roczn. pzh, 1999, 50, nr 1, 77-87 - Wydawnictwa NIZP-PZH

roczn. pzh, 1999, 50, nr 1, 77-87 - Wydawnictwa NIZP-PZH

ROCZN. PZH, 1999, 50, NR 1, 77-87
78
L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
te ch n o lo g icz n ej, kiedy istnieje niebezp ieczeń stw o ubytku, n iek ied y b a rd z o znacznego,
n a tu ra ln e j w itam iny C. D la te g o też n ie z b ę d n e są m e to d y an ality czn e um ożliw iające
o zn a cz en ie je j zaw artości w p ro d u k ta c h spożywczych. N ie k tó re z m e to d pozw alają
o znaczyć kw as L -askorbinow y, in n e n a to m ia st łą czn ą za w arto ść kw asów L -askorbinow eg o (A A ) i d e h y d ro a sk o rb in o w e g o (D H A A ). K lasyczna m e to d a m iareczk o w a wg
T illm ansa [19] p o le g a na u tle n ie n iu kw asu ask o rb in o w eg o za p o m o c ą 2,6-dichlorofen o lo in d o fe n o lu ; m e to d ę tę w ykorzystano też w P olskiej N o rm ie [17]. W przy p ad k u
o z n a cz an ia całkow itej zaw artości w itam iny C, kw as d eh y d ro a sk o rb in o w y re d u k u je się
n ajp ierw d o kw asu L -askorbinow ego. S iark o w o d ó r stosow any ja k o r e d u k to r w orygi­
n aln ej w ersji teg o p o stę p o w a n ia [19] stw arzał w iele n ie d o g o d n o ści; je d n a z p o d sta w o ­
wych w ad teg o odczynnika, to je g o m ała w ybiórczość ja k o re d u k to ra , co stanow i
przyczynę b łędów p o d cz as o znaczania.
D o innych, b ard z iej now oczesnych m e to d o zn a cz an ia w itam iny С n ależ ą m eto d y
e le k tro c h e m ic z n e [6], sp e k tro fo to m e try c z n e [1, 16, 18], flu o ry m etry czn e [5], w reszcie
m e to d y z zasto so w a n iem testów enzym atycznych [3] o raz m e to d y p o łączo n y ch tech n ik
przepływ ow ej analizy nastrzykow ej i sp e k tro fo to m e te rii [12].
W y so k o sp raw n a ch ro m a to g ra fia cieczow a (H P L C ) [7, 8, 9, 11, 13, 20], n ależy bez
w ą tp ie n ia d o co ra z częściej w ykorzystyw anych te ch n ik analitycznych stosow anych do
o zn a cz an ia w itam iny С w różnych p ro d u k ta c h spożywczych. D o jej za le t n ależą: w ysoka
specyficzność, czułość i łatw ość w ykonania analizy. K o rzy stając z tej te ch n ik i a n a li­
tycznej m o ż n a stosow ać ró ż n e d e te k to ry np.: fluorym etryczny, elek tro ch e m ic zn y , am p ero m e try cz n y o ra z d e te k to r U V [8].
H P L C w odw róconym uk ład zie faz, ta k że z zasto so w an iem p a r jo n o w y ch lu b na
k o lu m n a ch am inow ych z d e te k to re m U V , um ożliw ia b e z p o śre d n io łatw e i szybkie
o zn a cz en ie całkow itej zaw artości kw asu L -a skorbinow eg o p o o d p o w ied n io p rz e p ro w a ­
d zo n ej red u k cji je g o form y d eh y d ro za p o m o cą np. d itio tre ito lu [8, 9] czy D L -h o m o cysteiny [11]. M ożliw e je st rów nież rów n o czesn e o zn a cz en ie zaró w n o kw asu a s k o rb i­
n o w eg o (A A ) ja k i d eh y d ro a sk o rb in o w e g o (D H A A ) p o p rze k szta łc en iu teg o o sta tn ie g o
za p o m o c ą d ic h lo ro w o d o rk u fenylen o d iam in y w p o c h o d n ą silniej a b so rb u ją c ą U V
(3 -(l,2 -d ih y d ro k sy e ty lo )fu ro [3 ,4 -b ]c h in o k sa lin o -l-o n ) [7].
C e le m niniejszej pracy było o p rac o w a n ie now oczesnej m e to d y o zn a cz an ia w itam iny
С w p rze tw o ra ch ow ocow ych i w arzyw nych takich ja k soki, n a p o je i n ek tary , n a k tó re
sy stem aty cznie ro śn ie popyt w kraju. W ym óg d e k laro w an ia p rzez p ro d u c e n ta n a o p a ­
ko w an iach w ym ienionych p ro d u k tó w zaw artości tej w itam iny p rze m aw ia d o d a tk o w o za
p o d ję cie m tej tem atyki.
N a p o d sta w ie p rze g ląd u literatu ry i w łasnych b a d a ń w stępnych za n a jo d p o ­
w ied n iejszą u z n a n o m e to d ę o zn aczan ia całkow itej zaw artości w itam iny С ja k o kw asu
ask o rb in o w e g o te c h n ik ą w ysokospraw nej ch ro m a to g rafii cieczow ej (H P L C ) w o d ­
w ró co n y m u k ła d zie faz, z d etek c ją w U V i d o d a tk ie m D T T (d itio tre ito l) ja k o czynnika
red u k u ją ce g o .
M ATERIAŁY I M ETODYKA
Wyposażenie
Wykorzystano chrom atograf cieczowy firmy Milton-Roy/LDC Analytical złożony
z następujących elementów: pompy izokratycznej Constametric III, detektora UV Spectro-Moni-
jsjr ]
Oznaczanie witaminy С
79
tor 3100, zaworu dozującego Rheodyne 731 z pętlą o pojemności 20 /xl, kolumny chrom atogra­
ficznej Nova Pak RP-C18, W aters z przedkolumną o analogicznych właściwościach. Pracę zesta­
wu kontrolowano za pomocą kom putera z programem sterującym i integracyjnym Axxiom727.
Do rejestracji chromatogramów wykorzystano drukarkę Epson LX-400.
Stosowano ponadto: generator ultradźwięków Btichler, wagę analityczną WA34, wytrząsarkę
laboratoryjną Lab-line Instruments Inc, mikrostrzykawkę Hamilton poj. 100 ц1, sączki Schotta
G-2 z zestawem do sączenia pod zmniejszonym ciśnieniem oraz typowe szkło laboratoryjne takie
jak: kolby miarowe, pipety, cylindry miarowe, kolby EHenmayera, lejki szklane.
Odczynniki i materiały pomocnicze
1. Woda redestylowana znad 0,5 g КМПО4 i 5 g N aO H (na każde 2 litry wody destylowanej),
2. roztwór Carreza I: K4[Fe(CN)6] x 2 H 2O o stężeniu 3,6g/100 ml wody, 3. Roztwór Carreza
II: ZnS04 x 7 H2O o stężeniu 7,2g/100ml wody, 4. Fosforan potasowy I zasadowy (KH 2PO 4)
cz.d.a., POCh Gliwice, 5. 1,4-ditio-DL-treitol (DTT) 99%, Lancaster, 6. Wzorzec kwasu L-askorbinowego, Analar BDH, 7. Roztwory robocze kwasu L-askorbinowego w zakresie stężeń
0,005-0,020 mg/ml z dodatkiem 0,1% DTT.
Zasada metody
Zasada metody polega na oznaczeniu łącznej zawartości kwasów: L-askorbinowego i dehydroaskorbinowego w badanej próbce [8, 9]. Kwas dehydroaskorbinowy redukowany jest do kwasu
L-askorbinowego za pomocą ditiotreitolu. Witamina С oznaczana jest techniką wysokosprawnej
chromatografii cieczowej (HPLC) z zastosowaniem kolumny RP-C18 i detektora UV (X 254
Obróbka wstępna badanego materiału
Soki: 1 ml soku (bezpośrednio po otwarciu opakowania) pobierano do kolby miarowej poj.
25 ml, do której uprzednio odważano 25 mg DTT i rozpuszczano w 10 ml wody. Zawartość
kolby mieszano w łaźni ultradźwiękowej w czasie 15-20 sekund. Próbkę klarowano dodając po
0,1 ml roztworów Carreza I, II, następnie uzupełniano wodą do kreski i ponownie mieszano
w łaźni ultradźwiękowej. Tak przygotowaną próbkę przechowywano przez 2 godziny bez dostępu
światła w tem peraturze pokojowej. Bezpośrednio przed wykonaniem analizy chromatograficznej
próbkę przesączano przez bibułę.
Nektary i soki przecierowe (o zwiększonej zawartości miąższu): Próbkę nektaru (1 ml)
wytrząsano przez 30 min na wytrząsarce mechanicznej przy amplitudzie 2,5 x 100 RPM w 25 ml
kolbce miarowej z dodatkiem 25 mg DTT i 20 ml wody. Kolbkę zabezpieczano folią aluminiową
przed dostępem światła. Dalej postępowano jak z próbkami soków.
P r z yg o t o w a n i e krzywej wzor cowe j
Odważano 5 mg kwasu L-askorbinowego i rozpuszczano w wodzie w kolbie miarowej o po­
jemności 100 ml. Następnie pobierano po 1, 2 i 3 ml tak przygotowanego roztworu do kolb
miarowych pojemności 10 ml, do których dodawano po 10 mg DTT. Zawartość kolb uzupełniano
wodą do kreski i mieszano w łaźni ultradźwiękowej. Stężenie tak przygotowanych wzorców
wynosiło: 0,005; 0,10 i 0,015 mg/ml. Roztwory przed wykonaniem analizy chromatograficznej
przechowywano przez 2 godziny bez dostępu światła.
Wysokosprawna chr om at og raf ia cieczowa
Analizę chromatograficzną próbek wykonywano w tem peraturze otoczenia (20-25°C). Fazę
rozwijającą stanowił 0,5% roztwór wodny KH2PO4 z dodatkiem 0,1% D TT dozowany z prędkoś­
cią przepływu 0,3 ml/min. Pomiaru absorbancji w UV dokonywano przy długości fali X 254 nm.
W analogicznych warunkach chromatografowano roztwory wzorcowe witaminy C.
Zawartość witaminy С w mg/ml próbki obliczano z krzywej wzorcowej za pomoc:| programu
komputerowego wykorzystującego następujący wzór:
80
L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
w którym:
См - stężenie witaminy С w roztworze wzorcowym (mg/ml)
P - powierzchnia piku witaminy С w próbce badanej
Pst - powierzchnia piku witaminy С w roztworze wzorcowym
Vk - końcowa objętość próbki po rozcieńczeniu (ml)
V - objętość próbki pobrana do analizy (ml).
WYNIKI I ICH O M Ó W IENIE
W b a d a n ia c h w stępnych na ro ztw o rach w zorcow ych w itam iny С o k re ślo n o w arunki
red u k cji kw asu d eh y d ro a sk o rb in o w e g o o raz w aru n k i w ysokospraw nej ch ro m a to g rafii
cieczow ej. S tw ierd zo n o , że opty m aln y czas redukcji w ynosi 2 godziny.
Z a n ajo d p o w ied n iejszy e lu e n t u zn a n o 0,5% ro ztw ó r w odny K H 2P 0 4 z d o d atk iem
0,1% D T T . P rzepływ cieczy z p ręd k o śc ią 0,3 m l/m in o k a z a ł się o ptym alny, co p o tw ie r­
d zo n o ró w nież w przy p ad k u analizy p ró b e k fortyfikow anych w ybranych d o b a d a ń
p ro d u k tó w . Ś re d n i czas rete n cji kw asu ask orbinow ego w ynosił w e w sp o m n ian y ch w a­
ru n k a c h 7,7 m inuty. N a rye. 1 p rze d staw io n o przykładow y c h ro m a to g ra m kw asu a sk o r­
b in o w eg o w b a d a n e j p róbce.
P rz y d atn o ść
o p isan ej
p ro c e d u ry
analitycznej
do
o zn a cz an ia
w itam iny
С w poszczególnych ro d za jac h p ró b ek sp raw d zo n o forty fik u jąc p ró b k i soków , p rz e ­
cierów i n e k ta ró w o kreślonym i po zio m am i w itam iny C. W p rzy p ad k u p ró b e k zaw ie­
rających w ita m in ę C, odzysk m eto d y o k re śla n o w sto su n k u d o te o re ty cz n ie obliczonej
zaw arto ści w itam iny stanow iącej su m ę jej o zn a cz o n eg o stę że n ia i p o zio m u fortyfikacji,
p rzy jm u jąc tę w arto ść za 100% . D la o k reśle n ia śre d n ie g o odzysku i p o w tarzaln o ści
p o stę p o w a n ia an alitycznego w ykonano se rie o zn aczeń zaw artości w itam in y С
w p ró b k a c h handlow ych p rzetw orów ow ocow ych, ow ocow o-w arzyw nych i w arzyw nych.
W ta b e la c h I - I I z e b ra n o w sp o m n ia n e p ara m etry . Ja k w ynika z d anych zaw artych
w ta b e la c h , śred n i odzysk w itam iny С w ah a ł się w g ran icach o d 92 d o blisko 103%
w zależn o ści od rodzaju p ró b k i i poziom u fortyfikacji. W zg lęd n e o d ch y len ie s ta n d a r ­
dow e (w spółczynnik zm ien n o ści) w ynosiło 0 ,45-4,32% .
P o ziom y fortyfikacji (d la soków ow ocow ych 0,10 m g/m l i 1,00 m g/m l soku o raz dla
n e k ta ru i soku p o m id o ro w eg o 0,05 m g/m l i 0,50 m g/m l so k u ) d o sto so w a n o d o ilości
w itam in y С d ek laro w an ej na o p ak o w a n iu p rzez p ro d u c e n ta . W szystkie o zn aczen ia
w ykonyw ano w 6-ciu p o w tó rzen iach .
W a rto ści odzysku w itam iny С z p ró b e k takich p ro d u k tó w ja k m .in.: soki ow ocow e,
le m o n ia d a, uzyskane p rzez au to ró w prac, na których o p ie ra n o się p o d czas o p rac o w y ­
w an ia m e to d y o zn a cz an ia w itam iny С [8, 9] w ynosiły 9 0 -1 0 6 % , a w ięc były p o ró w n y ­
w alne.
W celu obiek ty w n eg o w yznaczenia granicy w ykryw alności i o zn aczaln o ści m eto d y
zasto so w a n o p o stę p o w a n ie wg H adricha i wsp. [10] stan o w iące m o d y fik ację p ro c e d u ry
za le ca n ej p rzez D IN o ra z D e u tsc h e F o rsch u n g sg em eisch aft (D F G ). W y k o n an o w ięc
p o 3 ró w n o ległe o zn a cz en ia zaw artości w itam iny С w e w zm ocnionym so k u jabłkow ym
Oznaczanie witaminy С
81
Ryc. 1. Chromatogram próbki soku z czarnej porzeczki oraz wzorzec witaminy С o stężeniu
0,005 mg/ml
Chromatograms of black currant juice sample and vitamin С standard (C = 0,005
mg/mgl)
00
to
Tabela
I.
Odzyskiwalność i precyzja metody na przykładzie soku pomidorowego i nektaru marchwiowo-pomarańczowego (n = 6
powtórzeń)
Recovery and precision of the method for tom ato juice and carrot-orange nectar (n = 6 paraleli determ inations)
L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
SD - odchylenie standardow e
RSD - względne odchylenie standardow e (współczynnik zmienności)
Nr 1
jsjr 1
Tabela
II.
Kryteria dla m etod analitycznych stosowanych w urzędowej kontroli
C riteria for analytical m ethods using in official control
Oznaczanie witaminy С
00
L*J
84
L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
Oznaczanie witaminy С
85
Rye. 2. Krzywe odzysku witaminy С z soku jabłkowego
Recovery curves of vitamin С for apple juice
Objaśnienia: G02 graficzne odwzorowanie granicy oznaczalności metody
Tabela
I I I . Zestawienie niektórych statystycznych danych metody
Some statistical data of the method
Sx
- odchylenie standardowe dla wszystkich poziomów fortyfikacji,
Sy
- odchylenie standardowe krzywej regresji,
Ykiyt - maksymalna, graniczna wartość sygnału detektora dla próbki nie zawierającej nznaczanej
substancji,
G»i - granica wykrywalności odpowiadającą wartości ykryi,
Gw2 - właściwa granica wykrywalności czyli najniższe stężenie witaminy C, dające się jakościo­
wo wykryć z prawdopodobieństwem 95%,
Goi - granica oznaczalności czyli najniższe stężenie analizowanej substancji, dla którego syg­
nały będą zawsze wyższe niż w przypadku wartości GW2,
Go2 - granica oznaczalności spełniającą poprzedni warunek dla odzysku pomiędzy 70 a 120%.
86
L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
WNIOSKI
O p isa n a m e to d a o zn a cz an ia w itam iny С w so k ach ow ocow ych i w arzyw nych o ra z w
n e k ta ra c h ch a rak te ry z u je się dobrym i p a ra m e tra m i śred n ie g o odzysku, precyzji i oznaczalności, co w p o łą cz en iu z p ro sto tą w ykonania pozw ala n a jej w y k o rzy stan ie w
an a liz ie rutynow ej.
L.
Czerwiecki,
G.
Wilczyńska
D ETER M IN A TIO N O F VITAM IN С IN SELECTED FR U IT AND VEGETA BLE
PRODUCTS
Summary
A simple method was described to determine vitamin С as L-ascorbic acid (after reduction
of dehydroascorbic acid by means of dithiothreitol) in fruit juices, fruit and vegetable-fruit
nectars. Ascorbic acid was analyzed by RP-HPLC technique with UV detection (254 nm).
