Ryzyko niepożądanych działaĘ wybranych niesteroidowych leków

&ARM0RZEGL.AUK †
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
2YZYKONIEPO˜’DANYCHDZIAŒAÊWYBRANYCH
NIESTEROIDOWYCHLEKÌWPRZECIWZAPALNYCHASPIRYNA
2ISKOFADVERSEDRUGREACTIONOFNONpSTEROIDAL
ANTIpINFLAMMATORYDRUGSACETYLSALICYLICACID
-AŒGORZATA-ACI’˜EK†*URCZYK!GNIESZKA3ZKUDLAREK†(AuNIK-AGDALENA+NOPIK
-ONIKA$ZIEWIAŒTOWSKA†"IELECKA!NETA$UDEK%WELINA+OLASIÊSKA
,UCYNA#ICHOÊ!NNA(ARTABUS*OANNA3ZCZUPAK
+ATEDRAI:AKŒAD&ARMACJI&IZYCZNEJ
7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Niepożądanym działaniem leku (adverse drug reaction
– ADR) jest każde szkodliwe i niezamierzone działanie
substancji leczniczej, które występuje podczas stosowania
dawek zalecanych u ludzi w celach profilaktycznych, diagnostycznych, leczenia chorób lub modyfikacji czynności
fizjologicznych [1]. Powikłania polekowe, ze względu na
swoje rozpowszechnienie, należą do jednych z głównych
przyczyn zgonów. Są uwarunkowane m.in. czynnikami
takimi jak: właściwości fizykochemiczne, farmakokinetyczne, farmakodynamiczne leków oraz cechy osobnicze
chorego. Jednoczesne stosowanie kilku leków o różnym
mechanizmie działania podwyższa skuteczność leczenia
i umożliwia uzyskanie szybszej poprawy stanu chorych.
Jednakże niekontrolowana polifarmakoterapia staje się
źródłem poważnych interakcji, działań niepożądanych
oraz w konsekwencji doprowadza do powikłań polekowych. Problemy towarzyszące terapii wielolekowej dotyczą prawie wszystkich chorób. Związane jest to głównie
z masowym spożywaniem leków wydawanych bez recepty (OTC – Over The Counter), zwłaszcza niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), których głównym
przedstawicielem jest aspiryna. Celem pracy jest charakterystyka niepożądanych działań kwasu acetylosalicylowego – aspiryny, na podstawie przeglądu literatury. Ponadto
przedstawiono analizę spektroskopową kompleksu aspiryna – białko transportujące (albumina surowicy krwi).
Adverse drug reaction (ADR) is very negative and unexpected reaction of therapy compound which may appear
during application of dosage recommended to the patients
in prevention or treatment of diseases or even physiological
functions modification [1]. Drug – induced complications,
because of their commonness, may be a reason of death.
Drugs are qualified by various factors e.g. physicochemical, pharmacoinetical and pharmacodynamical properties
as well as individual patients features. When the supply of
drugs induces the adverse effect, the amount of complications also increases. It leads to the statement that polypharmacotherapy without the control is one of the reasons
of the most dangerous and common therapeutic mistakes.
The problem of multidrug therapy concerns majority of
diseases. It depends on high dose over the counter (OTC)
products, especially non steroidal anti inflammatory drugs
(NSAIDs). Aspirin is the main precursor of NSAIDs.
The aim of the study was to characterize on the basis of
literature drug reaction of acetylsalicylic acid – aspirin.
Moreover spectroscopic analysis of aspirin – transporting
albumin (serum albumin) has been presented.
Key words: adverse drug reaction, non – steroidal anti –
inflammatory drugs, aspirin, quenching of fluorescence
Słowa kluczowe: niepożądane działanie leków, niesteroidowe leki przeciwzapalne, aspiryna, wygaszanie fluorescencji
Wstęp
Częstość terapii wielolekowej w leczeniu chorób przewlekłych ostatnimi laty stała się koniecznością. Wynika
z postępu wiedzy medycznej i rozwoju współczesnej farmakologii. Niestety działanie na różnorodne mechanizmy patogenetyczne chorób często wymyka się spod kontroli i może
doprowadzić do powikłań polekowych czy też niepożądanych objawów. Do czynników warunkujących wystąpienie
powikłań polekowych należą: cechy leków (właściwości
fizykochemiczne, farmakokinetyczne, farmakodynamiczne,
interakcje z innymi jednocześnie stosowanymi lekami), cechy osobnicze chorego wynikające z jego fizjologii, chorób
towarzyszących. Do niepożądanych działań leków zalicza
&ARM0RZEGL.AUK
się reakcje typu: uczulenie na leki, polekowe zaburzenia
psychiczne i neurologiczne, polekowe uszkodzenia narządu słuchu i równowagi, wzroku, przewodu pokarmowego,
układu krążenia, polekowe choroby układu oddechowego,
hematologiczne powikłania polekowe, polekowe uszkodzenia nerek i dróg moczowych oraz zaburzenia gospodarki
wodno – elektrolitowej, polekowe uszkodzenia skóry, zaburzenia hormonalne, kolagenozy, uszkodzenia narządu ruchu
spowodowane lekami.
Leki wydawane bez recepty (OTC), zawierające NLPZ,
znalazły szerokie zastosowanie w łagodzeniu reakcji bólowych i stanów zapalnych, obniżaniu temperatury ciała, chorobach zwyrodnieniowych stawów i kręgosłupa, profilaktyce przeciwzawałowej. Stosowane przewlekle przez wiele
miesięcy są podstawową grupą leków zalecanych w terapii
chorób reumatycznych. Idea OTC umożliwia pacjentom samoleczenie w powszechnych dolegliwościach, jak również
w okresie przed zasięgnięciem porady lekarskiej. Mimo iż
założeniem jest, że leki dopuszczone do obrotu jako leki
OTC muszą być bezpieczne w stosowaniu w ściśle limitowanym okresie (zwykle do 3 lub 5 dni), często są przyczyną
działań niepożądanych, ze względu na powszechne ich nadużywanie i nie przestrzeganie czasu terapii przez pacjenta.
Główną grupą leków przeciwbólowych dostępnych bez recepty są niesteroidowe leki przeciwzapalne
(NLPZ), których głównym przedstawicielem jest kwas
acetylosalicylowy, łac. acidum acetylsalicylicum (aspiryna, polopiryna, kwas 2 – acetyloksybenzoesowy, kwas
o – acetoksybenzoesowy, acetylosalicylan, ASA).
Działania niepożądane niesteroidowych
leków przeciwzapalnych (aspiryna)
Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) wykazują
wiele działań niepożądanych zależnych od ich mechanizmu
działania, tj. hamowania syntezy prostaglandyn i niezależnych od tego mechanizmów [2,3]. Na skutek hamowania
syntezy prostaglandyn NLPZ uszkadzają czynność przewodu pokarmowego, nerek i ośrodkowego układu nerwowego (o.u.n.). W obrębie przewodu pokarmowego mogą
powodować powstawanie owrzodzeń żołądka, krwawień
z przewodu pokarmowego niekiedy o ciężkim przebiegu.
W nerkach mogą zmniejszać przepływ krwi przez nerkę,
powodując zatrzymanie sodu i wody w organizmie. W o.u.n. powodują powstanie zaburzeń psychicznych o różnym
stopniu nasilania. Niezależnie od hamowania syntezy prostaglandyn NLPZ mogą wywoływać ciężkie powikłania
wynikające z: działania alergizującego, uszkodzenia układu
krwiotwórczego, uszkodzenia wątroby i skóry. NLPZ wywołują również polekowe napady dychawicy oskrzelowej,
należącej do chorób atopowych zaliczanych do niepożądanych działań leków. Nasilenie działań niepożądanych NLPZ
jest tym bardziej większe, im bardziej wydłuża się okres ich
stosowania. Chociaż leki przeciwzapalne zmniejszają objawy zapalenia stawów i poprawiają jakość życia chorych,
nie wykazują niestety korzystnego wpływu na postęp zmian
stawowych i średnią długość życia chorych, a ich stosowanie może wiązać się z ryzykiem wielu poważnych objawów
niepożądanych [4].
