Badanie czystości preparatów kosmetycznych (cz.1)

MIKROBIOLOGIA I IMMUNOLOGIA
dla studentów II roku studiów I st.
na kierunku KOSMETOLOGIA
Ćwiczenie 4
Badanie czystości preparatów kosmetycznych (cz.1) Kryteria i wymagania czystości
mikrobiologicznej kosmetyków. Konserwowanie kosmetyków. Testy kontrolowanego
zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Metody badania czystości mikrobiologicznej
kosmetyków
Ćwiczenie 5
Badanie czystości preparatów kosmetycznych (cz.2)
liczba godzin
2
liczba godzin
2
Zagadnienia do zajęć 4 - Badanie czystości preparatów kosmetycznych (cz.1)
1. Kryteria i wymagania czystości mikrobiologicznej kosmetyków.
2. Konserwowanie kosmetyków.
3. Testy kontrolowanego zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
4. Metody badania czystości mikrobiologicznej kosmetyków.
Zagadnienia do zajęć 5 - Badanie czystości preparatów kosmetycznych (cz.2)
1. Metody badania czystości mikrobiologicznej kosmetyków.
2. Charakterystyka podłoży: Baird-Parkera, podłoża z cetrymidem, Sabouraud (skład, zastosowanie
opis typowego wzrostu kolonii na tych podłożach).
3. Zasada wykonania testów na oksydazę cytochromową i katalazę.
BADANIE CZYSTOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ WYROBU KOSMETYCZNEGO
– wg Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 23 grudnia 2002 roku w sprawie określenia procedur
pobierania próbek kosmetyków oraz procedur przeprowadzania badań laboratoryjnych (Dz. U. nr 9,
poz.107)
Wymagania mikrobiologiczne określone w rozporządzeniu
1. Wymagania ilościowe (minimalna wielkość badanej próbki — 1 g lub 1 ml)
KATEGORIA I. Kosmetyki przeznaczone dla dzieci i w okolice oczu
Ogólna liczba drobnoustrojów tlenowych mezofilnych nie może przekraczać 100 jtk/g lub ml
(jtk — jednostki tworzące kolonie).
KATEGORIA II. Inne kosmetyki
Ogólna liczna drobnoustrojów tlenowych mezofilnych nie może przekraczać 1000 jtk/g lub ml.
Bardzo ważna jest interpretacja wyników. Opisane ograniczenia powinny być interpretowane następująco:
102 — maksymalny limit akceptacji to 5 x 102,
103 — maksymalny limit akceptacji to 5 x 103.
2. Wymagania jakościowe
W 0,1 g lub 0,1 ml próbki kosmetyku nie mogą być obecne następujące drobnoustroje:
— Pseudomonas aeruginosa,
— Staphylococcus aureus,
— Candida albicans.
3. Kryteria akceptacji
Akceptowana jest jakość próbek, które spełniają wymagania jakościowe i ilościowe.
Ocena mikrobiologiczna powinna być przeprowadzona na próbkach wielkości minimum 1 g lub 1 ml - dla
produktów o wadze mniejszej niż 1 g należy połączyć kilka próbek w celu otrzymania 1 g lub 1 ml.
1
Należy rozcieńczyć lub rozpuścić 1 ml lub 1 g wyrobu w mianowanym rozcieńczalniku neutralizującym
w celu otrzymania rozcieńczenia 1:10. W przypadku substancji słabo wilgotniejących można dodać
odpowiedni związek powierzchniowo czynny, np. 0,1% polisorbatu 80. Jeżeli konieczne jest uzyskanie
kolejnych dziesiętnych rozcieńczeń, (aby osłabić aktywność przeciwdrobnoustrojową produktu lub
uzyskać liczbę kolonii od 10 do 100 w celu łatwego zliczenia) należy użyć roztworu wyjściowego,
stosując ten sam rozcieńczalnik neutralizujący
Określenie ogólnej liczby żywych drobnoustrojów tlenowych mezofilnych powinno być prowadzone
według następujących zasad:
a) należy zachować ostrożność i unikać zanieczyszczenia produktu drobnoustrojami, które mogą być
wykryte w próbce,
b) eliminacja każdej przeciwdrobnoustrojowej właściwości produktu w czasie analizy powinna być
dokonana przez rozcieńczenie, zobojętnienie lub filtrację,
c) określenie ogólnej liczby żywych drobnoustrojów tlenowych mezofilnych prowadzi się, stosując
techniki wylewania płytek, techniki posiewów powierzchniowych lub filtracji,
d) identyfikacja określonych mikroorganizmów jest prowadzona przy użyciu selektywnych podłoży
hodowlanych
Ćwiczenia praktyczne
Badania ilościowe - oznaczanie ogólnej liczby żywych drobnoustrojów tlenowych mezofilnych
