Wstęp teoretyczny

Wstęp teoretyczny
Asymetryczna dystrybucja uszkodzeń komórkowych może być jedną z strategii zapobiegających
starzeniu się linii komórkowych powodując tym samym proces starzenia chronologicznego
pojedynczych komórek. Dzięki akumulacji uszkodzeń w jednej z komórek potomnych możliwe jest
odmłodzenie drugiej. Z tego powodu w hodowli degenerują komórki „starzejące się” - mające większą
ilość uszkodzeń ale cała hodowla jest utrzymana przez komórki „odmładzane”, które nie otrzymują
uszkodzonych elementów. Przykłady tego zjawiska można zobaczyć u wielu organizmów jednokomórkowych ale także w niektórych komórkach organizmów wielokomórkowych. Czy
nieśmiertelność linii komórek nowotworowych jest możliwa dzięki temu procesowi?
Przykłady procesów związanych z asymetryczną dystrybucją składników kom.(w tym uszkodzeń):
•
Bakterie:
- E. coli dzieląc się tworzą stary i nowy biegun. Obie komórki potomne wyglądają
identycznie, jednak śledząc losy bakterii dziedziczących stary biegun obserwuje się
zmniejszoną liczbę ich podziałów, zwiększenie czasu między podziałami oraz ich zwiększoną
śmiertelność [Stewart, 2005]
- Agregaty uszkodzonych białek wybarwione za pomocą przyłączonego do nich,
wyznakowanego białka opiekuńczego (IbpA), dziedziczą się asymetrycznie, a komórki
dziedziczące agregaty starzeją się w taki sam sposób jak zostało to zaobserwowane przez
Stewarta i wsp. [Lindner, 2008] (rys. 1)
- Rozbudowa ściany bakteryjnej zachodzi głównie na 1 biegunie bakterii [Brown i wsp., 2011]
Rysunek Starzenie i asymetryczna dystrybucja uszkodzeń u E.coli [Linder 2008]
•
Drożdże:
- S. cerevisiae dzieląc się asymetrycznie przez pączkowanie nie przekazują pączkom
pozachromosomalnych kolistych cząsteczek rybosomanlego DNA (Extrachromosomal
ribosomal DNA circles - ERC), co umożliwia odnowienie limitu replikacyjnego. Brak białek
odpowiedzialnych za ten proces (Sir2) powoduje symetryczny podział ERC, przez co kolejne
pączki pochodzące z danej komórki-matki żyją coraz krócej [Sinclair i Guarente, 1997]
- Kompleksy porów jądrowych z komórki-matki u S. cerevisiae nie przedostają się do
pączków. W każdym pączku 80% kompleksów jest syntetyzowana de novo i wbudowywana w
błonę jądrową [Shcheprova i wsp., 2008]
- Agregaty białkowe w komórce-matce S. cerevisiae analogicznie nie przechodzą do pączka
[Aguilaniu i wsp., 2003]
•
Komórki macierzyste:
- nieodpowiednio sfałdowane białka są nierównomiernie dziedziczone przez neuroblasty D.
melanogaster oraz przez komórki mysich krypt jelitowych, gdy po asymetrycznym podziale
komórki macierzystej komórka dalej różnicująca dziedziczy agresom (opisane później)
[Rujano, 2006].
Podczas starzenia się komórki akumulują uszkodzone i niepoprawnie sfałdowane białka, które mogą
tworzyć agregaty białkowe i uniknąć degradacji. Akumulacja białek w postaci agregatów jest
najbardziej widoczna w komórkach postmitotycznych, stanowiąc przyczynę licznych patologii
(chorób neurodegeneracyjnych). Jest więc możliwe, że zdolność komórek do podziału jest związana z
usuwaniem agregatów białkowych.
Agregaty białkowe mogą mieć postać drobnych inkluzji lub agresomów. Agresom jest definiowany
jako pericentriolarna, cytoplazmatyczna inkluzja, która zawiera ubikwitynowane, nieodpowiednio
sfałdowane i uszkodzone białka otoczona filamentami wimentynowymi. Powstaje on z mniejszych
agregatów, które są transportowane w wzdłuż mikrotubul w sposób zależny od dyneiny (rys. 2).
Wykazano akumulację licznych białek w agresomach, które są charakterystyczne dla patologii: CFTR
(mukowiscydoza) [Johnston, 1998], białko PrP (choroby prionowe) [Beaudoin, 2008] czy Huntingtyna
[Waelter, 2001; Rujano, 2006] w wielu liniach komórek normalnych i nowotworowych.
