Pełny tekst - Wydawnictwa NIZP-PZH

ROCZN. PZH, 1999, 50, N R 4, 409-419
LUDWIK CZERWIECKI, G RAŻYNA WILCZYŃSKA
O Z N A C Z A N IE W IT A M IN В, I B2 W W Y B R A N Y C H P R O D U K T A C H
O W O C O W O -W A R Z Y W N Y C H
D ETE RM IN ATIO N OF VITAM IN S Bi A N D B2 IN SELECTED VEG ETABLE-FRU IT
PRODUCTS
Zakład Analizy Żywności
Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego
02-532 Warszawa, ul. Rakowiecka 36
Kierownik: prof. dr hab. B. Szteke
Witaminy B i i B 2 w sokach owocowych i owocowo-warzywnych oznaczano
techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej par jonowych w odwróconym
układzie faz. Średni odzysk witaminy Bi wahał się w zakresie od 85 do 104%,
a witaminy B 2 od 94 do 106%. Granice wykrywalności i oznaczalności, w mg/ml
produktu, wynosiły, odpowiednio: 0,0008 i 0,0024 (witamina B i) oraz 0,0002
i 0,0007 (witamina В 2 ).
WSTĘP
T iam in a, czyli w itam in a Bi w ystępuje w różnych fo rm a ch (ch lo ro w o d o re k , piro fo sfo ran ) w zb ożach i ich p rze tw o ra ch o raz w m ięsie. W arzyw a, ow oce i ich p rzetw o ry są
rów nież źró d łe m tej w itam iny chociaż uboższym [7]. D o głów nych funkcji tiam in y w
o rg an izm ie ludzkim należy udział w reak cjach cyklu p en to zo w eg o i tw o rze n ie rybozy
n iezb ęd n ej w syntezie nukleotydów . W itam in a ta spełn ia rów nież isto tn ą ro lę w p r o ­
cesach zachodzących w k o m ó rk ach u kładu nerw ow ego [10].
D ru g a z grupy w itam in В - w itam ina B2, czyli ryboflaw ina, w ystępuje głów nie
w p o staci zw iązanej w m leku i jeg o przetw o rach , w m ięsie, w w ęd lin ach , w rybach,
w p ro d u k ta c h zbożow ych o ra z w roślinach strączkow ych [10]. P o n iew aż w o w ocach i
warzyw ach jej zaw artości są niew ielkie je st o n a często d o d a w a n a d o ich p rze tw o ró w
np. soków o ra z n ek taró w ow ocow ych i w arzyw nych w celu w zb o g acen ia ich w arto ści
odżywczej. R yboflaw ina w chodzi w skład flaw o p ro teid ó w b io rą c u d ział w p ro ce sac h
oksydoredukcyjnych zachodzących w żywym organizm ie.
G łów ny p ro b lem analityczny podczas oznaczan ia zaw artości w itam in Bi i B2
w żywności stanow i ich izolacja z połączeń w jak ich zazw yczaj w ystępują. S to so w an e
są ró żn e m e to d y ekstrakcji p o łączo n e zazwyczaj z hydrolizą kw asam i m in eraln y m i, b ąd ź
hydrolizą enzym atyczną [2, 3, 8, 11]. Jed n y m z m ożliw ych i prostszych rozw iązań je st
rów nież ek stra k cja kw asem nadchlorow ym [2, 3]. Z aw a rto ść w itam in o zn a cz a się
m eto d am i biologicznym i, enzym atycznym i [7], sp e k tro fo to m etry cz n ie, k o lo ry m etry czn e
oraz flu o ry m etrycznie [7]. S to su je się rów nież te ch n ik ę przepływ ow ej analizy nastrzy-
410
L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
kow ej z d etek c ją w U V [5]. W p rzypadku w itam iny Bi zw iązek m acierzysty p rzek ształca
się d o tio c h ro m u , k tó reg o fluorescencję m ierzy się przy 365/436 nm [7]. W m e to d zie
k o lo ry m etrycznej m ożliw e je st w ykorzystanie reakcji barw nej tiam in y z p -am in o ace to fe n o n e m [7].
