Veterinary and zoonotic impact of swine influenza virus

Veterinary and zoonotic impact of swine influenza virus

Veterinary and zoonotic impact of swine influenza virus - from myths to facts
Ramona Trebbien, Lars Erik Larsen
National Veterinary Institute; Denmark
Abstract
Influenza A virus infects a number of species, including swine, humans and birds. In
general, influenza A viruses are species specific, but there are several examples of viruses jumping
from one species to another. Since pigs seem to have receptors for both avian and human influenza
subtypes, pigs has been regarded as a possible mixing vessel for new influenza subtypes.
There are two important aspects linked to influenza A infections in pigs. First, influenza A
virus infections is a common cause of respiratory disease and abortions in swine. The impact on the
production economic and animal welfare of influenza A are in our opinion underestimated.
Secondly, the latest outbreak of a new influenza A in humans (the so called swine influenza,
Mexican flu or newH1N1) has sparked an increasing public focus on the zoonotic potential of swine
influenza viruses which the pig producers and advisers have to deal with in the future.
The review deals with the pathogenesis, epidemiology, host range determinants, pathology,
clinical signs and control of swine influenza from a veterinary point of view.
Key words: swine influenza, epidemiology, host range determinants, pathology, control
1
Weterynaryjne i zoonotyczne znaczenie wirusa grypy świń - od mitów do faktów
Ramona Trebbien, Lars Erik Larsen
Państwowy Instytut Weterynaryjny w Kopenhadze, Dania
Grypa jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych i najstarszych chorób ludzi. Została ona
opisana przez Hipokratesa już w 412 roku przed naszą erą.
Grypa świń po raz pierwszy została stwierdzona w 1918 roku. Zbiegło się to w czasie z
wystąpieniem pandemii grypy ludzi, znanej jako Hiszpanka, w wyniku której zmarły miliony osób
na świecie.
Nazewnictwo
Różnorodność podtypów wirusa grypy typu A zdeterminowana jest glikoproteinami
powierzchniowymi - HA i NA. Jest to związane z odpowiedzią serologiczną przeciwko
wymienionym antygenom powierzchniowym, które już historycznie wykorzystywane były do
określania podtypu wirusa. Obecnie do charakterystyki szczepów, uwzględniającej określenie
podtypu, stosowane są nowe techniki.
Bazując na metodach serologicznych, a w ostatnich latach także na sekwencjonowaniu
genomu, odkryto 16 różnych podtypów HA i 9 podtypów NA. Wszystkie znane dotychczas
podtypy izolowano z populacji ptaków wodnych, które uznawane są za główny rezerwuar wirusa
grypy (Webster i wsp., 1992).
Nazwa wirusów grypy obejmuje literę wskazującą na typ (A, B lub C), gatunek zwierzęcia
(jedynie w przypadku izolatów ludzkich nie podaje się tej informacji w nazwie szczepu), miejsce
izolacji, kolejny numer izolacji w laboratorium, rok izolacji i podtyp szczepu. Przykładowo szczep
typu
A
wyizolowany
w
2003
roku
od
świń
w
Danii
posiada
nazwę:
A/świnia/Dania/12687/2003(H1N2).
2
Dryft genetyczny
Właściwości antygenowe wirusów grypy ulegają ciągłym zmianom. W czasie syntezy
genomu dochodzi niekiedy do zaburzenia transkrypcji, co wynika z właściwości wirusowej
polimerazy RNA, która nie posiada właściwości autokorekty. Sprzyja to występowaniu mutacji,
których częstotliwość podczas transkrypcji szacowana jest na około 1,5 x10-5 (Parvin i wsp., 1986).
Presja selekcyjna powoduje pojawianie się mutacji najbardziej korzystnych dla wirusa, sprzyjając
tworzeniu dominujących quasi gatunków. Proces ten określany jest jako dryft genetyczny. Zjawisko
to jest szczególnie ważne i występuje głównie w odniesieniu do szczepów ludzkich, co
prawdopodobnie związane jest z faktem dłuższej przeżywalności ludzi i większej częstotliwości
reinfekcji w czasie niemal corocznych epidemii choroby. Częstotliwość występowania dryftu
genetycznego u świń jest mniejsza, co wiąże się z tym, że świnie żyją znacznie krócej, w
porównaniu do ludzi. Oznacza to, że szczepy wirusów grypy krążące w populacji trzody chlewnej
są znacznie bardziej stabilne genetycznie, w porównaniu do ludzkich (de Jong i wsp., 2007). Jeśli
mutacje wpłyną na zmianę właściwości antygenowych konsekwencją dryftu antygenowego będzie
ucieczka wirusa spod kontroli układu immunologicznego gospodarza.