Aspiryna (kwas acetylosalicylowy) jest pochodną kwa-
Ryc. 1. Kwas acetylosalicylowy, C9H8O4.
su salicylowego. Należy do grupy niesteroidowych leków
przeciwzapalnych (NLPZ). Charakteryzuje się słabą aktywnością analgetyczną, głównie obwodową. Silnie hamuje aktywność cyklooksygenazy prostaglandynowej COX1. Wykazuje działanie przeciwgorączkowe, przeciwzapalnie oraz
słabe przeciwbólowe. Hamuje biosyntezę prostaglandyn
acetylując reszty seryny występującej w cyklooksygenazie
prostaglandynowej COX1 i cyklooksygenazie prostaglandynowej COX2 oraz agregację krwinek, przez hamowanie
aktywności tromboksanów i cyklicznych nadtlenków. Podobnie jak pozostałe salicylany, przedłuża czas krwawienia, zapobiega powstawaniu agregatów krwinkowych oraz
hamuje wytrącanie blaszek miażdżycowych na ścianach
naczyń krwionośnych. Działa również przeciwzakrzepowo
i przeciwzawałowo. Podawana jest w małych dawkach w terapiach pozawałowych (profilaktyka) i w chorobie wieńcowej. Przedłużenie czasu krwawienia jest wskazaniem do
odstawienia ASA przed zabiegami operacyjnymi.
Kwas acetylosalicylowy wykazuje duże powinowactwo
do białek krwi. Wchłania się szybko i prawie całkowicie
z przewodu pokarmowego. Wiąże się w 50 – 80% z albuminami osocza, może się kumulować w tkankach. Eliminacja
kwasu acetylosalicylowego zachodzi z moczem, około 10%
leku wydala się w formie niezmienionej.
Kwas acetylosalicylowy prawidłowo dawkowany jest
lekiem bezpiecznym o małej toksyczności. Działania niepożądane wynikają przede wszystkim z mechanizmu działania
kwasu acetylosalicylowego, tzn. hamującego wpływu na aktywność COX1. Najbardziej podatni na działanie niepożądane salicylanów są pacjenci chorzy na chorobę wrzodową
żołądka lub dwunastnicy. Jednakże i u zdrowych osób stosowanie kwasu acetylosalicylowego w dawkach dobowych
1,5 – 3 g przez 7 dni powoduje pojawienie się krwi utajonej
w kale. Salicylany stosowane w dawkach leczniczych ze
względu na znoszenie działania protekcyjnego prostaglandyny E2 (PGE2) drażnią bezpośrednio błonę śluzową żołądka. Mogą powodować nudności, wymioty, bóle żołądka,
nadżerki błony śluzowej i krwawienia. Z obniżeniem PGE2
wiążą się zaburzenia żołądkowo – jelitowe, które wynikają
z podwyższonej motoryki jelit oraz zmniejszenia wydzielania jonów Na+ i wody przez nerki. Zaburzenia nerek raczej nie przybierają nasilenia i cofają się po odstawieniu.
Czasem może dojść do ostrej niewydolności nerek. Działania niepożądane charakterystyczne dla inhibitorów COX1
występują także w przypadku inhibitorów COX2, co może
powodować nudności, bóle głowy, biegunki, lekko podwyższoną podatność na infekcje w obrębie górnych dróg
oddechowych, retencję płynów i możliwość wystąpienia
nadciśnienia lub/i niewydolności serca. Stosowanie aspiryny w okresie ciąży jest przeciwwskazane. Wyjątek stanowi
podawanie go w dawkach do 80 mg/24h w pierwotnym ze-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Spektroskopowa analiza oddziaływań
aspiryny z albuminą surowicy krwi
Albuminy są najliczniej występującymi białkami osocza
krwi [6], o stężeniu 40÷50 g/l [7], co stanowi 55 – 65% wszystkich białek krwi. Pojedyncza cząsteczka albuminy składa się
z trzech homologicznych domen I, II, III. Każda z nich zbudowana jest z 10 helis głównych oznaczonych od h1 do h10 i podzielona na subdomeny A oraz B o zbliżonej strukturze [8].
Wieloletnie badania nad budową albuminy surowicy
krwi pochodzącej z różnych źródeł wykazały, iż najbardziej
zbliżoną (76%) pod względem budowy i składu do struktury
albuminy surowicy krwi ludzkiej (HSA) jest struktura albuminy surowicy krwi wołowej (BSA) [9]. W strukturze drugorzędowej albuminy surowicy krwi występuje jedna reszta
tryptofanylowa w pozycji Trp – 214, podczas gdy albumina
surowicy krwi wołowej (BSA) zawiera dwie reszty tryptofanylowe (Trp – 214 oraz Trp – 135).
Albumina surowicy krwi pełni funkcję nośnika we krwi,
posiada zdolność wiązania i transportu licznych endo– i egzogennych substancji, m.in. witamin, metabolitów, barwników, kwasów tłuszczowych, leków, jonów metali [10].
Wnęki hydrofobowe albuminy są miejscami wiązania wielu
ważnych fizjologicznie ligandów, co stwierdzono stosując
techniki dializy równowagowej, krystalografii rentgenowskiej oraz techniki spektroskopowe.
