Izolacja DNA z komórki roślinnej

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Izolacja DNA z komórki roślinnej
Genom jest to całość informacji genetycznej zawartej w komórce. W organizmie
roślinnym niemal cała ilość informacji o budowie i funkcjonowaniu znajduje się jest w jądrze
komórkowym, trzeba jednak pamiętać o informacji genetycznej zawartej w organellach takich jak
mitochondria i chloroplasty. Informacja ta jest przekazywana do nowo powstających komórek
w wyniku replikacji DNA w czasie podziału komórek merystematycznych, a podczas
rozmnaŜania roślin – komórkom generatywnym i następnym pokoleniom.
Genom jądrowy
Podstawowa struktura fizyczna wszystkich genomów eukariotycznych jest bardzo
podobna, ale róŜnią się one jedną waŜną cechą. Jest nią wielkość genomu, czyli wartość
odpowiadająca zawartości DNA w jądrze wyraŜona w jednostkach wagowych (pg) lub w liczbie
par zasad (Mpz) (0,1pg = ~100Mpz). Oznaczana jest symbolem C (ang. constans) na określenie
zawartości DNA w niezreplikowanym, podstawowym zespole danego gatunku. 1C DNA
odpowiada ilości DNA w gamecie, natomiast somatyczne komórki diploidalne mają 2C DNA lub
4C DNA, w zaleŜności od fazy cyklu komórkowego, odpowiednio przed i po replikacji.
Wielkość genomu jest określona dla wielu gatunków glonów, paprotników, mszaków
i roślin kwiatowych, w tym dla około 3500 gatunków okrytonasiennych, co stanowi zaledwie
1,4% opisanych gatunków. Wartości 1C DNA roślin okrytonasiennych charakteryzują się duŜą
rozpiętością (tabela 1).
Tabela 1. Zawartość DNA w jądrach wybranych roślin okrytonasiennych
Wg. www.nal.usda.gov/tables/nucna.html
Gatunek
Mpz/1C
Rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana)
145
Cebula zwyczajna (Allium cepa)
4024
Owies zwyczajny (Avena sativa)
11 315
Kapusta polna (Brassica campestris)
507
Pępawa zielona (Crepis capillaries)
1867
Jęczmień (Hordeum vulgare)
4873
Pomidor zwyczajny (Lycopersicon esculentum)
883
RyŜ siewny (Oryza sativa)
419
Pszenica zwyczajna (Triticum aestivum)
15 966
Kukurydza zwyczajna (Zea mays)
2292
Gatunki naleŜące do tej samej jednostki taksonomicznej, takiej jak rodzaj czy rodzina, są
podobne morfologicznie. Wielkość genomów natomiast moŜe się róŜnić wielokrotnie, nawet
między blisko spokrewnionymi gatunkami. O duŜej rozpiętości wielkości genomów decyduje
głównie obecność w jądrze nie tylko sekwencji kodujących ściśle związanych z genami, ale
równieŜ sekwencji pozagenowych takich jak:
a) sekwencje niekodujące – wśród których moŜna wyróŜnić DNA pełniący funkcje
regulatorowe, promotorowe lub DNA związany ze strukturą macierzy jądrowej oraz
sekwencje funkcjonalne chromosomów, tj. sekwencje telomerowe, centromerowe
i inicjacji replikacji DNA
b) sekwencje powtarzalne – stanowiące geny występujące w setkach, a czasem
w tysiącach kopii, będące istotną częścią genomu; naleŜą do nich geny rRNA, tRNA
i geny kodujące histony. Wśród sekwencji powtarzalnych wyróŜnić moŜna:
sekwencje rozproszone po całym genomie, ich liczba i pozycja moŜe się zmieniać
się w związku z moŜliwością przemieszczania się (transpozycji) w genomie
sekwencje
tandemowe
występujące
jedna
za
drugą,
tworzące
szeregi
monomerów DNA nie poprzedzielanych innymi sekwencjami
c) DNA, którego funkcja jest nieznana, określany jako „śmietnikowy DNA” (ang. junk DNA)
Genom
geny i sekwencje
związane z genami
geny pojedyncze
sekwencje
pozagenowe
geny powtarzalne
geny i sekwencje
związane z genami
geny i sekwencje
związane z genami
Rys 1. Typy sekwencji w genomie jądrowym
Genom mitochondrialny
Genomy mitochondrialne roślin są znacznie większe niŜ genomy mitochondrialne
zwierząt i grzybów. Wielkość genomu mitochondrialnego roślin uległa szybkim zmianom
w trakcie ewolucji. Za róŜnice w wielkości są odpowiedzialne wewnętrzne duplikacje oraz
integracja z genomem mitochondrialnym sekwencji pochodzących z genomu jądrowego
i plastydowego. Znacznej dynamice podlega równieŜ organizacja roślinnych genomów
mitochondrialnych: układ genów w tych genomach jest bardzo róŜny, choć zasadniczo
utrzymane są te same sekwencje kodujące. Mitochondrialny DNA (mtDNA) roślin posiada geny
związane z procesem wytwarzania energii, niektóre geny kodujące białka rybosomowe, geny
rybosomowych RNA (rRNA) oraz geny tRNA.
