Artykuł naukowy

Badanie aktywności przeciwnowotworowej nowej pochodnej 5-phenylo-2-amino-1,3,4tiadiazoli FABT w komórkach ludzkiego raka płuca
Małgorzata Juszczak
Zakład Biologii Medycznej, Instytut Medycyny Wsi, Lublin
e-mail: [email protected]
tel. 81 718 45 13
Streszczenie
Pochodne 2-amino-1,3,4-tiadiazoli stanowią szereg związków o szerokim spektrum właściwości
biologicznych, w tym przeciwnowotworowych. Pochodne 5-phenylo-2-amino-1,3,4-tiadiazoli, które
są obiektem zainteresowania naszej grupy badawczej zostały zsyntetyzowane i wyselekcjonowane na
podstawie analizy QSAR jako związki o potencjalnych właściwościach przeciwnowotworowych.
Zbadano wpływ FABT na proliferację komórek nowotworowych raka płuca, raka jelita grubego,
glioma oraz rhabdosarcoma-medulloblastoma. Sprawdzony został także ewentualny toksyczny
wpływ pochodnej na komórki prawidłowe (fibroblasty skóry, astrocyty i neurony). Analizowano
także mechanizmy komórkowe, które potencjalnie mogą być zaangażowane w działanie FABT na
poziomie molekularnym.
Na podstawie otrzymanych wyników badań stwierdzono, że FABT hamował proliferację komórek
nowotworowych w sposób zależny od stężenia, nie będąc przy tym toksycznym dla komórek
prawidłowych. Ponadto, zaobserwowano zdolność FABT do obniżania poziomu fosforylacji kinazy
ERK1/2 oraz podwyższania poziomu fosforylacji kinazy Akt w komórkach raka płuca linii A549.
Wykazano również, że badana substancja hamowała cykl komórkowy w fazie G0/G1 oraz wzrost
ekspresji białka p27/Kip1. Nie stwierdzono natomiast indukcji apoptozy w komórkach traktowanych
FABT.
Słowa kluczowe
hodowle komórek in vitro, 2-amino-1,3,4-tiadiazole, aktywność przeciwnowotworowa,
cytotoksyczność, kinaza ERK1/2, kinaza Akt, cykl komórkowy, p27/Kip1, apoptoza
Wstęp
Mimo znacznego postępu, jaki dokonał się w ostatnich latach w chemioterapii, radioterapii
i immunoterapii, opracowanie skutecznej terapii przeciwnowotworowej stanowi poważne wyzwanie
dla współczesnej medycyny. Stosowane obecnie leki cytostatyczne wywołują liczne efekty uboczne,
które ograniczają skuteczność ich działania oraz obniżają jakość życia pacjentów. Badania kliniczne
dowodzą, że chemioterapia jest toksyczna dla układu nerwowego. Poszukiwanie nowych strategii
terapeutycznych, a także opracowanie nowych leków działających specyficznie na komórki
nowotworowe i nie uszkadzających komórek prawidłowych, w tym komórek nerwowych, stanowi
szczególnie pilne zadanie dla badaczy, lekarzy oraz przemysłu farmaceutycznego. Badania in vitro
stanowią pierwszy etap oceny przydatności nowych substancji jako potencjalnych leków
przeciwnowotworowych.
Tematyką niniejszej pracy jest ocena aktywności przeciwnowotworowej nowej pochodnej 2amino-1,3,4-tiadiazoli 2-(4-fluorophenyloamino)-5-(2,4-dihydroxyphenyl)-1,3,4-thiadiazole (FABT)
w modelu badawczym in vitro oraz zbadanie molekularnych mechanizmów zaangażowanych w jej
działanie w komórkach nowotworowych. Pochodna ta została zsyntetyzowana w Katedrze Chemii,
Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. Struktura FABT opiera się na pierścieniu tetrazoliowym.
Pierścień tiadiazoliowy został wykorzystany jako szkielet do syntezy wielu pochodnych, które
wykazują szereg aktywności farmakologicznych [1]. Pochodne tiadiazoli posiadają aktywność
przeciwbakteryjną [2,3], przeciwgruźliczą [4], przeciwgrzybiczą [5] i przeciwwirusową [6]; znalazły
zastosowanie w leczeniu leiszmanioz [7] i malarii [8]. W szeregu publikacji zaprezentowano również
właściwości przeciwdrgawkowe, przeciwdepresyjne, przeciwbólowe, którymi obdarzone są głównie
pochodne indolowe tiadiazoli [9, 10]. Szeroko opisywaną właściwością pochodnych aminotiadiazoli
jest ich aktywność przeciwnowotworowa. Zdolność hamowania proliferacji nowotworów testowano
zarówno w układach badawczych in vitro [11-16], jak i in vivo [17-23]. Z tego względu
nowozsyntetyzowane pochodne 5-phenylo-2-amino-1,3,4-tiadiazoli poddano analizie QSAR
(ilościowa zależność pomiędzy strukturą a reaktywnością), która wykazała ich potencjalne
właściwości przeciwnowotworowe. Następnie przeprowadzono badania z wykorzystaniem hodowli
komórek in vitro. Testy te wykazały zdolność pochodnych chlorowej (4ClABT), fluorowych (FABT,
3FABT) oraz bromowej (BrABT) do hamowania proliferacji komórek nowotworowych
pochodzących z guzów układu nerwowego, między innymi glioma, neuroblastoma, astrocytoma,
rhabdosarcoma-medulloblastoma, jak i nowotworów narządów obwodowych – raka płuc, jelita
grubego, piersi, krtani, tchawicy, białaczki T-limfocytarnej czy szpiczaka mnogiego [24-28].