Rysunek Model formowania się agresomu [Garcia-Mata, 2002]
Odkryto asymetryczną dystrybucję agresomów w komórkach macierzystych i linii HEK [Rujano,
2006]. Występowanie asymetrycznego przekazania agresomu nie zostało jednak sprawdzone w innych
liniach komórkowych, w tym w liniach komórek nowotworowych. Podczas gdy asymetryczna
dystrybucja agregatów białkowych wpływa na różnice w szybkości wzrostu i śmiertelności bakterii
[Linder, 2008], wpływ ten nie został zbadany u wyższych eukariota.
W komórkach nowotworowych wiele białek jest nadekspresjonowanych lub zmienionych strukturalnie
ze względu na liczne mutacje. Białka te mogą pojawiać się w komórkach nowotworowych w postaci
agregatów [Huo, 2010]. Nie został jednak poznany wpływ asymetrii dystrybucji agregatów(w postaci
agresomów lub mniejszych inkluzji) na śmiertelność komórek nowotworowych.
Nadekspresja cytoplazmatycznej formy białka PrP (CyPrP) może prowadzić do powstania agresomu
lub mniejszych, drobnych inkluzji w zależności od linii komórkowej a także czasu transfekcji
plazmidem kodującym CyPrP (rys. 3) [Beaudoin, 2008].
Komórki nowotworowe podobnie jak komórki macierzyste mają bardzo wysoki limit podziałowy a
niektóre ich rodzaje przypuszczalnie nie mają go w ogóle (ESC, nowotworowe komórki macierzyste).
Zakładając, że postępująca z czasem akumulacja w postaci agregatów uszkodzonych i nieprawidłowo
sfałdowanych białkek ma znaczący wpływ na ich żywotność, komórki te mogą na dwa sposoby radzić
sobie z agregatami umożliwiając nieśmiertelność linii komórkowych:
1.
Pozbywając się agregatów na drodze autofagii
2.
Asymetrycznie przekazując agregaty, tak jak niektóre uszkodzenia są asymetryczne
przekazywanie w E.coli, S. cerevisiae czy komórkach macierzystych.
Rysunek Charakterystyka dwóch typów agregatów CyPrP w różnych komórkach. (A) Formacja agresomów (pierwsze
zdjęcie po lewej) lub ciałek inkluzyjnych (reszta zdjęć) wywołana transfekcją plazmidem kodującym CyPrP w zależności od
linii komórkowej. (B) Czasu transfekcji także wpływa na procent komórek u których zaobserwowano agresomy lub
rozproszone agregaty: N2a (czarne kolumny), Hela (białe kolumny) [Beaudoin, 2008].
Nie wykazano dotychczas związku między nieśmiertelnością linii komórek nowotworowych a
asymetryczną dystrybucją potencjalnie szkodliwych elementów.
Podstawowe cele projektu:
1)
Potwierdzenie pojawiania się agresomów lub mniejszych ciałek inkluzyjnych w
zależności od czasu transfekcji i rodzaju linii komórkowej.
2)
Potwierdzenie asymetrycznej dystrybucji agresomu w komórkach normalnych oraz
sprawdzenie czy proces ten dotyczy także komórek nowotworowych
3)
Zbadanie symetrii dystrybucji mniejszych ciałek inkluzyjnych w komórkach
normalnych i nowotworowych
4)
Sprawdzenie wpływu obecności agresomu/mniejszych ciałek inkluzyjnych na
przeżywalność komórek normalnych i nowotworowych
5)
Sprawdzenie wpływu cytotoksyn/szkodliwych warunków fizykochemicznych na
komórki dziedziczące agresom/mniejsze ciałka inkluzyjne
Cele dodatkowe:
1)
Zbadanie wpływu inhibicji tworzenia agresomu na komórki
2)
Zbadanie wpływu inhibicji autofagii na komórki
Plan projektu:
1.
Hodowla komórkowa
Hodowane linie komórkowe HEK i Hela (+ być może inne linie nowotworowe).
2.
Namnożenie i wyizolowanie otrzymanych plazmidów ekspresyjnych z hodowli bakteryjnej.
3.
Testy cytotoksycznego wpływu MG132, nokodazolu i paklitakselu na linie komórkowe HEK i
HeLa.
4.
Ocena wpływu MG132 i nokodazolu na zdolność do agregacji i tworzenia agresomów
5.
Ilościowa ocena wydajności ekspresji poszczególnych plazmidów i zmiany pod wpływem
paklitakselu i różnych warunków fizyko-chemicznych.
6.
Transfekcja przejściowa komórek plazmidem.
Planuje się przeprowadzenie transfekcj przy użyciu TrasnlT®-2020 (i/lub GeneJuice) zgodnie z
instrukcja producenta. Stosując różne czasy transfekcji prawdopodobnie możliwe będzie
utrzymanie rozproszonych inkluzji lub agresomów [Beaudoin, 2008]
7.