Szyft genetyczny (skok antygenowy)
Skok antygenowy ma miejsce wówczas, gdy komórka gospodarza zakażona zostanie
jednocześnie dwoma różnymi szczepami wirusa grypy o różnych właściwościach genetycznych i w
czasie replikacji dojdzie do wymiany segmentów genomu, czego konsekwencją będzie powstanie
szczepu o nowej konstelacji genów. W przedstawionym przypadku jednoczesnej koinfekcji
komórki dwoma szczepami, z uwagi na możliwość wymiany każdego z 8 segmentów, mogą
powstać 254 możliwe kombinacje genetyczne. Należy zaznaczyć, że nie każda reasortacja genów
musi skutkować zmianą właściwości antygenowych szczepu, jak wiadomo są one związane z
białkami HA i NA. Nie mniej jednak zmiana genetyczna dotycząca innych segmentów genomu
3
może powodować zmianę właściwości biologicznych wirusa, np. może determinować zmianę
adaptacji do gospodarza bądź zmianę zjadliwości szczepu.
W czasie epidemii grypy w Hong Kongu, w 1997 roku, spowodowanej szczepem podtypu
H5N1, 18 osób uległo zakażeniu wysoce patogennym szczepem wirusa grypy ptasiej (HPAI)
H5N1; 6 osób zmarło w wyniku ciężkiego zapalenia płuc i niewydolności oddechowej (Chan,
2009). Był to pierwszy udokumentowany przypadek bezpośredniej infekcji człowieka przez wirusa
grypy ptasiej i przełamania bariery gatunkowej człowiek-ptak. Dawniej sądzono, że do tego celu
niezbędny jest udział dodatkowego, pośredniego gospodarza. Za tzw. mikser wirusów grypy
uznawano organizm świni. Było to spowodowane rozmieszczeniem receptorów wiążących wirusa
grypy i zbliżonym powinowactwem receptorów do wirusów atakujących inne gatunki, w tym
przede wszystkim ludzi i ptaki.
W piśmiennictwie opisano przypadki naturalnego zakażenia świń szczepami o różnych
podtypach i pochodzących od różnych gospodarzy pierwotnych. Wyniki przeprowadzonych w tym
zakresie badań pokazały, że świnie poza pełną wrażliwością na zakażenie szczepami świńskimi, są
także podatne na zakażenie szczepami ptasimi i ludzkimi (Kida i wsp., 1994). Szczególnie w
krajach słabo rozwiniętych, gdzie występują gorsze warunki chowu i brak jest pewnych
zabezpieczeń uniemożliwiających bezpośredni kontakt pomiędzy zwierzętami różnych gatunków,
może dojść do przedstawionych zmian genetycznych. Wolno żyjące zwierzęta różnych gatunków
żyjące na tym samym obszarze, oraz w bliskim kontakcie z człowiekiem, stanowią zagrożenie i
predysponują do międzygatunkowej transmisji wirusów grypy, stwarzając idealne warunki do
tworzenia reasortantów.
Specyficzność gatunkowa i zakażenia międzygatunkowe
Ptaki wodne uznawane są za naturalny rezerwuar wirusów grypy typu A, ponieważ, jak
wspomniano powyżej, wszystkie znane podtypy HA (H1-16) i NA (N1-9) były izolowane od
4
ptaków. Wirusy grypy atakujące ptaki dzieli się na dwie grupy, zależnie od ich zjadliwości – na
szczepy charakteryzujące się niską patogennością (LPAI) oraz szczepy o wysokiej patogenności
(HPAI). Szczepy o niskiej patogenności wywołują chorobę o słabo lub średnio wyrażonych
objawach klinicznych, od nietypowych (przebieg niesymptomatyczny) do typowego zakażenia
górnych dróg oddechowych przebiegającego z wysoką zakaźnością i niską śmiertelnością. Wysoce
patogenne wirusy wywołują infekcje systemowe o ciężkim przebiegu, wyrażające się m. in.