Co ważne, w stężeniach działających antyproliferacyjnie, nie były one toksyczne dla komórek
prawidłowych, w tym fibroblastów skóry, hepatocytów, neuronów, astrocytów oraz
oligodendrocytów. Zaobserwowano ponadto troficzne działanie FABT w hodowli neuronów
poddanych działaniu czynników neurotoksycznych, co może świadczyć o jej działaniu
neuroprotekcyjnym. Działanie przeciwnowotworowe pochodnych 5-phenylo-2-amino-1,3,4tiadiazoli ujawniało się w hamowaniu podziału komórek nowotworowych, obniżaniu poziomu
syntezy DNA, zmianie morfologii tych komórek oraz zdolności zmniejszania ruchliwości komórek
nowotworowych. Wyniki badań dotyczących przeciwnowotworowej i neuroprotekcyjnej aktywności
5-phenylo-2-amino-1,3,4-tiadiazoli stały się podstawą do opracowania dwóch zgłoszeń patentowych
[29, 30].
Niniejsza praca jest syntetyczną analizą opisanych dotychczas wyników badań dokumentujących
przeciwnowotworowe działanie FABT, ze szczególnym uwzględnieniem komórek raka płuca linii
A549. Powstała w oparciu o publikacje:
Rzeski W, Matysiak J, Kandefer-Szerszeń M. Anticancer, neuroprotective activities and
computational studies of 2-amino-1,3,4-thiadiazole based compound. Bioorganic & Medicinal
Chemistry 2007;15:3201–3207
Juszczak M, Matysiak J, Szeliga M, Pozarowski P, Niewiadomy A, Albrecht J, Rzeski W. 2-Amino1,3,4-thiadiazole derivative (FABT) inhibits the extracellular signal-regulated kinase pathway and
induces cell cycle arrest in human non-small lung carcinoma cells. Bioorganic & Medicinal
Chemistry Letters 2012, 22, 5466-5469
oraz badań w zakresie Projektu badawczego Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N N401
223734.
Materiały i metody
Struktura chemiczna FABT
FABT (2-(4-fluorophenyloamino)-5-(2,4-dihydroxyphenyl)-1,3,4-thiadiazole) otrzymano z 4-(4fluorophenyl)-3-thiosemicarbazide (Lancaster, Germany) i sulfinylbis-(2,4-dihydroxythiobenzoyl)
w procesie endocyklizacji. Strukturę chemiczną FABT przedstawia Ryc.1
HO
N N
F
N
H
OH
S
Ryc. 1 Struktura 2-(4-fluorophenyloamino)-5-(2,4-dihydroxyphenyl)-1,3,4-thiadiazole (FABT).
Hodowle komórkowe.
Doświadczenia przeprowadzono z wykorzystaniem komórek nowotworowych linii A549 - ludzki
niedrobnokomórkowy rak płuca, HT-29 – ludzki rak jelita grubego, TE671 – ludzka
rhabdomyosarcoma/medulloblastoma (uzyskane z ECACC, European Collection of Cell Cultures)
oraz C6 – glioma szczurza (uzyskana z Department of Neonatology, Charite-Virchow Clinics,
Humboldt University, Berlin, Germany). Cytotoksyczność związku badano wobec: pierwotnej
hodowli fibroblastów skóry ludzkiej (HSF- human skin fibroblasts), wprowadzonej z fragmentu
skóry izolowanej od zdrowych ochotników; neuronów mysich (hodowla wprowadzona z komórek
linii P19 indukowanej do różnicowania kwasem retinowym) oraz szczurzego astrogleju (hodowla
izolowana z mózgów osesków szczurzych).
Komórki hodowano w podłożach hodowlanych: A549 – DMEM+Nutrient Mixture F-12 Ham
w stosunku 3:1; C6, HSF – DMEM; TE671, HT-29, astroglej - DMEM+Nutrient Mixture F-12 Ham
w stosunku 1:1 (Sigma) oraz neurony – podłoże Neurobasal +2% B27 Suplement + 2mM Lglutaminy i P19 – podłoże Alpha MEM (Gibco).
Do płynów hodowlanych, oprócz podłoża Neurobasal, dodano 10% bydlęcej surowicy płodowej
(FBS – Sigma) oraz antybiotyki: penicylinę (100 j/ml) i streptomycynę (100 mg/ml). Komórki
inkubowano w temperaturze 37oC w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5% CO2.
Pierwotna hodowla szczurzego astrogleju
Hodowlę astrogleju zakładano z mózgów 3-dniowych szczurów. Tkankę mózgową
rozdysocjacjowywano na pojedyncze komórki roztworem 0,25% trypsyny-EDTA. Komórki
zawieszano w podłożu hodowlanym DMEM+Nutrient Mixture F-12 Ham (1:1) z dodatkiem 10%
FBS, po czym wylewano na butelki hodowlane o powierzchni 75cm 2. Komórki hodowano
w temperaturze 37oC w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5% CO2. Selekcję w kierunku
astrocytów przeprowadzano w momencie gdy hodowla uzyskała monolayer, wykorzystując siłę
adhezji komórek do podłoża. Butelkę poddano intensywnemu wytrząsaniu tak, aby usunąć komórki
słabiej przyklejone do podłoża, w wyniku czego na powierzchni butelki pozostawały najbardziej
adherentne astrocyty. Identyfikację astrocytów wykonano poprzez immunocytochemiczne
potwierdzenie ekspresji GFAP (glial fibryllary acidic protein).
Hodowla neuronów mysich
Hodowlę neuronów uzyskano z komórek mysiego potworniaka linii P19 w wyniku indukcji
kwasem retinowym. Zawiesinę komórek P19 poddano indukcji różnicowania w kierunku neuronów
kwasem retinowym (0,5 M) w podłożu AlphaMEM zawierającym 5% FBS (po 48 godz.
od założenia doświadczenia wymieniono płyn hodowlany z kwasem retinowym na świeży). Powstałe
neutrosfery (po 5 dniach od indukcji) zebrano i zwirowano dwukrotnie (450 rpm, 5 minut),
przepłukując podłożem AlphaMEM bez surowicy. Następnie rozdysocjowywano na pojedyncze
komórki za pomocą 0,01% trypsyny w EDTA w temp. 37oC, po czym zawiesinę neuronów
oczyszczono z uwolnionego DNA poprzez trawienie DN-azą. Otrzymaną zawiesinę neuronów
wylewano na opłaszczone poli-L-lizyną mikropłytki 96-dolkowe (Nunc) w gęstości 4 x 105 kom/ml.
Komórki nerwowe hodowano w temperaturze 37oC w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5%
CO2, zmieniając podłoże hodowlane co drugi dzień.
Do wykonania doświadczeń wykorzystywano neurony 10-11 dniowe (licząc od dnia założenia
hodowli).
Oznaczanie stopnia proliferacji komórek metodą MTT
Metoda ta została opracowana w celu badania proliferacji i żywotności komórek w obecności
substancji cytostatycznych i cytotoksycznych. Komórki aktywne metabolicznie przy udziale
dehydrogenaz mitochondrialnych redukują żółtą sól tetrazoliową MTT do niebieskiego formazanu.
Nierozpuszczalne w wodzie kryształki formazanu gromadzą się w komórkach i do ich rozpuszczenia
konieczne jest użycie detergentu rozbijającego błonę komórkową i jednocześnie rozpuszczającego
barwnik. W tym celu używany jest bufor SDS-HCl o pH 7,4. Stężenie uwolnionego barwnika mierzy
się ilościowo w czytniku do płytek 96-dołkowych przy długości fali 570 nm. Intensywność barwy
jest wprost proporcjonalna do ilości żywych komórek.
Na płytce 96-dołkowej z płaskim dnem (Nunc) przygotowano hodowlę komórek linii A549, TE671
o gęstości 1 × 104 kom/ml, linii C6 - 0,5× 104 kom/ml oraz HT-29 – 3 × 104 kom/ml. Następnego
dnia płyn hodowlany zebrano i komórki poddano działaniu FABT w zakresie stężeń 1–100 M. Po
96 godz. okresie inkubacji określono żywotność komórek przy pomocy testu MTT. Natężenie
wytworzonej w reakcji barwy mierzono w czytniku spektrofotometrycznym Elx800 (BIO-TEK,
Highland Park, Winooski, Vermont, USA).
Badanie aktywności cytotoksycznej komórkach prawidłowych
Na płytce 96-dołkowej przygotowano hodowle komórek prawidłowych: HSF i astrogleju
o gęstości 1 × 105 kom/ml oraz neuronów – 4 x 105 kom/ml . Następnego dnia komórki poddano
działaniu szeregu stężeń badanych substancji. Po 24 godzinach inkubacji określono żywotność
komórek metodą LDH (In Vitro Toxicology Assay Kit, Lactic Dehydrogenase based, Sigma).
Test LDH opiera się na określaniu stężenia dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w płynie
hodowlanym. Substancje działające toksycznie na komórki powodują uszkodzenie błony
komórkowej. W wyniku tego do środowiska pozakomórkowego uwalniane są składniki cytoplazmy
komórek, między innymi dehydrogenaza mleczanowa. Ilość LDH uwolnionego do podłoża
hodowlanego jest proporcjonalna do stopnia uszkodzenia komórek. Metoda opiera się na redukcji
NAD do NADH przez komórkową LDH. NADH następnie reaguje z barwnikiem tetrazoliowym,
który zmienia kolor. Natężenie wytworzonej w tej reakcji barwy mierzy się spektrofotometrycznie
przy długości fali 490nm.
Oznaczanie poziomu syntezy DNA w komórce - metoda BrdU (Cell proliferation ELISA, BrdU,
Roche Diagnostics)
Test wiązania bromodezoksyurydyny (BrdU) opiera się na określeniu wpływu badanych
substancji na syntezę DNA w komórkach nowotworowych. Komórki linii A549 wylewano na dołki
mikropłytki 96-dołkowej (2 x 104 kom/ml). Następnego dnia płyn hodowlany zebrano a komórki
poddano działaniu badanych substancji (1-100 M) zawieszonych w świeżym podłożu hodowlanym.
Po 48 godz. wykonano test BrdU według procedury kitu. W trakcie replikacji BrdU jest
wbudowywana do DNA. Ilość wbudowanego substratu mierzona natężeniem barwy jest wprost
proporcjonalna do aktywności replikacyjnej komórek. Natężenie wytworzonej w reakcji barwy
mierzono w czytniku Elx800 przy długości fali 450nm.
Określanie zdolności indukcji apoptozy (Cell Death ELISAPLUS, Roche Diagnostics)
Test opiera się na wykrywaniu w hodowli poddanej działaniu badanych substancji, monoi oligo-nukleosomów, charakterystycznych markerów fragmentacji DNA i śmierci apoptotycznej
komórek.
Komórki A549 wylewano na mikropłytki 96-dołkowe. Następnego dnia usuwano podłoże
hodowlane i dodawano FABT rozpuszczoną w świeżym płynie hodowlanym. Po 24 godzinach
określano poziom apoptozy w komórkach testem Cell Death ELISA, według procedury kitu. Do
zlizowanych komórek dodawano przeciwciała wiążące się specyficznie do pofragmentowanego DNA
o określonej długości oraz do histonów. Następnie przeciwciała te wiązane były przez przeciwciała
II-rzędowe połączone z peroksydazą chrzanową, która w oddziaływaniu z substratem dawała reakcję
barwną. Natężenie wytworzonej w reakcji barwy mierzono w czytniku spektrofotometrycznym przy
długości fali 405nm.
Western Blotting
Western Blotting jest metodą immunodetekcji białek. W pierwszym etapie białka zawarte
w lizacie komórkowym są poddawane rozdziałowi elektroforetycznemu, kolejnym etapem zaś jest
elektrotransfer białek na membranę. Obecność badanych białek na membranie potwierdzana jest przy
użyciu specyficznych przeciwciał. Wizualizacja prążków na membranie przeprowadzana jest
w reakcji chemiluminescencji będącej efektem działania peroksydazy chrzanowej sprzężonej
z przeciwciałami II-rzędowymi.
W celu przygotowania próbek do Western Blotting hodowle komórek nowotworowych zostały
poddane działaniu FABT przez okres 24 godz. W próbkach zlizowanych buforem RIPA, oznaczano
ilość białka metodą BCA (BCA Protein Assay Kit, Pierce), po czym próbki były zawieszane
w buforze próbkowym i denaturowane w temp. 100°C przez 5 min. Rozdział elektroforetyczny
białek przeprowadzano na żelach poliakrylamidowych 10%. Następnie białka były przenoszone na
membranę PVDF na drodze elektrotransferu półsuchego. W kolejnym etapie miejsca
niespecyficznego wiązania białek na membranie zostały zablokowane 5% odtłuszczonym mlekiem
w TBS / 0,1% Tween przez 1 godz. w temperaturze pokojowej a następnie membrany inkubowano z
odpowiednimi przeciwciałami I-rzędowymi (Cell Signalling, Sigma) przez noc w temperaturze 4˚C.
Stosowano rozcieńczenie przeciwciał zgodnie do zaleceń producenta. Po tym czasie membrany
inkubowano z przeciwciałami II-rzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Cell Signaling)
o odpowiedniej specyfice gatunkowej w standardowym rozcieńczeniu 1:2000 przez 1 godz.
w temperaturze pokojowej. Białka na membranie uwidoczniano na drodze reakcji przeprowadzonej
przez peroksydazę chrzanową. Na membranę nanoszono substrat dla peroksydazy (ECL Pierce),
który był przekształcany w luminol. Reakcje wizualizowano na kliszy fotograficznej (Kodak).
Cytometria przepływowa - metoda z oranżem akrydyny
Cytometria jest prostą metoda umożliwiającą ocenę ilości komórek znajdujących się
w poszczególnych fazach cyklu komórkowego, jak i poziomu apoptozy. Różnicowanie komórek
opiera się na pomiarze zawartości DNA i RNA w komórkach w wiązce lasera z wykorzystaniem
metachromatycznego fluorochromu oranż akrydyny (AO). Komórki poddane działaniu FABT
zawieszano w PBS, po czym dodawano do nich odczynnik zawierający niejonowy detergent
TritonX-100, który tworzył pory w błonie komórkowej, zwiększając jej przepuszczalność. Następnie
dodawano oranż akrydyny – barwnik fluorescencyjny wiążący się specyficznie do DNA i RNA
komórek. Analizę fluorescencji przeprowadzano w cytometrze FACSCalibur (Becton Dickinson).
Wyniki i dyskusja
Antyproliferacyjne działanie FABT badane było w szeregu linii nowotworowych.
Wykorzystane w doświadczeniach komórki pochodziły zarówno z nowotworów układu nerwowego
(neuroblastoma SK-N-AS, glioma C6), jak i guzów narządów obwodowych (rak płuca A549, rak
jelita grubego HT-29). Komórki poddano działaniu FABT w zakresie stężeń 1-100 µM (1; 2,5; 5; 10;
25; 50 i 100 µM) przez okres 96 godz., po czym wykonano test MTT. Następnie obliczono wartości
IC50 (wartość stężenia powodującego zahamowanie proliferacji 50% komórek) dla każdej linii
nowotworowej, które przedstawiono w Tabeli 1. Na postawie wyników powyższego doświadczenia
stwierdzono, że FABT hamował proliferację komórek nowotworowych w sposób zależny
od stężenia, przy czym nasilenie tego efektu zależało od rodzaju komórek nowotworowych.
Najbardziej wrażliwe na działanie badanej pochodnej okazały się komórki raka płuca A549,
najbardziej oporne zaś komórki raka jelita grubego HT-29.
Linia
Typ histologiczny
A549
ludzki niedrobnokomórkowy rak płuca
ludzka rhabdomyosarcoma–
medulloblastoma
glioma szczurza
ludzki rak jelita grubego
TE671
C6
HT-29
IC50 (μM)
22,8
26
27,3
33,1
Tab. 1 Wartości IC50 obliczone metodą regresji liniowej wg Litchfielda and Wilcoxona [35] na
podstawie wyników analizy proliferacji metodą MTT.
Powyższe wyniki korelują z aktywnością badanych poprzednio pochodnych z szeregu 5-phenylo-2amino-1,3,4-tiadiazoli: 3FABT, 4ClABT, 4BrABT [25, 26]. Pochodne te, podobnie jak FABT
hamowały proliferację komórek nowotworowych w sposób zależny od stężenia, jednak różniły się
one pomiędzy sobą nasileniem efektu antyproliferacyjnego. Pochodne bromowa (4BrABT)
i chlorowa (4ClABT) wykazały silniejsze właściwości hamowania podziałów komórek
nowotworowych niż FABT.
Ponieważ niezwykle istotnym problemem w chemioterapii jest toksyczność leków
przeciwnowotworowych wobec prawidłowych tkanek, zbadano wpływ FABT na komórki
prawidłowe. W tym celu działaniu FABT poddano pierwotną hodowlę fibroblastów skóry ludzkiej
(HSF), pierwotną hodowlę astrogleju szczurzego oraz oligodendrocyty szczurze OLN-93 przez okres
24 godz. Następnie zmierzono poziom toksyczności w hodowlach, w porównaniu z kontrolą przy
wykorzystaniu testu LDH. Na podstawie wyników powyższych doświadczeń (Ryc. 2) stwierdzono,
że FABT nie był toksyczny dla fibroblastów, astrocytów oraz oligodendrocytów (wzrost poziomu
dehyrdogenazy mleczanowej zaobserwowano jedynie przy najwyższym użytym stężeniu FABT 100μM w hodowli astrogleju oraz oligodendrocytów). Co więcej, zaobserwowano istotne
statystycznie obniżenie poziomu LDH w hodowlach fibroblastów (w zakresie 25-100 µM) oraz
astrogleju (w zakresie 2,5-50 µM) w porównaniu z kontrolą, co może świadczyć o protekcyjnym
działaniu FABT wobec komórek prawidłowych. Podobne wyniki uzyskano dla innych, badanych
uprzednio pochodnych z szeregu 5-phenylo-2-amino-1,3,4-tiadiazoli [25, 26].
HSF
Astroglej
OLN-93
250
300
100
***
**
**
50
50
FABT [ M]
Ryc. 2 Wpływ FABT na żywotność fibroblastów, astrocytów oraz oligodendrocytów po 24
godzinach inkubacji badany metodą LDH. Kolumny przedstawiają poziom LDH w hodowli poddanej
działaniu FABT w porównaniu z kontrolą. Różnice istotne statystycznie w odniesieniu do kontroli
przy **p< 0,01, ***p< 0,001, test One-way ANOVA z testem następowym post test Tukey.
Kolejnym etapem badań było określenie molekularnych mechanizmów zaangażowanych
w działanie FABT w komórkach nowotworowych. Doświadczenia zostały przeprowadzone w
komórkach raka płuca linii A549, jako najbardziej wrażliwych na działanie badanej substancji. W
celu analizy tego problemu sprawdzono wpływ FABT na poziom syntezy DNA w komórkach, szlaki
przekazywania sygnału, progresję cyklu komórkowego oraz zdolność indukcji apoptozy.
W pierwszej kolejności zbadano wpływ FABT na poziom syntezy DNA w komórkach A549.
Doświadczenie zostało przeprowadzone z wykorzystaniem testu Cell proliferation ELISA, BrdU.
Na postawie wyników przedstawionych na Ryc. 3, stwierdzono istotny statystycznie spadek poziomu
bromodezoksyurydyny wbudowanej do DNA komórek w stężeniu 10 µM FABT i wyższych.
Świadczy to o spadku potencjału replikacyjnego komórek raka płuca poddanych działaniu
pochodnej.
10
0
10
0
50
25
10
2,
5
1
50
10
0
25
10
5
1
2,
5
5
FABT [ M]
50
0
0
FABT [ M]
100
25
0
*** ***
150
10
50
150
5
***
200
2,
5
***
200
% kontroli
***
% kontroli
% kontroli
100
***
***
250
1
150
poziom syntezy DNA
(% kontroli)
100
80
***
60
***
40
***
***
20
10
0
50
25
10
5
2,
5
1
0
FABT [ M]
Ryc. 3 Wpływ FABT na syntezę DNA w komórkach raka płuca A549 po 48 godz. inkubacji.
Kolumny przedstawiają poziom bromodezoksyurydyny wbudowanej do DNA podczas replikacji
w hodowli poddanej działaniu FABT w porównaniu z kontrolą. Różnice istotne statystycznie
w odniesieniu do kontroli przy ***p< 0,001, test One-way ANOVA z testem następowym post test
Tukey.
Następnie oceniano wpływ FABT na główne szlaki przekazywania sygnału zaangażowane
w proliferację i przeżycie komórek nowotworowych, jakimi są szlak kinazy ERK1/2 (extracellularsignal regulated kinase) oraz kinazy Akt. W komórkach traktowanych FABT przez 24 godz. metodą
Western Blotting badano poziom fosforylacji kinaz, będący miarą ich aktywacji. Stwierdzono,
zależny od stężenia FABT, spadek poziomu fosforylacji kinazy pERK1/2 oraz wzrost fosforylacji
kinazy pAkt. Zmiany te nie były efektem różnic w ilości białka w poszczególnych próbkach, o czym
świadczy stały poziom β-aktyny. Wyniki zostały przedstawione na Ryc. 4. Obniżenie poziomu
aktywacji kinazy ERK1/2, jak podaje piśmiennictwo, może być związane z hiperaktywacją kinazy
Akt. Kinazy te regulują nawzajem swoją aktywność w procesach wzrostu komórek nowotworowych,
indukcji apoptozy oraz oporności na cytostatyki [31].
Ryc. 4 Analiza poziomu fosforylacji kinaz pERK1/2 i pAkt metodą Western Blotting po 24 godz.
inkubacji z FABT. Jednakową ilość białka w poszczególnym próbkach potwierdzono przeciwciałami
skierowanymi przeciwko β-aktynie.
Niezwykle istotnym mechanizmem, który może być celem leków przeciwnowotworowych
w chemioterapii jest cykl komórkowy. Z tego względu w dalszej kolejności zbadano wpływ FABT
na progresję cyklu komórkowego w komórkach A549. Komórki inkubowane z badaną pochodną
przez 24 godz. poddano analizie cytometrycznej. Wyniki analizy (Ryc. 5 A) jednoznacznie wskazują,
że FABT powodował zablokowanie cyklu komórkowego w fazie G0/G1. Wraz ze wzrostem stężenia
substancji rosła ilość komórek znajdujących się fazie G0/G1 cyklu komórkowego, zmniejszała się
natomiast ilość komórek w fazach S i G2/M. Dodatkowo ekspresja białek regulujących cykl
komórkowy została zbadana metodą Western Blotting. Analizowano poziom białek p21Waf1/Cip1,
p27/Kip1 i Cykliny D1 w komórkach poddanych działaniu FABT przez 24 godz. i porównano je
z hodowlą kontrolną. Wyniki [Ryc. 5 B] wskazują, że FABT stymulował ekspresję białka p27/Kip1,
nie zmieniając jednocześnie ekspresji p21Waf1/Cip1 i Cykliny D1. Stymulacja p27 jest korzystna
z punktu widzenia terapii raka płuca, gdyż badania kliniczne wykazały, że obniżenie poziomu
ekspresji tego białka jest skorelowane z krótszym czasem przeżycia pacjentów [32].
Ryc. 5 (A) Wpływ FABT na progresję cyklu komórkowego badany metodą cytometrii przepływowej
metodą barwienia oranżem akrydyny po 24 godz. inkubacji. Kolumny przedstawiają ilość komórek
żywych w porównaniu z kontrolą. Różnice istotne statystycznie w odniesieniu do kontroli przy *p<
0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, test One-way ANOVA z testem następowym post test Tukey. (B)
Analiza ekspresji białka p27 metodą Western Blotting po 24 godz. inkubacji z FABT. Jednakową
ilość białka w poszczególnym próbkach sprawdzono przeciwciałami skierowanymi przeciwko βaktynie.
Stwierdzona w badaniach zdolność FABT do modulacji aktywności kinaz oraz blokowania cyklu
komórkowego pozostają w zgodności z doniesieniami literaturowymi. Szeroko dyskutowany jest
związek pomiędzy zmianami w nasileniu sygnału w komórce przekazywanego w szlaku kinazy
ERK1/2 a istnieniem blokady progresji cyklu komórkowego z fazy G1 do fazy S, szczególnie
z udziałem białka p27/Kip1 [33, 34].
Sprawdzono również zdolność FABT do indukowania apoptozy. Test przeprowadzony
metodą ELISA wykazał, że badana pochodna nie indukowała śmierci komórek na drodze apoptozy
w komórkach A549. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w poziomie apoptozy
w komórkach poddanych działaniu FABT w porównaniu z kontrolą po 24 godz. inkubacji (dane nie
przedstawione).
Przedstawione w pracy wyniki świadczą o tym, że FABT wykazuje działanie
antyproliferacyjne, nie będąc toksycznym dla komórek prawidłowych. W komórkach raka płuca
badana substancja hamowała proces syntezy DNA oraz zmieniała poziom fosforylacji kinaz ERK
i Akt. Ponadto, indukowała blokadę cyklu komórkowego w fazie G0/G1, nie powodując apoptozy.
