ćwiczenie 4 - ATRINBIOTECH

„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
ĆWICZENIE 4
MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN WYSTĘPUJĄCE U BAKTERII
POZARYZOSFEROWYCH, RYZOSFEROWYCH, RYZOPLANY, BAKTERII
ENDOFITYCZNYCH
CZĘŚĆ TEORETYCZNA
Mechanizmy promujące wzrost roślin
Bakterie pozaryzosferowe, ryzosferowe, ryzpolany, endofityczne- charakterystyka
Interakcje bakterie rośliny
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
1. Posiew wcześniej wyizolowanych bakterii pozaryzosferowych, ryzosferowych, ryzoplanu i
endofitów na podłoża sprawdzające właściwości promujące wzrost roślin. Inkubację wszystkich
podłoży przeprowadzić w temperaturze 28 oC przez 7 dni.
a) Wytwarzanie sideroforów- podłoże CAS- posiew redukcyjny.
Podłoże CAS jest niebieskie i zawiera jony żelaza Fe3+. Bakterie wydzielając do
środowiska siderofory powodują wyłapywanie żelaza i usuwanie go z kompleksu jaki
tworzy z barwnikiem chrome azurol S (CAS). Dlatego podłoże zmienia kolor. Pod
wpływem wydzielanych sideroforów katecholowych zmienia barwę na fioletowy, a w
przypadku wydzielania sideroforów hydroksamowych staje się żółto-pomarańczowe.
b) Produkcja enzymów rozkładających ścianę komórkową fitopatogenów- podłoże z
karboksymetylocelulozą (CMC)- posiew redukcyjny.
CMC w podłożu jest jedynym źródłem węgla dla bakterii. Płyn Lugola łączy się z
powstałymi po rozkładzie cukrami prostymi co powoduje, że podłoże barwi się na kolor
żółty. Jeżeli CMC nie została rozłożona to wchodzi w reakcję z płynem Lugola i
powstaje brązowo-czarne zabarwienie. Kompleks enzymatyczny- celulaza- rozkładający
celulozę składa się z trzech głównych enzymów: endoglukanaza– hydrolizuje wiązania β
-1,4 w środku łańcucha, egzoglukanaza– odłącza disacharyd celobiozę, celobiaza (βglukozydaza)– hydrolizuje disacharydy.
c) Uwalnianie fosforu z jego nierozpuszczalnych związków- podłoże Pikowskaya agarposiew punktowy za pomocą sterylnej igły bakteriologicznej w trzech powtórzeniach na
jednej płytce Petriego.
Podłoże Pikowskaya zawiera Ca3(PO4)2 jako źródło nierozpuszczalnego fosforu. Wokół
kolonii bakterii zdolnych do jego rozpuszczania powstają charakterystyczne strefy
przejaśnień. Ich wielkość świadczy o zróżnicowanych zdolnościach do wydzielania
kwasów organicznych a tym samym uwalniania fosforu.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
Mikrobiologiczne
rozpuszczanie
nieorganicznych
fosforanów
to
proces
nieenzymatyczny. Mikroorganizmy produkują i wydzielają do środowiska kwasy
organiczne obniżając w ten sposób pH gleby, w którym trudno dostępna forma fosforanu
trójwapniowego (Ca3(PO4)2) przechodzi w formę bardziej dostępną dla roślin (fosforan
dwuwapniowy i jednowapniowy). Najefektywniejsze mikroorganizmy (bakterie, grzyby,
promieniowce) zdolne do uruchamiania fosforu glebowego z jego nierozpuszczalnych
związków to PSM (ang. Phosphate Solubilizing Microorganisms).
d) Produkcja kwasu indolilo-3-octowego (IAA, auksyna)- podłoże LB z dodatkiem
tryptofanu (500 µg/ml)- posiew na podłoże płynne.
Auksyny są hormonami spełniającymi wiele funkcji w roślinie. Jedną z najbardziej znanych
auksyn jest IAA. Odpowiada za kontrolę i aktywację podziałów komórkowych oraz
pobudzanie wzrostu wydłużeniowego tkanek. Jako prekursor w syntezie IAA bakterie mogą
wykorzystywać tryptofan, indol, serynę, kwas antranilowy.
Reakcja wykrywania IAA to reakcja barwna, gdzie intensywność różowo-czerwonego
zabarwienia jest skorelowana ze stężeniem powstałego związku.
e) Produkcja amoniaku- podłoże woda peptonowa- posiew na podłoże płynne.
Amoniak jest łatwo przyswajalnym źródłem azotu dla roślin. Mikroorganizmy
przeprowadzając proces amonifikacji rozkładają aminokwasy uwalniając między innymi
amoniak jako produkt uboczny.
f) Produkcja cyjanowodoru- podłoże z glicyną (4,4 g/l)- posiew na podłoże płynne.
Bezpośrednim prekursorem cyjanowodoru jest glicyna, aminokwas który w dużej ilości
jest wydzielany przez korzenie do ryzosfery. Reakcja barwna polega na zabarwieniu
bibuły nasączonej Na2CO3 i kwasem pikrynowym na kolor brązowy.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
2. Określenie zdolności badanych szczepów do wzrostu na podłożu z ACC jako jedynym
źródłem azotu oraz oznaczanie aktywności enzymu deaminazy ACC.
Bakterie zdolne do wykorzystywania kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego
(ACC) wytwarzają enzym deaminazę ACC. Końcowym produktem reakcji hydrolizy
ACC jest kwas α-ketomasłowy. Na podstawie ilości produktu końcowego wyznacza się
aktywność enzymu deaminazy ACC.
Posiać wyizolowane bakterie na podłoże płynne DF z ACC w stężeniu 3 mM.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego