Zastosowanie testów krótkoterminowych w badaniach - Eko-DOk

pył zawieszony, organiczne zanieczyszczenia powietrza,
testy krótkoterminowe, genotoksyczność, mutagenność
Maciej K. BEŁCIK, Katarzyna PIEKARSKA*
ZASTOSOWANIE TESTÓW KRÓTKOTERMINOWYCH W
BADANIACH GENOTOKSYCZNOŚCI ORGANICZNYCH
ZANIECZYSZCZEŃ POWIETRZA
Rozwój technologiczny wpływa na pogorszenie się środowiska naturalnego. Rezultatem tego jest
coraz większa liczba zanieczyszczeń powietrza atmosferycznego. Podczas oddychania do organizmu
ludzkiego dostają się nie tylko zanieczyszczenia gazowe, ale także zawieszone w powietrzu pyły, na
których zaabsorbowane są związki o działaniu genotoksycznym. W celu badania wpływu zanieczyszczeń powietrza na zdrowie ludzi należy wykonywać badania ich aktywności biologicznej. Do łatwych, szybkich i stosunkowo tanich badań należą testy krótkoterminowe. W pracy przedstawiono
przykładowe testy mogące służyć do wykrywania genotoksycznego charakteru zanieczyszczeń powietrza.
1. WSTĘP
Wraz z rozwojem technologicznym i wzrostem światowej industrializacji obserwuje się stałe pogarszanie warunków środowiskowych na naszej planecie. Zjawisko to
wiąże się ze zwiększaniem zachorowalności populacji ludzkiej na choroby nowotworowe. Duży udział wśród wszystkich zanieczyszczeń mających wpływ na zdrowie
człowieka mają zanieczyszczenia powietrza, które jako nośnik ksenobiotyków wnikają do organizmu za pośrednictwem układu oddechowego. Szacuje się, że dorosły
człowiek pobiera w ciągu doby od 12 do 15 m3 powietrza [1]. Jak podają źródła literaturowe [2, 3] zanieczyszczenia znajdujące się w powietrzu to ponad 2000 związków
należących do odmiennych klas chemicznych tworzących mieszaniny o różnych właściwościach biologicznych. Poza, stanowiącymi znaczną większość, gazowymi zanieczyszczeniami powietrza, drugą grupę stanowią pyły tzw. PM z angielskiego particu__________
* Politechnika Wrocławska, Wybrzeże Wyspiańskiego 27, Wrocław, [email protected].
44
M.K. BEŁCIK, K. PIEKARSKA
late matter. Ich emisja do atmosfery wywoływana jest zarówno czynnikami naturalnymi takimi jak wybuchy wulkanów, jak i antropogenicznymi związanymi stricte
z działalnością człowieka. Wśród tych drugich największe znaczenie mają koksownie,
gazownie, zakłady wykorzystujące paliwa kopalne, smołę i asfalt, a także spaliny
samochodowe i piece węglowe nadal używane w wielu gospodarstwach domowych
nie posiadających centralnego ogrzewania [4, 5].
Pyłem nazywamy mieszaninę małych cząstek stałych zawieszonych w powietrzu.
Większe z nich, tak zwana grubsza frakcja, powstają poprzez ścieranie się, mniejsze –
z kondensacji cząstek i molekuł w fazie gazowej. W zależności od rozmiaru cząstek
pyłu, wyróżniamy pył o cząstkach mniejszych od 10 µm (PM10), mniejszych od 5 µm
(PM5), mniejszych od 2,5 µm (PM2,5) oraz mniejszych od 1 µm (PM1) [6, 7]. Największym zagrożeniem dla zdrowia ludzi są cząstki pyłu o średnicach mniejszych od
5 µm zwane inaczej cząstkami respirabilnymi, które ze względu na swoje niewielkie
wymiary mają zdolność penetrowania głębokich partii układu oddechowego włączając w to drobne pęcherzyki płucne. Ponadto małe cząstki zawieszone w powietrzu
posiadają niski ciężar własny, co przekłada się na ich wolne opadanie i długie czasy
półtrwania w powietrzu [4].
Niewielkie zdolności samooczyszczania się powietrza atmosferycznego w stosunku do zanieczyszczeń pyłowych powodują, iż szczególnie ważnym staje się podejmowanie kontroli stanu jego czystości. Niestety standardowe metody badania powietrza
obejmują aktualnie tylko stężenie pyłu zawieszonego oraz wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych znajdujących się na liście United State Envirinmental
Protection Agency pod względem ilościowym. Badania te nie obejmują zatem aktywności biologicznej tych zanieczyszczeń, ani potencjalnego ich wpływu na człowieka
i organizmy żywe. Zaleca się zastosowanie badań bioindykacyjnych, obok obecnie
stosowanych metod, w celu kompleksowej analizy zanieczyszczeń powietrza wraz ze
skutkami, które wywołują w stosunku do organizmów żywych [4, 8].
2. GENOTOKSYCZNOŚĆ PYŁOWYCH ZANIECZYSZCZEŃ POWIETRZA
Genotoksycznością, określa się zjawisko szkodliwego działania na materiał genetyczny, a związkami genotoksycznymi takie substancje chemiczne, które powodują
uszkodzenie DNA, w wyniku którego może nastąpić rozwój nowotworu. Działanie
genotoksyczne należy jednak stanowczo oddzielić od mutagenności, która wywołuje
trwałe i dziedziczne zmiany w materiale genetycznym komórek i organizmów. Substancje genotoksyczne nie koniecznie musza prowadzić do powstawania mutacji
obejmujących zarówno pojedyncze geny, jak i pewne jego odcinki, a nawet całe
chromosomy [4, 9].
Zastosowanie testów krótkoterminowych w badaniach genotoksyczności organicznych...
45
Związki mające działanie genotoksyczne wiążą się z materiałem genetycznym komórek powodując naruszenie ich struktur i funkcji bądź systemów naprawy [4]. Najlepiej poznanymi związkami o właściwościach mutagennych i kancerogennych są
wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne. Poza nimi w powietrzu występują
także inne zanieczyszczenia do których należą między innymi: jedno- i dwupierścieniowe węglowodory aromatyczne, węglowodory alifatyczne, cykloalkany oraz związki organiczne zawierające w swojej strukturze tlen, siarkę, chlor bądź metale [2, 4].
Większość zanieczyszczeń genotoksycznych zaabsorbowana jest na cząsteczkach
pyłu zawieszonego, w którym według badań znajdują się polarne związki aromatyczne, związki heterocykliczne i fenole. Największą mutagennością wśród nich wyróżniają się nitrowe i aminowe pochodne wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych [4, 8]. Stężenie pyłu zawieszonego w atmosferze jest zmienne i zależy od
wielu czynników z których najważniejszymi wydają się być, emisja pyłów z przedsiębiorstw i gospodarstw domowych, intensywność transportu drogowego, odległość
źródeł emisji od miejsca poboru próbek, ukształtowanie terenu oraz warunki meteorologiczne i klimatyczne danego obszaru.
3. TESTY WYKRYWANIA GENOTOKSYCZNOŚCI
Na podstawie analizy chemicznej zanieczyszczeń powietrza nie jest możliwa prognoza skutków biologicznych ich oddziaływania na organizm zwierzęcy i ludzki. To
właśnie z tego względu obok wykonywanych standardowo badań coraz częściej wykonuje się także badania bioindykacyjne, które mogą stanowić dobre narzędzie analizy zagrożenia zdrowotnego ludzi i zwierząt wywołanego przez substancje zaadsorbowane na cząstkach pyłu zawieszonego [4, 8]. Badania takie podzielić można na
3 grupy w zależności od czasu ich trwania. Wyróżnia się: testy krótkoterminowe, badania prowadzone na zwierzętach doświadczalnych oraz długoterminowe badania
epidemiologiczne. Najlepsze rezultaty, najbardziej zbliżone do rzeczywistego działania zanieczyszczeń dają badania epidemiologiczne, jednak poważną ich wadą jest
długość prowadzenia, która może wynosić nawet ponad 20 lat. Badania na zwierzętach doświadczalnych niosą za sobą wysokie koszty i wśród niektórych budzą kontrowersje natury etycznej [4, 10]. Najszybszą, stosunkowo tanią i łatwą w prowadzeniu metodą oceny mutagenności związków i mieszanin są testy krótkoterminowe.