Powyższe wyniki są odmienne od rezultatów badania aktywności (E,E)-2,5-bis[4-(3-dimethylaminopropoxy)styryl]-1,3,4-thiadiazole, uzyskanych przez Chou i współpracowników. Stwierdzili
oni, że pochodna ta indukowała apoptozę w mechanizmie zależnym od kinazy Akt [15]. Może to
świadczyć o tym, że mechanizm działania pochodnych aminotiadiazoli zależy od struktury
łańcuchów bocznych przyłączonych do tiadiazolowego rdzenia.
FABT, ze względu na swoje właściwości antyproliferacyjne oraz niską toksyczność w stosunku
do komórek prawidłowych wydaje się być atrakcyjnym kandydatem na nowy lek
przeciwnowotworowy. Osiągnięcie tego celu wymaga potwierdzenia aktywności badanej substancji
w badaniach in vivo oraz w próbach klinicznych.
Podziękowania
Większość badań, których wyniki zawarte są w niniejszej pracy zostało sfinansowane ze środków
finansowych Projektu badawczego Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N N401 223734.
Piśmiennictwo
1. Glossman M. D. „Application of density functional theory concepts to the study of the chemical
reactivity of thiadiazoles”. Journal of Molecular Structure (Theochem) 1995, 330:385-388.
2. Chochan Z. H., Rau A., Supuran C. T. „Antibacterial Co(II) and Ni(II) complexes of N(2furanylmethylene)-2-aminothiadiazole and role of SO42- , NO3-, C2O42- and CH3CO2- on
biological properties”. Metal-Based Drugs 2002, 8, 287-291.
3. Tumkevicius S., Labanauskas L., Bucinskaite V., Brukstus A., Urbelis G. „Synthesis and
structure of benzimidazo[1,2-c][1,2,3]thiadiazoles: first examples of a novel ring system”.
Tetraedron Letters 2003, 44, 6635-6638.
4. Foroumadi A., Asadipour A., Mirzaei M., Karimi J., Emami S. „Antituberculosis agents. V.
Synthesis, evaluation of in vitro antituberculosis activity and cytotoxicity of some 2-(5-nitro-2furyl)-1,3,4-thiadiazole derivatives”. Il Farmaco 2002, 57, 765-769.
5. Kumita I., Noda K. „Synthesis of antifungal 2-anilino-4-phenylthiazoles and their inhibitory
activities on sterol biosynthesis”. Journal of Pesticide Science 2001, 26 (2), 1-2.
6. Ijichi K., Fujiwara M., Nagano H., Matsumoto Y., Hanasaki Y., Ide T., Katsuura K., Takayama
H., Shirakawa S., Aimi N., Shigeta S., Konno K., Matsushima M., Yokota T., Baba M. „Anti-
HIV-1 activity of thiadiazole derivatives: structure-activity relationship, reverse transcriptase
inhibition, and lipophilicity”. Antiviral Research 1996, 31, 87-94.
7. Ram V. J., Goel A., Kandpal M., Mittal N., Goyal N., Tekwani B. L., Guru P. Y., Rastogi A. K.
„Tetraazaacenaphthene, tetraazaphenalene and 1,3,4-thiadiazole derivatives as potential
leischmanicides”. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1997, 7 (6), 651-656.
8. Invidiata F. P., Grimaudo S., Giammanco P., Giammanco L. „Synthesis and pharmacological
properties of 6-substituted 3-(pyridine-4-yl)-1,2,4-triazole [3,4-b][1,3,4]thiadiazoles”. Farmaco
1991, 46 (12), 1489-1495.
9. Dogan H. N., Duran A., Rollas S., Sener G., Uysal M. K., Gülen D. „Synthesis of new 2,5disubstituted-1,3,4-thiadiazoles and preliminary evaluation of anticonvulsant and antimicrobial
activities”. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2002, 10, 2893-2898.
10. Varvaresou A., Siatra-Papastaikoudi T., Tsotinis A., Tsantili-Kakoulidou A., Vamvakides A.
„Synthesis. Lipophilicity and biological evaluation of indole-containing derivatives of 1,3,4thiadiazole and 1,2,4-triazole”. Il Farmaco 1998, 53, 320-326.
11. Oettgen HF, Purple JR, Coley VC, Krakoff IH, Burchenal JH. Potentiation of the anti-leucemic
effects of 2-aminothiadiazole by isonicotinamide and derivatives. Cancer Research 1964, 24:689–
692.
12. Nelson JA, Rose LM, Bennett LL Jr. Effect of 2-amino-1,3,4-thiadiazole on ribonucleotide pools
of leukemia L1210 cells. Cancer Research 1976, 36, 1375–1378.
13. Nelson JA, Rose LM, Bennett LL Jr. Mechanism of action 2-amino-1,3,4-thiadiazole (NSC4728).
Cancer Research 1977, 37, 182–187.
14. Hill DL. Aminothiadiazoles. Cancer Chemother Pharmacol. 1980;4:215–220.
15. Chou JY, Lai SY, Pan SL, Jow GM, Chern JW, Guh JH. Investigation of anticancer mechanism
of thiadiazole-based compound in human non-small cell lung cancer A549 cells. Biochemical
Pharmacology 2003;66:115–124.
16. Alam MS, Liu L, Lee DU. Cytotoxicity of New 5-Phenyl-4,5-dihydro-1,3,4-thiadiazole
Analogues. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 2011, 59, 1413—1416.
17. Lu K, Loo TL. The pharmacologic fate of the antitumor agent 2-amino-1,3,4-thiadiazole in the
dog. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 1980, 4, 275–279.
18. Steward JA, Ackerly CC, Myers CF, Newman RA, Krakoff IH. Clinical and clinical
pharmacologic studies of 2-amino-1,3,4-thiadiazole (A-TDA:NSC 4728). Cancer Chemotherapy
and Pharmacology 1986, 16, 287–291.
19. Asbury RF, Wilson J, Blessing JA, Buchsbaum HJ, DiSaia PJ. Aminothiadiazole (NSC4728) in
patient with advanced ovarian carcinoma. A phase II study of the Gynecologic Oncology Group.
American Journal of Clinical Oncology1986, 9, 334–336.
20. Asbury RF, Blessing JA, Mortel R, Homesley HD, Malfetano J. Aminothiadiazole (NSC #4728)
in patients with advanced cervical carcinoma. A phase II study of the Gynecologic Oncology
Group. American Journal of Clinical Oncology 1987, 10, 299–301.
21. Locker GY, Khandekar J, Krauss S et al. Phase II trial of aminothiadiazole in previously treated
and untreated patients with advanced colorectal carcinoma: an Illinois Cancer Council Trial.
Cancer Treatment Reports 1987; 71, 649–650.
22. Asbury RF, Kramar A, Haller DG. Aminothiadiazole (NSC#4728) in patient with advanced colon
cancer. A phase II study of the Eastern Cooperative Oncology Group. American Journal of
Clinical Oncology 1987, 10, 380–382.
23. Asbury R, Blessing JA, Smith DM, Carson LF. Aminothiadiazole in the treatment of advanced
leiomyosarcoma of the uterine corpus. A Gynecologic Oncology Group study. American Journal
of Clinical Oncology 1995, 18, 397–399.
24. Rzeski W, Matysiak J, Kandefer-Szerszeń M. Anticancer, neuroprotective activities and
computational studies of 2-amino-1,3,4-thiadiazole based compound. Bioorganic and Medicinal
Chemistry 2007, 15, 3201–3207.
25. Juszczak M., Matysiak J., Brzana W., Niewiadomy A., Rzeski W. „Evaluation of the
antiproliferative activity of 2-(monohalogenophenyl-amino)-5-(2,4-dihydroxyphenyl)-1,3,4thiadiazoles” Arzneimittel-Forschung (Drug Research) 2008, 58, 353-357.
26. Juszczak M., Matysiak J., Niewiadomy A., Rzeski W. The activity of a new 2-amino-1,3,4thiadiazole derivative 4ClABT in cancer and normal cells. In vitro study. Folia Histochemica et
Cytobiologica, 2011, 49(3), 436-444.
27. Juszczak M, Matysiak J, Szeliga M, Pozarowski P, Niewiadomy A, Albrecht J, Rzeski W. 2Amino-1,3,4-thiadiazole derivative (FABT) inhibits the extracellular signal-regulated kinase
pathway and induces cell cycle arrest in human non-small lung carcinoma cells. Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters 2012, 22, 5466-5469.
28. J. Matysiak, A. Opolski, Synthesis and antiproliferative activity of N-substituted 2-amino-5-(2,4dihydroxyphenyl)-1,3,4-thiadiazoles. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2006, 14, 4483-4489.
29. Niewiadomy A., Matysiak J, Rzeski W., Opolski A. (2004): Nowy związek, zastosowanie
nowego związku jako czynnika antynowotworowego oraz sposób otrzymywania nowego
związku. Urząd Patentowy RP, zgłoszenie w sprawie uzyskania patentu nr P-366643.
30. Niewiadomy A., Matysiak J, Rzeski W. (2004): Nowy związek, zastosowanie nowego związku w
leczeniu chorób neurologicznych oraz sposób otrzymywania nowego związku. Urząd Patentowy
RP, zgłoszenie w sprawie uzyskania patentu nr P-366644.
31. McCubrey JA, Steelman LS, Chappell WH, Abrams SL, Wong EWT, Chang F, Lehmann B,
Terrian DM, Milella M, Tafusi A, Stivala F, Libra M, Basecke J, Evangelisti C, Martelli AM,
Franklin RA. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and
drug resistance Biochimica et Biophysica Acta 2007, 1773, 1263-1284.
32. Tsukamoto, S.; Sugio, K.; Sakada, T.; Ushijima, C.; Yamazaki, K.; Sugimachi, K. Reduced
expression of cell-cycle regulator p27(Kip1) correlates with a shortened survival in non-small cell
lung cancer. Lung Cancer 2001, 34, 83-90.
33. Meloche, S.; Pouyssegur, J. The ERK1/2 mitogen-activated protein kinase pathway as a master
regulator of the G1- to S-phase transition. Oncogene 2007, 26, 3227-3239.
34. Roovers, K.; Assoian, R. K. Integrating the MAP kinase signal into the G1 phase cell cycle
machinery. BioEssays 2000, 22, 818-826.
35. Litchfield LT, Wilcoxon F: A simpliefied method of evaluation dose-effect experiments. Journal
of Pharmacology and Experimantal Therapeutics 1949, 96, 99-113.