The average recovery of ascorbic acid was 92-103% and limits of identification and detection
were 0,003 and 0,009 mg/ml of products respectively.
PIŚM IENNICTW O
1. Anwar J., Farooqi M.I., Nagra S.A. i wsp.: A new method for spectrofotometric determ ina­
tion of ascorbic acid. J. Chem Soc. of Pakistan, 1990, 12, 75-79.
2. Belitz H.D., Grosch W.: Vitamine w : Lehrbuch der Lebensmittelchemie, Springer Verlag,
Berlin, Heidelberg, 1987, 323-338.
3. Casella L., Gullotti М., Morchesini i wsp.: Rapid enzymatic method for vitamin С assay in
fruits and vegetables using peroxidase. J. Food Sci., 1989, 54, 374-375.
4. Charleux J.L.: Beta-carotene, antioxidant vitamins and their role in preventive nutrition.
Reprint from FIE Conference Proceedings, 1992, 1.
5. Chung H.K., Ingle J.D.(Jr): Fluorimetric kinetic method for the determ ination of total
ascorbic acid with o-phenylenediamine. Anal. Chim. Acta, 1991, 243, 89-95.
6. Craston D.H.: Microband electrodes fabricated by screen printing processes: applications
in electroanalysis. Talanta, 1991, 38, 17-26.
7. Dodson K.Y., Young E.R., Soliman A .C .M .: Determination of total vitamin С in various
food matrixes by liquid chromatography and fluorescence detection. J. AOAC. Int., 1992,
75, 887-891.
8. Gókmen V., AcarJ.: D eterm ination of total vitamin С as ascorbic acid in foods using HPLC.
E uro Food Chem, VIII, Vienna, 1995, 2, 345-348.
9. Gókmen V., AcarJ.-. A simple HPLC method for determ ination of total vitamin С in fruit
juices and drinks. Fruit Process., 1996, 6, 198-201.
10. Hadrich J., Vogelgesang J. : Konzept 96 zur Ermittlung von Nachweis, - Erfassungs - und
Bestimmungsgrenze. Deutsch. Lebensm. Rdsch., 1996, 92, 341-350.
11. Hoare М., Jones S., Lindsay J.: Total vitamin С analysis of orange juice. Food Australia,
1993, 45, 341-345.
12. Jain A., Chaurasia A., Verma K.K.: Determination of ascorbic acid in soft drinks, preserved
fruit juices and pharmaceuticals by flow injection spectrometry: matrix absorbance corre­
ction by treatm ent with sodium hydroxide. Talanta, 1995, 42, 779-787.
13. Khaled M.Y.: Simultaneous HPLC analysis of L-ascorbic acid, L-ascorbyl-2-sulfate and
L-ascorbyl-2-polyphosphate. J Liq. Chem. Rel. Technol., 1996, 19, 3105-3118.
14. Nadolna J.: W itamina С w: Wybrane metody badania składu i wartości odżywczej żywności.,
ed. U. Rutkowska, PZWL, Warszawa, 1981, 291-298.
Oznaczanie witaminy С
87
15. Nisperos-Caniedo М., Busling B.S., Shaw P.E. : Simultaneous detection of dehydroascorbic,
ascorbic and some organic acids in fruits and vegetables by HPLC. J. Agr. Food Chem.,
1992, 40, 1127-1130.
16. Ózgur M. U., Sungur S.: Third order derivative spectrophotometric determ ination of ascorbic
acid in fruits and vegetables. Talanta, 1995, 42, 1631-1640.
17. Polska N orm a PN-90/A-75101/11. Przetwory owocowe i warzywne. Przygotowanie próbek
i metody badań fizykochemicznych. Oznaczanie zawartości witaminy C, 1990, 1-5.
18. Srividya К., Balasubramanin N.: Indirect spectrophotometric determ ination of ascorbic acid
in pharmaceutical samples and fruit juices. Analyst, 1996, 121, 1635-1655.
19. Tillmans J., Hirsh P.\ Vitamin C. Biochem Z., 1932, 250, 312.
20. Vanderslice J.T., Higgs D.J.\ Quantitative determination of ascorbic, dehydroascorbic, isoascorbic, and dehydroisoascorbic acids by HPLC in foods and other matrices. J. Nutr.
Biochem., 1993, 4, 184-190.
Otrzymano: 1998.05.15