N a to m ia s t w itam in ę Bi, k tó ra p od w pływ em św iatła w środow isku alkalicznym ulega
p rz e m ia n ie d o lum iflaw iny (7,8,10-trim etyloizoaloksazyna), o zn acza się fo to m etry czn ie
przy 450 nm lub fluorym etrycznie z em isją przy 513 nm [7].
W an ality ce o bu w itam in В w ykorzyw ana je st rów nież co raz częściej te c h n ik a wyso k o sp raw n ej ch ro m a to g rafii cieczow ej (H P L C ) w odw róconym u k ład zie faz, rów nież
z za sto so w an iem p a r jonow ych, z d etek c ją w U V b ąd ź flu o ry m etry czn ą [1, 2, 3, 8, 11].
C elem niniejszej pracy była ad a p ta c ja now oczesnej i m ożliw ie p ro stej m eto d y o zn a­
cz an ia w itam in Bi i B i w p rzetw o rach ow ocow ych i w arzyw nych, tak ich jak : soki,
n e k ta ry lub p rzeciery itp.
N a p o d sta w ie p rze g ląd u literatu ry i w łasnych b a d a ń w stępnych, za n a jo d p o ­
w ied n iejszą u zn a n o m e to d ę o zn aczan ia o bu w itam in В te ch n ik ą w ysokospraw nej c h ro ­
m a to g rafii cieczow ej (H P L C ) z zasto so w an iem p a r jonow ych w o d w ró co n y m układzie
faz, p o ek strakcji kw asem nadchlorow ym z d etek c ją w U V [2, 3]. P o n iew aż m etody
o ry g in aln e odnosiły się d o tk a n ek zw ierzęcych [9] o raz do p re p a ra tó w odżyw czych dla
n iem o w ląt n a bazie soji i m leka, n ie zb ę d n e były m odyfikacje u m o żliw iające ich za sto ­
sow anie d o innej grupy p ro d u k tó w , do których n ależą w ym ienione w cześniej przetw ory
ow ocow o-w arzyw ne.
M ATERIAŁY I METODYKA
Wyposażenie
Wykorzystano chromatograf cieczowy firmy Milton-Roy/LDC Analytical zestawiony z na­
stępujących elementów: pompy izokratycznej Constametric III, detektora UV Spectro-Monitor
3100, zaworu dozującego Rheodyne 731 z pętlą o pojemności 20 ц1, kolumny chromatograficznej
Nova Pak RP-C18, W aters z przedkolumną o analogicznych właściwościach. Pracę zestawu
kontrolowano za pomocą komputera z programem sterującym i integracyjnym Axxiom727. Do
rejestracji chromatogramów wykorzystano drukarkę Epson LX-400.
Stosowano ponadto: systemy oczyszczania wody Elix™ i R iO S™ , Milipore, generator
ultradźwięków Biichler, pH-m etr mikrokomputerowy CP-135 Elmerton z elektrodą zespoloną
E R H -1 1 i czujnikiem temperatury MT-100 AM, wagę analityczną WA34, wytrząsarkę laborato­
ryjną Lab-line Instruments Inc, mikrostrzykawkę Hamilton poj. 100 ц1, sączki Schotta G-2
z zestawem do sączenia pod zmniejszonym ciśnieniem oraz typowe szkło laboratoryjne takie jak:
kolby miarowe, pipety, cylindry miarowe, kolby Erlcnmayera, lejki szklane.
Odczynniki
i materiały
pomocnicze
1.
