Obserwacje kliniczne zwierząt w badaniach toksykometrycznych

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
/BSERWACJEKLINICZNEZWIERZ’T
WBADANIACHTOKSYKOMETRYCZNYCH
#LINICALOBSERVATIONSOFANIMALSINTOXICOMETRICSTUDIES
)NGA-RZYK!LEKSANDRA3ZEWCZYK2OBERT3ORNAT-AŒGORZATA0RZYBYŒA
)NSTYTUT0RZEMYSŒU/RGANICZNEGO
/DDZIAŒW0SZCZYNIE
Streszczenie
Obserwacja wyglądu i zachowania się zwierząt to ważny
element w badaniach toksykometrycznych substancji chemicznych, zarówno w badaniu toksyczności po podaniu
jednorazowym jak również w badaniach toksyczności po
podaniu wielokrotnym. Często niedoceniane obserwacje
kliniczne stanowią ważne źródło informacji o niekorzystnym wpływie badanej substancji na stan zdrowia zwierzęcia. W opracowaniu przedstawiono zakres obserwacji klinicznych i stopniowanie ich nasilenia. System ten
sprawdził się w praktyce i może być poddany międzylaboratoryjnej weryfikacji.
Słowa kluczowe: toksykometria, obserwacje kliniczne,
klasyfikacja objawów klinicznych
Jednym z podstawowych a często niedocenianych elementów oceny działania szkodliwego substancji chemicznych w badaniach toksykometrycznych są obserwacje kliniczne. Pozwalają one często na uchwycenie objawów działania toksycznego, które nie uwidaczniają się w badaniach
kliniczno-chemicznych i patomorfologicznych. Niejednokrotnie stanowią one pierwsze sygnały działania neurotoksycznego badanej substancji.
W badaniach toksykometrycznych obserwacje kliniczne
prowadzone są już od dawna, lecz ich zakres był określany zbyt ogólnie i różnił się w znacznym stopniu w różnych
laboratoriach przeprowadzających badania. Brak było również ujednoliconego sposobu oceny nasilenia występujących objawów.
W nowelizowanych lub nowoopracowanych Wytycznych OECD (Wytyczna 407-1995, Wytyczna 408-1998, Wytyczna 424-1997) zalecane jest opracowanie i zastosowanie
systemu punktacji zawierającej kryteria lub skalę punktową
dla każdego parametru klinicznego. Rozbudowanie zakresu obserwacji klinicznych, obok wprowadzenia elementów
badania zachowania się zwierząt, miało na celu zwrócenie
uwagi na ocenę funkcjonowania układu nerwowego w badaniach toksyczności po narażeniu jednorazowym i wielokrotnym. W obowiązujących wytycznych działanie neurotoksyczne rozumiane jest znacznie szerzej niż tylko neuropatia,
uwzględnia się też m.in. zaburzenia koordynacji ruchowej
czy ubytki sensoryczne [1].
Abstract
Observation of animals’ appearance and behavior is an
important element in toxicometric studies of chemical
substances including toxicological studies after single
administration as well as repeated dose toxicological studies. The underestimated clinical observations are important source of information on unfavorable influence of test
item on health state of animal. In the treatise a range of
clinical observations and grading of their intensity are presented. This system was verified in practice and may be
subjected to interlaboratory verification.
Key words: toxicometrics, clinical observations, classification of clinical signs
W tradycyjnych metodach ustalania toksyczności ostrej
padnięcia stanowiły wartość końcową [2]. Nowe podejście
w tego rodzaju badaniach polega na obserwacji wyraźnych
objawów toksyczności w jednym z poziomów ustalonych
dawek, unikając w ten sposób padnięć zwierząt [3].
Częstość przeprowadzania obserwacji klinicznych zależy od
rodzaju badania. W badaniu toksyczności ostrej obserwacje kliniczne zwierząt prowadzi się przed podaniem badanej substancji,
następnie kilka razy w dniu podania badanej substancji, a potem
raz dziennie w czasie 14-dniowego trwania doświadczenia [3].
W badaniach przy powtarzanym dawkowaniu szczegółowe obserwacje kliniczne przeprowadza się przed podaniem badanej substancji, a następnie w odstępach tygodniowych [4, 5]. Kliniczne oznaki toksyczności odnotowywane
w trakcie trwania narażenia mogą wiązać się albo z punktami
końcowymi toksyczności albo z procesami chorobowymi.
Mogą one zostać użyte jako dowody popierające zależność
dawka - odpowiedź, a w ten sposób mogą odgrywać znaczącą rolę w określeniu poziomu bez obserwowanego działania
szkodliwego (NOEL –No Observed Effect Level). Jednakże
nie wszystkie objawy kliniczne muszą być skorelowane ze
zmianami patologicznymi w tkankach i narządach. Niektóre
z nich, powodowane przez biochemiczne lub fizjologiczne
skutki, tj. brak koordynacji, skurcze mięśni, drżenie, biegunka, mogą wskazywać na inhibicję acetylocholinoesterazy bez jakichkolwiek zmian morfologicznych spotykanych
w tkance nerwowej [6, 7].
&ARM0RZEGL.AUK
Tabela I. Szczegółowe obserwacje kliniczne zwierząt i ich stopniowanie
I
UKŁAD RUCHU, ZACHOWANIE SIĘ, REAKCJE NA BODŹCE
1.
Postawa ciała:
0 – bez zmian
1– grzbiet zaokrąglony
2 – zwierzę leży na boku
3 – zwierzę leży na brzuchu
4 – zwierzę chwycone za ogon kręci się po okręgu
2.
Sposób chodzenia
0 – prawidłowy: głowa jest w poziomie, brzuch nieznacznie uniesiony nad podłogą, ciało podnosi się i opuszcza delikatnie podczas chodzenia
1 – chwiejny chód
2 – niedowład tylnych kończyn (zwierzę wlecze tylne kończyny)
3 – zwierzę leży bezwładnie
3.
Aktywność ruchowa:
0 – normalna
1 – nieznaczny spadek
2 – wyraźny spadek
3 – nieznaczny wzrost
4 – wyraźny wzrost
5 – brak ruchu
4.
Ruch mimowolny – kloniczny (szybko występujące jeden po drugim skurcze mięśniowe)
0 – brak
1 – drżenie
2 – drgawki
5.
Ruch mimowolny – toniczny (długo trwające naprężenia mięśniowe):
0 – brak
1 - występuje
6.
Reakcja zwierząt na ich chwytanie:
0 – bez zmian (łatwo, normalnie, zwierzę nie stawia wyraźnego oporu)
1 – bardzo łatwo (zwierzę siedzi lub leży, pozwala się podnieść i zabrać)
2 – trudno (zwierzę kuli się i staje się sztywne lub biega wkoło i jest trudne do uchwycenia)
3 – bardzo trudno (zwierzę atakuje)
7.
Wokalizacja:
0 – brak
1 – występuje
8.
Reakcje na bodźce dźwiękowe (stukanie palcem w bok klatki lub w podłoże, gdy zwierzę jest poza klatką)
0 – prawidłowa
1 – zmniejszona reakcja (osowiałość)
2 – zwiększona reakcja (nadpobudliwość)
3 – brak reakcji
II. SKÓRA I SIERŚĆ
1.
Barwa skóry:
0 – prawidłowa
1 – rumień
2 – bladość
3 – zasinienie
2.
Obrzęk
0 – brak (bez zmian)
1 – występuje
3.
Naskórek
0 – bez zmian
1 – wysuszenie
2 – złuszczanie się
4.
Sierść:
0 – bez zmian
1 – nastroszenie
2 – przerzedzenie
3 – wyłysienie
5.
Zmiany na skórze:
0 – bez zmian
1 – strup lub strupki
2 – ropień
3 – guz
III. OCZY I POWIEKI
1.
Wydzielina z oczu:
0 – brak
1 – łzawienie
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
2 – wydzielina z krwią
3 – odkładanie się porfiryn wokół oczu („czerwone łzy”)
2.
Wytrzesz oczu:
0 – brak
1 - występuje
3.
Zmętnienie rogówki:
0 – brak
1 – występuje
4.
Zamknięcie powieki:
0 – otwarta
1 – przymknięta
2 – zamknięta
IV. UKŁAD ODDECHOWY
1.
Oddychanie:
0 – normalne
1 – szmery oddechowe
2 – przyśpieszony oddech
3 – utrudnione oddychanie
2.
Wydzielina z nozdrzy:
0 – brak
1 – śluzowa
2 – ropna
3 – z krwią
4 – odkładanie się porfiryn wokół nozdrzy
V. UKŁAD POKARMOWY
1.
Ślinotok
0 – brak
1 – wilgoć tylko wokół pyska
2 – ślina płynie z pyska
2.
Biegunka
0 – brak
1 – występuje
3.
Krwawienie z odbytu:
0 – brak
1 – występuje
VI. UKŁAD MOCZOWY
1.
Moczenie się:
0 – brak
1 – występuje
2.
Krwiomocz:
0 – brak
1 – występuje
VII UKŁAD ROZRODCZY
1.
Wydzielina patologiczna z narządów rozrodczych
0 – brak
1 – występuje
Ponieważ ocena objawów klinicznych jest z natury oceną subiektywną, różniącą się pomiędzy laboratoriami jak
i wykonywana w danym laboratorium przez różne osoby,
wskazane było zatem by obserwacje kliniczne prowadziła
zawsze ta sama osoba. W przypadku badań toksyczności
ostrej jest to możliwe, natomiast w badaniach przewlekłych
trwających do 2 lat takie rozwiązanie jest praktycznie niemożliwe.
Ważną zasadą wykonywania obserwacji klinicznych jest
prowadzenie ich każdorazowo o tym samym czasie i w standardowym miejscu zapewniając jednocześnie, że zmiany
w warunkach badania były minimalne.
Zakres badań klinicznych w badaniach toksykometrycznych wg Wytycznych OECD do Badań Substancji Chemicznych powinien obejmować, ale nie ograniczać się, do zmian
w skórze, sierści, oczach i błon śluzowych, występowania
wydzielin i wydalin oraz objawów odruchowych tj. łzawienie, stroszenie się sierści, nienormalny sposób oddychania.
Należy odnotować zmiany w chodzie, postawie i reakcji
na chwytanie, jak również obecność ruchów klonicznych
lub tonicznych, stereotypię lub dziwaczne zachowanie się
[3, 4, 5].
Uzyskane wyniki obserwacji klinicznych powinny być
opisane przy zastosowaniu systemów punktowych, wyraźnie określonych przez dane laboratorium. Celem ujednolicenia oceny zmian klinicznych i ich optymalizacji opracowano
klasyfikację punktową stosowaną w naszym laboratorium.
Klasyfikację tę przedstawiono w tabeli I. Opracowanie tej
skali miało na celu dokładne scharakteryzowanie zmian
z jednoczesnym uwzględnieniem ich natężenia. Z wprowa-
&ARM0RZEGL.AUK
Tabela II.
Wyniki szczegółowych obserwacji klinicznych – karta badania
Rodzaj badania: ………………………………………………………………………………..
Badany materiał: ………………………………………………………………………….…….
Kod badania: .……. Dawka / stężenie* (mg/kg m.c.) / (ppm)*: ………Nr klatki: ……….
Gatunek: …………..….… Płeć: ……………………. Nr zwierzęcia (komp./rejstr.): ...….……
Dzień lub tydzień doświadczenia * / data obserwacji
Parametr
I Układ ruchu, zachowanie
się, reakcje na bodźce
1. Postawa ciała
2. Sposób chodzenia
3. Aktywność ruchowa
4. Ruch mimowolny – kloniczny
5. Ruch mimowolny – toniczny
6. Reakcja zwierzęcia na chwytanie
7. Wokalizacja
II Skóra i sierść
8. Reakcja na bodźce dźwiękowe
1. Barwa skóry
2. Obrzęk
3. Naskórek
4. Sierść
5. Zmiany na skórze
III Oczy i
powieki
1. Wydzielina z oczu
2. Wytrzeszcz oczu
3. Zmętnienie rogówki
IV Układ
oddechowy
4. Zamknięcie powieki
1. Oddychanie
2. Wydzielina z nozdrzy
VII Układ
rozrodczy
VI
Układ
moczowy
V Układ
pokarmowy
1. Ślinotok
2. Biegunka
3. Krwawienie z odbytu
1. Moczenie się
2. Krwiomocz
1. Wydzielina patologiczna z narządów
rozrodczych
Podpis
* niepotrzebne skreślić
dzeniem klasyfikacji związane było wprowadzenie odpowiedniej karty badania, w której notuje się wyniki przeprowadzonych szczegółowych obserwacji klinicznych (tabela
II). Regularne prowadzenie obserwacji dostarcza informacji
o momencie pojawienia się oznak toksyczności, ich nasileniu jak również czasie trwania.
Wprowadzenie w naszym laboratorium ujednoliconego
systemu uchwycenia i kwalifikacji objawów klinicznych
oraz ich opisywanie w odpowiednich kwestionariuszach
sprawdziło się. Pomimo subiektywnego charakteru obser-
wacji, opracowany system pozwala na wykrycie i jednolitą ocenę występujących objawów klinicznych, w tym objawów wczesnej neurotoksyczności. System ten może być
przeniesiony do innych laboratoriów toksykometrycznych
i poddany miedzylaboratoryjnej ocenie.
Prowadzenie obserwacji klinicznych pozwala na wczesne wykrycie oznak toksyczności, zmian chorobowych
oraz zapobiega stratom zwierząt dla oceny toksyczności ze
względu na ich padnięcie, a następnie autolizę tkanek [8].
Z punktu widzenia etycznego prowadzenie tych obserwacji
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
pozwala na identyfikację zwierząt będących w stanie agonii
lub widocznie cierpiących bądź też wykazujących oznaki
silnego i trwałego bólu, co daje podstawę do przeprowadzenia eutanazji [9].
Piśmiennictwo
1. Rydzyński K. Przegląd zmian w metodach toksykometrycznych zalecanych przez OECD i Unię Europejską;
metody alternatywne. Med Pr 1996; 5:17-30.
2. OECD. Acute Oral Toxicity. W: OECD Guidelines for
Testing of Chemicals. Section 4, No 401,OECD, Paris,
1987.
3. OECD. Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Method. W:
OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Section 4,
No 420,OECD, Paris, 1992.
4. OECD. Repeated Dose 28-Day Oral Toxicity Study in
Rodents. W: OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Section 4, No 407,OECD, Paris, 1995.
5. OECD. Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in
Rodents. W: OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Section 4, No 408,OECD, Paris, 1998
6. OECD.Guidance Notes for Analysis and Evaluation of
Repeated Dose Toxicity Studies. Enviromental Health
and Safety Monograph Series on Testing and Assesment
No 32, OECD 2000
7. Gralewicz S. Ocena działania neurotoksycznego. W:
Toksykologia przemysłowa. Red Indulski J A, Piotrowski J K. Wydawnictwo IMP. Łódź 1993, 39-49.
8. Zasady i metody oceny toksyczności związków chemicznych. Kryteria Zdrowotne Środowiska. Wydawnictwo PZWL. T 6, Warszawa 1986.
9. OECD. Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation.
Enviromental Health and Safety Monograph Series on
Testing and Assesment No 19, OECD 2000
Adres do korespondencji:
Inga Mrzyk
Instytut Przemysłu Organicznego
Oddział w Pszczynie
ul. Doświadczalna 27, 43-200 Pszczyna
tel. 32 210 30 81 wew. 102
e-mail: [email protected]