Ustaw kreator badania na środku ekranu monitora i naciśnij przycisk <Finish>.
2. Raport jest tworzony automatycznie i musi zostać wydrukowany.
3. Przebieg testowy zostanie automatycznie zapisany.
UWAGA: Jeśli dane konkretnego pacjenta znajdujące się w <nawiasach> w oprogramowaniu LightCycler® zostaną w jakikolwiek
sposób zmienione, należy uaktualnić bazę danych, wybierając i klikając ikony „Abs Quant G(+) 610” i „Abs Quant
G(+) 640”.
4. Eksportuj plik *.ixo do folderu <C:\Export to SIS>.
5. Sprawdź, czy w raporcie występują oznaczenia, a także czy została wyświetlona informacja <run state: complete>.
6. Jeśli w raporcie oprogramowania LightCycler® (LCS) obecne są znaczniki lub inne komunikaty dotyczące stanu przebiegu testowego,
przebieg testowy jest nieważny i testy wszystkich próbek trzeba wykonać ponownie.
Automatyczna identyfikacja największej wartości za pomocą oprogramowania SeptiFast Identification Software (SIS)
1. Kliknij dwukrotnie ikonę SIS na pulpicie, następnie naciśnij przycisk <Start>.
2. Wybierz przebieg z katalogu <C:\Export to SIS> i załaduj plik *.ixo.
3. Wybierz „Yes” lub „No”, aby wskazać, czy raport LightCycler® zawiera znacznik <User Developed or Modified Test Method>.
4. Plik *.ixo zostanie automatycznie poddany analizie, a dane będą wyświetlone w raporcie.
5. Wydrukuj raport SIS.
04822625001-08PL
16
Doc Rev. 8.0
WYNIKI
Walidacja przebiegu testowego
Walidacja przebiegu testowego jest przeprowadzana automatycznie przy użyciu oprogramowania SeptiFast Identification Software v2.0 (SIS).
Nieważne przebiegi testowe są wyświetlane i oznaczane za pomocą
.
Jeśli przebieg testowy jest nieważny, należy go powtórzyć w całości (wszystkie 3 oznaczenia). Błędy systemowe, które mogą unieważnić
przebieg testowy, wymieniono w niniejszym dokumencie w rozdziale Rozwiązywanie problemów.
Walidacja oznaczenia
Znaczniki, które można utworzyć w związku z ważnością trzech różnych oznaczeń i ich interpretacją, wymieniono w tabeli 4.
Tabela 4: Znaczniki związane z walidacją oznaczenia i próbki
Komentarze
1
Interpretacja
ASSAY FLAG
NC: IC not detected
W NC nie wykryto ani docelowego mikroorganizmu, ani IC.
ASSAY FLAG
NC: < CH …, TM …, PH …, CP1 …>,< gatunki >
W NC wykryto gatunek.
ASSAY FLAG
NC: more amplicons detected
Dodatkowe oznaczenie, jeżeli w NC wykryto więcej niż
3 amplikony.
ASSAY FLAG
RC: No amplicon: <gatunki>
Nie wykryto jednego lub więcej amplikonów w RC.
ASSAY FLAG
RC: more amplicons not detected
Dodatkowe oznaczenie, jeżeli w RC nie wykryto więcej niż
3 amplikonów.
SPECIMEN FLAG
IC not detected
Nie wykryto ani docelowej sekwencji, ani IC.
Wartość CP jest wyświetlana tylko dla kanałów G(+) 610 i 640.
Interpretacja wyników
Oprogramowanie SeptiFast Identification Software v2.0 (SIS) może tworzyć OZNACZENIA i KOMENTARZE, takie jak RUN FLAGS, ASSAY FLAGS
i FLAGS w oknie SPECIMEN (patrz niżej). Użytkownik musi sprawdzić wydruk(i) przebiegu, aby ustalić, czy w jakimkolwiek oknie występują
FLAGS lub COMMENTS.
Rysunek 5: Okno Specimen
Specimen
Próbka
SeptiFast1
Assay
Data
Result
G(+)
<CH..., TM..., PH..., CP...>
<gatunki>
G(–)