spadkiem nieśności oraz wysoką śmiertelnością, sięgającą nawet do 100% zainfekowanych ptaków
(Alexander, 2000). W wyniku zmian genetycznych polegających na insercji (podstawieniu)
aminokwasów w miejscach cięcia hemaglutyniny w szczepach LPAI może dojść do zmiany ich
patogenności i przekształcenia się w szczepy HPAI. Powoduje to, że szczepy HPAI stają się
podatne na działanie proteaz komórkowych tnących nieaktywną cząsteczkę HA na dwie
podjednostki HA1 i HA2. Stwarza to wirusowi warunki do zakażania komórek organizmu ptaka
(Senne i wsp., 1996).
Wysokim powinowactwem gatunkowym cechują się szczepy wirusa grypy typu A krążące
w populacji ludzi i trzody chlewnej. Także inne gatunki ssaków wykazują wrażliwość na zakażenie
wirusami grypy należącymi do typu A, wśród nich wymienić należy konie (H7N7, H3N8), foki
(H1N1, H3, H6, H3N2, H7N7, H3N3, H4N5, H4N6), wieloryby (H13N2, H13N9), norki (H10N4,
H10N7, H3N2, H1), wielbłądy (H1N1)(Yamnikova i wsp., 1993), koty (H5N1) oraz psy (H3N8,
H3N2, H5N1)(Harder and Vahlenkamp, w druku ). U kotów wykryto obecność przeciwciał dla
wirusów grypy typu A, ponadto zanotowano jeden przypadek infekcji bydła szczepem H3N2
(Brown i wsp., 1998).
Wirusy grypy krążące w populacji ludzi i świń należą zasadniczo do 3 podtypów: H1N1,
H1N2 i H3N2. Wykazano możliwość międzygatunkowej transmisji wirusów pomiędzy tymi
dwoma gatunkami, stwierdzono, że zarówno zakażone świnie mogą być źródłem infekcji dla ludzi,
5
jaki i zakażeni ludzie, będący siewcami wirusa, mogą infekować świnie. Także wirusy grypy ptasiej
mogą zakażać świnie. W ostatnich latach udowodniono, że wirusy grypy ptasiej zdolne są do
bezpośredniej infekcji ludzi.
Różne czynniki mogą wpływać na specyficzność gatunkową i ekologię wirusów grypy,
jednym z bardziej istotnych wydaje sie być sam makroorganizm (gospodarz). Udowodniono, że
czynnikami determinującymi specyficzność gatunkową są molekularne komponenty genomu wirusa
np. wirusowe polimerazy oraz HA
(Matrosovich i wsp., 2009). Lokalizacja receptorów w
organizmie gospodarza może determinować, czy komórki wykazują wrażliwość czy nie są wrażliwe
na zakażenie określonym szczepem wirusa grypy.
Utrzymywanie zwierząt w systemie hodowli otwartej, w porównaniu do chowu
zamkniętego, może zwiększać ryzyko transferu wirusa z rezerwuaru, jakim są zwierzęta wolno
żyjące. Także utrzymywanie w jednym gospodarstwie różnych gatunków zwierząt, np. drobiu i
świń, stwarza idealne warunki do transmisji międzygatunkowej. W Norwegii opisano przypadek
transmisji pandemicznego szczepu wirusa grypy - pandemic H1N1 od pracownika obsługi do świń
(Hofshagen i wsp., 2009). Także zachowanie zwierząt (ich odruchy behawioralne) oraz
przemieszczanie zwierząt sprzyjają transmisji wirusa, w związku z czym są one wymieniane jako
czynniki ryzyka. Dostęp zwierząt wolno żyjących do chorych ptaków lub ich zwłok także może
stanowić poważny problem. W czasie występowania ognisk grypy spowodowanej szczepem
podtypu H5N1 zjadanie surowego, nie poddanego obróbce termicznej mięsa drobiowego uznano z
czynnik ryzyka dla ludzi.
Ważną rolę mogą odgrywać także różnice fizjologiczne pomiędzy potencjalnymi
gospodarzami. Przykładem może być mucyna obecna w drogach oddechowych, która może
osłabiać wirusa lub nawet go inaktywować u niektórych gatunków (Gagneux i wsp., 2003).