Genom chloroplastowy
Chloroplasty zawierają wiele kopii kolistej cząsteczki DNA. Liczba tych kopii jest zmienna
i zaleŜna od czynników zewnętrznych. Średnio jest od 20 do 60 identycznych cząsteczek,
jednak liczba ta moŜe osiągnąć zawrotną wartość 900 kopii na organellę w przypadku
intensywnej ekspozycji rośliny na światło. Tę ogromną liczbę cząsteczek DNA przypadającą na
jeden chloroplast tłumaczy się wzmoŜonym zapotrzebowaniem na rybosomy organellowe,
a zwiększenie ich liczby musi być poprzedzone powieleniem liczby genów rRNA. Poznano
całkowitą sekwencję nukleotydów kolistego DNA chloroplastowego niektórych gatunków roślin
(np. tytoń, ryŜ) i wyjaśniono funkcję większości występujących tam genów. Oprócz genów
kodujących niektóre białka chloroplastowe, DNA plastydowy zawiera takŜe geny kodujące
wszystkie rodzaje RNA chloroplastowego (mRNA, tRNA, rRNA) uczestniczące w procesie
translacji. Szacuje się, Ŝe genom plastydowy zawiera geny dla około 120 białek, co stanowi
niewielką część wszystkich białek występujących w chloroplastach, zaś pozostałe białka
kodowane są przez genom jądrowy. Wiele białek chloroplastowych np. karboksylaza
1,5-bisfosforybulozy, kluczowy enzym w procesie asymilacji CO2, powstaje w wyniku
współdziałania genomu plastydowego i jądrowego.
śyjemy w erze intensywnego poznawania sekwencji nukleotydowych genomów wielu
organizmów. Przykładem mogą być genomy dwóch roślin modelowych: Arabidopsis thaliana
(dwuliściennej) i Oryza sativa (jednoliściennej). Znamy obecnie sekwencję zarówno ich genomu
jądrowego, mitochondrialnego, jak i plastydowego.
Organizm modelowy to taki, który badany jest przez wielu naukowców ze względu na jego
cechy, które czynią go łatwym obiektem badań oraz jest on na tyle podobny do innych
organizmów, Ŝe wnioski wyciągnięte z jego badań mogą być szeroko zastosowane. Jednym
z przykładów organizmów modelowych jest Arabidopsis thaliana (rzodkienik pospolity).
Kukurydza i ryŜ – waŜne rośliny uprawne, równieŜ są szeroko badane, a Antirrhinum majus
(wyŜlin wielki, potocznie „lwia paszcza”) stał się modelem do badania kwitnienia.
Arabidopsis thaliana naleŜy do rodziny kapustowatych i jest małym, niezbyt waŜnym
chwastem rolniczym. Ma wiele istotnych cech, które czynią go odpowiednim organizmem
modelowym do badania roślin:
małe rozmiary genomu – (120 000 kpz) umoŜliwiły całkowite zsenkwencjonowanie
genomu (Arabidopsis Genome Project – AGP)
niewielkie rozmiary – pozwalają na hodowanie duŜej liczby roślin w komorach
hodowlanych i szklarniach
krótki cykl Ŝyciowy – od wykiełkowania do wytworzenia nowych nasion mija 6-8 tygodni
małe nasiona – waŜące 20µg kaŜde, około 20 000 z kaŜdej rośliny; nasiona moŜna
łatwo przechowywać i łatwo teŜ uzyskiwać duŜą liczbę roślin
łatwe indukowanie mutacji – za pomocą czynników chemicznych lub promieniowania
jonizującego
łatwy obiekt do badań molekularnych
Wykonanie ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest izolacja DNA z liści dowolnej rośliny pochodzącej z hodowli in vitro.
Materiały i sprzęt
Zestaw do izolacji DNA z roślin Genomic Mini AX Plant (A&A Biotechnology).