Badania te oparte są na różnego typu organizmach począwszy od bakterii, drożdży,
owadów po zwierzęta doświadczalne. Wyniki badań łatwo można ekstrapolować na
organizm ludzki poprzez fakt uniwersalności materiału genetycznego. Wykrycie genotoksycznego działania związku w stosunku do organizmu poddawanego testowi sugerować może analogiczne jego działanie dla innych organizmów. Prawie wszystkie
testy krótkoterminowe opierają się o wykrywanie mutacji genowych, uszkodzeń
46
M.K. BEŁCIK, K. PIEKARSKA
chromosomów lub uszkodzeń bądź zaburzeń w naprawie DNA oraz powstawania
adduktów. W tabeli 1 przedstawiono możliwe efekty końcowe i testy wykorzystywane
do ich wykrycia [4, 9].
Tabela 1. Testy wykorzystywane do wykrywania efektów końcowych [9]
Proces mutagenny
Zmiany przedmutacyjne
Uszkodzenie DNA
Trwałe mutacje genowe
Efekt końcowy
Interakcja substancji z DNA
Uszkodzenie i naprawa DNA
Mutacje genowe
Zakłócenia struktury DNA
Aberracje chromosomowe,
Pęknięcie nici DNA
Test
Addukty DNA
Test kometkowy
Test Amesa
Test rewersji mutacji E. coli WP2
zależnej od tryptofanu
badania genetyczne in vivo
Test na aberracje chromosomowe
Test mikrojądrowy
Wśród wymienionych wyżej testów żaden nie stanowi idealnej metody oceny mutagenności i genotoksyczności związków zaadsorbowanych na pyle zawieszonym.
Prowadzone badania powinny uwzględniać odpowiednia kombinację procedur opierających się na poszczególnych efektach końcowych. Polecany przez OECD zestaw
testów składa się z 2 do 5 elementów zawierających test bakteryjny oceny mutagenności (np. test Amesa) oraz jeden z testów do oceny indukcji strukturalnych aberracji
chromosomowych [1].
3.1. TEST AMESA
Najpowszechniej stosowanym krótkoterminowym testem wykrywającym mutagenność zanieczyszczeń środowiskowych jest test Salmonella opracowany przez Bruce’a Amesa. Test ten znalazł uznanie jako najbardziej reprezentatywny do oceny
chemicznej mutagenezy i zalecany jest przez Międzynarodową Agencję Badań nad
Rakiem (International Agency for Research on Cancer). Test Amesa wykrywa czy
badany związek powoduje rewersję zwrotną histydynozależnych szczepów bakterii
Salmonella typhimurium LT2. Przygotowane w celu badania szczepy posiadają rfa
mutację powodującą zwiększoną przepuszczalność błony komórkowej w wyniku
zmiany jej składników lipoproteinowych [4, 10].
Jednym z wariantów wykorzystywanych w trakcie oceny mutagenności jest zastosowanie frakcji S-9. Frakcja ta składa się z enzymów mikrosomalnych, które wyizolowane zostały z wątroby szczura i zaindukowane zostały przy pomocy mieszaniny
bifenyli. Przygotowany w ten sposób test powoduje metaboliczną aktywację promutagenów, dzięki czemu możliwa staje się korelacja wyników uzyskanych w teście bakteryjnym z efektami wywoływanymi u ssaków [10, 11].
Zastosowanie testów krótkoterminowych w badaniach genotoksyczności organicznych...
47
Test Amesa znalazł zastosowanie wśród licznych badań pyłowych zanieczyszczeń
powietrza zarówno na świecie jak i w Polsce między innymi w Warszawie, we Wrocławiu i na terenie Górnego Śląska [4, 12-16].
3.2. POZOSTAŁE TESTY BAKTERYJNE
Alternatywnym testem, który wykazuje podobne odpowiedzi do testu Salmonella
jest SOS-Chromotest. W pracy K. Piekarskiej [4] wykazano, że dla 82% badanych
substancji oboma metodami wykazano podobną odpowiedź. SOS-Chromotest wykorzystuje proces naprawy DNA komórek Escherichia coli K12 PQ37. Pomiar pomaga
na sprawdzeniu ekspresji genów wchodzących w skład systemu SOS, a miarą mutagenności jest aktywność β-galaktozy [1, 9, 10].