Mechanizm oddziaływania leków z białkiem transportującym stanowi istotny element terapii ze względu na wpływ
60
50
40
RF
spole przeciwciał przeciwfosfolipidowych (ZPPF) i w przebiegu tocznia rumieniowatego z objawami towarzyszącego
wtórnego ZPPF, będące zabezpieczeniem przed utratą ciąży,
bądź w rzucawce. Ciężkie zatrucia pochodnymi kwasu salicylowego przebiegają wśród takich objawów, jak: wymioty,
bóle brzucha, hiperwentylacja, zasadowica, podwyższona
temperatura oraz odwodnienie organizmu, hipoglikemia
i objawy uszkodzenia o.u.n. Podczas stosowania kwasu
acetylosalicylowego u osób nadwrażliwych mogą wystąpić reakcje uczuleniowe, przebiegające w postać zaburzeń
czynności oddechowej (duszność) spowodowane skurczem
mięśni gładkich oskrzelików. Przyczyną tego może być brak
PGE2, która rozszerza oskrzelika lub nadmiar leukotrienu C.
Zespół takich objawów często nosi nazwę astmy aspirynowej, która może rozwinąć astmę. Kluczową rolę w jej patogenezie odgrywają leukotrieny cysteinylowe (cys – LTs),
pochodne kwasu arachidonowego, które mają właściwości
bronchokonstrukcyjne i pozapalne. NLPZ blokując syntezę m. in. prostaglandyny F2 (PGF2) znosi jej działanie wobec Cys – LTs [5], które wywołują skurcz oskrzeli, wzrost
wydzielania śluzu w drogach oddechowych, rozszerzenie
i wzrost przepuszczalności naczyń.
Działa synergicznie z innymi lekami przeciwzapalnymi,
przeciwgorączkowymi i przeciwbólowymi, może zmniejszać
działanie niektórych NLPZ oraz leków zwiększających wydalanie kwasu moczowego. Wypiera uprzednio związane przez
białka leki takie jak: doustne leki przeciwzakrzepowe, metotreksat, sulfonamidy zwiększając ich działanie farmakologiczne. Nasila działanie leków przeciwgruźliczych, penicylin, fenytoiny, metotreksatu. To właśnie na etapie transportu za pomocą
osocza krwi, zachodzą główne interakcje z wieloma lekami.
30
20
10
0
290
300
310
320
330
340
350
360
λ [nm]
Ryc. 2. Emisyjne widma fluorescencji HSA w obecności
ASA, [ASA]:[HSA] 10:1÷600:1, λex=280nm, T=310K.
na zmianę aktywności biologicznej substancji leczniczej.
W badaniach wiązania leków do albumin ważna jest znajomość nie tylko liczby miejsc wiążących i wartości stałych
wiązania [11], ale również rodzaj ugrupowań makromolekuły aktywnych podczas tworzenia wiązania [12].
Mechanizm wiązania lek – albumina zależy od właściwości fizykochemicznych leku oraz stężenia i zdolności cząsteczek białka do wiązania leku. Stosowanie terapii
wielolekowej, kojarzącej m. in. leki wydawane bez recepty,
wiąże się z większą częstością występowania objawów niepożądanych [13], które mogą zachodzić na skutek interakcji
między stosowanymi jednocześnie preparatami na drodze
farmakokinetycznej bądź farmakodynamicznej.
Wygaszanie fluorescencji jest zjawiskiem polegającym
na obniżeniu wydajności kwantowej fluorescencji. Przyczyną wygaszania fluorescencji są procesy, które zmniejszają
intensywność luminescencji: zmiana chemiczna substancji fluoryzującej, obecność innej substancji w roztworze,
zwiększenie stężenia substancji fluoryzującej. Zjawisko
wygaszania fluorescencji jest wykorzystywane w badaniach
oddziaływań albumina – ligand.
Analiza spektralna kompleksu aspiryna – albumina surowicy krwi
Badaniem oddziaływań kwasu acetylosalicylowego (ASA) z albuminą surowicy krwi oraz wyznaczeniem
miejsc wiązania do białka transportującego zajmowało się
dotychczas wielu naukowców. Watanabe i wsp. [14] oraz
Mao i wsp. [15], stosując technikę ultrafiltracji, dichroizmu
kołowego (CD) i magnetycznego rezonansu jądrowego
(NMR) zbadali elektrostatyczne oddziaływania ASA z niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi. He [16] oraz Jakoby
[17] i ich współautorzy za pomocą rentgenografii kryształów
kompleksów ligandów z albuminą surowicy krwi oraz Machtejevas, dzięki metodom chromatograficznym [18], wyznaczyli miejsce wiązania ASA w subdomenie IIA i IIIA.