F

Flags
Comment
1
Wartości CP są wyświetlane tylko dla kanałów G(+) 610 i 640.
Dodatkowe informacje można uzyskać w polach COMMENT dla RUN FLAGs i ASSAY FLAGs.
Wyniki próbki
Nazwy <gatunków> w polu RESULT wskazują, że w próbce wykryto istotny mikroorganizm. Obliczone dane dotyczące odnośnych
największych wartości są wyświetlane w polu DATA; zawierają one kanał (CH), temperaturę topnienia (TM), największą wartość (PH) oraz punkt
przecięcia (CP1).
Symbol  w polu RESULT oznacza, że nie wykryto oznaczanego składnika w zakresie zdefiniowanych kryteriów dla gatunków z listy SML.
Interpretacja wartości CP dla kanałów G(+) 610 lub 640
Wyniki wyświetlone w modułach analizy bezwzględnego oznaczania ilościowego oprogramowania LightCycler® należy zweryfikować przez
porównanie z wynikami wyświetlonymi w raporcie oprogramowania SIS.
1. Kliknij ikonę Abs Quant 610.
2. Uwidocznij kolumnę wyników, w której wyświetlone są wartości CP, przesuwając okna z wykresami na prawą stronę ekranu.
3. Wybierz pojedynczą kapilarę, której dotyczy wyświetlona wartość CP. Skontroluj wzrokowo krzywą wzrostu amplifikacji i upewnij się, że
wzrost oraz wyświetlona wartość CP są zgodne.
4. Posługując się objaśnioną poniżej „regułą wartości granicznej CP”, porównaj wyświetlony wynik próbki z odpowiednim wynikiem próbki
z raportu programu SIS. Upewnij się, że oba wyniki są zgodne. Jeśli tak nie jest, skontaktuj się z miejscową firmą stowarzyszoną z firmą
Roche.
5. Powtórz czynności opisane powyżej w punktach od 2 do 4 ze wszystkimi kapilarami z wyświetloną wartością CP.
6. Kliknij ikonę Abs Quant 640.
7. Powtórz czynności opisane powyżej w punktach od 2 do 5 ze wszystkimi kapilarami z wyświetloną wartością CP.
Reguła wartości granicznej CP
Kilka drobnoustrojów z listy głównej testu SeptiFast (Septi Fast Master List, SML) występuje na powierzchni ciała jako normalna flora
bakteryjna. Mogą one zostać przeniesione do testu SeptiFast podczas pobierania krwi. Reguła wartości granicznej CP to funkcja
oprogramowania, która zmniejsza odsetek wyników dodatnich, dotyczących pewnych drobnoustrojów komensalnych, na podstawie założenia,
że doszło do skażenia nimi próbki i nie są one czynnikami przyczynowymi rzeczywistej infekcji. Reguła wartości granicznej CP odnosi się tylko
do koagulazoujemnych szczepów gronkowców (CoNS) i szczepów Streptococcus spp. i została ustawiona na 20 cykli. Wartość CP < 20
oznacza wynik dodatni, natomiast wartość CP > 20 uważa się za wynik wskazujący na skażenie, wyświetlany w raporcie oprogramowania SIS
jako wynik ujemny.
04822625001-08PL
17
Doc Rev. 8.0
Wykrywanie genu mecA
Jeśli uzyskano pozytywny wynik na obecność Staphylococcus aureus, należy rozważyć przeprowadzenie w dalszej kolejności badania
w kierunku oporności mecA. Szczegóły znajdują się w ulotce dołączonej do opakowania zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
(P/N: 04 488 814 001).
KONTROLA JAKOŚCI
Do każdego z 3 równoległych oznaczeń [G(+), G(–), F] w każdym przebiegu testowym należy włączyć jedną ujemną próbę kontrolną (NC)
oraz po jednej z 3 kontroli odczynników (RC). Wartości NC i RC muszą być umieszczone w określonych pozycjach, tak jak to opisano w części
„Przygotowanie reakcji PCR”.
Zaleca się poddanie wszystkim procedurom przetwarzania próbek własnego materiału dodatniego jako kontroli dodatniej (zgodnie z opisem
w części „Materiały wymagane, lecz niedostarczane”). Przy użyciu oprogramowania SIS określa się wynik kontroli wewnętrznej (IC), kontroli