Odmianą SOS-Chromotestu jest test UMU, którego zasada działania jest podobna.
Czynniki mogące uszkodzić DNA, a zatem są potencjalnymi kancerogenami powodują wyłączenie operonu Umu. Szczepem bakteryjnym wykorzystywanym w tym przypadku jest Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 [1, 10].
3.3. TESTY NA ORGANIZMACH EUKARIOTYCZNYCH
Testy genotoksyczności można wykonywać także na organizmach eukariotycznych. Najczęściej stosowane do tego celu są komórki grzybów, organizmy roślinne
takie jak glony i rośliny naczyniowe oraz owady. Genotoksyczność powinno się badać
przy użyciu co najmniej dwóch testów, z których jeden jest testem bakteryjnym, natomiast drugi wykonuje się przy udziale organizmów eukariotycznych [9].
Testy z wykorzystaniem grzybów stanowią dobry model do oceny substancji chemicznych ze względu na podobieństwo ich komórek do struktury komórek wyższych.
Podobieństwo to daje możliwość badania różnych końcowych efektów genetycznych
wywoływanych przez testowane próbki. Najczęściej stosowanymi organizmami
w tych badaniach są drożdże z rodzaju Saccharomyces cerevisiae, grzyby pleśniowe
Neurospora crassa i Aspergilius nidulans. Wspomniane gatunki umożliwiają badanie
mutacji punktowych w DNA jądrowym oraz mitochondrialnym [9, 17].
Rośliny wyższe pozwalają na badanie genotoksyczności wielu czynników środowiskowych. Do testów wykorzystuje się fasolę (Vicia faba), cebulę (Allium cepa),
kukurydzę (Zea mays), trzykrotkę (Tradescantia sp.). Niewątpliwą wadą testów na
roślinach wyższych jest brak możliwości ekstrapolacji ich wyników na organizmy
zwierzęce. Rośliny wyższe różnią się od zwierzęcych nie tylko budową jak np. obecność ściany komórkowej, ale także metabolizmem. W związku z tym brak genotoksycznego działania związków na te organizmy nie musi wiązać się z bezpieczeństwem
dla człowieka [1, 9].
48
M.K. BEŁCIK, K. PIEKARSKA
Przykładem testu na owadach są badania prowadzone na muszce owocowej Drosophila melanogaster. Test ten stanowi uzupełnienie testów bakteryjnych oraz pozwala na ich weryfikację. Muszki nie wymagają frakcji S-9, koniecznej w przypadku organizmów bakteryjnych do metabolizowania substancji chemicznych. Drosophila
melanogaster, posiadają enzymy działające w sposób podobny do ludzkich pozwalają
na łatwą ekstrapolacje wyników doświadczeń na organizm ludzki. W testach wykorzystujących muszkę owocowa wykrywa się aberracje chromosomowe, rekombinacje
i mutacje genowe [9].
4. PODSUMOWANIE
Myśląc o zanieczyszczeniach powietrza atmosferycznego nie należy skupiać się
wyłącznie na badaniu ich stężeń oraz porównywaniu ich z tymi przyjętymi za graniczne. Problem należy potraktować dużo głębiej. Prócz stężeń związków i pyłu zawieszonego w powietrzu należy wziąć pod uwagę także ich oddziaływanie względem
organizmów żywych, w tym organizmu ludzkiego. Wiele ze związków zaadsorbowanych na pyle zawieszonym wykazuje właściwości mutagenne i kancerogenne, mogące
prowadzić do uszkodzenia materiału genetycznego człowieka i licznych chorób.
W związku z rosnącą lawinowo liczbą różnego rodzaju substancji chemicznych niemożliwym staje się dokładne przebadanie każdej z nich. Z pomocą przychodzą tu
krótkoterminowe testy genotoksyczności, które ze względu na swoją prostą formę
i niskie koszty pozwalają na szybką ocenę potencjalnego zagrożenia związków oraz
ich mieszanin. Prowadzone badania nie powinny ograniczać się jedynie do jednego
z testów, ale brać pod uwagę kilka, badając jak największą liczbę mierzalnych efektów końcowych działań genotoksycznych.