Na podstawie zarejestrowanych emisyjnych widm
fluorescencji albuminy surowicy krwi ludzkiej (HSA)
wzbudzonej promieniowaniem o długości fali λex=280nm
i λex=295nm w obecności kwasu acetylosalicylowego
(ASA), zaobserwowano obniżenie intensywności fluorescencji albuminy pod wpływem ASA, ze wzrostem jej stężenia. Ze wzrostem stężenia kwasu acetylosalicylowego zmalała dostępność fluoroforów dla kolejnych cząsteczek leku.
Ryc. 2 przedstawia przykładowe emisyjne widma flu-
&ARM0RZEGL.AUK
1
λex=280nm
λex=295nm
a)
RF/RFo
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
100
200
300
400
500
600
700
[ASA]:[HSA]
1
b)
λex=280nm
λex=295nm
RF/RFo
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
100
200
300
400
500
600
700
[ASA]:[BSA]
Ryc. 3. Krzywe wygaszania fluorescencji a) HSA
oraz b) BSA w obecności ASA [ASA]:[ SA] 10:1÷600:1,
T=310K (wyznaczone błędy są mniejsze niż wielkość symbolu).
orescencji HSA w obecności ASA ([ASA]:[HSA]
10:1÷600:1). Zastosowanie promieniowania o długości
fali λex=280nm wzbudza w albuminie reszty grup tryptofanylowych i tyrozylowych, podczas gdy promieniowanie o długości fali λex=295nm wzbudza tylko reszty grup
tryptofanylowych. Na podstawie porównania krzywych
wygaszania fluorescencji HSA w obecności ASA, przy
wzbudzeniu promieniowaniem o długości fali λex=280nm
i λex=295nm (Ryc. 3a) zaobserwowano niewielkie różnice w ich przebiegu. Zjawisko to wskazuje na udział
w oddziaływaniu ASA – HSA reszt grup tryptofanylowych
znajdujących się w obrębie subdomeny IIA (Trp – 214) i IB
(Trp – 135) oraz niewielki udział reszt grup tyrozylowych,
znajdujących się w subdomenie IIA lub/i IIB, IIIA. Aby potwierdzić miejsce wiązania kwasu acetylosalicylowego w cząsteczce albuminy, bądź dokładniej wskazać jego lokalizację,
w badaniach wykorzystano zjawisko wygaszania fluorescencji albuminy surowicy krwi wołowej (BSA), wzbudzonej promieniowaniem o tych samych długościach fali,
tj. λex=280nm i λex=295nm. Z danych otrzymanych z emisyjnych widm fluorescencji BSA wykreślono, podobnie jak
dla układu ASA – HSA, krzywe wygaszania BSA w obecności ASA. Ze wzrostem stężenia ASA zarejestrowano
obniżenie fluorescencji albuminy surowicy krwi wołowej.
Porównaniu poddano krzywe wygaszania fluorescencji BSA
wzbudzonej promieniowaniem o długości fali λex=280nm
i λex=295nm (Ryc. 3b) oraz BSA i HSA w obecności ASA,
kolejno dla λex=280nm i λex=295nm. Analogicznie, jak
w układzie ASA – HSA, wskazano na niewielkie różnice w przebiegu krzywych, które sugerują występowanie
miejsca wiązania ASA w obrębie subdomeny IIA lub/i IB,
ze względu na obecność odpowiednio Trp 214 i 135, bądź
IIA, IIB, IIIA ze względu na niewielki udział reszt grup tyrozylowych. Różnice w przebiegu krzywych wygaszania
fluorescencji BSA i HSA wzbudzonych promieniowaniem
o długościach fali 280nm i 295nm w obecności ASA, potwierdzają, że w oddziaływaniu ASA – SA biorą udział
oba tryptofany obecne w subdomenie IIA i IB makromolekuły (dane niepublikowane). Reasumując, wskazano na
subdomenę IIA jako główne miejsce wiązania w cząsteczce albuminy lub/i IB, IIB, IIIA jako jedno z dodatkowych
miejsc oddziaływania ASA z albuminą. Miejsce wiązania
w subdomenie IIA i IIIA zostało również rozpoznane przez
He [16], Jakoby [17] i ich współautorów, którzy zastosowali rentgenografię kryształów kompleksów ligandów
z albuminą surowicy krwi. Miejsce wiązania ASA oraz innych leków o budowie strukturalnej podobnej do ASA (posiadających pierścień aromatyczny z grupą karboksylową
np. kwas trójjodobenzoesowy TIB [19] oraz warfaryna [20])
może znajdować się w subdomenie IB tylko wówczas, gdy
interakcje są wspomagane przez kwasy tłuszczowe.
