Genetyczne podłoże męskiej sterylności pszenżyta z różnymi

WYNIKI
z realizacji zadania na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w 2016 roku
Genetyczne podłoże męskiej sterylności pszenżyta z różnymi cytoplazmami oraz
możliwość wykorzystania badanych cytoplazm do tworzenia systemów CMS u pszenicy
Temat badawczy 1
Wytworzenie populacji mapujących i mapowanie porównawcze genów kontrolujących męską
płodność w różnych cytoplazmach sterylizujących pszenżyta.
Cel zadania badawczego: Ocena fenotypowa męskiej płodności/sterylności w obrębie trzech
mieszańców pszenżyta z cytoplamami T. timopheevi i CMS-Pampa, skonstruowanie dla jednej
z nich mapy sprzężeń i określenie na niej przypuszczalnych rejonów zawierających geny
kontrolujące przywracanie płodności u pszenżyta oraz wytworzenie populacji mapującej do
planowanego mapowania porównawczego restorerów skutecznych w cytoplazmie Ae.
sharonensis. – cel zrealizowany
Materiały i metody (opisać jak w publikacji)
Materiałem badawczym ocenianym fenotypowo w 2016 roku były rośliny mieszańców F2
otrzymanych w wyniku zapylenia męskosterylnej linii L19 występującej w dwóch wersjach
cytoplazmatycznych: z cytoplazmą T. timopheevi i cytoplazmą Pampa (z żyta uprawnego),
pyłkiem trzech linii pszenżyta: Bolero 14/1, Stan I i Krakowiak. Ocena fenotypowa męskiej
płodności została wykonana na około 90 osobnikach każdej kombinacji mieszańcowej. Badania
prowadzono na polu stacji doświadczalnej ZUT w Szczecinie. Rośliny na polu były wysadzane
ręcznie w szerokiej rozstawie 20 x 20 cm. Do oceny wykorzystano dwie metody: wzrokową
ocena pylenia roślin przy użyciu 5-stopniowej skali bonitacyjnej opracowanej przez Góral
(2002) oraz ocenę zawiązywania ziaren w kłosach pod izolatorami. Na początku strzelania w
źdźbło pobrano i zamrożono w -70 stopniach C fragmenty liści z roślin badanych mieszańców
w celu późniejszej izolacji DNA i wykonania analiz genetycznych.
Spośród ocenionych trzech kombinacji krzyżowania (z których każda występowała w dwóch
wersjach cytoplazmatycznych) do analiz DNA wybrano jedną. Podstawą wyboru były m.in.
zgodne wyniki obu metod oceny fenotypowej. Po wyizolowaniu DNA osobniki wybranej
populacji mapującej poddane zostały analizom DArTseq - wysoko-przepustowej techniki
genotypowania oferowanej przez firmę Diversity Arrays Technology Pty. Technologia ta
generuje dwie kategorie markerów molekularnych: Silico-DArT (markery dominujące) oraz
SNP (markery kodominujące pozwalające na identyfikację heterozygot w populacjach
mapujących).
Konstruowanie grup sprzężeń wykonywano przy użyciu programu JoinMap 3.0
wykorzystującego algorytm Regression Mapping (RM). Grupowanie wykonywano w oparciu o
funkcję LOD przy wartości krytycznej 20, a dystanse na mapach określano w centyMorganach
(cM) przy zastosowaniu funkcji Kosambi.
Dodatkowo ocenie fentypowej pod kątem męskiej płodności poddano około 20 linii bliskoizogenicznych w stosunku do męskosterylnej linii CMS-Salvo 15/1 oraz cztery mieszańce F2
między czterema męskosterylnymi liniami pszenżyta z cytoplazmami T. timopheevi (CMS-T),
Ae. Sharonensis (CMS-A), Ae. Ventricosa (CMS-V) i CMS-Pampa (CMS-P) zapylonych
wspólnym restorerem DAD182/00. Wyniki tej wstępnej oceny przeprowadzono na około 100
osobnikach w celu określenia przydatności w/w mieszańców do mapowania genów
restorerowych działających w różnych cytoplazmach sterylizujących pszenżyta (pozytywny
wynik oceny skutkował decyzją o założenia w dwóch miejscowościach doświadczenia
polowego z populacjami mapującymi przeznaczonymi do mapowania porównawczego).
Wyniki (opisać)
Wszystkie trzy kombinacje mieszańców międzyliniowych występujące w dwóch wersjach
cytoplazmatycznych (z cytoplazmą T. timopheevi i CMS-Pampa), które oceniano w warunkach
polowych charakteryzowały się obecnością roślin o zróżnicowanym poziomie męskiej
1
płodności. W pokoleniu F2 mieszańca między linią CMS-19T (z cytoplazmą T. timopheevi) a
linią Stan I obserwowano przewagę roślin całkowicie lub prawie całkowicie męskopłodnych
(rys.1). Analogiczne genotypy w cytoplazmie Pampa dzieliły się w miarę równomiernie
pomiędzy kategorie form męskosterylnych i męskopłodnych..
2
CMS-19T x Stan I
CMS-19P x Stan I
35
60
50
29
30
49
25
22
40
19
20
15
30
15
22
20
10
10
14
6
5
6
1
0
0
1
2
3
4
1
5
2
3
4
5
Rys.1 Rozkład fenotypowy męskiej płodności (wg 5-stopniowej skali bonitacyjnej opracowanej przez Góral 2002) w populacjach mapujących mieszańców F2
otrzymanych po skrzyżowaniu męskosterylnych wersji linii CMS-19 z linią Stan I
3
CMS-19T x Krakowiak
50
CMS-19P x Krakowiak
60
46
45
49
50
40
35
40
30
25
30
25
20
10
5
20
14
15
10
5
0
10
9
6
0
0
1
16
2
3
4
1
5
2
3
4
5
Rys.2 Rozkład fenotypowy męskiej płodności (wg 5-stopniowej skali bonitacyjnej opracowanej przez Góral 2002) w populacjach mapujących mieszańców F2
otrzymanych po skrzyżowaniu męskosterylnych wersji linii CMS-19 z linią Krakowiak
4
CMS-19T x Bolero
CMS-19P x Bolero
45
30
39
40
25
25
25
35
20
30
20
25
22
24
16
15
20
15
10
10
5
7
8
5
3
0
0
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Rys.3 Rozkład fenotypowy męskiej płodności (wg 5-stopniowej skali bonitacyjnej opracowanej przez Góral 2002) w populacjach mapujących mieszańców F2
otrzymanych po skrzyżowaniu męskosterylnych wersji linii CMS-19 z linią Bolero 14/1
5
Linia Krakowiak w sposób bardzo skuteczny przywracała płodność w mieszańcach z cytoplazmą T.
timopheevi, ale przy obecności cytoplazmy Pampa okazała się być mało efektywnym restorerem
(rys.2). Linia Bolero 14/1 w sposób porównywalny przywracała męską płodność w obu badanych
cytoplazmach (rys.3). Jednocześnie u mieszańców z udziałem tej linii ojcowskiej rozkłady fenotypowe
w pokoleniu F2 były najbardziej zbliżone do rozkładu normalnego. Taki rozkład jest metodycznie
pożądany przy próbach zastosowania metody mapowania w przedziałach (ang. Interval Mapping –
IM) do lokalizowania genów odpowiedzialnych za dziedziczenie cech o złożonym podłożu
genetycznym. Wyniki oceny wzrokowej były u mieszańców między CMS-19 a linią Bolero 14/1
wysoce istotnie skorelowane (wartości wsp. korelacji powyżej 0,7) z rezultatami oceny zawiązywania
ziaren pod izolatorami (tab.1). Ta kombinacja krzyżowania została wybrana do analiz przy użyciu
technologii DArTseq. Genotypowaniem objęto po 90 roślin mieszańca między linią CMS-19 a Bolero
z cytoplazmą T. timopheevi i Pampa (łącznie 180 genotypów) oraz linie rodzicielskie.
Tabela 1
Współczynniki korelacji pomiędzy wynikami oceny męskiej płodności opartymi o obserwacje
wzrokowe pylenia i zawiązywanie ziaren pod izolatorami.
Mieszaniec F2
Wsp. korelacji
CMS-19T x Stan I
0,633
CMS-19P x Stan I
0,887
CMS-19T x Krakowiak
0,592
CMS-19P x Krakowiak
0,861
CMS-19T x Bolero
0,739
CMS-19P x Bolero
0,783
Do tworzenia grup sprzężeń w obrębie mieszańca [CMS-19T x Bolero]F2 użyto kodominujących
markerów SNP, których w wyniku analizy techniką DArTseq otrzymano łącznie 5967. Spośród nich
do mapowania wybrano 2148 markerów, które różnicowały linie rodzicielskie CMS-19T i Bolero
14/1. W wyniku grupowania przy poziomie LOD=20 powstało 12 większych grup sprzężeń liczących
co najmniej 50 markerów oraz kilkadziesiąt drobnych grup liczących przeważnie po kilka-kilkanaście
markerów. Większe grupy stanowiące znaczące fragmenty chromosomów pszenżyta wykorzystano do
analizy Regression Mapping w celu skonstruowania map genetycznych. Finalnie w obrębie
utworzonych map znalazło się łącznie 1269 markerów (tab.2). Największą liczbę markerów zawierały
grupy sprzężeń 1, 3 i 4 (każda około 180 markerów), ale największą długość miała mapa grupy
sprzężeń 10 (prawie 120cM) licząca zaledwie 67 markerów i charakteryzująca się w związku z tym
stosunkowo małą gęstością (rys.4)
Tabela 2
Charakterystyka grup sprzężeń utworzonych w obrębie populacji mapującej [CMS-19T x
Bolero]F2
Grupa sprzężeń
Liczba markerów
Długość mapy (cM)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Ogółem
178
136
185
182
93
70
50
55
98
67
67
88
1269
75.7
52.5
92.2
79.3
56.5
49.6
29.3
49.8
74.5
119.5
29.5