ujemnej (NC) i kontroli odczynników (RC). Jeżeli kontrole nie spełniają określonych wymogów, wyniki wszystkich próbek zostaną oznaczone
w odpowiednim polu okna SPECIMEN. Sprawdź, czy w oknie SPECIMEN na wydruku przebiegu znajdują się znaczniki i komentarze, aby
upewnić się, że wyniki są ważne.
Ujemna próba kontrolna (NC)
W każdym oznaczeniu ważnego przebiegu testowego wynik NC musi być ujemny, a wynik wewnętrznej próby kontrolnej musi być dodatni.
Jeżeli ujemna próba kontrolna (NC) nie spełnia powyższych kryteriów, wyniki wszystkich próbek w oznaczeniu zostaną oznaczone. Wyniki
w tym oznaczeniu są nieważne i nie wolno ich umieszczać w raporcie. Wyniki innych ważnych oznaczeń w tym samym ważnym przebiegu
testowym są ważne i można je umieszczać w raporcie. Jednak cały przebieg testowy trzeba będzie powtórzyć, ponieważ oprogramowanie
LightCycler® nie będzie działać poprawnie w przypadku powtórzenia jednego lub dwóch spośród trzech oznaczeń.
Kontrole odczynników (RC)
W każdym oznaczeniu ważnego przebiegu testowego wynik RC musi być dodatni dla docelowych amplikonów RC. Jeżeli RC nie spełnia
powyższego kryterium, wyniki wszystkich próbek w oznaczeniu zostaną oznaczone. Wyniki w tym oznaczeniu są nieważne i nie wolno ich
umieszczać w raporcie. Wyniki innych ważnych oznaczeń w tym samym ważnym przebiegu testowym są ważne i można je umieszczać
w raporcie. Jednak cały przebieg testowy trzeba będzie powtórzyć, ponieważ oprogramowanie LightCycler® nie będzie działać poprawnie
w przypadku powtórzenia jednego lub dwóch spośród trzech oznaczeń.
Dodatnia próba kontrolna
Wynik zewnętrznej dodatniej próby kontrolnej musi być dodatni. Jeżeli własne materiały dodatnie lub zewnętrzne dodatnie próby kontrolne nie
spełniają tego kryterium, cały przebieg jest nieważny i trzeba będzie go powtórzyć. Oprogramowanie SIS nie wyświetla żadnego oznaczenia.
Wewnętrzna próba kontrolna (IC)
Wynik kontroli wewnętrznej musi być dodatni dla wszystkich próbek ujemnych oraz w kontroli ujemnej. Jeżeli wewnętrzna próba kontrolna (IC)
nie spełnia powyższego kryterium, wynik próbki jest nieważny i zostanie oznaczony.
W przypadku nieważnych prób kontrolnych należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbki i prób kontrolnych, amplifikację i wykrywanie
dla wszystkich 3 oznaczeń). Jeżeli wyniki kontroli są nadal nieważne, skontaktuj się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania
pomocy technicznej.
04822625001-08PL
18
Doc Rev. 8.0
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW
Tabela 5: Komunikaty systemowe, wyświetlane w części wydruku oprogramowania SIS, przeznaczonej na znaczniki
Komunikat systemowy
(wyświetlany w części
wydruku SIS przeznaczonej
dla oznaczeń)
Możliwa przyczyna
Czynność naprawcza
User Developed or Modified
Test Method
Przebieg testowy jest nieważny; możliwe
przyczyny opisano w podręczniku użytkownika
urządzenia LightCycler® 2.0. Standardowe
ustawienia makropolecenia (np. wartości
początkowe, protokół przebiegu testowego itp.)
mogą być zmienione.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® i sprawdź wartości początkowe w tabeli 3.
Zapisz i ponownie wyeksportuj plik.
CCC File Name: Multiple
CCC used!
W przynajmniej jednym module analizy są
aktywne co najmniej dwa pliki kompensacji
kolorów.
Wybierz odpowiednią kompensację kolorów i ponów
obliczenia.
Color Compensation has
expired on DD-Month-YY
Obiekt kompensacji kolorów jest starszy niż sześć Utwórz i zakwalifikuj nowy obiekt kompensacji kolorów.
miesięcy.
Invalid Macro