Ryc. 3 przedstawia przykładowe porównanie krzywych
wygaszania fluorescencji a) HSA oraz b) BSA ([ASA]:[SA]
10:1÷600:1).
Neault i wsp. wykorzystując m.in. spektroskopię w zakresie światła ultrafioletowego i widzialnego UV – VIS zajmowali się analizą drugorzędowej struktury albuminy surowicy krwi ludzkiej w obecności kwasu acetylosalicylowego
[21]. Przy niskich stężeniach ASA nie potwierdzono interakcji ASA – HSA, podczas gdy przy stężeniu 1 – 5·10-3M
zaobserwowano acetylację lizyny Lys – 199 znajdującej się
w niedalekim sąsiedztwie subdomeny IIA, co może wpływać na oddziaływanie z ligandami w I klasie miejsc wiążących. Acetylację Lys – 199 badał już w latach 60 – tych
Hawkins i wsp. [22]. Ponieważ dowiedziono, że podczas
oddziaływań grupy karboksylowej niesteroidowych leków
przeciwzapalnych z HSA szczególną rolę odgrywa obecność reszt tyrozyny, lizyny oraz histydyny [23], acetylacja
Lys – 199 może mieć niekorzystny wpływ na tworzenie
kompleksu i wzmagać ryzyko interakcji kwasu acetylosalicylowego z innymi ligandami. Zjawisko to potwierdzono
podczas badania kompetycji cytarabiny (araC) i aspiryny
(ASA) w wiązaniu z albuminą surowicy krwi [24].
Parametry wiązania
Na podstawie równania:
(1)
R
F 0
1 1 1
1
• •
[25]
$R
F
[Q] f a K Q f a
gdzie:
∆RF = RF – RF0 – przyrost natężenia fluorescencji
RF, RF0 – natężenie fluorescencji w obecności i nieobecności liganda
[Q] – stężenia liganda
fa – ułamkowe maksimum dostępnej fluorescencji albuminy sumowanej po n fluoroforach
KQ – stała wygaszania
wykreślono zmodyfikowane krzywe Sterna – Volmera i wyznaczono stałe wygaszania KQ [M-1] świadczące o dostępno-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
25
BSA
HSA
-3
-1
{[Lb]/([Lf]*[SA])}*10 [M ]
RFo/(RFo-RF)
20
1,7
15
10
5
BSA
I.HSA
II.HSA
1,4
1,1
0,8
0,5
0,2
0
0
2
4
6
8
-3
10
12
14
-0,1 0
0,2
-1
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
[Lb]/[SA]
{1/ASA}*10 [M ]
Ryc. 4. Zmodyfikowane krzywe Sterna-Volmera dla HSA Ryc. 5. Krzywe Scatcharda dla HSA oraz BSA w obecności
oraz BSA w obecności ASA [ASA]:[SA] 10:1÷600:1, ASA [ASA]:[SA] 10:1÷600:1, λex=280nm, T=310K (wyλex=280nm, T=310K (wyznaczone błędy są mniejsze niż znaczone błędy są mniejsze niż wielkość symbolu).
wielkość symbolu).
KaIHSA_280nm=0,19·104 [M-1], aIHSA_280nm=0,84,
ści ASA do wzbudzonego fluoroforu. Na podstawie wartości KaIIHSA_280nm=0,07·104 [M-1], aIIHSA_280nm=1,30,
stałych wygaszania stwierdzono, że ASA wykazuje większe KaBSA_280nm=0,07·104 [M-1], aBSA_280nm=1,26;
zdolności wygaszania HSA niż BSA:
KaIHSA_295nm=0,16·104 [M-1], aIHSA_295nm=0,89,
3
-1
KQHSA_280nm=1,89·10 [M ],
KaIIHSA_295nm=0,07·104 [M-1], aIIHSA_295nm=1,30,
3
-1
KQBSA_280nm=0,74·10 [M ],
KaBSA_295nm=0,06·104 [M-1], aBSA_295nm=1,34.