W oda do HPLC uzyskana z wody wodociągowej po oczyszczeniu za pomocą systemów
Elix™ i R iO S IM Milipore 2. kwas solny 67% cz.d.a., Analar BDH do przygotowania roztworu
0,1 molowego, 3. wodorotlenek potasowy cz.d.a., PPH Standard, Lublin (do przygotowania
6 molowego roztworu), 4. kwas nadchlorowy 70%, Aristar BDH, 5. kwas heksanosulfonowy 99%,
Lancaster, 6. amoniak 25% cz.d.a., Analar BDH, 7. acetonitryl do HPLC, Promochem GmbH,
8. kwas o-fosforowy 85% cz.d.a., PPH POCh, Gliwice, 9. tiamina 99%, Lancaster do przygoto­
wania roztworu wzorcowego podstawowego o stężeniu 0,1 mg/ml w 0,1 molowym roztworze
kwasu solnego, 10. ryboflawina 98%, Lancaster do przygotowania roztworu wzorcowego pod­
stawowego o stężeniu 0,02 mg/ml w 0,1 molowym roztworze kwasu solnego, 11. standard
wewnętrzny jako kwas 3-hydroksybenzoesowy (m-HBA) 97%, Lancaster do przygotowania
Metoda oznaczania witamin Bi i B2 w żywności
411
roztworu o stężeniu 0,55 mg/ml cieczy elucyjnej roboczej, 12. bufor o pH 4, Eurosensor, Gliwice,
13. bufor o pH 7, Eurosensor, Gliwice.
Zasada metody
Zasada metody polega na ekstrakcji witamin z próbki przy użyciu kwasu nadchlorowego,
usunięciu jego nadmiaru za pomocą 6 molowego roztworu wodorotlenku potasowego i dopro­
wadzeniu analizowanego roztworu do wartości pH 3,0-3,6 [2, 3]. Witaminy B| i B2 rozdzielano
i oznaczano techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z zastosowaniem par
jonowych na kolumnie RP-C18 z detektorem UV przy długości fali X. 254 nm.
Obróbka wstępna badanego materiału
Soki i soki przecierowe: bezpośrednio po otwarciu opakowania pobierano 20 ml soku do
kolby Erlenmayera poj. 100 ml. Próbkę rozcieńczano 30 ml wody i zakwaszano 2 ml kwasu
nadchlorowego.
Kolbę zamykano korkiem szlifowym i zabezpieczano folią aluminiową przed dostępem świat­
ła. Zawartość kolby wytrząsano przez 1 godzinę na wytrząsarce mechanicznej, następnie prze­
noszono do zlewki pojemności 150 ml i doprowadzano do pH 3,0-3,6 dodając kroplami 6 mo­
lowy roztwór wodorotlenku potasowego. Próbkę przenoszono następnie ilościowo do kolby
miarowej pojemności 100 ml uzupełniając jej objętość do kreski cieczą elucyjną roboczą1. Tak
przygotowaną próbkę przechowywano przez 24 godziny w lodówce w celu sklarowania. W przy­
padku niecałkowitego sklarowania zawartość kolby sączono przez sączek z bibuły. Przed wyko­
naniem analizy HPLC pobierano 5 ml klarownego roztworu do kolbki miarowej poj. 10 ml, do
której uprzednio dodano 100 ц1 roztworu wzorca wewnętrznego (m-HBA). Zawartość kolbki
uzupełniano do kreski roztworem cieczy elucyjnej roboczej i mieszano w łaźni ultradźwiękowej
15-20 sek. Równolegle, w podobny sposób przygotowywano roztwór bez dodatku wzorca
wewnętrznego.
Przygot owanie krzywej wzorcowej
Do kolby Erlenmayera poj. 100 ml zabezpieczonej folią aluminiową przed dostępem światła
odmierzano 2 ml roztworu podstawowego witaminy Bi, 10 ml roztworu podstawowego witaminy
B2, 40 ml wody i 2 ml kwasu nadchlorowego. Dalej postępowano jak z próbkami soków.
Bezpośrednio przed wykonaniem analizy HPLC do 3 kolbek miarowych poj. 10 ml zawie­
rających 100 (il wzorca wewnętrznego pobierano po 2,5; 5,0 i 7,5 ml uprzednio przygotowanego
roztworu wzorcowego witamin Bi i B2. Zawartość kolbek uzupełniano do kreski roztworem
cieczy elucyjnej roboczej i mieszano w łaźni ultradźwiękowej w czasie 15-20 sek. W tak przygo­
towanych roztworach wzorcowych stężenie witamin Bi i B2 wynosiło odpowiednio: 0,0005, 0,0010
i 0,0015 mg/ml, a stężenie wzorca wewnętrznego (m-HBA) - 0,0055 mg/ml.