Zastosowano złe makropolecenie.
Sprawdź, czy makropolecenie w oprogramowaniu
LightCycler® i/lub SeptiFast Software Set v2.0 jest
prawidłowe.
Invalid Baseline
Wartości początkowe mogły zostać przypadkowo
zmienione.
LightCycler® i sprawdź wartości początkowe w tabeli 3.
Zapisz i ponownie wyeksportuj plik.
Invalid Control Tube
Przynajmniej jedna kontrola ma nieprawidłową
nazwę.
LightCycler® i sprawdź poprawność nazw kontroli
w edytorze próbki. Zmień nazwy na standardowe, zapisz
i ponownie wyeksportuj.
Missing Sample Tube
Przynajmniej jedna kapilara z próbką ma
niewłaściwą nazwę lub brakuje kapilar z
próbkami.
LightCycler® i sprawdź poprawność nazw próbek
w edytorze próbki. Zmień nazwy na standardowe, zapisz
Invalid LightCycler® SW
Version
Do procedury zastosowano nieprawidłową wersję Otwórz oprogramowanie LightCycler® i sprawdź
oprogramowania LightCycler®.
prawidłowość numeru wersji oprogramowania.
No Manual TM Calling
Nie przeprowadzono ręcznego określania TM (w
żadnej próbce i w żadnym module analizy).
Makropolecenie zostało zakończone bez analizy.
LightCycler® i przeprowadź ręczne określanie TM. Zapisz
+ additional run flags
Wykryto więcej niż 5 oznaczeń przebiegu
testowego.
Spróbuj samodzielnie rozwiązać opisane oznaczenia,
ponownie przeprowadź analizę przebiegu testowego za
pomocą SIS.
Invalid CCC File Name
W przynajmniej jednym module analizy są
aktywne co najmniej dwa pliki kompensacji
kolorów.
Wybierz odpowiedni plik kompensacji kolorów i ponów
obliczenia.
Jeśli w raporcie SIS brakuje jednej lub więcej próbek, sprawdź czy: 1) dowolna spośród trzech kapilar z próbką została nieprawidłowo
nazwana, tj. został przypadkowo usunięty pierwszy człon swoisty dla danego oznaczenia (G+, G–, F), lub 2) jedna lub więcej kapilar z próbką
zostały nieprawidłowo nazwane albo brakuje kapilar z próbką. Aby skorygować tę sytuację, otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® i sprawdź poprawność nazw próbek w edytorze próbki. Zmień nazwy na standardowe, zapisz i ponownie wyeksportuj.
OGRANICZENIA METODY
• Test ten został zatwierdzony wyłącznie do badania ludzkiej krwi pobranej do probówki zawierającej K-EDTA (substancję
przeciwkrzepliwą). Badanie innych rodzajów próbek może dawać wyniki nieprawidłowe, fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie.
• Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki, transportu, przechowywania oraz procedur obróbki.
• Niniejszy produkt powinien być używany wyłącznie przez personel specjalnie przeszkolony do pracy z testem LightCycler® SeptiFast MG.
• Działanie testu LightCycler® SeptiFast MG zostało dowiedzione dla próbek krwi zawierających od 1000 WBC/µl do 30 000 WBC/µl.
• Aktualna taksonomia mikroorganizmów opiera się głównie na klasyfikacji fenotypowej (właściwościach biochemicznych
i fizjologicznych); może nie być identyczna z ustaleniami genetycznymi.
• Pomimo tego, że primery i sondy skierowane są przeciw wysoce konserwatywnym fragmentom regionu wewnętrznej wstawki
transkrybowanej (ITS – Internal Transcribed Spacer), docelowo swoista temperatura topnienia (TM) sond H może ulec
zmianie na skutek losowej zmienności sekwencji genomu poszczególnych gatunków bakterii.
• W niektórych przypadkach, gdy wiele mikroorganizmów z listy SML znajduje się w próbkach, nie wszystkie mikroorganizmy będą
zgłaszane w raporcie.
04822625001-08PL
19
Doc Rev. 8.0
OCENA KLINICZNA
Wyniki badania klinicznego
Nie obliczono czułości i swoistości diagnostycznej, ponieważ nie jest dostępna odpowiednia metoda referencyjna.