3
-1
KQHSA_295nm=1,52·10 [M ],
KQBSA_295nm=0,50·103[M-1].
Wyznaczone wartości „a” i Ka świadczą o zależności
między wzrostem średniej ilości cząsteczek leku przypadaRyc. 4 przedstawia przykładowe zmodyfikowane krzy- jącej na jedną cząsteczkę albuminy a zmniejszeniem wartowe Sterna – Volmera dla HSA oraz BSA w obecności ASA ści stałej wiązania tego leku do albuminy [27].
([ASA]:[ SA] 10:1÷600:1, λex=280nm).
Ryc. 5 przedstawia przykładowy przebieg krzyZ danych uzyskanych z emisyjnych widm fluorescen- wych Scatcharda dla HSA oraz BSA w obecności ASA
cyjnych albuminy ludzkiej (HSA) i wołowej (BSA) wykre- ([ASA]:[SA] 10:1÷600:1, λex=280nm).
ślono na podstawie równania (2) krzywe Scatcharda oraz
wyznaczono stałe asocjacji Ka [M-1] świadczące o trwałości Podsumowanie
utworzonego kompleksu i średnią ilość cząsteczek leku „a”
przypadającą na jedną cząsteczkę albuminy ludzkiej i wołoPotwierdzono na podstawie analizy oddziaływań techwej odpowiednio w pierwszej i drugiej klasie miejsc wiążą- niką spektrofluorymetrii tworzenie kompleksu kwasu
cych (aIHSA, aIIHSA, aIBSA, aIIHSA).
acetylosalicylowego z albuminą surowicy krwi ludzkiej
i wołowej ([ASA]:[SA] 10:1÷600:1). Miejsce wiązania
Równanie Scatcharda:
aspiryny w obrębie subdomeny IIA oraz rząd stałej asor
cjacji (Ka=102÷103 [M-1]) mogą wskazywać na wystę n • K a K a • r [26]
(2)
[L f ]
powanie oddziaływań typu π – π (struktury „sandwich”)
między pierścieniami aromatycznymi cząsteczek ASA
gdzie:
a pierścieniami aromatycznymi aminokwasów występujących w hydrofobowej wnęce albuminy.
[L ]
– liczba moli leku związanego przez
Różnorodność miejsc wiążących oraz mechanizmów
r b
[ X]
1 mol albuminy
jakie towarzyszą podczas tworzenia kompleksu oraz rząd
[Lb] – stężenie leku związanego z albuminą
stałych asocjacji i ryzyko niepożądanych działań leków wy[Lf] – stężenie leku niezwiązanego z albuminą
dawanych bez recepty (aspiryna), wskazują na bardzo istot[X] – stężenie albuminy
ną rolę terapii monitorowanej, jaką należy wdrożyć podczas
n – liczba miejsc wiążących
terapii wielolekowej.
Ka – stała asocjacji kompleksu lek – albumina
Piśmiennictwo
Przebieg krzywych Scatcharda sugeruje występowanie
dwóch klas miejsc wiążących cząsteczkę kwasu acetylosalicylowego (ASA) w cząsteczce HSA ([ASA]:[HSA]
10:1÷200:1 – I klasa miejsc wiążących, [ASA]:[HSA]
200:1÷600:1 – II klasa miejsc wiążących) i jednej w cząsteczce BSA ([ASA]:[BSA] 10:1÷600:1). Stałe asocjacji Ka
i średnia ilość cząsteczek leku „a” przypadająca na jedną
cząsteczkę albuminy wyznaczone metodą Scatcharda wynoszą:
1. Wiela-Hojeńska A, Orzechowska-Juzwenko K. Niepożądane działania leków. [W:] Orzechowska – Juzwenko
K., red. Farmakologia kliniczna. Znaczenie w praktyce
medycznej. Górnicki Wydawnictwo Medyczne. Wrocław 2006.
2. Furt DE i wsp. Updated consensus statement on biological agents for the treatment of rheumatic diseases. Ann
Rheum Dis 2008; 67: iii2 – iii25.
&ARM0RZEGL.AUK
3. Filipowicz-Sosnowska A. Reumatoidalne zapalenie stawów. [W:], Zimmermann-Górska I., red. Reumatologia
kliniczna. T. 2. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 2008.