82.3
790.7
6
Przypuszczalny
fragment
chromosomu
Brak danych
6B (6BL)
7B
6R
Brak danych
5A
Brak danych
5R (5RL)
7R (7RL)
1B
2R (2RS)
Brak danych
LG1
0
LG2
4200517_6:T>C
LG3
4369059_6:T>A
4341892_16:C>T
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
4370084_19:T>C
4343207_7:G>A
3619871_8:C>T
4371047_65:T>C
3607106_35:A>G
4207037_38:A>G
8538651_31:C>G
14475647_21:C>G
3617959_35:G>C
14477157_65:G>A
8538511_53:T>C
3041622_23:T>C
4203614_12:G>A
4370985_34:T>C
3606689_14:A>T
10518960_11:A>T
4209793_6:G>C
10524563_37:A>G
10525146_17:G>A
10522225_14:A>T
4370374_18:G>T
8537930_25:A>G
10520370_25:A>G
4208234_16:A>C
4205848_9:A>G
4219369_58:A>G
8516288_31:A>C
10519063_23:G>A
14478834_6:T>C
3045127_34:C>T
10516342_13:A>G
3623653_11:T>G
3618383_9:A>C 10517241_10:A>G
3048145_8:A>G
3611101_5:T>C
3620743_8:A>G 10525042_9:C>G
3044845_12:C>G
3041326_19:G>A 3042073_33:C>G
4563805_22:C>T
15998360_8:T>A 3045391_19:T>C
3623802_11:G>A
4347372_24:G>T
3042965_20:A>G 3041514_51:C>T 4220710_13:C>G
3045704_29:C>T 4217841_10:A>G
8511166_22:C>G
10519415_18:C>T 4211342_7:G>T
4207806_11:G>C 3617375_40:A>G 3604322_45:G>A
15997813_16:G>C 16312244_18:T>A
4206613_10:G>T 3041189_8:G>C 8539354_8:A>G 4210781_36:C>A 3616842_19:A>C
4215613_10:A>G 3043425_5:A>G
8537837_5:T>A 3618272_15:A>G 3041026_62:A>G
10511726_24:A>C 4348502_13:G>A 4344553_23:G>A 4202107_11:G>A 3047764_31:C>A
3610105_6:G>C 4369666_15:G>C
3624423_29:T>C
4571663_10:G>C 4368451_27:C>A 3042961_7:A>G 3044346_25:A>G 3617710_34:G>T
8538573_12:T>C 11911058_30:A>C 3611574_10:C>T
4354861_11:A>G 8538212_43:C>T 3609303_26:T>C
4200663_33:G>A 3623032_15:A>G
4575372_8:G>C 3622899_6:C>T 3044315_62:A>C
3619651_13:T>C 8510735_38:A>G 8517692_9:C>G
10519051_13:C>G 3625140_6:C>T
4207000_38:A>G 4203024_13:A>G
3043873_22:A>G 3044673_31:T>C
8510207_8:T>G
3616949_23:C>G
4342393_32:G>A
3047292_6:T>A
16312215_22:C>G 3046092_19:C>G
3617217_50:G>A 15998304_8:C>T
3041044_49:T>A
10518966_19:T>C
10523227_50:C>A
3617166_25:G>C
3042073_41:C>T
4551080_32:G>C
3041086_53:G>A
3041825_25:C>G
3620196_5:C>G
3046856_12:C>A
3042303_5:C>A
3047463_19:A>G
4213087_33:C>G
3618513_15:A>G
4362259_7:A>G
3047946_40:C>G
3622263_14:A>T
3044818_38:A>G
3045127_51:G>C
4367388_15:C>G
8537398_38:T>C
14479864_5:C>T
4352789_39:G>A
4212021_56:C>G
14479864_13:C>T
8510489_28:T>A
4204931_20:A>G
4347548_19:G>C
4219424_8:A>G
16312680_16:G>T
8511009_11:A>G
4211581_34:A>G
8537908_12:T>C
4205456_6:G>C
3610735_41:T>C
3622878_37:T>G 3622878_44:T>C
4202106_6:C>T
4340756_23:G>A
8511185_9:T>C
10519168_20:C>T
3623153_33:A>G
3045703_49:A>C
4349257_17:A>G
8511737_25:T>C
4201278_29:A>G
8537313_25:A>G
8537313_9:C>A
3047554_29:A>G 8512333_20:G>A 3046975_40:C>A
8535017_16:T>A
3046975_17:T>G
3042504_52:A>G
4371852_18:T>A
3047808_26:C>G
4202187_32:T>C
3047554_14:A>G
4218829_19:A>G
10524548_11:G>C
4208510_22:A>G
4203432_31:G>A
16312399_8:C>G
4566513_31:G>T
16312869_8:A>G
4209536_23:T>C
4352882_17:T>C
3046560_8:T>C
3040564_52:C>G
4213658_44:A>T
3604205_35:A>G
3611335_39:C>G
3042672_27:T>C
8510348_7:G>C
3044696_12:C>T
3615526_28:G>T
4212501_23:A>G
4212239_15:T>C
4203632_49:C>G
8512625_12:C>T
3603956_15:A>G
4210971_29:T>C
3608152_58:A>G
10525106_18:T>C
16312632_10:C>G 15997814_10:C>T
10519787_27:G>A
3041303_52:T>C
11912736_23:T>A
4569772_14:G>C
8538747_39:G>A
4562450_20:C>T 14476270_14:A>G
3614972_26:T>C
4210230_41:A>T
3606714_6:A>G
3622526_34:C>T
3045718_56:A>G 4552026_44:T>C
3043506_20:A>G 4204834_35:C>T
3047638_24:C>G 14476307_17:A>T
4203067_18:G>T
3608152_8:T>C 3607671_64:G>A 4364341_9:G>T 3042723_38:T>C
4370259_26:T>C
16312395_13:A>G 8538179_23:C>T 4341658_18:G>A 8532704_9:T>C
4364718_26:A>T 4203206_56:A>G 4356436_10:T>C 14477633_17:G>A
3607048_29:C>G 3621876_18:C>G 8512930_23:T>C 4356888_7:T>C
3616028_17:C>T 16312703_14:A>C 3046387_9:T>C 3610261_27:T>C 14476264_16:T>A
3047970_39:T>A 4203922_8:G>C 3605448_7:C>G 3618494_31:A>C 8511607_8:A>G
3623678_7:C>T 15998513_23:A>G 8533125_8:C>A 8538596_19:T>C 4571111_26:C>G
3621876_27:A>G 4219728_25:C>T 3040881_17:A>T
4341579_9:A>T 4340816_8:C>G 4339518_18:C>T
3041515_66:A>G 4348674_26:T>G 8512930_22:T>C 4210501_38:T>C 8536517_14:T>G
10525105_6:A>G
3608894_37:C>G 3041841_28:G>C
3048061_17:A>G 4213198_16:T>C
4206307_24:T>C 4213274_21:G>A
8538213_38:G>C 4367092_15:T>G 4214032_18:C>G 4353195_12:C>T
4545701_11:T>G
3604726_62:G>A
3605924_20:T>A
4212280_33:T>G
4215614_26:A>G 10521034_38:T>C
3041108_57:T>C
4209605_41:A>T 3043609_17:A>G
3616663_27:A>C
3047631_38:A>G
3617118_68:A>C
4550280_9:T>A
11912572_8:C>G 4220608_24:A>T
16312582_21:A>G
11912572_10:G>C
4344372_11:G>A
4201765_5:C>G
3616757_38:G>C
3616795_10:T>C 3043840_55:C>A
3607931_30:G>T
4211171_31:A>G
3623424_34:C>T
3615090_10:A>G
11911774_13:T>G
3616260_18:C>T
8537970_22:A>G
4345430_16:G>C
4339658_55:T>C
4554178_14:G>C
3615405_12:C>A
4348506_15:G>A
3620552_7:C>G
4570905_20:C>T
15998531_19:C>T
4548031_40:G>A
60
8537175_17:C>T
65
4358453_14:T>A
70
3606454_50:T>C 3047508_42:C>A
75
4346604_40:T>C
80
85
LG4
3045255_27:G>A
4343801_12:T>C
4203207_9:T>A
4218565_11:G>A
4562526_43:A>G
4368895_5:T>A
8537541_8:G>A
16312694_19:G>C
3608720_13:A>G
8510268_15:G>A
10512204_7:T>A
3047071_35:C>T
4364443_13:T>C
4216945_28:A>T
3620740_36:C>G
4208658_43:G>A
4220935_21:C>T 8510474_18:A>G
4216390_9:G>C 4339191_32:G>C
4201025_7:C>G
3621711_11:G>C 16312400_6:C>A
3618450_41:T>G 3040628_5:C>G 3616610_9:G>A 4220967_32:T>C 4220918_34:T>C
4346684_30:A>G 16312356_32:T>G 4210393_9:A>C 3619618_25:G>A 11910343_7:C>A
4214099_50:C>T
4339880_8:G>C 10521167_22:A>T
3047394_15:A>G
4217808_29:A>G 4217011_24:A>T
4219937_7:T>C
3614996_10:T>C
8510358_9:T>C 4203155_20:C>G
8535339_52:T>C
3040600_48:C>T
16312285_14:A>G
3042007_16:A>G
4367446_8:C>T
4211537_31:A>T
3618118_35:G>C
3046479_32:G>T
4371383_10:T>G
3044150_26:A>G
10512090_14:T>C
8532881_10:T>C
3047208_22:T>C
3046418_8:C>G
3047876_33:A>G
10512250_10:G>A 3048140_26:C>G 3048065_18:A>G
10516661_8:G>T
4203562_8:A>G
3040791_7:C>T
10523034_9:T>C
3045715_40:T>C
3604021_40:C>G
3608719_41:C>A
3611570_7:C>T
3047822_24:C>A
3615493_19:T>C
8512177_21:C>G
16312363_14:A>G
4209519_10:C>A
16312286_6:C>T
4350438_13:T>C
3616847_47:G>T
3043544_15:G>A 3609161_37:C>A
3042761_7:C>G
8521863_8:C>G
4211485_32:T>G
4570583_18:T>A
3605081_16:C>A
8538123_18:A>G
3606672_41:T>A
4204571_49:T>C
4221306_27:A>C
4353315_64:A>G
3613238_8:G>C
3042702_26:T>G
10520401_12:C>G
3611949_30:A>G
3614684_53:G>T
8537567_32:A>C
8538039_31:G>A
3610527_13:G>C
16312206_18:T>G
4206627_32:T>C
14478904_15:C>T 4354033_21:T>G
3603358_60:T>A
4341167_14:G>A
3040588_19:C>A
4339863_9:A>G
4346573_7:T>C 3040905_28:A>G
4545735_7:T>G
8536488_15:A>G
3048252_13:G>A
11913047_15:A>T
4220085_24:A>G
3044922_8:T>C
3622476_7:T>C 4545902_31:G>A 3619332_14:G>A
10516634_10:A>G
3042172_35:A>G
3040704_17:C>T
4546613_23:T>C
4218405_28:C>G
10522949_13:C>T
3041752_30:C>T
3040829_16:C>T
3043422_6:T>C
4204145_15:G>A
4208065_49:C>G 4217484_5:C>G
8539579_16:T>C 4217484_13:T>C
3046690_29:T>C 4347572_8:G>C
3624822_20:G>A
3046598_13:G>A
3040592_41:C>A
4200510_14:C>T
3047750_23:G>A
4348152_7:T>C
8512828_9:C>T 4553649_15:C>T
3041053_58:G>A
10524774_6:A>G
3604030_17:A>G
4220880_31:T>C
4371583_11:T>C
3046771_24:C>T
3610536_39:G>A
4209191_11:T>C
4362141_28:T>C
8511973_43:T>C
3047273_63:A>G
4201326_44:A>C
3618480_29:A>G 11911180_27:A>T
4342357_16:G>C
3623517_37:T>C
4218712_19:T>C
4351440_11:T>C
16312349_17:A>G
4219325_6:C>T
4359537_9:T>C
4204530_8:A>G
4208325_28:A>T 4218839_8:A>G
4343617_16:C>G
3045338_29:T>C
4368576_13:A>G
3623977_26:G>A
8512751_26:T>A
8538906_16:C>A
4214830_30:A>T
3617279_13:T>C
16312456_16:T>A
4214507_37:C>T
4212809_52:G>A
4218934_19:T>A
16312798_23:G>C
3040762_38:C>A
3617147_27:A>C
8539423_38:T>C
8539425_13:C>T
3617228_15:T>C
3623149_10:G>T
4365296_8:T>C
3615962_45:G>A
LG5
LG6
3045105_7:G>A
3607899_11:G>A
4206515_8:T>A
3623190_29:A>C
3620241_14:G>A
10513717_33:T>G
3041890_46:G>A
4341126_51:C>G
8511722_29:A>G
3046432_29:A>T
4339987_6:C>T
10523542_14:G>A
3040907_61:G>A
3041968_45:C>T
10523542_24:T>C
3612726_35:C>G
3046190_18:A>G
3040971_16:T>C