Wysokosprawna
chromatografia
cieczowa
Analizę chromatograficzną próbek wykonywano w temperaturze otoczenia (20-25°C). Fazę
rozwijającą (roztwór stężony) przygotowywano rozpuszczając 0,95 g kwasu heksanosulfonowego
w mieszaninie o składzie: woda : acetonitryl : amoniak (904,5 : 95 : 0,5). Roztwór ten zo­
bojętniono do pH 3,6 kwasem o-fosforowym. W celu przygotowania cieczy elucyjnej roboczej,
do 950 ml cieczy podstawowej dodawano 50 ml wody.
Optymalna prędkość przepływu cieczy elucyjnej wynosiła 1 ml/min. Pomiaru absorbancji
w UV dokonywano przy długości fali A. 254 nm.
W analogicznych warunkach chromatografowano roztwory wzorcowe witamin Bi i B2. Z a­
wartość witamin В w mg/ml próbki obliczano z krzywej wzorcowej za pomocą programu kom­
puterowego wykorzystującego następujące wzory:
' patrz: Wysokosprawna chromatografia cieczowa
412
L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
Nr 4
WYNIKI I ICH OM ÓW IENIE
W b ad a n ia c h w stępnych na roztw orach w zorcow ych w itam in sp raw d zo n o o p ty m aln e
długości fali absorpcji w U V . S tw ierdzono, że przy 254 nm m o żn a o zn aczać zaró w n o
w itam in ę Bi ja k i B 2 (p o m im o ich różnych m aksim ów absorpcji; o d p o w ied n io : 246, 266
nm ). U sta lo n o p o n a d to , że roboczy zakres liniow ości d e te k to ra przy tej długości fali
o b ejm o w ał stę ż e n ia od 0,0005 d o 0,0015 m g/m l każdej z ozn aczan y ch w itam in. W yka­
za n o rów nież pozytyw ny wpływ (lepszy rozdział o bu substancji n a c h ro m a to g ra m a c h
przy n iezn aczn ie dłuższych czasach rete n cji) rozcień czen ia 950 ml cieczy elucyjnej 50
ml wody.
W pierw szej fazie b a d a ń p rze śled z o n o rów nież (n a ro ztw o rach w zorcow ych) dw a
sp o so b y o b liczan ia w yniku: m e to d ą sta n d a rd u w ew nętrzn eg o o ra z m e to d ą sta n d a rd u
ze w n ętrzn eg o . U z n a n o , że wyniki o trzy m an e w obu p rzyp ad k ach były porów nyw alne.
Je d n a k w późniejszej fazie b a d a ń na rzeczyw istych p ró b k ac h , o k az ało się, że w o p isa ­
nych w aru n k ac h m e to d a sta n d a rd u w ew nętrznego z m -H B A n ie m o że być sto so w an a
d o soków , np. d o soku jabłkow ego, soku p rzecierow ego z m archw i o raz so k u z jab łek
i brzoskw iń ze w zględu na obecn o ść w nich n iezidentyfik o w an ej su b stan cji o czasie
rete n cji zbliżonym d o sto so w an eg o sta n d a rd u w ew n ętrzn eg o (rye. 1).
Z a sto so w a n ie w ięc w zorca w ew nętrznego m oże być celow e je d y n ie w przy p ad k u ,
gdy w b a d a n e j p ró b c e nie w ystępuje substan cja o pod o b n y m czasie rete n cji do użytego
w zorca, a w ykonyw ane czynności w sposób istotny m ogą rzu to w ać n a p o p raw n o ść
Metoda oznaczania witamin Bi i B2 w żywności
413
Ryc. 1. Chromatogramy próbki soku jabłkowego z dodatkiem HBA (I) oraz próbki fortyfikowanej witaminami Bi i B2 bez dodatku HBA (II)
Chromatograms of apple juice samples with HBA (I) and fortified by vitamins Bi and
B2 without HBA (II)
w yniku o zn aczen ia. W przedstaw ionych b ad a n ia ch nie stw ierd zo n o isto tn eg o wpływu
zabiegów zw iązanych z izolow aniem w itam in z p róbki na w ynik o zn aczen ia.