Posiewy krwi (BC) lub PCR przeprowadzono ogółem w 358 próbkach pochodzących od 177 pacjentów z posocznicą. Wyłączono próbki
zawierające gatunki, których nie ma na liście SML.
Tabela 6: Liczba gatunków wykrytych w krwi pobranej do EDTA w ramach badania klinicznego
Wyłącznie BC
Wyłącznie PCR
Obie metody
1
17
7
CoNS
14
---
4
---
1
---
Streptococcus spp.
---
3
1
---
11
2
1
23
4
Acinetobacter baumannii
1
---
1
Enterobacter aerogenes/cloacae
---
8
---
Escherichia coli
---
8
6
Klebsiella pneumoniae/oxytoca
---
15
3
Proteus mirabilis
---
---
---
---
8
---
Serratia marcescens
---
---
---
---
2
---
---
---
---
Candida albicans
---
8
6
Candida glabrata
---
---
1
Candida krusei
---
---
---
---
---
---
Candida tropicalis
---
---
---
Wszystkie mikroorganizmy łącznie
17
104
35
04822625001-08PL
20
Doc Rev. 8.0
OCENA DZIAŁANIA W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
Substancje interferujące
Następujące substancje nie wpływają na wykrywanie bakteryjnego i grzybiczego DNA za pomocą niniejszego testu.
Tabela 7: Substancje interferujące
Nr
Nazwa handlowa
Substancja czynna
Producent
1 x Cmaks.
3 x Cmaks.
Jednostka
1
Piperacillin®
piperacylina
Hexal
4,0
12,0
mg/ml
2
Fortum®
ceftazydym
GlaxoSmithKline
0,50
1,5
mg/ml
3
Zienam®
imipenem/cilastatyna
MSD Sharp & Dohme
0,27
0,67
mg/ml
4
Tazobac®
piperacylina/tazobaktam
Wyeth Pharma
0,75
2,3
mg/ml
5
Ciprobay®
ciprofloksacyna
Bayer
33,3
100,0
µg/ml
6
Vancomycin®
wankomycyna
Lilly
83,0
250,0
µg/ml
7
Refobacin®
gentamycyna
Merck
80,0
240,0
µg/ml
8
Zyvoxid®
linezolid
Pfizer
0,10
0,30
mg/ml
mg/ml
9
Sobelin®
klindamycyna
Pfizer
0,30
0,90
10
InfectoClont®
metronidazol
Infectopharm
83,3
250,0
µg/ml
11
Diflucan®
flukonazol
Pfizer
0,13
0,39
mg/ml
12
Cancidas®
kaspofungina
MSD Sharp & Dohme
8,3
25,0
µg/ml
13
Amphotericin B®
amfoterycyna B
Bristol-Myers Squibb
20,0
60,0
µg/ml
14
Novalgin®
metamizol
Aventis Pharma
0,83
2,5
mg/ml
15
Dexahexal®
deksametazon
Hexal
1,3
4,0
µg/ml
16
ARA-cell®
cytarabina
cellpharm
63,3
190,0
µg/ml
17
Arterenol®
norepinefryna (noradrenalina)
Aventis Pharma
4,8
14,4
µg/ml
18
Aquo-Trinitrosan®
nitrogliceryna
Merck
1,3
4,0
µg/ml
19
Heparin-Natrium-5000ratiopharm®
heparyna
ratiopharm
0,83
2,5
IU/ml
Czułość analityczna
Czułość analityczną testu LightCycler® SeptiFast MG oceniano za pomocą analizy odsetka trafień każdego oznaczanego składnika
w serii rozcieńczeń 100, 30 i 3 CFU/ml we krwi pobranej od zdrowych ochotników na EDTA (patrz tabela 8). Minimalną czułość
(30 CFU/ml) uzyskano dla wszystkich gatunków, z wyjątkiem Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae oraz Streptococcus mitis (100 CFU/ml).
Tabela 8: Gatunki badane za pomocą analizy odsetka trafień
Docelowy gatunek
Liczba dodatnich/liczba
badanych
Docelowy gatunek
Stężenie [CFU/ml]
Acinetobacter baumannii
1
2
100
30
3
8/8
12/12
11/20
Liczba dodatnich/liczba
badanych
Stężenie [CFU/ml]
100
30
3
Klebsiella pneumoniae
8/8
12/12
17/20
16/20
8/8
12/12
20/20
Proteus mirabilis
8/8
12/12
Candida albicans
8/8
12/12
12/20
8/8
12/12
5/20
Candida glabrata
8/8
12/12
10/20
Serratia marcescens
8/8
12/12
19/20
Candida krusei
8/8
12/12
8/20
8/8
12/12
8/20
8/8
12/12
7/20
Staphylococcus epidermidis1
8/8
1/12
0/20
Candida tropicalis
8/8
12/12
9/20
Staphylococcus haemolyticus1
8/8
0/12
0/20
Enterobacter aerogenes
8/8
12/12
16/20
8/8
12/12
18/20
Enterobacter cloacae
8/8
12/12
12/20
8/8
7/12
1/20
8/8
12/12
15/20
Streptococcus agalactiae2
8/8
7/12
0/20
8/8
12/12
17/20
Streptococcus pyogenes2
8/8
9/12
4/20
Escherichia coli
8/8