3040711_42:G>C
8537576_8:G>T
4342343_17:A>G
3046717_15:C>T
4209686_53:T>C
8510178_5:A>G
3048244_31:C>T
14468834_21:C>A
4203329_13:T>C
3048220_5:T>C
3041407_31:C>T
3045465_31:T>G
4346853_16:G>C
4350979_31:G>A 4201444_40:G>C 4207462_15:A>G 3604764_20:A>G
3041276_54:G>A
15998167_20:T>C
3048043_34:C>G
3045539_18:A>G 3041073_29:T>C 4204480_26:G>C 4218437_16:G>T
3610638_16:G>C
3606416_67:C>G 10523814_14:G>A
4219493_15:G>A 3040826_20:C>A
4216356_10:A>G 3620422_31:A>G
3614149_18:G>A 3045017_15:G>A 3042679_7:A>G
3042613_14:C>A 3041596_20:C>G
4559398_16:C>G 3043285_32:T>C
8511649_19:A>T
4204479_28:A>G
3043172_11:G>T
3046310_27:A>G
3040688_10:C>T
4344834_17:G>C
4342410_7:C>T 3044677_7:A>G
4211811_31:A>G
3040810_42:C>T
3041094_51:T>C
3046571_21:G>A
4546612_20:T>G
3607294_14:T>C
3047975_28:G>C
3040766_12:A>C 3614369_37:T>G
4203815_6:C>T
4208446_14:C>T
3604105_5:C>T
3611055_16:C>T
8511804_6:A>G
4558953_10:T>A
3620957_20:A>G
3618177_24:G>A
3624702_11:A>G 3608272_57:C>G
3046775_32:G>T 8511255_28:G>A
8538494_32:A>G
8512279_29:T>C
8538038_15:C>T
4211525_8:A>G
4203594_44:C>A
3046899_9:G>A 4347264_20:C>T
4368379_9:T>G
4561892_23:G>A
4561734_6:T>C
16312216_20:G>C
3043908_29:C>G
3605952_7:T>G
3043908_17:A>G
3605947_5:G>C
4547878_13:G>T
3605801_25:G>T
3612993_49:G>A
3610745_19:A>T
3047924_28:C>A
4342984_11:C>A
10511507_5:T>A
4570356_6:A>G
3605500_31:G>A
3607083_25:C>T
3608290_9:C>G 3619869_32:T>G
3615961_30:A>G
3611246_7:T>A
3619711_52:A>T
3622112_32:A>C
3622393_11:T>C
3605696_6:A>G
4218915_22:G>A
8512532_6:C>T
8512040_28:C>T
8512040_7:T>C
3624218_10:C>T
3047246_27:T>G 3042993_14:A>G
8512872_29:C>G
3046992_5:C>T
8512426_19:C>G
11911887_13:G>C
3045252_17:T>C
4341466_7:G>A
3044862_37:C>G
8539386_8:C>G
8539387_11:G>T
3609790_42:C>G
11912927_19:A>G
8535341_53:T>C
3611288_54:G>C
8512046_15:T>A
11912927_8:G>C
3617902_6:T>C
3604799_30:G>A
4345775_10:A>G
3048139_23:A>C
3047329_17:T>G
3624664_16:G>C
3607337_26:A>T
3615183_28:A>G
3613671_61:T>C
4340365_28:A>G 10519092_13:T>C
3620641_19:G>A
3614498_16:G>A
4345126_20:T>C
16312306_14:A>G
4353813_13:G>A
3622885_41:C>T
3041796_10:T>A
4208601_31:A>C
4344257_17:C>A
4358372_13:T>G
3608065_49:A>T
3621357_27:A>C
4210976_22:T>C
3047485_47:C>G
8511829_24:G>C
4219847_22:A>C
4555102_52:G>A
8537234_28:A>C
4339290_10:G>C
4370510_37:G>T
3616313_24:A>C
3047136_35:G>T
3612871_13:G>C
16312333_9:T>A
4560525_31:A>T
16312343_25:A>C
3619908_31:A>G
3613251_14:A>C
3040826_50:T>G
3613805_13:C>A
3046685_44:A>C
3603792_9:C>A
4204466_7:G>A
8537857_38:C>G
4567534_36:G>A
4353938_24:A>C
4210838_14:A>G
16312735_13:C>T
4213344_26:A>G
4207744_20:T>C
4564872_32:G>A
4564945_41:C>T
4555174_39:T>C
10516917_11:T>C
4200698_6:A>G
8510033_17:C>G
4356515_51:T>C
4210589_47:G>T
15997424_24:T>A
10524355_9:A>G
10502487_7:T>G
3042704_53:G>A
10524355_7:C>G 4358922_31:G>A
3045518_21:C>A
10525077_17:A>G
3045085_65:C>G
4568813_6:T>A
4551618_60:C>G
8512257_40:C>G
10522677_27:T>C
3044258_16:G>A
8533004_17:G>A
8510431_10:A>G
4342038_5:A>G
3617287_19:T>C
4200832_19:T>C
8510996_15:A>C
8539278_7:C>G
4368818_23:T>C
3619660_7:T>C
3048250_15:A>G
3044678_40:G>C
3615632_14:C>T
8536350_23:A>T 3617026_31:A>C
4572685_9:A>G
4353143_26:T>G 10521132_14:C>T
10525198_21:A>T 4573256_16:C>T
3606355_39:T>C
3042234_12:C>T
3046799_22:T>A
3042370_13:C>T 4346310_8:G>A
3047796_8:C>G 3047221_41:G>A 3047727_36:T>C
3625231_6:C>G 3604216_15:G>C 3044936_17:C>G
4215292_14:C>A
4575260_25:C>G 11911735_8:C>G 10521022_6:T>A 4201336_26:A>C 8536437_18:A>C
3044867_12:C>T 3047899_35:C>G 4205347_30:A>G 4364754_12:T>C 4342269_7:G>C
3047857_37:C>G 4205620_41:G>A 3619158_8:G>A 3603528_29:T>C 4353711_20:C>G
4357404_68:C>T
4552146_10:G>A
4342007_27:A>G 4202758_7:A>G 3045590_25:T>G 4203814_14:C>T 3040724_7:T>G
4217372_8:A>G 3604539_35:A>G
3041231_29:T>C 4551347_5:T>C
3041102_35:A>G 4347120_7:A>C 3043509_20:A>C
3047529_25:T>C
3040921_60:A>C
4208670_14:T>C
4200444_9:C>T
8531078_17:T>C
4211590_9:A>T
3048011_26:G>A
4371015_53:C>T
4210679_32:T>C
3048262_9:A>G
4219596_14:A>C
4221278_37:C>T
3047529_20:G>A
3045905_47:A>G
3625011_21:T>C
4205389_46:A>G
3611291_10:C>A
4210059_17:G>C
4210122_32:G>A
10522168_8:T>G
3623190_38:T>C
3621726_5:A>G
3044020_23:A>G
3040826_35:T>C
8512114_50:A>G
8538488_26:C>G
8510885_7:T>C
3048151_50:C>T
3043601_36:A>G
8511160_8:C>T
4215435_6:C>G
3624589_39:T>C
8511269_19:A>G
3046251_37:A>C
4205783_10:G>A 4201091_11:A>C
3605361_40:A>G
3610616_46:A>G
3041892_39:T>C
3040601_16:G>A
3040609_11:T>C
8511755_5:T>G
4345220_22:C>G
3045831_35:C>T
4201021_10:T>A
3042606_15:C>A
3617130_9:C>A
3040693_31:A>T
3043210_63:T>C
3606110_12:G>T
4212587_31:C>A
4209639_37:A>G
3620171_8:T>C
4347248_43:G>A
3042989_35:A>T
10519249_19:G>T
4361241_31:C>T
4209849_6:C>G
3612113_33:A>C
4361137_10:A>G
3047028_21:T>A
8531407_39:G>C
4206239_7:T>C
4367672_9:A>G
3041539_61:G>C
4342269_17:T>C
4202456_21:C>G
16312805_9:A>C
3046345_14:T>G
3045843_68:C>G
3621270_13:A>T
90
4369059_8:A>G
LG7
0
3617523_53:A>C
11911015_8:T>C
LG8
8510473_10:G>C
LG9
8510037_21:A>G
LG10
3617134_41:A>C
3616413_6:T>C
4374082_17:C>A
8510993_7:T>G
4571714_13:C>G
3047013_24:A>G
3610016_43:T>A
10
15
20
3040595_6:T>G
4218361_21:T>C
3045769_35:A>G
3046519_44:T>C
4214702_5:T>C
11911003_7:T>G
4345313_8:A>C
4340530_27:C>T
3618084_36:C>T
3604406_25:G>A
3623013_19:T>C
4210082_47:C>T
4212295_19:C>G
8512406_15:G>A
3617743_50:A>C
3042687_15:T>C
3048031_11:G>A
3624487_15:C>T
10519333_6:A>G
4355584_5:C>A
3040723_18:A>G
4342423_11:A>G
8512614_39:G>A
3615395_22:T>C 4343385_18:C>A
3040580_25:A>G
4575569_10:C>T 4548539_15:A>G 4210134_18:G>C
4366507_16:T>C
4212794_16:T>C
4211220_19:C>T
8538257_8:C>T
4212343_27:C>G
3047454_19:C>T
3047671_15:A>G
4370286_44:A>G
4212020_42:T>C
3046890_31:C>A
4363445_8:C>G
4206831_44:T>C
3619611_12:A>G
4212490_37:C>T
25
3048114_23:G>T
3047568_19:A>C
30
3040817_66:T>G
LG12
3609507_44:C>T
8510396_17:C>G
3618092_28:C>G
5
LG11
4340576_53:A>G
3622989_13:G>C
16312491_15:A>G
3625105_10:G>A
3611150_64:A>C
3040584_20:G>C
4340193_17:G>C 3622989_22:G>C
3622989_37:A>G
3043846_14:T>A
4221479_5:T>C
3043846_32:T>C
8511169_9:G>C
4202933_27:A>G
3040991_37:A>T
3041340_28:A>C
4361756_6:T>C
3616641_15:T>G
8511204_9:A>T
10516656_16:T>C
4547679_25:C>T
4217392_13:C>A
4215779_18:A>C
4215309_17:A>G
10523094_12:A>G
8512935_16:C>G
4343218_11:G>A
3048057_31:C>G
16312648_7:G>A
4221452_11:T>C
4351620_21:G>C
10514725_50:C>T
8510197_16:G>A
8511223_10:C>G
16312659_14:G>C
4208590_10:G>C
4208448_22:G>C
14478219_9:T>G
4213788_12:C>T
4221210_26:T>G
4217148_40:C>T
11912825_10:G>A
4216046_37:G>A
4212826_13:T>C
16312574_16:A>T
8512709_22:A>G
4560101_20:G>A
8510353_5:A>C 4209476_46:T>C
4213719_7:T>C
4216126_21:A>C
4216126_39:T>C
4553698_5:C>T
4561171_8:A>T
4555706_5:T>A
4212227_5:A>C
11912166_7:C>A
8538037_22:C>T
4357171_47:G>A
4367223_34:A>G
4569396_11:C>G
4351599_32:T>C
4202705_9:A>G
3040630_53:T>C
3046659_13:G>C
4346232_9:T>C
4204780_19:G>T
4569602_22:T>C
4204669_7:G>C
4210132_27:C>G
8512717_17:C>G
3043759_29:C>A
4552728_33:T>C
4566252_29:C>T
8531064_13:G>C
4352433_23:T>A
15997416_6:T>C
8511263_12:G>A
4208011_24:C>G
4346295_22:A>G
3620274_17:A>G
3045344_61:C>G
8537838_13:T>G
3610348_12:G>C
3041104_46:G>A
10519011_9:G>C
3046073_6:T>C
3042064_49:A>C
4219627_19:A>G
4204635_9:G>A
4568294_11:C>T 4575270_26:A>C
4369083_38:C>T
4373393_5:A>G 4360736_18:G>A
3047507_31:C>T
4357859_31:G>A 3608446_7:T>C
3042365_10:A>G
4362248_44:C>T 4368078_35:C>T
3044419_9:G>A 3041018_66:G>C 4355049_62:A>G 3041629_34:T>C
3048194_29:T>C 4560129_6:A>G 4213504_14:A>T
4364182_15:A>G
8512600_17:A>G
8536247_12:T>C
4571321_25:G>A
4219787_10:C>A
4367812_25:G>A
4362246_19:C>T
10514413_61:C>G
3046950_25:C>T
4341029_11:T>C
3617083_24:G>T
4339935_5:T>A
3620012_7:A>G
4567845_11:T>C
4564710_61:T>C
4367026_7:A>C
4368184_26:A>G
3046817_30:A>G
8511445_44:A>G
8530950_57:C>G
10524688_21:A>G
4369685_27:C>T
4348422_29:C>T
4343039_15:G>A
4340589_28:A>G
4342127_6:A>G
3621359_18:G>A
4343503_25:T>C
4353384_28:G>A 4363114_8:G>A 4549657_18:A>G
4349296_17:G>C
4206568_23:A>G
10516108_16:T>C
4342210_24:A>G
3045079_22:C>T
3042505_36:G>C