w wyrobach kosmetycznych – techniką płytek lanych, 1 ml rozcieńczeń 10-1, 10-2, 10-3
1. Przygotowanie szeregu rozcieńczeń badanego wyrobu kosmetycznego:
- 1 ml kosmetyku wprowadzić jałowo do probówki z 9 ml rozcieńczalnika, mieszać – rozc. 10-1
- 1 ml rozc. 10-1 wprowadzić jałowo do probówki z 9 ml rozcieńczalnika, mieszać – rozc. 10-2
- 1 ml rozc. 10-2 wprowadzić jałowo do probówki z 9 ml rozcieńczalnika, mieszać – rozc. 10-3
2. Oznaczanie ogólnej liczby bakterii
− po 1 ml każdego rozcieńczenia kosmetyku wprowadzić jałowo na 3 kolejne, sterylne szalki Petriego,
− zalać upłynnionym agarem z hydrolizatem kazeiny i soi, wymieszać podłoże z inokulum,
− inkubować w temp. 30-35°C, przez 3 dni
− po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie
− obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie (jtk) w 1 ml wyrobu kosmetycznego
3. Oznaczanie ogólnej liczby grzybów
− po 1 ml każdego rozcieńczenia kosmetyku wprowadzić jałowo na 3 kolejne, sterylne szalki Petriego,
− zalać upłynnionym podłożem Sabouraud, wymieszać podłoże z inokulum,
− inkubować w temp. 20-25°C, przez 5 dni
− po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie
− obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie (jtk) w 1 ml wyrobu kosmetycznego
Warunki
inkubacji
Oznaczenie
Podłoże
Ogólna liczba
bakterii
agar z hydrolizatem
30-35°C, 3 dni
kazeiny i soi
Ogólna liczba
grzybów
Sabouraud
Liczba wyrosłych kolonii
rozc. 10
-1
rozc. 10
-2
-3
rozc. 10
Liczba jtk/1 ml
badanego wyrobu
kosmetycznego
20-25°C, 5 dni
2
Badania jakościowe - wykrywanie obecności określonych drobnoustrojów w wyrobach kosmetycznych
A Wykrywanie obecności Pseudomonas aeruginosa
Wykrywanie tego mikroorganizmu przeprowadza się stosując podłoże z cetrymidem
(posiew powierzchniowy; 0,1 ml kosmetyku nierozcieńczonego; inkubacja: 37°C, 24 godz.)
- na podłożu tym typowe kolonie P. aeruginosa są płaskie, przejrzyste, żółto-zielonkawe do
niebieskich.
Należy przeprowadzić co najmniej następujące testy potwierdzające:
- barwienie metodą Grama,
- test oksydazowy,
- test na ruchliwość,
- wzrost w 42ºC.
P. aeruginosa jest Gram-ujemną pałeczką, oksydazo-dodatnią, ruchliwą, i rośnie w temp. 42ºC
Oznaczenie
wzrost kolonii na podłożu
z cetrymidem
Wynik/Rysunek i opis
inkubacja: 37°C, 24 godz.
barwienie metodą Grama
test na oksydazę
cytochromową
ruchliwość (obserwacja
bakterii w kropli wiszącej)
wzrost w 42°C
WYNIK:
3
B Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus
Wykrywanie tego mikroorganizmu przeprowadza się stosując podłoże Baird-Parkera
(posiew powierzchniowy; 0,1 ml kosmetyku nierozcieńczonego; inkubacja: 37°C, 24-48 godz.)
- na podłożu tym typowe kolonie S. aureus są czarne, błyszczące, wypukłe, otoczone przejrzystym
obszarem, który może opalizować.
Należy przeprowadzić co najmniej następujące testy potwierdzające:
- barwienie metodą Grama,
- test katalazowy,
- test koagulazowy.
Gram-dodatnie ziarniaki, katalazo- i koagulazo-dodatnie mogą być uważane za S. aureus
Oznaczenie
wzrost kolonii na podłożu
Baird-Parkera
Wynik/Rysunek i opis
inkubacja: 37°C, 24-48 godz.
barwienie metodą Grama
test na katalazę
test na koagulazę:
WYNIK:
C Wykrywanie obecności Candida albicans
Wykrywanie tego mikroorganizmu przeprowadza się stosując podłoże Sabouraud-dekstrozowe
(posiew powierzchniowy; 0,1 ml kosmetyku nierozcieńczonego; inkubacja: 20-25°C, 5 dni)
- na podłożu tym typowe kolonie C. albicans są białe do beżowych, kremowe, wypukłe.
Należy przeprowadzić co najmniej następujące testy potwierdzające:
- badanie mikroskopowe,
- test tworzenia nibystrzępek,
- tworzenie chlamidosporów.
Drożdże tworzące nibystrzępki i dające chlamidospory mogą być uważane za C. Albicans.
Oznaczenie
wzrost kolonii na podłożu
Sabouraud
Wynik/Rysunek i opis
inkubacja: 20-25°C, 5 dni
barwienie błękitem
metylenowym
test tworzenia nibystrzępek
tworzenie chlamidosporów
WYNIK:
4