Rozmieszczenie
receptorów
we
wrażliwych
na
zakażenie
tkankach
gospodarza
jest
6
prawdopodobnie istotnym czynnikiem ułatwiającym wirusowi infekcję. Niektóre osobniki mogą
siać większe ilości wirusa w czasie infekcji, zwiększając tym samym ekspozycję otoczenia na
zakażenie.
Ryc.1. Schemat międzygatunkowej transmisji wirusów grypy typu A
(źródło: http://english.shanghaipasteur.cas.cn/ph/kb/200906/W020090630748385856765.jpg)
Patogeneza
Grypa świń to infekcja dróg oddechowych. Wirus przedostaje się do układu oddechowego
wraz z wdychanym powietrzem (zakażenie aerozolowe), ale do zakażenia może również dojść
poprzez zainfekowaną paszę, wodę oraz powierzchnie siedliska hodowlanego. Infekcja rozpoczyna
się w górnych drogach oddechowych, wirus replikuje głównie w komórkach nabłonka nosa,
tchawicy i oskrzeli. Zmiany chorobowe mogą rozwijać się szybko, obejmując stopniowo kolejne
odcinki dróg oddechowych, w ciągu kilku godzin po zakażeniu większość komórek układu
oddechowego może być objęta procesem zapalnym. W przypadku niepowikłanego przebiegu
choroby zmiany ustępują w ciągu kilku dni (zazwyczaj do tygodnia), zazwyczaj z powodu
osłabienia organizmu dochodzi jednak do nadkażenia bakteriami, w wyniku czego objawy
chorobowe ulegają nasileniu.
7
Siewstwo wirusa z wydzieliną z jamy nosowej można zaobserwować już od 1 dnia po
zakażeniu, może się ono utrzymywać do 7 dni (Brown, 1993;Choi, 2004). Wirus wykazuje tropizm
przede wszystkim do tkanki płucnej, komórkami docelowymi są przede wszystkim komórki
nabłonka oskrzelików. Miano wirusa w tkance płucnej jest zwykle wysokie, niemniej jednak
utrzymuje się ono krótko, zwykle 2-3 dni. Izolacja wirusa z płuc nie jest zwykle skuteczna po
upływie 7 dni od zakażenia.
Cytokiny wydzielane w organizmie gospodarza, w odpowiedzi na zakażenie wirusem grypy,
odgrywają prawdopodobnie główną rolę w rozwoju grypy świń powodując dysfunkcję układu
oddechowego, rozwój procesu zapalnego, gorączkę , apatię oraz utratę apetytu.
Zwykle nie dochodzi do wiremii w przebiegu grypy świń, aczkolwiek jest to możliwe,
towarzyszy jej zwykle niskie miano wirusa utrzymujące się przez krótki okres czasu (Brown, 1993).
Replikacja wirusa grypy świń poza układem oddechowym nie została dotychczas udowodniona
(Choi, 2004).
Objawy chorobowe
Objawy chorobowe związane z grypą świń manifestują się ostrym stanem zapalnym dróg
oddechowych, z towarzyszącą mu gorączką, brakiem apetytu, utratą masy ciała, apatią, kaszlem,
dusznością, wypływem z oczu i nosa. Wtórne infekcje bakteryjne, wikłające obraz chorobowy,
zdarzają się często, co wpływa na zaostrzenie objawów chorobowych. Zachorowalność jest zwykle
wysoka, natomiast wskaźnik śmiertelności na ogół jest niski. W przypadku niepowikłanego
przebiegu grypy choroba zwykle ustępuje samoistnie, w wyniku sekrecji przeciwciał ochronnych.
Na ogół grypa przebiega jako choroba stada, a objawy chorobowe typowe dla zainfekowanego
stada to: podwyższenie wewnętrznej ciepłoty ciała, osłabienie, apatia, niechęć do ruchu, a nawet do
picia, zapalenie spojówek, kaszel i duszność. Lochy z wysoką gorączką mogą ronić, czego
8
konsekwencją może być niepłodność. Jeśli zakażeniu stada wirusem grypy nie towarzyszą inne
wtórne infekcje w ciągu kilku tygodni dochodzi do samoistnego (spontanicznego) wyleczenia stada.