4367928_37:G>T
4364350_9:C>G 4351699_8:T>G
14475943_9:G>A
3047555_36:T>C
3041043_12:T>G 4339218_30:G>C
4354843_14:A>T
8511075_24:T>A
4366468_6:T>C
4556833_20:T>A
4570941_17:A>G
4204886_25:C>G
8535302_38:A>G
4221305_44:G>C
35
3609380_16:G>A
40
3613160_25:C>A
45
50
55
60
4571686_12:T>G
4346454_11:G>A
4346932_24:T>G
4358975_10:T>C
4358136_48:T>C
8510529_20:G>T
4206125_14:A>G
4211417_5:C>G
4348066_24:A>G
8537205_8:G>A
4220679_30:G>A
3046207_40:T>G
3044163_6:G>A
3041025_45:C>G
3040739_36:A>G
3043326_62:A>G
4358759_8:A>C
4568188_23:G>A
11912465_29:A>T
4350841_18:T>A
4357015_32:G>C
8511979_8:G>A
4210797_18:T>G
3617015_56:T>C
4211419_41:T>C
8534980_7:G>C
4548774_56:T>C
3046403_25:A>G
3046713_25:C>G
4553468_34:T>G
4207867_63:T>C
3042218_11:A>G 4545030_17:G>A
4210752_5:C>G
4562068_12:A>T 8512270_25:T>C 4574144_13:A>G
4573304_20:A>G
3040773_38:C>T
3040771_59:T>C
4339434_7:A>G
4341510_11:A>G
3044946_19:T>A
8539384_20:G>T
3620292_33:C>G
3042556_37:A>G
3048245_8:A>G
3043856_7:T>C 3605484_35:A>C
3047307_46:A>G
3044317_27:A>G
3048233_38:G>C
4550845_10:A>C
3044199_33:T>C
3047471_27:G>C
3046626_49:A>C
4339825_11:G>A
3617534_38:G>A
4339472_11:T>C
4351035_16:T>G
8510541_15:T>C
3617252_19:A>G
3606199_23:G>A
3040585_58:G>A
4218999_37:A>G
4343927_24:A>G
8511739_8:C>T
4210222_14:T>C
4210030_24:G>C
3044130_33:G>T
3040864_68:T>C
8510602_14:G>C
8512814_12:A>C
3042835_19:C>T
4347937_66:G>C
4351181_5:C>G
3614304_17:G>A
3042310_22:G>A
65
3046836_36:C>T
3045497_32:G>C
3045077_68:G>C
4341404_24:T>C
3620074_10:A>G
4208738_6:A>G
3047732_26:A>G
70
4357139_8:C>T
4371574_19:G>A
4343174_13:C>A
4208900_37:C>A
10511535_11:A>C
4217001_23:C>T
10525241_18:G>A
8539695_7:A>G
3040849_52:C>T
4370462_43:G>A
3042907_7:G>A
3046159_17:G>C
4204460_27:A>C
8537060_65:A>G
3041857_59:G>A
3045930_32:A>G
4203457_7:T>C
3041770_24:T>C
3040713_57:A>G
4219921_24:T>C
4367451_61:C>T
4344504_37:C>A
4549292_19:C>T
3044827_34:C>A
4219959_27:G>A
3040586_57:T>C
16312292_12:T>A
4212658_13:T>C
3041155_36:C>G 4206309_7:C>T
4353136_16:C>T 4351782_36:A>G
4210358_18:A>G
3047690_13:T>C
4208562_25:T>A
4369987_59:C>G
4207933_31:T>C
4210005_11:A>G
3048059_14:T>C
16312429_21:T>C
4203633_40:T>G
4373138_8:G>A
3048209_21:T>C
4209418_11:A>G
3042419_40:T>C
3044937_31:G>A
4215929_14:A>G
8509796_67:G>A
4208037_6:A>T
4208832_12:C>T
3610037_5:C>G
4207143_63:T>C
3046546_11:T>C
8509921_39:A>C
4340616_13:T>C
8535077_6:G>A
3047943_18:A>G
3622544_25:C>T
10516838_30:C>A
4345270_25:A>C
4345704_49:T>C
3041107_24:A>C
3047237_6:G>C
4205968_40:T>C
75
8512043_19:T>C
3047330_34:G>T
3048132_43:T>C
4545422_17:G>A
4570077_16:A>G
10524864_12:T>A
80
3045859_18:C>T
4561075_7:C>T
4342853_48:G>A
3043799_21:G>A
3047721_12:A>C
4205130_18:G>C
85
3611438_43:C>T
90
3612560_51:C>T
4220360_55:C>T
4204821_11:G>A
95
100
105
4210681_43:C>A
4209443_28:T>C
3048181_52:C>G
3604473_46:C>G
8511443_5:C>G
4208109_23:C>T
4206115_14:C>A
3046308_35:A>G
3046336_16:G>A
3044906_54:C>T
4369631_34:A>G
8512743_8:C>T
3044858_38:A>G
4205996_26:C>A 4206614_22:A>C 4359359_5:T>C
4354602_17:C>T
3041349_20:G>A
8511378_20:G>T
3043491_25:C>T
8510494_18:G>C
16312252_8:C>T 4370401_34:C>G 4345636_10:G>A
4367136_68:T>G
4363145_24:A>G
11910944_14:C>A
3045848_40:T>C
4213972_8:T>C
8512351_53:A>T
4369934_9:C>G
3042808_53:T>C
110
4346790_13:G>A
3609379_24:A>G
3046620_29:T>C
115
3047818_13:A>G
4553572_13:C>T
3040551_19:T>A
Rys. 4. Mapa genetyczna dwunastu grup sprzężeń markerów SNP-DArTseq w populacji
[CMS-19T x Bolero]F2
7
Pewne trudności napotkano przy identyfikowaniu lokalizacji chromosomowej otrzymanych grup
sprzężeń. Poszukiwano polimorficznych markerów PCR oraz markerów DArTseq o znanej lokalizacji
chromosomowej. Osiem z dwunastu grup sprzężeń przypisano do konkretnych chromosomów (ramion
chromosomowych) pszenżyta (tab.2). Wśród zidentyfikowanych chromosomów jeden pochodził z
genomu A (5A), trzy z genomu B (1B, 6B, 7B) i cztery z genomu R (2R, 5R, 6R, 7R).
Próbę określenia lokalizacji na utworzonych mapach sprzężeniowych genów odpowiedzialnych za
przywracanie męskiej płodności zrealizowano przy zastosowaniu metody mapowania interwałowego.
Tylko w przypadku dwóch grup sprzężeń – 4 (chromosom 6R) i 5 (chromosom dotąd
niezidentyfikowany) krzywa LOD przekroczyła poziom istotności określony na LOD=2,5 (rys.5).
Zarówno przebieg krzywej, jak i wartości parametrów wykrytych QTLi wskazują na obecnośći genów
o słabym efekcie fenotypowym. Dodatkowo wykonana analiza danych testem nieparametrycznym
Kruskala-Wallsa wykazała statystycznie istotny związek z genami restorerowymi zaledwie 71
markerów SNP-DArTseq. Wśród nich 58 znajdowało się w obrębie wymienionych dwóch grup
sprzężeń, a pozostałe 13 markerów nie były włączone do skonstruowanych map (znajdowały się wśród
markerów tworzących wspomniane powyżej drobne grupy sprzężeń).
Rys.5. Przebieg krzywych LOD w obrębie grup sprzężeń 4 (chromosom 6R) i 5
Spośród 5967 makerów SNP otrzymanych w wyniku analiz DArTseq w populacji [CMS-19P x
Bolero]F2, 1894 markery polimorficzne użyto do konstruowania map sprzężeń. Przy wartości
krytycznej parametru LOD uzyskano 8 dużych grup sprzężeń zawierających co najmniej 45 markerów
oraz kilkanaście drobnych grup liczących po kilka-kilkanaście loci. Dla ośmiu dużych grup sprzężeń
skonstruowano mapy genetyczne (rys.6) o długościach od 31,9 do 94,2cM (tab.3). Łącznie w obrębie
map sprzężeń znalazły się 764 markery SNP, a łączna długość utworzonej mapy to 480,4cM.
8
LG1
0
8538951_10:C>G
LG2
4213021_6:C>T
LG3
4208187_32:G>T
LG4
LG5
10524864_12:T>A
LG6
4212053_58:G>A
LG7
4218961_25:A>G
LG8
3045233_61:C>T
3609507_44:C>T
4214315_17:A>C
8539354_6:C>A
8512160_11:C>T
4212339_16:A>C
3047297_20:T>G
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
4549657_18:A>G
8512966_15:C>T
5
16312680_16:G>T
3041622_23:T>C
16312832_14:G>C
4219424_8:A>G
8510489_28:T>A
3622263_14:A>T
3611427_17:G>C
3617959_35:G>C
10522225_14:A>T
14477157_65:G>A
3041086_53:G>A
8538511_53:T>C
8516288_31:A>C
3041026_62:A>G
10518966_19:T>C
10523227_50:C>A
3603328_12:C>G
4362259_7:A>G
3624423_29:T>C
3041514_51:C>T
4220710_13:C>G
10517241_10:A>G
4208234_16:A>C
15998304_8:C>T
4207806_11:G>C
3048145_8:A>G
8510735_38:A>G
3044346_25:A>G
3617166_25:G>C
10519063_23:G>A
4203024_13:A>G
3611101_5:T>C
8517692_9:C>G
4217841_10:A>G 4207000_38:A>G
4342393_32:G>A
8537398_38:T>C
3044315_62:A>C 4348502_13:G>A
10519415_18:C>T
4215613_10:A>G 3045704_29:C>T
3617217_50:G>A 3042303_5:C>A
4200663_33:G>A
3616842_19:A>C 3042965_20:A>G
4347372_24:G>T 4575372_8:G>C
8511166_22:C>G 3623032_15:A>G 14478834_6:T>C
10519051_13:C>G
4571663_10:G>C 8539354_8:A>G 4211342_7:G>T 3046092_19:C>G 3618272_15:A>G
3617710_34:G>T 4369666_15:G>C
3047463_19:A>G 4210781_36:C>A
3045391_19:T>C 3618383_9:A>C 10525042_9:C>G 3622899_6:C>T 3610105_6:G>C
3043425_5:A>G 4368451_27:C>A 8538573_12:T>C 4354861_11:A>G 10511726_24:A>C
3044845_12:C>G 3619651_13:T>C 4206613_10:G>T 3625140_6:C>T 15997813_16:G>C
15998360_8:T>A 8537837_5:T>A
3611574_10:C>T 4219369_58:A>G
16312244_18:T>A 3041825_25:C>G 4344553_23:G>A
4202107_11:G>A
3047764_31:C>A 3617375_40:A>G 3041326_19:G>A
4563805_22:C>T 3042961_7:A>G
3043873_22:A>G
10516342_13:A>G
3041189_8:G>C
3044673_31:T>C 3046856_12:C>A
8537930_25:A>G
3616949_23:C>G
4205848_9:A>G
16312215_22:C>G 3618513_15:A>G
11911058_30:A>C
8510207_8:T>G
3623802_11:G>A
3041044_49:T>A
3047292_6:T>A 3045127_34:C>T
3042073_41:C>T 3042073_33:C>G
3045127_51:G>C
4203614_12:G>A
14479864_13:C>T
14479864_5:C>T
4209793_6:G>C
4367388_15:C>G
4347548_19:G>C
3047946_40:C>G
3623653_11:T>G
3620196_5:C>G
10518960_11:A>T
3606689_14:A>T
8511009_11:A>G
4204931_20:A>G
8511185_9:T>C
3623153_33:A>G
4370374_18:G>T
4213087_33:C>G
3622878_37:T>G
3622878_44:T>C
4202106_6:C>T
3045703_49:A>C
10519168_20:C>T
4207037_38:A>G
4349257_17:A>G
8512333_20:G>A
8535017_16:T>A
3047554_29:A>G
3042504_52:A>G
3042171_27:C>G
4202187_32:T>C
3046975_17:T>G
3610735_41:T>C
8511737_25:T>C
3047808_26:C>G
3046975_40:C>A
8537175_17:C>T
4205456_6:G>C
8537908_12:T>C
4218829_19:A>G
4340756_23:G>A
3619871_8:C>T
14475647_21:C>G
3607106_35:A>G