12/12
20/20
Streptococcus mitis2
8/8
9/12
0/20
Klebsiella oxytoca
8/8
12/12
14/20
Gatunki, które reprezentują grupę CoNS na liście SML w tabeli 1.
Gatunki, które reprezentują grupę Streptococcus spp. na liście SML w tabeli 1.
04822625001-08PL
21
Doc Rev. 8.0
Swoistość analityczna
Reprezentatywność
Aby udowodnić jednakowość i homogenność regionu docelowego ITS, zebrano izolaty kliniczne pochodzące z kilku regionów geograficznych
Europy (południowego, centralnego, północnego), z Japonii oraz z USA. Ogółem metodami mikrobiologicznymi i przy użyciu testu
LightCycler® SeptiFast MG zbadano 1709 izolatów [patrz tabela 1: Lista główna testu SeptiFast (SML)]. Zbiór z USA i z Japonii nie zawiera
gatunków Aspergillus fumigatus, Candida krusei i Staphylococcus haemolyticus. W grupach Streptococcus spp. i koagulazoujemnych
Staphylococci (CoNS) dla gatunków umieszczonych w tabeli 9 uzyskano wyniki dodatnie w teście LightCycler® SeptiFast MG. Zbiór z Japonii
nie zawiera gatunków Aspergillus fumigatus i Candida krusei.
Tabela 9: Gatunki reprezentujące grupy Streptococcus spp. i koagulazoujemnych Staphylococci
(CoNS), dla których w teście LightCycler® SeptiFast MGuzyskano wyniki dodatnie
Streptococcus spp.
Koagulazoujemne Staphylococci (CoNS)
S. agalactiae
S. hominis subsp. novobiosepticus
S. anginosus
S. pasteuri
S. bovis
S. warneri
S. constellatus
S. cohnii subsp. urealyticum
S. cristatus
S. hominis subsp. hominis
S. gordonii
S. lugdunensis
S. intermedius
S. cohnii subsp. cohnii
S. milleri
S. capitis subsp. ureolyticus
S. mitis
S. capitis subsp. capitis
S. mutans
S. caprae
S. oralis
S. saprophyticus
S. parasanguinis
S. saprophyticus subsp. saprophyticus
S. pneumoniae
S. xylosus
S. pyogenes
S. epidermidis
S. salivarius
S. haemolyticus
S. sanguinis
S. thermophilus
S. vestibularis
S. viridans
Wyniki rozbieżne otrzymano w mniej niż 1,2% wszystkich wyników.
•
•
•
•
6 spośród 143 szczepów Enterobacter (aerogenes/cloacae) miało identyczny region ITS jak Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) i zostało
zidentyfikowanych jako Klebsiella (pneumoniae/oxytoca).
Citrobacter freundii i Salmonella enterica mogą mieć identyczne regiony ITS jak, odpowiednio, Klebsiella (pneumoniae/oxytoca)
i E. coli; z tego powodu będą wykrywane jako, odpowiednio, Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) i E. coli.
14 spośród 160 szczepów Streptococcus viridans miało identyczny region ITS jak Streptococcus pneumoniae; z tego powodu będą
wykrywane jako S. pneumoniae.
W rzadkich przypadkach Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) może nie zostać wykryta, jeśli mutacja w sekwencji docelowej spowoduje
zmianę temperatury topnienia.
04822625001-08PL
22
Doc Rev. 8.0
Wyłączność diagnostyczna
Tabela 10: Gatunki, które miały ujemny wynik w każdym z oznaczeń
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Corynebacterium jeikeium
Aeromonas hydrophila
Cryptococcus neoformans
Neisseria meningitidis
Bacillus cereus
Gemella haemolysans
Pantoea agglomerans
Bacteroides fragilis
Haemophilus influenzae
Peptostreptococcus magnus
Bartonella henselae
Histoplasma capsulatum
Porphyromonas gingivalis
Bordetella pertussis
Legionella pneumophila
Prevotella denticola
Borrelia burgdorferi
Listeria monocytogenes
Propionibacterium acnes
Burkholderia cepacia
Moraxella (Branhamella) catarrhalis
Proteus vulgaris
Campylobacter jejuni
Morganella morganii
Yersinia enterocolitica
Cardiobacterium hominis
Mycobacterium fortuitum
Clostridium perfringens
Mycobacterium tuberculosis