Świnie wykazują wrażliwość na zakażenie wirusami grypy typu A o odmiennym niż
świńskie pochodzeniu genów. Objawy choroby mogą być zróżnicowane, zależnie od podtypu
wirusa zakażającego. Przykładowo wirus podtypu H4N6 przeniesiony na świnie w Kanadzie
spowodował wystąpienie grypy o przebiegu zbliżonym do klasycznej grypy świń (Karasin i wsp.
2000; Karasin, 2000). W Chinach podtyp H9N2 spowodował znacznie cięższy przebieg choroby,
prawdopodobnie z powodu koinfekcji z wirusem PRRS (Guo i wsp., 2000). U ludzi zakażonych
wirusem grypy ptasiej H5N1 przebieg choroby może być bardzo ciężki, zakończony zejściem
śmiertelnym zainfekowanych pacjentów. Zaskakującym był fakt, że zmarła młoda, pierwotnie
zdrowa osoba. W przebiegu grypy H5N1 w roku 1997, w Hong Kongu, podobnie jak miało to
miejsce w czasie pandemii grypy H1N1 w roku 1918, obserwowano zapalenie płuc, nadprodukcję
cytokin w płucach oraz wielonarządowe zaburzenia czynnościowe (Korteweg i wsp., Gu,
2008;Subbarao i wsp., 1998;Taubenberger, 2006). Taki gwałtowny przebieg choroby nie został
dotychczas opisany w odniesieniu do trzody chlewnej. W przeciwieństwie do tego, zakażenie świń
szczepami wirusa grypy podtypu H5N1 skutkowało jedynie łagodnie wyrażonymi objawami lub
choroba przebiegała subklinicznie (Lipatov i wsp., 2008).
Epidemiologia
Na półkuli północnej grypę obserwuje się najczęściej w sezonie jesienno-zimowym.
Czynnikiem szczególnie predysponującym jest wprowadzenie nowych świń nosicieli wirusa do
wrażliwej
populacji.
Często
choroba
występuje
jednocześnie
w
różnych
chlewniach
zlokalizowanych w tym samym regionie. Straty spowodowane wystąpieniem grypy w stadzie są
znaczne z powodu wysokiego wskaźnika zachorowalności. Najważniejszymi czynnikami ryzyka
są: przemieszczanie zwierząt, ochłodzenie oraz nieodpowiednia wentylacja. Do zakażenia dochodzi
9
najczęściej poprzez bezpośredni kontakt zwierząt zdrowych i zakażonych, główną bramą poprzez
którą wirus dostaje się do organizmu jest nos i gardło, a miano wirusa w wydzielinie z nosa wynosi
>107 cząstek zakaźnych/ml (Landolt i wsp., 2003;Van Reeth i wsp., 2003). Wirusy, które
przedostaną się do stada krążą w nim tak długo, dopóki w stadzie znajdują się osobniki
immunologicznie naiwne. Czynniki stresogenne zwiększają podatność stada na zakażenie. Ostry
przebieg z szybkim rozprzestrzenianiem się infekcji i możliwymi zaburzeniami w rozrodzie
obserwuje się na ogół w stadach, które nie miały wcześniej kontaktu z wirusem i nie posiadają
swoistej odporności przeciwko wirusowi grypy. Przetrwałe zakażenie pojedynczych osobników
powoduje, że choroba może utrzymywać się w stadzie i z chwilą wprowadzenia do niego nowych
świń dochodzi do ponownego jej wybuchu, dotyczy to najczęściej tuczarni. Nietypowy przebieg
choroby obserwuje się w stadach, w których jedynie pewne grupy wiekowe demonstrują kliniczne
objawy zakażenia, co najczęściej dotyczy tuczników w wieku 4-6 miesięcy nie posiadających
odporności biernej laktogennej.
Zmiany sekcyjne
Zmiany widoczne po przechorowaniu grypy świń dotyczą układu oddechowego. Zmiany w
płucach zlokalizowane mogą być we wszystkich płatach, mają one wygląd silnie zaczerwienionych
ognisk zapalnych, stwardnień, niekiedy widoczny jest wysięk. Najczęściej obserwuje się je w części
doczaszkowej (w płatach szczytowych i sercowych) .