4371047_65:T>C
10524548_11:G>C
8538651_31:C>G
16312343_25:A>C
3617287_19:T>C
10522677_27:T>C
3045905_47:A>G
4219596_14:A>C
4210679_32:T>C
3625011_21:T>C
3047529_20:G>A
3040921_60:A>C
4342038_5:A>G
3047727_36:T>C
4221278_37:C>T
3619158_8:G>A
4364754_12:T>C
3046799_22:T>A
3041102_35:A>G 3043509_20:A>C
4205389_46:A>G
3604216_15:G>C 8536437_18:A>C
4552146_10:G>A
3041231_29:T>C 4575260_25:C>G
4573256_16:C>T
4368818_23:T>C
3047529_25:T>C 3045590_25:T>G
4211590_9:A>T
4346310_8:G>A
3047221_41:G>A 3604539_35:A>G 4342007_27:A>G 4347120_7:A>C 4572685_9:A>G
10521022_6:T>A
3044867_12:C>T
10521132_14:C>T 4342269_7:G>C 4200832_19:T>C 4201336_26:A>C 3603528_29:T>C
3042234_12:C>T 3044936_17:C>G 8536350_23:A>T 3047857_37:C>G 4353711_20:C>G
3047899_35:C>G 4200444_9:C>T 3044678_40:G>C 4371015_53:C>T
8533004_17:G>A 8512710_36:C>A
10516609_18:T>C 3617026_31:A>C
3619660_7:T>C 3040724_7:T>G
11911735_8:C>G 4353143_26:T>G
3615632_14:C>T 3625231_6:C>G
3042370_13:C>T 4357404_68:C>T
4551347_5:T>C 4205347_30:A>G
4203814_14:C>T
3048262_9:A>G
8510996_15:A>C
4202758_7:A>G
10525198_21:A>T
3047796_8:C>G
3606355_39:T>C
8531078_17:T>C
8539278_7:C>G
4217372_8:A>G
3048250_15:A>G
4215292_14:C>A
4208670_14:T>C
3044258_16:G>A
8510431_10:A>G
3611291_10:C>A
3048011_26:G>A
4210059_17:G>C
4210122_32:G>A
10522168_8:T>G
3045085_65:C>G
4206239_7:T>C
60
65
3613016_35:C>A
16312243_13:G>C
11910494_53:A>T
16312333_9:T>A
75
80
85
90
4361717_19:A>G
3045177_28:T>C
4342127_6:A>G
4340589_28:A>G
4343039_15:G>A
3612871_13:G>C
10524685_16:T>C
4370510_37:G>T
8537234_28:A>C
3045066_33:C>T
4339290_10:G>C 3616313_24:A>C
4367415_13:A>G
10519092_13:T>C
3606939_25:T>C
3047485_47:C>G
8511829_24:G>C
3621357_27:A>C
3045512_22:A>G
4202645_30:G>T
4358372_13:T>G
3608065_49:A>T 4210976_22:T>C
4344257_17:C>A
4353813_13:G>A
3620641_19:G>A
4340365_28:A>G
4219847_22:A>C
3607044_45:G>A
10511507_5:T>A
3614498_16:G>A
3624664_16:G>C
16312306_14:A>G
3607337_26:A>T
4208601_31:A>C
3617902_6:T>C
3604799_30:G>A
3615183_28:A>G
11912927_19:A>G
11912927_8:G>C
4345775_10:A>G
3048139_23:A>C
3611288_54:G>C
4553084_8:C>G
8539387_11:G>T
8539386_8:C>G
3046992_5:C>T
3624218_10:C>T
3617325_25:C>T
4339213_14:T>C
4211205_14:A>G
3046552_16:C>G
3619022_10:T>C
4214835_17:C>T
3046741_68:A>G
4217789_41:C>T
3041297_39:A>G
4204780_19:G>T
3040806_35:C>A
8512948_7:A>G
8539759_14:C>T
4215973_46:A>G
3047761_24:A>G
8512948_46:C>G
4352433_23:T>A
4204669_7:G>C
3042064_49:A>C
8511445_44:A>G
8531064_13:G>C
4552728_33:T>C
3041104_46:G>A
4369083_38:C>T
8537838_13:T>G
4219787_10:C>A
10519011_9:G>C
3617083_24:G>T
3048194_29:T>C
4368184_26:A>G
3047507_31:C>T 4564710_61:T>C 3044419_9:G>A
3046073_6:T>C
4355049_62:A>G
15997416_6:T>C
4368078_35:C>T
4571321_25:G>A 10514413_61:C>G
3041018_66:G>C 4357859_31:G>A
4367812_25:G>A 4213504_14:A>T 3041629_34:T>C 4568294_11:C>T 3046950_25:C>T
4575270_26:A>C 4560129_6:A>G 3608446_7:T>C 3042365_10:A>G 3620012_7:A>G
8512600_17:A>G 4362246_19:C>T
4360736_18:G>A 8536247_12:T>C
4373393_5:A>G
4362248_44:C>T
4204635_9:G>A
3043759_29:C>A
4364182_15:A>G
4219627_19:A>G
4339935_5:T>A
3610348_12:G>C
8530950_57:C>G
4367026_7:A>C
4341029_11:T>C
4567845_11:T>C
4569602_22:T>C
4346295_22:A>G
4566252_29:C>T 8512717_17:C>G
3045344_61:C>G
10524688_21:A>G
4208011_24:C>G
3046817_30:A>G
4210132_27:C>G
4369685_27:C>T
4348422_29:C>T
3620274_17:A>G
4204544_13:G>A
4343503_25:T>C
8510396_17:C>G
4363114_8:G>A
8510473_10:G>C
4353384_28:G>A
3616413_6:T>C
3621359_18:G>A
16312295_12:T>C
16312491_15:A>G
4340193_17:G>C
4221305_44:G>C
3622989_22:G>C
3622989_13:G>C
3622989_37:A>G
3047568_19:A>C
4340576_53:A>G
3048114_23:G>T
4363445_8:C>G
4547679_25:C>T
8512935_16:C>G
10523094_12:A>G
4215779_18:A>C
4343218_11:G>A
16312659_14:G>C
8511223_10:C>G
3048057_31:C>G 4351620_21:G>C 16312648_7:G>A 4221452_11:T>C
10514725_50:C>T
8510197_16:G>A
4215309_17:A>G
4354843_14:A>T
4371101_20:C>T
3624894_10:C>G
4213788_12:C>T
14478219_9:T>G
4221210_26:T>G
3045079_22:C>T
3040662_15:A>G
3042505_36:G>C
4557612_5:A>C
4564642_68:A>G
4367928_37:G>T
4366468_6:T>C 4556833_20:T>A
3041340_28:A>C
4217392_13:C>A
4221534_40:C>A
8512814_12:A>C
4212490_37:C>T
4202933_27:A>G
3616689_13:G>C
3619869_32:T>G
3612608_22:C>T
4370286_44:A>G
3046890_31:C>A
8538257_8:C>T
4206831_44:T>C
3047671_15:A>G
4212343_27:C>G
3048031_11:G>A
3617743_50:A>C
4355584_5:C>A
4212794_16:T>C 4211220_19:C>T
3047454_19:C>T
3040580_25:A>G
4210134_18:G>C 4366507_16:T>C 4548539_15:A>G 4575569_10:C>T
3040723_18:A>G
8512614_39:G>A 3615395_22:T>C
4342423_11:A>G
4343385_18:C>A
4212020_42:T>C
3624487_15:C>T 10519333_6:A>G
3042687_15:T>C
4212295_19:C>G
4340530_27:C>T 4210082_47:C>T
3610016_43:T>A
3623013_19:T>C
3618084_36:C>T
3040595_6:T>G
4345313_8:A>C
3604406_25:G>A 3046519_44:T>C
11911003_7:T>G
4348918_18:A>G
3045769_35:A>G
4214702_5:T>C
4218361_21:T>C
3047013_24:A>G
3618092_28:C>G
3617523_53:A>C
4208590_10:G>C
4205403_9:C>T
8511739_8:C>T
3044130_33:G>T
3042835_19:C>T
3042907_7:G>A
4204460_27:A>C
16312292_12:T>A
4549292_19:C>T
3040586_57:T>C
8536541_14:C>A
3041155_36:C>G
4367451_61:C>T
3042419_40:T>C
4358449_7:C>G
4207143_63:T>C
3047943_18:A>G
3047237_6:G>C
8539390_38:A>T
4208448_22:G>C
4212826_13:T>C
4216046_37:G>A
4217148_40:C>T
8512709_22:A>G
4553698_5:C>T
4213719_7:T>C
8538037_22:C>T
16312574_16:A>T
4216126_39:T>C
4367223_34:A>G
4560101_20:G>A
4216126_21:A>C
4555706_5:T>A
4561171_8:A>T
4209476_46:T>C
4212227_5:A>C
8510353_5:A>C
4357171_47:G>A
11912166_7:C>A
3043908_17:A>G
3043908_29:C>G
3616719_10:G>C
3623848_11:G>A
4545800_5:T>C
15997797_17:G>A
4202645_31:C>T
3047281_36:A>T
3620552_7:C>G
16312654_8:A>G
3605924_20:T>A
4348506_15:G>A
3041303_52:T>C
3623424_34:C>T
4550280_9:T>A
4212239_15:T>C
4212280_33:T>G
8512625_12:C>T
10519787_27:G>A
3042723_38:T>C
4344372_11:G>A
15997814_10:C>T
3604726_62:G>A
4219728_25:C>T
3047631_38:A>G
3614972_26:T>C
10521034_38:T>C
3603956_15:A>G
3042672_27:T>C
4340816_8:C>G
8532704_9:T>C
8538747_39:G>A 3043840_55:C>A
10525106_18:T>C
15998513_23:A>G
4356888_7:T>C
4210501_38:T>C 4370259_26:T>C
4213198_16:T>C 8538596_19:T>C
11912736_23:T>A
4220608_24:A>T 10525105_6:A>G
16312582_21:A>G 16312703_14:A>C 4353195_12:C>T
3606714_6:A>G 3046387_9:T>C 14476270_14:A>G
4339518_18:C>T 3043506_20:A>G 3047970_39:T>A
14477633_17:G>A 8538179_23:C>T
70
3609380_16:G>A
8510321_7:A>C
3041841_28:G>C 4569772_14:G>C 4348674_26:T>G 16312395_13:A>G 8512930_23:T>C
8536517_14:T>G 3610261_27:T>C 3617118_68:A>C 3608894_37:C>G 4571111_26:C>G
3040881_17:A>T 3618494_31:A>C 3047638_24:C>G 3041515_66:A>G 4203067_18:G>T
14476264_16:T>A 4364718_26:A>T 4203922_8:G>C 3616028_17:C>T 14476307_17:A>T
16312632_10:C>G 8511607_8:A>G 4215614_26:A>G 4210971_29:T>C
3623678_7:C>T 8512930_22:T>C 4209605_41:A>T
8538213_38:G>C 4356436_10:T>C 4341658_18:G>A
3041108_57:T>C 8533125_8:C>A
4203206_56:A>G 3621876_27:A>G
3605448_7:C>G 4341579_9:A>T
4203632_49:C>G
4545701_11:T>G
4552026_44:T>C
3043609_17:A>G 3621876_18:C>G
4204834_35:C>T
4210230_41:A>T
4214032_18:C>G 4367092_15:T>G
3048061_17:A>G
4206307_24:T>C
4212501_23:A>G
3607671_64:G>A
3616757_38:G>C
4364341_9:G>T
3608152_8:T>C 3608152_58:A>G
3616663_27:A>C
8510348_7:G>C
4213274_21:G>A
3616795_10:T>C
4201765_5:C>G
11912572_8:C>G
3616260_18:C>T
3607931_30:G>T
11912572_10:G>C
3622526_34:C>T
4211171_31:A>G 4345430_16:G>C 4554178_14:G>C
4562450_20:C>T
3047026_6:T>C
8537970_22:A>G
3615526_28:G>T
11911774_13:T>G
3615090_10:A>G
3615405_12:C>A
3604205_35:A>G
4339658_55:T>C
3044696_12:C>T
4213658_44:A>T
3040564_52:C>G
3048188_20:G>C
4342245_19:C>T
4203432_31:G>A
4209536_23:T>C
4205253_5:G>A 16312399_8:C>G
4352882_17:T>C
3046560_8:T>C
4566513_31:G>T
3609381_24:A>G
3605947_5:G>C
3617277_15:G>A
3047898_32:A>C
4201926_21:A>G
3622843_45:G>C
8538038_15:C>T
4211525_8:A>G
3045453_17:A>C
3040766_12:A>C
3044368_15:C>G
4221592_20:G>C
4546612_20:T>G
3607876_46:T>C
3620347_17:T>C
3606416_67:C>G
3040971_16:T>C
3041968_45:C>T
4201265_29:G>C
3045465_31:T>G
3604764_20:A>G
4350979_31:G>A
4201444_40:G>C 10523542_14:G>A
10523542_24:T>C 4207462_15:A>G
4342410_7:C>T
3620422_31:A>G
4209686_53:T>C
3041276_54:G>A