P rzy d atn o ść o p isan ej p ro ce d u ry analitycznej d o o zn aczan ia w itam in Bi i B2
w poszczególnych ro d za jac h p ro d u k tó w sp raw d zo n o fortyfik u jąc p ró b k i soków i soków
przecierow ych określonym i poziom am i o bu w itam in. M e to d a ek strak cji w itam in В
kw asem nad chlorow ym sto so w a n a do tk a n e k zw ierzęcych [9] o raz p re p a ra tó w sojow ych
i p rzetw o ró w m lecznych, o k az ała się przy d atn a rów nież d o p ro d u k tó w tak ich ja k soki
ow ocow e i w arzyw ne. W przy p ad k u p ró b e k zaw ierających te w itam iny, odzysk m e to d y
o k reśla n o w sto su n k u d o te o rety czn ie obliczonej ich zaw artości stan o w iącej su m ę
o zn a cz o n eg o stę że n ia i p o zio m u fortyfikacji, przyjm ując tę w arto ść za 100%. D o
o b liczan ia zaw artości w itam iny B, i B2 stosow ano m e to d ę sta n d a rd u zew n ętrzn e g o . W
ta b ela ch l - I I I ze b ra n o m .in. w artości śred n ie g o odzysku o b u w itam in.
Metoda oznaczania witamin Bi i B2 w żywności
417
Jak wynika z przedstaw ionych danych zawartych w tabelach, średni odzysk witaminy
Bi wahał się w granicach od 85 do 104% w zależności od rodzaju próbki i poziom u
wzmocnienia. W zględne odchylenie standardow e (współczynnik zm ienności) wynosiło
1,5 do 10,6%.
W przypadku witaminy B2 w tych samych produktach, przy tym samym poziom ie
fortyfikacji, wartości te wynosiły odpowiednio: 94-106% i 1,6-10,0% .
W celu obiektywnego wyznaczenia granicy wykrywalności i oznaczalności m etody
zastosowano postępow anie wg H adricha i wsp. [6]. D la w itaminy Bi w ykonano zatem
po 3 równoległe w zm ocnienia soku z czarnej porzeczki (nie zawierającej tiam iny) na
poziomie: 0,020; 0,010 i 0,002 mg/ml soku określając dla każdego poziom u odpow iedź
detektora. Podobnie postępow ano w przypadku witaminy B2 wykonując po 3 rów no­
ległe pom iary w soku pom idorowym (nie zawierającym ryboflawiny) fortyfikowanym
poziomami: 0,0050; 0,0025 i 0,0005 mg/ml soku. W ten sposób wyznaczono rów nanie
regresji opisujące zależność pom iędzy stężeniem dodanych witamin a wielkością syg­
nału detektora. N astępnie korzystając dalej z tego sposobu, który zastosow ano również
z powodzeniem we wcześniejszej pracy własnej dotyczącej oznaczania witaminy С [4],
wyznaczono m.in.: rów nania regresji opisujące zależność pom iędzy stężeniem roz­
tworów wzorcowych w itam in a sygnałem d etektora oraz wykreślono krzywe odzysku,
czyli zależności pom iędzy stężeniam i dodanych do próbek witamin В a stężeniam i
obliczonymi z rów nań regresji krzywych kalibracyjnych roztworów wzorcowych. W yra­
żają to rów nania: у = 0,00011855 + 1,0011 x (dla witaminy Bi) oraz у = -0,0000568
+ 1,00457 x ( dla w itaminy B2 ) (ryc. 2 i 3). O bliczono także granice wykrywalności
oraz oznaczalności dla obu witamin.
Ryc. 2. Krzywa odzysku witminy Bi z soku z czarnej porzeczki
Recovery curves of vitamin Bi for black-currant juice
418
L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
Nr 4
Ryc. 3. Krzywa odzysku witaminy B2 z soku pomidorowego.