Materiały i sprzęt:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
50mg
liście tytoniu
ciekły azot
10ml
70% EtOH
0,5ml
bufor TE
100µl
probówki Eppendorfa
probówki 15ml z kolumną
pipety automatyczne
moździerz
łopatka metalowa
wirówka eppendorfa 12 000 – 14 000 obr./min
termoblok
worteks
Izolacja DNA
1. Próbkę materiału roślinnego (50 mg) umieścić w probówce eppendorfa i wstawić probówkę
do lodu.
2. Następnie tkankę roślinną przenieść do moździerza i ucierać energicznie z 10 ml ciekłego
azotu.
3. Przenieść utartą masę roślinną do probówki eppendorfa i dodać 0,9 ml zawiesiny lizującej
LS (uwaga: zawiesinę naleŜy wymieszać przez kilkukrotne odwracanie butelki) oraz 20 µl
roztworu Proteazy.
LS składa się z:
Tritonu X-100
Chlorowodorku guanidyny
Bufor MOPS
4. Całość wymieszać i inkubować w 50°C przez 30 min. Probówkę naleŜy mieszać od czasu
do czasu przez worteksowanie.
5. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 sek., a następnie wirować 5 min.
przy 10 000 – 14 000 obr./min.
6. Pobrać supernatant (na dnie powinien znajdować się zwarty osad stanowiący mieszaninę
niezlizowanego materiału oraz drobinek pochodzących z mieszaniny lizującej) i nanieść go
na kolumnę umieszczoną w probówce 15 ml. Poczekać aŜ lizat przejdzie przez kolumnę.
7. Następnie dwukrotnie przepłukać kolumnę przez dodanie 1,5 ml roztworu płuczącego K2.
Za kaŜdym razem poczekać aŜ roztwór wypłynie z kolumny.
Skład roztworu K2:
0,8M NaCl
15% izopropanol
Bufor MOPS
8. Dodać do kolumny 0,25 ml roztworu elucyjnego K3 i poczekać aŜ wypłynie z kolumny (krok
ten ma na celu zmniejszenie całkowitej objętości eluatu, gdyŜ martwa objętość kolumny
wynosi 0,3ml).
Skład roztworu K3:
1,2M NaCl
15% izopropanol
bufor Tris-HCl, pH=8,0
9. Przenieść kolumnę do nowej probówki 2 ml, która posiada odpowiednie Ŝeberka
pozwalające na łatwe umieszczenie w probówce i eluować DNA przez dodanie do kolumny
1 ml roztworu elucyjnego K3.
10. Do eluatu zwierającego DNA dodać 0,8 ml mieszaniny precypitacyjnej PM. Całość
wymieszać i wirować 10 min. przy 12 000 obr./min (uwaga: roztwór PM zawiera dodatkowo
wzmacniacz precypitacji, dlatego przed uŜyciem naleŜy go wymieszać przez kilkukrotne
odwracanie butelki).
Skład PM:
izopropanol
akrylami liniowy (wzmacniacz precypitacji)
11. Po odwirowaniu zlać supernatant (na dnie powinien być widoczny jasnoniebieski osad DNA)
i dodać do probówki 0,5 ml 70% EtOH, w celu wytrącenia DNA. Próbkę wymieszać
i wirować 3 min. przy 12 000 obr./min.
12. Po odwirowaniu zlać supernatant i trzymając probówkę w pozycji odwróconej, przytknąć
samą końcówkę pipety (bez pipety) do dna i ścianek probówki celem kapilarnego usunięcia
resztek alkoholu. Następnie suszyć odwróconą do góry dnem probówkę przez 5 min.
w temp. pokojowej.
13. Osad zawiesić w 20 µl buforu TE (niebieska barwa osadu pozwala kontrolować proces
rozpuszczania DNA).
Przygotowanie sprawozdania
1. Opisać procedurę izolacji DNA z komórki roślinnej i wyjaśnić cel kaŜdego etapu i rolę
kaŜdego odczynnika.
2. Scharakteryzować inny niŜ Arabidopsis thaliana roślinny organizm modelowy.
3. Wymienić główne róŜnice między genomem komórki roślinnej i zwierzęcej.
Literatura uzupełniająca:
1. Wojtaszek P, Woźny A, Ratajczak L. Biologia komórki roślinnej. Funkcja. PWN 2007
2. Lack AJ, Evans DE. Biologia roślin. Krótkie wykłady. PWN 2003
3. Brown TA. Genomy. PWN 2001
4. Kopcewicz J, Lewak S. Fizjologia roślin. PWN 2002