3045539_18:A>G
3040810_42:C>T
4559398_16:C>G
3043172_11:G>T
3610638_16:G>C
8537576_8:G>T 3048043_34:C>G
14468834_21:C>A
3046310_27:A>G 3614149_18:G>A 4216356_10:A>G 3041094_51:T>C 3046571_21:G>A
3043285_32:T>C 15998167_20:T>C 4204480_26:G>C 3042679_7:A>G 3041073_29:T>C
3041596_20:C>G 4204479_28:A>G 4219493_15:G>A 3040826_20:C>A
4203329_13:T>C
3042613_14:C>A 3040711_42:G>C 4344834_17:G>C
3610970_53:C>T
4218437_16:G>T
4211811_31:A>G
8510178_5:A>G 3041407_31:C>T
4346853_16:G>C
3046717_15:C>T
8511649_19:A>T
4342343_17:A>G
8511722_29:A>G
3040688_10:C>T
3048220_5:T>C
3044677_7:A>G
3620241_14:G>A
3048244_31:C>T
4206515_8:T>A
3040907_61:G>A
3623190_29:A>C
8512382_15:C>G
10516319_15:C>A
10523814_14:G>A
3046432_29:A>T
3046190_18:A>G
4339987_6:C>T
3612726_35:C>G
10516838_30:C>A
11911015_8:T>C
3041107_24:A>C
4345704_49:T>C
10503549_15:C>A
4570680_9:T>C
4569396_11:C>G
10525350_7:A>G
4548031_40:G>A
3040870_56:C>T
10523035_18:G>T
8535819_18:C>T
4217266_43:A>G
3046432_49:T>A
Rys. 6. Mapa genetyczna ośmiu grup sprzężeń markerów SNP-DArTseq w populacji [CMS19P x Bolero]F2
Tabela 3
Charakterystyka grup sprzężeń utworzonych w obrębie populacji mapującej [CMS-19P x
Bolero]F2
Grupa sprzężeń
1
2
3
4
5
6
7
8
Ogółem
Liczba markerów
Długość mapy (cM)
157
86
147
143
81
52
52
46
764
50,3
31,9
87,7
94,2
50,2
56,7
45,4
64,0
480,4
Przypuszczalny
fragment
chromosomu
5R (1R)
Brak danych
6B
6R
2R
5R
7R (3B, 5B)
7B (5R)
Ocena fenotypowa liczących po około 100 osobników populacji F2 pszenżyta z czterema źródłami
CMS (CMS-V, CMS-A, CMS-T i CMS-P), w których uniwersalnym restorerem był ród DAD182/00
ujawniła zróżnicowanie w obrębie każdego z badanych obiektów (rys.6-9). Ogólnie – najmniej liczną
kategorią fenotypową były rośliny z przywróconą w pełni płodnością (oceniane na 5 w skali
bonitacyjnej wg Góral 2002). W mieszańcach z CMS-V i CMS-A nie było takich roślin w ogóle (rys.
6 i 7), przy obecności cytoplazm CMS-T i CMS-P (rys. 8 i 9) były to pojedyncze osobniki. W
cytoplazmach CMS-V i CMS-T najliczniejszymi kategoriami fenotypowymi były formy całkowicie
męskosterylne, podczas gdy w pozostałych dwóch cytoplazmach najczęściej pojawiały się osobniki
częściowo płodne.
9
35
30
25
20
15
10
5
0
33
31
CMS-V
27
10
0
1
2
3
4
5
Płodność (skala 5-stopniowa)
Rys. 6. Wyniki oceny męskiej płodności u mieszańca F2 pszenżyta z cytoplazmą CMS-V
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
40
CMS-A
26
27
8
0
1
2
3
4
5
Płodność (skala 5-stopniowa)
Rys. 7. Wyniki oceny męskiej płodności u mieszańca F2 pszenżyta z cytoplazmą CMS-A
10
50
CMS-T
46
40
30
24
20
13
13
10
4
0
1
2
3
4
5
Płodność (skala 5-stopniowa)
Rys. 8. Wyniki oceny męskiej płodności u mieszańca F2 pszenżyta z cytoplazmą CMS-T
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
CMS-P
39
27
21
12
1
1
2
3
4
5
Płodność (skala 5-stopniowa)
Rys. 9. Wyniki oceny męskiej płodności u mieszańca F2 pszenżyta z cytoplazmą CMS-P
Wyniki tej wstępnej oceny zmienności fenotypowej w obrębie mieszańców z czterema typami
cytoplazmy pozwoliły na podjęcie decyzji o założeniu więszego doświadczenia polowego w dwóch
lokalizacjach (Szczecin i Kraków), gdzie w kolejnym sezonie wegetacyjnym planowane jest zebranie
danych fenotypowych niezbędnych do mapowania porównawczego genów restorerowych.
11
Dyskusja (opisać jak w publikacji)
Wyniki oceny męskiej płodności roślin pochodzących z różnych mieszańców pszenżyta
wskazują na dość złożony mechanizm dziedziczenia tej cechy. W populacjach F2 pojawiały się rozkłady
o różnych kształtach od zbliżonych do normalnego po typowo bimodalne. Złożony charkater
dziedziczenia przywracania płodności w systemach CMS pszenżyta był wcześniej opisywany (Góral i
in. 2010). Niewiele wiadomo o lokalizacji genów odpowiadających za przywracanie płodności. Analizy
cytogenetyczne wskazywały na obecność genów restorerowych na chromosomach 4R i 6R (Curtis i
Lukaszewski 1993). Wyniki mapowania wykonanego na jednej populacji mapującej potwierdzały
znaczenie chromosomu 6R z jednoczesnym wskazaniem, że na chromosomach 6A i 6b też są
zlokalizowane geny przywracające płodność (Stojałowski i in 2013). Uzyskane wyniki opisane powyżej
stanowią kolejne potwierdzenie znaczenia chromosomu 6R, ale sugerują jednocześnie, że jest tu
zlokalizowany tylko jeden z co najmniej kilku genów regulujących przywracanie męskiej płodności u
pszenżyta.
Dotychczas skonstruowano niewiele pełnych map genetycznych pszenżyta. Pierwsze mapy dla
pojedynczych populacji mapujących, które zaczęły się pojawiać na początku obecnej dekady były
przeważnie niekompletne (nie obejmowały wszystkich chromosomów w całości (Tyrka i in. 2011;
Stojałowski i in. 2013). Jedynie w pracy Alheit i in. (2011) opartej o markery DArT, w której mapa
została utworzona w wyniku integracji danych z pięciu populacji mapujących, mapa pszenżyta jest
kompletna. Niestety użyte w pracy markery DArT (markery otrzymywane techniką mikromacierzy) nie
były analizowane w populacji [CMS-19T x Bolero]F2, gdyż użyto bardziej efektywnej techniki
DArTseq (bazującej na nowych metodach sekwencjonowania NGS). Markery tego typu zostały ostatnio
użyte do skonstruowania nowej mapy genetycznej pszenżyta (Tyrka i in. 2015), która okazała się bardzo
pomocnym narzędziem przy identyfikowaniu lokalizacji chromosomowej utworzonych grup sprzężeń.
Wnioski (opisać jak w publikacji)
Przywracanie męskiej płodności u pszenżyta znajduje się pod kontrolą większej liczby genów o
stosunkowo słabym działaniu. Tego rodzaju geny są trudne do zlokalizowania na mapach
chromosomowych.
Chromosom 6R u pszenżyta zawiera geny restorerowe, ale siła ich działania nie jest wystarczająca do
pełnego przywracania męskiej płodności.
Temat badawczy 2
Identyfikacja przydatnych dla hodowli markerów molekularnych wykazujących sprzężenie z
genami kontrolującymi męską płodność u pszenżyta z cytoplazmami T. timopheevi, CMS-Pampa.
Weryfikacja skuteczności tych markerów w obrębie różnych genetycznie mieszańców.
Cel: Zaprojektowanie starterów PCR pozwalających na rozpoczęcie poszukiwań przydatnych
w hodowli markerów wykazujących sprzężenie z głównymi genami kontrolującymi męską
płodność u pszenżyta z cytoplazmami T. timopheevi i CMS-Pampa – cel zrealizowany.
Materiały i metody (opisać jak w publikacji)
Realizacja zadania jest oparta o dane otrzymane z genotypowania populacji mapującej
wykonywanego w zadaniu 1. Na podstawie danych sekwencyjnych uzyskanych z analiz
DArTseq (komercyjny wariant metody GBS) wykonanych przez firmę Diversity Arrays
Technology Pty. oraz sekwencji dostępnych w bazach danych, które zlokalizowane są w
obszarach zainteresowań zaprojektowano w 2016 roku 20 par starterów. Markery otrzymane
metodą PCR z użyciem tych starterów oceniono pod kątem wykrywania polimorfizmu DNA
pomiędzy formami rodzicielskimi populacji mapujących.
Przed przygotowaniem reakcji PCR, uzyskane izolaty DNA rozcieńczano wodą MilliQ do
uzyskania stężenia końcowego 10 ng/μl.
Mieszanina do reakcji PCR zawierała:
-
12,3 µl H2O
-
2,0 µl 10 x bufor PCR [Fermantas]
-
2,0 µl MgCl2 (25 mM) [Fermantas]
-
0,5 µl dNTP (10 mM) [Fermantas]
-
0,5 µl starter forvard (10 μM) [Proligo]
12
-
0,5 µl starter reverse (10 μM) [Proligo]
-
0,2 µl polimeraza Taq (5U/µl) [Fermantas]
-
2,0 µl DNA
Amplifikacje prowadzono w termocyklerze firmy Eppendorf, a profil temperaturowy reakcji
przedstawiał się następująco:
- początkowa denaturacja
94°C/30s
- denaturacja
94°C/30s
- przyłączenie starterów
40°C/1min
- amplifikacja DNA
72°C/2min
- końcowa amplifikacja DNA
72°C/10min
- chłodzenie
4°C
35x
Sprawdzenie wydajności amplifikacji przeprowadzono na 2% żelach agarozowych zawierających
bromek etydyny. Właściwą weryfikację długości amplifikowanych fragmentów (wykrywanie
niewielkich różnic w wielkości amplikonów) przeprowadzono rozdzielając produkty PCR w 10% żelach
polikryloamidowych w buforze 1xTBE przy natężeniu pola 10 V/cm przez 5 h. W celu wizualizacji
produktów reakcji wykonano barwienie żelu (30 min) w roztworze bromku etydyny o stężeniu 0,5 μg/1
ml i podświetlanie światłem UV.