Praca opracowana w ramach grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego
Nr N523 612939 (2010-2013)
LITERATURA
[1]
[2]
[3]
[4]
BUBAK A., Biomonitoring mutagenności powietrza atmosferycznego i wody, [w:] Materiały
Szkoleniowe Instytutu Ekologii Terenów Uprzemysłowionych, 127–136.
JADCZYK P., Genotoksyczność zanieczyszczeń atmosfery, [w:] Serwis informacyjny TOZ we
Wrocławiu.
CLAXTON L.D., MATTHEWS P.P., WARREN S.H., The genotoxicity of ambient outdoor air, a
review: Salminella mutagenicity, Mutation Research, 2004, Vol. 567, 347-399.
PIEKARSKA K.., Modyfikacje testu Salmonella do oceny mutagenności pyłowych zanieczyszczeń
powietrza atmosferycznego, Prace Naukowe Instytutu Inżynierii Ochrony Środowiska Politechniki
wrocławskiej, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, 2008.
Zastosowanie testów krótkoterminowych w badaniach genotoksyczności organicznych...
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
49
DE KOK T.M.C.M., DRIECE H.A.L. et al., Toxicological assessment of ambient and traffic- related particulate matter: A review of recent studies, Mutation Research: Reviews Mutation Research,
vol. 613 (2-3), 2006, 103-122.
KÜNZLI N., KAISER R., MEDINA S. et al., Public-health impact of outdoor and traffic-related
air pollution: a European assessment, The Lancet, 2000, Vol. 356, 795-801.
LENICEK J., SEKYRA M. et al., Fractionation and chemical analysis of urban air particulate extracts, International Journal of Environmental Analytical Chemistry, vol. 77 (4), 2000, 269- 288.
PIEKARSKA K., ZACIERA M., CZARNY A., ZACZYŃSKA E., Zastosowanie testów krótkoterminowych do oceny stopnia skażenia powietrza atmosferycznego, Współczesne osiągnięcia w
ochronie powietrza atmosferycznego, Wydawnictwo PZITS Nr 893, 2010, 293-306.
TRACZEWSKA T.M., Biologiczne metody oceny skażenia środowiska, Oficyna Wydawnicza
Politechniki Wrocławskiej, Wrocław, 2011.
BEŁCIK M., Wpływ środków dezynfekcyjnych na mutagenność mikrozanieczyszczeń wody do picia,
Praca inżynierska, Wrocław, 2011.
ONG T.M., MUKHTAR C.R., et al., Differential effects of cytochrome P450-inducers on
promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, vol. 4, 1980, 55-65.
EEA Report No 5/2009, Ensuring quality of life in Europe’s cities and towns, 2009.
Wojewódzki Inspektorat Ochrony Środowiska we Wrocławiu, Raport o stanie środowiska w województwie dolnośląskim w 2010 roku, Wrocław 2011.
BINKOVA B., CEMA B., et al., Biological activities of organic compounds adsorbed onto ambient air particles: comparison between the cities of Teplice and Prague during the summer winter
seasons 2000-2001, Mutation Research, vol. 525, 2003, 43-59.
GILLI G., PIGNATA C., et al., The mutagenic hazards of environmental PM2.5 in Turin, Environmental Research, vol. 103 (2), 2007, 168- 175.
DU FOUR V.A., VAN LAREBEKE N., et al., Genotoxic and mutagenic activity of environmental
air samples in Flanders, Belgium, Mutation Research, vol. 558, 2004, 155-167.
CORBISIER P., BARCELO D., European Union Concerted Action; BIOSET: Biosensors for
Environmental Technology, Newsteller No. 8, March 2001; Report on the technical workshop on
genotoxicity biosensing, Mol, Belgium 2000.
APPLICATION OF SHORT-TERM TESTS IN STUDIES OF GENOTOXICITY ORGANIC AIR
POLLUTANTS
Technological advances affects the deterioration of the environment. The result is a growing number
of air pollutants. During the process of respiration many pollutants get into human body. Pollutants are
not only gasses but also particulate matter with absorbed organic compounds. These compounds are often
genotoxic. In order to study the impact of air pollution on human health we need to examine their biological activity. Easy, quick and relatively cheap are short-term tests. This paper presents example short-term
testes, which can be used to detecting genotoxic character of air pollutions.