Objaśnienia: G0Zn - graficzne odwzorowanie granicy oznaczalności metody
Recovery curves of vit. B2 for tomato juice
D la w itam iny Bi g ran ic a w ykryw alności dla odzysku po m ięd zy 70 a 120% (ró w n an ia:
у = 0,7 x i у = 1,2 x) w ynosiła 0,0008 m g/m l p ro d u k tu , n a to m ia st g ran ic a o zn aczalności
0,0024 m g/m l. W przy p ad k u w itam iny B 2 w artości te wynosiły, dla w a ru n k u jak
p o p rz e d n io , o d p o w ied n io : 0,0002 i 0,0007 m g/m l analizo w an eg o p ro d u k tu (ryc. 2, 3).
WNIOSKI
1. O p isa n a m e to d a o zn a cz en ia w itam in Bi i B2 w sokach ow ocow ych i ow ocow ow arzyw nych je st sto su n k o w o p ro sta i ch a rak te ry z u je się d o b ry m i p a ra m e tra m i
śre d n ie g o odzysku i pow tarzalności, a ta k że w ykryw alności i o zn aczaln o ści. M oże
w ięc być sto so w an a w b ad a n ia c h rutynow ych. Jej ew e n tu a ln e za sto so w a n ie do
innych p ro d u k tó w spożywczych w ym aga je d n a k spraw d zen ia.
L.
Czerwiecki,
G.
Wilczyńska
D ETER M IN A TIO N O F VITAMINS Bi AND B2 IN SELECTED V EG ETA BLE-FRU IT
PRODUCTS
Summary
A simple method was described to determ ine vitamins Bi and B2 in fruit and vegetable-fruit
juices. Vitamins were extracted with perchloric acid and for their determ ination an ion pairing
RP-HPLC technique with UV detection by 254 nm was applied.
Metoda oznaczania witamin Bi i B2 w żywności
419
The average recovery for vitamin Bi was 85-104% and 94-105% for vitamin B2. The
statitically estimated limits of identification and detection were respectively, for both vitamins:
for Bi: 0,008 and 0,0024, and for B2 0,0002 and 0,0007 mg/ml of product.
PIŚMIENNICTWO
1. Albada-Hurtado S., Veciana-Nogues M.T., Izquierdo-Pulido M. i wsp.: Determ ination of
water-soluble vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography. J. Chrom.
A. 1997, 778, 247-253.
2. Chase G.W. Jr, Landen IV.O. Jr, EitenillerR.R. i wsp.: Liquid chromatographic determ ination
of thiamine, riboflavin and pyridoxine in infant formula. J. AOAC Int. 1992, 75, 561-565.
3. Chase G.W. Jr, Landen W.O. Jr, Saliman E.G. i wsp.: M ethod modification for liquid
chromatographic determ ination of thiamine, riboflavin and pyridoxine in medical foods. J.
AO AC Int. 1993, 76, 1276-80.
4. Czerwiecki L., Wilczyńska G.\ Oznaczanie witaminy С w wybranych produktach owocowowarzywnych. Roczn. PZH 1999, 50, 77-87.
5. Danet A.F., Calatayud J.M .: FIA-spectrophotometric determination of thiamine after UVirradation. Talanta 1994, 41, 2147-2157.
6. Hadrich J., Vogelgesang J.: Konzept 96 zur Ermittlung von Nachweis-Erfassungs-und Bestimmungsgrenze. Deutsch. Lebensm. Rdsch. 1996, 92, 341-350.
7. Moszyński P., Pyć R.: Biochemia witamin. Cz. I. Witaminy grupy В i koenzymy. PWN,
Warszawa 1998, 24-76.
8. Ótles S.: Vergleichende Vitamin Bi und B2 Bestimmungen in Lebensmitteln. Z. Lebensm.
Forsch. 1991, 193, 347-350.
9. Pierotti J.A., Dickson A.G., Palmer J.К. i in.: Liquid chromatographic separation and quan­
titation of B6 vitamers in selected rat tissues. J. Chrom. 1984, 306, 377-382.
10. Secomska B.\ Tiamina. W: Wybrane metody badania składu i wartości odżywczej żywności,
ed. U. Rutkowska, PZWL, Warszawa 1981, 253-258.
11. Vidal-Valverde С., Reche A.: Reliable system for the analysis of riboflavin in foods by
high-performance liquid chromatography and UV detection. J. Liq. Chrom. 1990, 10,
2089-2101.
Otrzymano: 1999.05.10.