Obserwacja symetrii dystrybucji agregatów
Prawdopodobnie niezbędne będzie zablokowanie aktywności proteasomów. Planuje się
wykorzystanie MG132 [Beaudoin, 2008]. Sprawdzanie symetrii dystrybucji inkluzji poprzez
liczenie foci (rys. 1) uszkodzeń przed i po podziale w każdej komórce i/lub agresomów przez
ustalenie jego lokalizacji po podziale przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z
wykorzystaniem techniki time-lapse.
8.
Obserwacja losów komórek po asymetrycznym odziedziczeniu większej liczby/całości
uszkodzeń.
1) Sprawdzenie, czy te komórki charakteryzują się zmniejszoną zdolnością do podziałów lub
większą umieralnością z wykorzystaniem techniki time-lapse, być może podobnie jak w
przypadku bakterii [Linder, 2008].
2) To samo, tylko po zmianie warunków fizykochemicznych (np. zmiana temperatury) oraz
potraktowaniu komórek cytotoksynami (cis-platyna, paclitaksel)
9.
Obserwacja powstawania agregatów i ewentualnej symetrii ich dystrybucji po
zahamowaniu tworzenia agresomów lub inhibicji autofagii
W celu inhibicji autofagii planuje się wykorzystanie 3-metyloadenin.
Sposób inhibicji tworzenia agresomów pozostał jeszcze do ustalenia.
10. *Ustalenie
mechanizmu powstawania agresomów poprzez badania oddziaływania badanych
białek i ich agregatów z białkami specyficznymi dla agresomów za pomocą techniki BiCF.
Dodatkowo rozważane jest:
Zastosowanie przeciwciał aby możliwe było pokazanie, że dany agregat stanowi agresom:
wykorzystanie przeciwciał przeciw ubikwitynie, mikrotubulom lub wimentynie.
Wykorzystanie techniki „Bimolecular fluorescence complementation” [Fang, 2004]
Bibliografia:
Aguilaniu H, Gustafsson L, Rigoulet M, Nystrom T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins
during cytokinesis. Science, 2003
Beaudoin S, Goggin K, Bissonnette C, Grenier C , Roucou T. Aggresomes do not represent a general cellular response to protein
misfolding in mammalian cells. BCM Cell Biology, 2008
Browna P.J. B. , de Pedro M., Kyselac D., Van der Henst C., Kima J., De Bollec X., Fuquaa C., Brun Y. Polar growth in the
Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2011
Fang U, Kerppola T. Ubiquitin-mediated fluorescence complementation reveals that Jun ubiquitinated by Itch/AIP4 is localized to
lysosomes. PNAS, 2004
Garcia-Mata R, Ya-Sheng Gao, Sztul E. Hassles with taking out the garbage: aggravating aggresomes. Traffic, 2002
Huo Q. Protein complexes/aggregates as potential cancer biomarkers revealed by a nanoparticle aggregation immunoassay. Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces. 2010
Johnston JA, Ward CW, Kopito RR . Aggresomes: A cellular response to misfolded proteins. J Cell Biol. 1998
Lark, K. G., Consigli, R. A. & Minocha, H. C. Segregation of sister chromatids in mammalian cells. Science 1966
Lindner A.B., Madden R., Demarez A., Stewart E.J., Taddei F.:Asymmetric segregation of protein aggregates is
associated with cellular aging and rejuvenation. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2008
Rujano MA, Bosveld F, Salomons FA, Dijk F, van Waarde MA, van der Want JJ, de Vos RA, Brunt ER, Sibon OC, Kampinga
HH. Polarised asymmetric inheritance of accumulated protein damage in higher eukaryotes. PLoS Biol, 2006
Shcheprova Z, Baldi S, Frei SB, Gonnet G, Barral Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast
budding. Nature, 2008
Sinclair DA, Guarente L. Extrachromosomal rDNA circles - A cause of aging in yeast. Cell, 1997
Steinhauser M.L., P. Bailey, Samuel E. Senyo,, Christelle Guillermier, Todd S. Perlstein, Alex P. Gould Richard T. Lee1, Claude
P. Lechene. Multi-isotope imaging mass spectrometry quantifiesstem cell division and metabolism. Nature, 2011
Stewart EJ, Madden R, Paul G, Taddei F. Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric
division. PLoS Biol, 2005
Waelter S, Boeddrich A, Lurz R, Scherzinger E, Lueder G, et al. Accumulation of mutant huntingtin fragments in aggresome-like inclusion
bodies as a result of insufficient protein degradation. Mol Biol Cell, 2001.