Wyniki (opisać)
Markery PCR otrzymywane w wyniku amplifikacji z użyciem starterów zaprojektowanych do
sekwencji otrzymanych jako wynik analizy techniką DArTseq nie ujawniały polimorfizmu
genetycznego w badanym materiale. Z uwagi na fakt, że fragmenty amplifikowanego DNA były
bardzo krótkie nie było możliwości zaprojektowania innych wersji starterów lub wykorzystania
enzymów restrykcyjnych, które mogłyby pomóc w uzyskaniu polimorficznych markerów. Wśród
badanych markerów część została zaprojektowana w oparciu o znaną lokalizację genu restorerowego
na chromosomie 6R. Sekwencje DNA żyta zdeponowane w bazach danych NCBI oraz GABI wybrano
na podstawie ich lokalizacji i zaprojektowano dodatkową serię starterów. Niestety markery te również
okazały się w większości monomorficzne lub startery nie inicjowały amplifikacji, albo też generowały
produkty mało specyficzne. Dokładna analiza porównawcza wielkości amplikonów u form
rodzicielskich CMS-19T, CMS-19P oraz Bolero (populacje użyte do konstruowania map sprzężeń w
temacie badawczym 1) wykazała polimorfizm w przypadku 6 markerów: SWES 131, SWES, 135,
SWES 188, SWES 204, SWES 209 i SWES 217 (tab.4). Spośród nich tylko dwa ostatnie ujawniały
różnice pozwalające na zastosowanie ich do mapowania porównawczego dla obu badanych populacji
mapujących (wykryte różnice dotyczyły linii ojcowskiej oraz obu wariantów linii matecznej). Niestety
wykryte różnice w wielkości produktów są niewielkie (poniżej 10 nukleotydów), w związku z czym
wymagają wykonywania analiz w żelach poliaryloamidowych.
13
Tabela 4.
Wyniki analiz PCR dla 20 markerów
Startery
SWES 1 (f/r)
SWES 3 (f/r)
SWES 12 (f/r)
SWES 19 (f/r)
SWES 48 (f/r)
SWES 71 (f/r)
SWES 131 (f/r)
SWES 135 (f/r)
SWES 149 (f/r)
SWES 166 (f/r)
SWES 180 (f/r)
SWES 184 (f/r)
SWES 188 (f/r)
SWES 195 (f/r)
SWES 204 (f/r)
SWES 207 (f/r)
SWES 209 (f/r)
SWES 217 (f/r)
SWES 250 (f/r)
SWES 251 (f/r)
Oczekiwany produkt
[pz]
Obserwowany produkt
[pz]
CMS-19T
Bolero
CMS-19P
300
300
300
170
170
170
189
189
189
295
295
295
178
178
178
282, 239
239
282, 249, 239
404
413
413
250
250
250
100
100
100
248
248
248
270
270
270
274
270
269, 239, 234
269, 231
234
249, 239
249, 239
249, 239
306
315
306
182
188
182
-
300
170
280
215
300
178
290/285
404
275
100
242
242
309
238
260
265
300
145
275
640
Dyskusja (opisać jak w publikacji)
Pszenżyto należy do gatunków uprawnych, które mają zauważalne znaczenie w skali globalnej,
a w gospodarce rolnej krajów Europy Środkowej należą do najważniejszych zbóż. Pomimo tego, wiedza
na temat genetyki pszenżyta jest wciąż bardzo ograniczona. Pierwsze mapy genetyczne pszenżyta
zaczęły powstawać dopiero w ostatnich latach (Tyrka i in. 2011; 2015; Alheit i in. 2011; Stojałowski i
in. 2013) i w wielu przypadkach nie obejmowały całego genomu. Jest to o tyle zaskakujące, że mapy
genetyczne gatunków rodzicielskich pszenżyta: pszenicy i żyta znane są już od ponad 20 lat. Można
przypuszczać, że problem z analizami pszenżyta wynika z jednej strony z jego mniejszej stabilności
cytogenetycznej, a z drugiej strony z ograniczonej zmienności genetycznej – pszenżyto jest gatunkiem
nowym i nie było dość czasu, aby naturalna zmienność wynikająca ze spontanicznych mutacji mogła
się znacząco rozwinąć. Stąd też trzeba się liczyć z ograniczoną efektywnością prac badawczych
zmierzających do otrzymania przydatnych w hodowli pszenżyta markerów DNA. W czasie
przeprowadzonych badań uzyskano tylko dwa markery przydatne do mapowania porównawczego
genów restorerowych. Oba markery wymagają wykonywania analiz w żelach poliaryloamidowych, co
ze względu na pracochłonność ogranicza ich przydatność dla komercyjnej hodowli.
Wnioski (opisać jak w publikacji)
Bezpośrednie wykorzystanie sekwencji markerów DArTseq do projektowania markerów PCR nie
przyniosło pozytywnych rezultatów – nie uzyskano markerów polimorficznych.
Wykorzystanie dostępnych baz danych o sekwencjach DNA roślin zbożowych pozwala na uzyskanie
polimorficznych markerów PCR o potencjalnej przydatności w pracach hodowlanych, ale efektywność
tego rodzaju działań nie jest wysoka.
14
Temat badawczy 3
Ocena różnic pomiędzy genomami mitochondrialnymi i próba identyfikacji czynników
wywołujących męską sterylność u pszenżyta z różnymi cytoplazmami
Cel: przygotowanie materiału biologicznego do oceny różnic pomiędzy genomami
mitochondrialnymi pszenżyta z cytoplazmami T. timopheevi i CMS-Pampa – cel zrealizowany.
Materiały i metody (opisać jak w publikacji)
Badania w 2016 roku polegały na namnożeniu nasion męskosterylnych wersji linii CMS-Salvo
15/1 z cytoplazmą T. timopheevi oraz linii 19 z cytoplazmami T. timopheevi oraz CMS-Pampa,
jak również ich męskopłodnych analogów. Z uzyskanych nasion wytworzono etiolowane kiełki
zawierające różne cytoplazmy: normalną (partie kiełków oznaczone N13 i N15), CMSTimopheevi (T13 i T15) oraz Pampa (P13 i P15).
Izolacja mitochondriów
1. Około 20 g etiolowanch 1-tygodniowych kiełków homogenizowano blenderem kuchennym w
180 ml buforu homogenizacyjnego.
2. Homogenat przefiltrowywano przez pojedynczą warstwę tkaniny do kolby. Uzyskany filtrat
przelewano do butelki wirowniczej o poj. 250 ml. Wypełnione butelki równoważono, a
następnie wirowano przez 10 minut przy 2 300 rcf (rotor Sorvall F16-250).
3. Nadsącz przelewano do nowych butelek wirowniczych o poj. 250 ml, które równoważono i
wirowano przez 20 minut przy 20 600 rcf (rotor Sorvall F16-250).
4. Uzyskany osad zawieszano w 10 ml buforu do DNazy. Do zawiesiny dodawano 100 µl 1 M
MgCl2 oraz 94 µl r-ru DNazy [5 mg DNazy I (Sigma DN25) + 500 µl buforu do DNazy]. Całość
inkubowano w 4°C przez 45 minut mieszając zawartość butelki co 15 minut.
5. Po inkubacji do mieszaniny dodawano 45 ml buforu stopującego i wirowano przez 20 minut
przy 20 600 rcf (rotor Sorvall F16-250).
6. Nadsącz usuwano, natomiast osad zawieszano w 1 ml medium Y. Uzyskaną zawiesinę
nakładano na skokowy gradient Percollu:
7. Gradienty wirowano przez 20 minut przy 18 000 rcf (rotor Sigma 12148-H).
8. Po wirowaniu pipetą usuwano górne frakcje gradientu zanieczyszczone plastydami, a następnie
pipetą ustawioną na 200 µl odbierano około 600 µl frakcji mitochondriów do probówki o poj.
1,5 ml. Do odebranej zawiesiny mitochondriów dodawano 1 ml medium Y, całość mieszano
przez kilkukrotne odwrócenie probówki i wirowano przez 20 minut przy 18 000 rcf (rotor Sigma
12148-H).
9. Po usunięciu nadsączu osad mitochondriów zamrażano w ciekłym azocie, a następnie
umieszczano w zamrażarce w -80°C.
Wszystkie wirowania wykonywano w temp. 4°C. Poza wirowaniami i inkubacją z DNazą próby
były przetrzymywane w lodzie.
Posłużyła ona do wyizolowania i oczyszczenia DNA mitochondrialnego wg następującej metodyki:
Izolacja mitochondrialnego DNA (mtDNA)
Izolację mtDNA wykonano przy użyciu zestawu Qiagen Plant Mini Kit, w którym oryginalne
kolumny adsorpcyjne zastąpiono kolumnami typu III firmy Dongsheng Biotech.
1. Zamrożone osady mitochondriów rozpuszczano w 400 µl buforu AP1, a następnie próby
inkubowano w 65°C przez 10 minut. Nie dodawano RNazy.
2. Do preparatów dodawano 130 µl buforu AP2, zawartość probówek mieszano na worteksie,
a następnie próby inkubowano w lodzie przez 5 minut.
3. Próby wirowano przez 5 minut przy 18 000 rcf.
4. Nadsącz odbierano do nowych probówek o poj. 1,5 ml i ponownie wirowano przy takich
samych parametrach (w odebranym nadsączu były widoczne zanieczyszczenia).
15
5. Nadsącz odbierano do nowych probówek o poj. 1,5 ml i dodawano 1,5 objętości buforu
AP3. Zawartość probówek mieszano przez pipetowanie, a następnie nakładano na kolumnę
adsorpcyjną i wirowano przez 1 minutę przy 8 000 rcf.
6. Kolumny przepłukiwano dwukrotnie 500 µl buforu AW, po każdym płukaniu wirując je
przez 1 minutę przy 8 000 rcf, po czym kolumny suszono wirując je dodatkowo przy 18
000 rcf przez 5 minut.
7. Elucję wykonywano dwukrotnie 40 µl buforu TE. Po nałożeniu buforu kolumny
inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przez 1 minutę
przy 8 000 rcf.
8. Probówki z roztworem mtDNA umieszczano w zamrażarce w -20°C.
Oczyszczanie mitochondrialnego DNA
Oczyszczanie mtDNA wykonywano przy wykorzystaniu roztworów sporządzonych we
własnym zakresie na podstawie składu odpowiednich roztworów z zestawu Wizard SV Gel
and PCR Clean-Up System firmy Promega. Do oczyszczania wykorzystywano kolumny
adsorpcyjne typu III firmy Dongsheng Biotech. Przed oczyszczaniem pulowano próby z I i
II elucji danego preparatu DNA.
1. Do 70 µl spulowanych prób mtDNA dodawano 7 µl RNazy A (10 µg/ml, Sigma R4875).
Próby inkubowano przez 1 godzinę w 37°C.
2. Do preparatów dodawano Membrane Binding Solution (w stosunku 1 : 1 v/v) i całość
dokładnie mieszano przez pipetowanie. Otrzymaną mieszaninę nakładano na złoże
krzemionkowe kolumn i kolumny inkubowano przez 1 minutę w temp. pokojowej.
3. Kolumny wirowano przez 1 minutę przy 16 000 rcf.
4. Kolumny przenoszono do nowych probówek zbiorczych. Dodawano 500 µl Membrane
Wash Solution i wirowano przez 1 minutę przy 16 000 rcf.
5. Kolumny przenoszono do nowych probówek zbiorczych. Dodawano 500 µl Membrane
Wash Solution i wirowano przez 5 minut przy 16 000 rcf.
6. Kolumny przenoszono do nowych probówek zbiorczych. Wieczka kolumn otwierano i
wirowano dodatkowo przez 1 minutę przy 16 000 rcf.
7. Kolumny przenoszono do nowych probówek o poj. 1,5 ml. Dodawano 40 µl 10 mM Tris
pH 8,0; inkubowano przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przez
1 minutę przy 16 000 rcf (I elucja).