10
Ryc.2. Zmiany patologiczne w płucach świni zakażonej wirusem grypy
Ryc.3. Wynik badania immunohistochemicznego skrawków płuc świni zakażonej wirusem grypy
Profilaktyka swoista
Dostępne są szczepionki przeciwko grypie świń. Rozważając ich stosowanie należy wziąć
pod uwagę ryzyko wystąpienia dryftu i szyftu genetycznego w szczepach terenowych krążących w
11
danej populacji, których konsekwencją może być brak skuteczności profilaktyki swoistej. Dotyczy
to przede wszystkim ludzi, u których częstotliwość zmian genetycznych jest bardzo duża, co
stanowi poważny problem dla producentów szczepionek i wiąże się z koniecznością corocznej
aktualizacji składu szczepionek przeciwko grypie sezonowej. Wirusy grypy świń nie ulegają tak
częstym mutacjom, jak szczepy ludzkie, co wynika z krótkiej żywotności świni. Nie mniej jednak
mutacje punktowe także akumulują się w szczepach wirusów grypy świń, w związku z czym należy
testować szczepionki pod kątem ich powinowactwa do szczepów krążących w populacji w danym
czasie. Aby zapewnić wysoką skuteczność szczepień należy je prowadzić w połączeniu z
monitoringiem serologicznym zwierząt, pod kątem charakterystyki krążących szczepów. Należy
pamiętać, że szczepienie nie zawsze zabezpiecza przed zakażeniem i siewstwem wirusa, natomiast
zabezpiecza ono przed wystąpieniem objawów choroby (Macklin i wsp., 1998). Dlatego trzeba o
tym pamiętać, szczególnie wprowadzając naiwne immunologicznie zwierzęta do szczepionego
stada, ponieważ jak wspomniano powyżej, świnie szczepione mogą być źródłem wirusa dla świń
zdrowych (naiwnych).
Rozpoznanie
W diagnostyce grypy świń stosowanych jest wiele metod. Niektóre z nich były
wykorzystywane bardziej intensywnie, inne rzadziej, zarówno w przeszłości , jak i obecnie. Do
wykrywania przeciwciał dla wirusa grypy świń najczęściej używa się testu ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent assay) lub zahamowania hemaglutynacji (Hemagglutination inhibition test, HI).
Samo stwierdzenie obecności przeciwciał nie jest wystarczające do postawienia rozpoznania ostrej
infekcji, w związku z czym stosuje się badanie par surowic pobranych od tych samych zwierząt w
odstępie 3 tygodni. Wiele zwierząt starszych, głównie loch, posiada przeciwciała dla najczęściej
krążących podtypów wirusa grypy świń dlatego nowe zakażenie może być potwierdzone jedynie
12
poprzez wykazanie co najmniej czterokrotnego wzrostu poziomu przeciwciał w badanych parach
surowic. Na ogół, obok badań serologicznych w diagnostyce grypy stosuje się izolację wirusa.
Do wykrywania wirusa grypy typu A także można zastosować kilka metod laboratoryjnych.
Do tego celu wykorzystuje się zazwyczaj wycinki tkanki płucnej lub wymazy z nosa (te ostatnie
wykorzystywane są w diagnostyce bardziej powszechnie). Izolacji wirusa można dokonać zarówno
w hodowlach komórkowych, np. wyprowadzonych z komórek nerki świni lub psa , jak i z użyciem
zarodków kurzych. Obydwie metodą są przydatne do izolacji wirusa z próbek pobranych
przyżyciowo bądź pośmiertnie.
W ostatnich latach metody klasyczne zostają wypierane przez metody molekularne,
pozwalające na charakterystykę genomu wirusa, np. RT-PCR. Są one zwykle szybsze, bardziej
czułe, umożliwiają jednoczesne przebadanie dużej liczby próbek, co czyni je idealnym narzędziem
w szybkim wykrywaniu ognisk choroby. Zależnie od opracowanych starterów reakcji RT-PCR
może być zastosowany do wykrywania wszystkich szczepów wirusa grypy, natomiast zastosowanie
primerów charakterystycznych dla określonych typów HA i NA pozwala na określenie podtypu
izolatu.
Immunohistochemia (IHC) nie jest rutynowo wykorzystywana w rozpoznawaniu grypy
świń, choć jest to metoda pozwalająca na wykrycie antygenu wirusa w skrawkach tkanki płucnej.
Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko wirusowi grypy oraz systemu barwienia
pozwala na określenie lokalizacji zainfekowanych wirusem pneumocytów (Haines i Clark, 1991).
Piśmiennictwo u Autorów
13