4. Hrycaj P. Terapia wielolekowa w reumatologii – pomaga czy szkodzi? Reumatologia 2005; 43: 379 – 382.
5. Specjalski K, Chełmińska M. Patogeneza astmy aspirynowej. Pol Arch Med Wew 2006; 3: 265 – 270.
6. Zunszain PA i wsp. Crystal structural analysis of human
serum albumin complexed with hemin and fatty acid.
BMC Struct Biol 2003; 3: 6.
7. Peters T Jr. All about albumin. Biochemistry, Genetics
and Medical Applications. New York: Academic Press;
1996.
8. Carter DC, He XM. Structure of serum albumin. Science 1990; 249: 302 – 303.
9. Peters T Jr. Serum albumin. Adv Protein Chem 1985;
37: 161 – 245.
10. Simard JR, Zunszain PA, Ha C-E i wsp. Locating high –
affinity fatty acid – binding sites on albumin by x – ray
crystallography and NMR spectroscopy. Proc Natl Acad
Sci 2005; 102: 17958 – 17963.
11. Omran AA i wsp. Binding of amitriptyline and imipramine to bovine serum albumin: a study by second
derivative spectrophotometry. J Appl Sci Res 2007; 3:
1730 – 1736.
12. Szekerke M, Horvath M. Interaction of homopyrimidazole derivatives with biopolymers. II. Binding to chemically modified albumins; attempt to correlate chemical
structure and binding affinity. Arzneimittelforschung
1976; 26: 478 – 482.
13. Strand V i wsp. Physical function and health related quality of life: analysis of 2 – year data from randomized,
controlled studies of leflunomide, sulfasalazine, or methotrexate in patients with active rheumatoid arthritis. J
Rheumatol 2005; 32: 590 – 601.
14. Watanabe H i wsp. Role of Arg – 410 and Tyr – 411 in
human serum albumin for ligand binding and esterase –
like avtivity. Biochem J 2000; 349: 813 – 819.
15. Mao H i wsp. Rational design of diflunisal analogues
with reduced affinity for human serum albumin. J Am
Chem Soc 2001; 123: 10429 – 10435.
data otrzymania pracy: 15.07.2010 r.
data akceptacji do druku: 06.10.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr n. farm Małgorzata Maciążek-Jurczyk
Katedra i Zakład Farmacji Fizycznej
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Jagiellońska 4
41-200 Sosnowiec
tel. +48 32 364 15 80
e -mail: [email protected]
16. He XM, Carter DC. Atomic structure and chemistry of
human serum albumin. Nature 1992; 358: 209 – 215.
17. Jakoby MG, Covey DF, Cistola DP. Localization of tolbutamide binding sites on human serum albumin using
titration calorimetry and heteronuclear 2 – D NMR.
Biochemistry 1995; 34: 8780 – 8787.
18. Machtejevas E, Maruška A. A New approach to human
serum albumin chiral stationary phase synthesis and its
use in capillary liquid chromatography and capillary
electrochromatography. J Sep Sci 2002; 25: 1 – 6.
19. Curry S i wsp. Crystal structure of human serum albumin complexed with fatty acid reveals an asymmetric
distribution of binding sites. Nat Struct Biol 1998; 5:
827 – 835.
20. Bojko B i wsp. Changes of serum albumin affinity for
aspirin induced by fatty acid. J Biol Macromol 2008;
42: 314 – 323.
21. Neault JF i wsp. The effect of aspirin – HSA complexation on the protein secondary structure. Can J Chem
2000; 78: 291 – 296.
22. Hawkins D, Pinckard RN, Farr RS. Acetylation of human serum albumin by acetylsalicylic acid. Science
1968; 160:780 – 781.
23. Trynda-Lemiesz L. Interactions of human serum albumin with meloxicam: Characterization of binding site. J
Pharm Biomed Anal 2010; 52: 300 – 304.
24. Sułkowska A i wsp. Competition of cytarabine and aspirin in binding to serum albumin in multidrug therapy.
Biopolymers 2006; 81: 464 – 472.
25. Eftink MR, Ghiron CA. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry 1976; 15:
672 – 680.
26. Hiratsuka T. Conformation changes in the 23 – kilodalton NH2 – terminal peptide segment of myosin ATPase
associated with ATP hydrolysis. J Biol Chem 1990; 265:
18786 – 18790.
27. Maciążek-Jurczyk M. Kompetycja w wiązaniu leków
przeciwreumatycznych do albuminy surowicy krwi
w terapii wielolekowej. Rozprawa doktorska. Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Katowice,
2008.