04822625001-08PL
23
Mycoplasma pneumoniae
Doc Rev. 8.0
INFORMACJA DLA NABYWCY
Zakup niniejszego produktu umożliwia nabywcy używanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu nukleinowego w celach diagnostyki
in vitro próbek pochodzących od ludzi. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje żadnego patentu ogólnego lub innej
licencji poza prawem do określonego, szczególnego zastosowania produktu.
PIŚMIENNICTWO
1. Kollef M, et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest 1999, 115: 462-474.
2. Garnacho-Montero J, et al. Impact of inadequate empirical antibiotic therapy on the outcome of patients admitted to the ICU with
Sepsis, Crit Care Med. 2003, 31(12): 2742-51.
3. Byl B, et al. Impact of Infectious Disease Specialists and Microbiological Data on the Appropriateness of Antimicrobial Therapy for
Bacteremia, Clin Infect Dis 1999: 29: 60-66.
4. Suttorp N. “Changing populations and future trends in the management of serious infections” from: AIM website (www.infectionacademy.org).
5. Peterson LR, et al. Towards targeted prescribing: will the cure for antimicrobial resistance be specific, directed therapy through
improved diagnostic testing?, J Antimicrob Chemother 2004, 53: 902-5.
6. Harbarth S, et al. Inappropriate initial antimicrobial therapy and its effect on survival in a clinical trial of immunomodulating therapy for
severe sepsis, Am J Med. 2003, 115: 529-535.
7. Houang, E.T.S., et al. Significance of Genomic DNA Group Delineation in Comparative Studies of Antimicrobial Susceptibility of
Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother, Apr. 2003, p. 1472-1475.
8. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number
(CDC) 93-8395.
9. Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids
and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997.
10. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
04822625001-08PL
24
Doc Rev. 8.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 8.0
02/2016
Informacje dotyczące zagrożeń zostały zaktualizowane.
Zaktualizowano część dotyczącą znaków towarowych i patentów w celu odzwierciedlenia tylko
źródeł internetowych.
Z informacji o prawach autorskich usunięto tekst „Wszystkie prawa zastrzeżone”.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche.
Wyprodukowano w Niemczech
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
"
Distributed by
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Quèbec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877-273-3433)
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
68305 Mannheim, Germany
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Bilings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
C
Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Germany
Znaki towarowe i patenty
Patrz http://www.roche-diagnostics.us/patents
©2016 Roche Molecular Systems, Inc.
02/2016
Doc Rev. 8.0
04822625001-08PL
(04623886001-08ENGL)
04822625001-08
25
Doc Rev. 8.0

LightCycler SeptiFast Test MG

Transkrypt

Podobne dokumenty

Papier A4 Coloraction Mix pastelowy

Opis zajęć

Wyprawka grupa II (Pszczółki)

Tikkurila | Valtti - ochrona i dekoracja zewnętrznych powierzchni

Przetwornik PIXELPLUS 72KB Feb 06 2016 09:30:57 AM

Wzornik kolorów lazury Aidol HK

Tynki i farby ozobne | Wzornik kolorów

Wiosna/lato 2015 Nowoczesna poezja Nowoczesność, otwartość

Pobierz kartę produktu - Ekrany projekcyjne, projektory, uchwyty

ppk2410020 Clairefontaine Ksero kolorowe Trophee Oferta