8. Kolumny przenoszono do nowych probówek o poj. 1,5 ml. Dodawano 30 µl 10 mM Tris
pH 8,0; inkubowano przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przez
1 minutę przy 16 000 rcf (II elucja).
9.
Otrzymane preparaty mtDNA umieszczano w zamrażarce w -20°C.
Jakość wyizolowanych preparatów mtDNA oceniano na podstawie ich rozdziału elektroforetycznego
w 1% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny o stężeniu 1,33 µg/ml. Rozdział prowadzono
w buforze TBE przy natężeniu pola 4 V/cm przez 1,5 godziny. Na żel nakładano 3 µl preparatu
mtDNA z dodatkiem 2 µl buforu obciążającego (6x Loading Dye, Fermentas) oraz 7 µl wody.
Równolegle z preparatami mtDNA na żel nakładano 5 µl wzorca wielkości fragmentów DNA (1 kb
ladder, Dongsheng Biotech) oraz zróżnicowane ilości DNA faga λ.
Wyniki (opisać)
Do izolacji mitochondrialnego DNA (mtDNA) pszenżyta wykorzystano sześć partii kiełków: N13, P13,
T13, N15, P15 oraz T15.
W rezultacie przeprowadzonej izolacji mitochondriów oraz mitochondrialnego DNA uzyskano
próby o stężeniach DNA rzędu kilku ng/µl (rys. 11).
16
Rys. 11. Obraz elektroforetyczny uzyskanych preparatów mtDNA pszenżyta. Równolegle rozdzielano
wzorzec wielkości fragmentów DNA (M) oraz zróżnicowane ilości (10 – 450 ng) DNA faga λ (Thermo
Scientific SD0011).
W próbach tych odnotowano także obecność znacznych ilości rybosomalnego RNA. Z tego względu
próby mtDNA poddano obtrawianiu RNazą A i dodatkowej rundzie oczyszczania na kolumnach
adsorpcyjnych. Inspekcja oczyszczonych prób mtDNA (rys. 12) wykazała brak zanieczyszczeń
rybosomalnym RNA. Efektem ubocznym wykonanego doczyszczania było jednak obniżenie ilości
DNA w próbach – w większości z nich jest ono mniejsze niż 1 ng/µl. Szczególnie niskie wartości
koncentracji odnotowano dla próby N13 z I elucji (rys.12).
Pozostałe pięć izolowanych obiektów też charakteryzowało się niskim stężeniem, ale uznano, że
spełniają one kryteria niezbędne do wykorzystania ich do dlaszych badań na poziomie sekwencyjnym.
Rys. 12. Obraz elektroforetyczny oczyszczonych (obtrawianie RNazą A i II runda oczyszczania na
kolumnach adsorpcyjnych) preparatów mtDNA pszenżyta. Równolegle rozdzielano wzorzec wielkości
fragmentów DNA (M) oraz zróżnicowane ilości (10 – 450 ng) DNA faga λ.
Dyskusja (opisać jak w publikacji)
Izolacja DNA mitochondrialnego zbóż jest najefektywniejsza, gdy materiał biologiczny stanowią
etiolowane 10-14 dniowe kiełki (Tudzynski i in. 1986). Zastosowana w aktualnym projekcie metoda
izolacji dała bardzo dobre wyniki przy analizach cytoplazm żytnich i zaowocowała opracowaniem
pierwszych markerów diagnostycznych dla rodzaju cytoplazmy hodowlanej u żyta (Stojałowski i
in. 2006). Pewnym zaskoczeniem były problemy z uzyskaniem preparatów mtDNA pszenżyta o
zadowalającej czystości. Dodatkowa runda oczyszczania spowodowała, że koncentracja DNA
została znacząco obniżona w finalnych preparatach, ale dla 5 obiektów pozostaje wciąż w granicach,
które pozwalają na użycie otrzymanych ekstraktów do sekwencjonowań wysokoprzepustowych
nowej generacji (NGS). Obecnie do uzyskania biblioteki DNA w systemie firmy Illumina (jeden z
wariantów NGS) wystarcza nawet 1 ng DNA (informacja od Emily Kumimoto z Genome Center,
University of California-Davis). Biorąc pod uwagę możliwość łączenia prób reprezentujących tą
samą cytoplazmę, ilości mtDNA jakie zostały zabezpieczone są rzędu kilkudziesięciu nanogramów.
Wnioski (opisać jak w publikacji)
Uzyskano i zabezpieczono 5 prób mtDNA reprezentujących trzy cytoplazmy pszenżyta
(normalna, CMS-T i CMS-P) w celu wykonania analiz sekwencjonowania metodami nowej generacji
(NGS)
17
Temat badawczy 4
Próba wytworzenia męskosterylnych linii pszenżyta z nowymi źródłami cytoplazmy
sterylizującej oraz ocena nowych genotypów pszenżyta i pszenicy pod kątem zdolności do
utrzymywania męskiej sterylności i przywracania płodności w cytoplazmie T. timopheevi.
Cel: próba wytworzenia nowych linii alloplazmatycznych pszenżyta. Scharakteryzowanie
nowych genotypów pod kątem zdolności do utrzymywania męskiej sterylności i przywracania płodności
w cytoplazmie T. timopheevi – cel zrealizowany.
Materiały i metody (opisać jak w publikacji)
Genotypami, które wykorzystano w 2016 roku do tworzenia linii alloplazmatycznych (linii
różniących się cytoplazmami) były cztery linie wsobne pszenżyta: DAD1, Baltiko 1, Zorro 1 i Salvo 15.
Wykonano krzyżowania wsteczne w celu wprowadzenia wymienionych genotypów do czterech
cytoplazm sterylizujących: T. timopheevi, Pampa, Ae. sharonensis i Ae. ventricosa. Krzyżowania
wykonywano ręcznie w warunkach polowych przy jednoczesnej ocenie męskiej płodności roślin
matecznych.
Ponadto w celu oceny męskiej płodności w obrębie 20 mieszańców F1 pszenżyta z różnymi
cytoplazmami sterylizującymi oraz 5 mieszańców pszenicy z cytoplazmą sterylizującą T. timopheevi,
wykonano rozmnożenia linii męskosterylnych niezbędnych do prowadzenia dalszych badań oraz
krzyżowania nowych odmian lub rodów pszenżyta i pszenicy ze źródłami męskiej sterylności.
Przed kwitnieniem wykastrowano po 6 kłosów na każdej linii matecznej. W czasie kwitnienia
zapylono ręcznie zaizolowane kłosy odpowiednią formą ojcowską uzyskując kolejne pokolenie linii.
Linie ojcowskie poddano ścisłemu chowowi wsobnemu zbierając ziarno po samozapyleniu z
zaizolowanych kłosów na poszczególnych roślinach. Jednocześnie na roślinach każdej linii matecznej
przed kwitnieniem zaizolowano po 5 kłosów w celu kontroli męskiej płodności.
Przy ocenie płodności stosowano skalę bonitacyjną 5-stopniową zaproponowaną przez Góral
(2002) oraz określano zawiązywanie ziaren pod izolatorami przyjmując następujące kryteria:
- Brak ziarna w wyniku samozapylenia (0 ziaren na kłos) rośliny świadczy o męskiej sterylności,
- Pełne uziarnienie (powyżej 30 ziaren na kłos) świadczy o męskiej płodności.
- Rośliny zawiązujące od 1 do 29 ziaren na kłos kwalifikowano jako pośrednie.
Stosując tę umowną skalę obliczono indeks restoracji według wzoru: N + 0,5 P, gdzie N - %
roślin męskopłodnych, P - % roślin pośrednich.
Wyniki (opisać)
Tegoroczna kontrola męskiej płodności linii pszenżyta potwierdziła interakcję genotypu linii z
cytoplazmą w ekspresji męskiej płodności/sterylności. Linia DAD 1 była męskopłodna w każdej z
cytoplazm, linia Salvo 15 – męskosterylna, a linie Baltiko 1 i Zorro1 męskosterylne, pośrednie lub
męskopłodne w zależności od rodzaju cytoplazmy (tab.5).
Linia pszenicy Grana z cytoplazmą T.timopheevi była męskosterylna. Również pełną sterylność
odnotowano u pięciu mieszańców między pszenicą Grana z cytoplamą T. timopheevi, a pięcioma
rodami pszenicy (tab.6).
Zróżnicowany poziom pylenia zaobserwowano u dwudziestu badanych mieszańców F1
pszenżyta (tab.7). Większość badanych rodów ojcowskich przywracała męską płodność we wszystkich
czterech badanych cytoplazmach sterylizujących, ale nie była to restoracja pełna. Ród DL 1146/10 w
cytoplazmach P (Pampa) i A (Ae. sharonensis) dawał mieszańce F1 całkowicie sterylne.
Tabela 5
Indeks restoracji (%) 4 linii pszenżyta w różnych cytoplazmach
Linia ojcowska
Cytoplazma
T. timopheevi
Pampa
Ae. sharonensis
DAD 1
85,0 (BC8)
100,0 (BC7)
100,0 (BC7)
Salvo 15
0,0 (BC8)
0,0 (BC7)
0,0 (BC4)
Baltiko 1
83,0 (BC5)
0,0 (BC7)
100,0 (BC4)
Zorro 1
92,0 (BC4)
0,1 (BC4)
0,0 (BC7)
18
Ae. ventricosa
91,1 (BC3)
0,0 BC8)
78,0 (BC3)
55,0 (BC3)
Tabela 6
Indeks restoracji męskiej płodności u 5 mieszańców odmiany Grana z cytoplazmą T.
timopheevi zapylonych przez 5 rodów ojcowskich
Ród ojcowski Indeks restoracji (%)
DL 325/11
0,0
DL 423/11
0,0
DL 237/12
0,0
DL 312/12
0,0
DL 375/12
0,0
Tabela 7
Płodność 20 mieszańców F1 pszenżyta (5 linii ojcowskich w 4 cytoplazmach*)
Ród
Cytoplazma
ojcowski
T. timopheevi
Pampa
Ae. sharonensis
Ae. ventricosa
Indeks restoracji (%)
DL 593/07
88,9
58,3
50,0
50,0
DL 643/09
45,0
100
20,0
50,0
DL 1146/10
50,0
0,0
0,0
55,0
DL 402/11
50,0
68,8
55,6
55,0
DL 1261/12
59,0
100
11,1
50,0
*cms Salvo 15, cms Baltiko 1, cms Zorro 1 i cms Salvo 15 odpowiednio w cytoplazmach: (T) T.timopheevi, (P)
Pampa, (A) Ae.sharonensis, (V) Ae.ventricosa
Przygotowano (przycięcie plewek i ości) i zaizolowano po 10 kłosów na roślinach
męskosterylnych linii: cms Salvo 15, cms Baltiko 1, cms Zorro 1 i cms Salvo 15 odpowiednio w
cytoplazmach: T.timopheevi (CMS-T), Pampa (CMS-P), Ae.sharonensis (CMS-A), Ae.ventricosa
(CMS-V) do zapylenia 12 rodami pszenżyta ozimego oraz po 10 kłosów linii cms Grana pszenicy z
cytoplazmą T.timopheevi do zapylenia 5 rodami pszenicy. W czasie kwitnienia wykonano dwukrotne
ręczne zapylenia pod izolatorem (48 kombinacji pszenżyta i 5 kombinacji pszenicy). Uzyskano
zróżnicowaną liczbę ziaren mieszańców F1 (tab. 8, 9).
19
Tabela 8.
Liczba ziaren F1 otrzymanych w wyniku ręcznych krzyżowań męskosterylnych linii pszenżyta w
różnych cytoplazmach z rodami, 2016
Forma ojcowska
Linia mateczna (cytoplazma)
cms Salvo
cms Baltiko
cms Zorro
cms Salvo
(CMS-T)
(CMS-P)
(CMS-A)
(CMS-V)
Subito
120
114
219
70
DL 593
119
89
124
118
DL 122
70
92
218
110
DL 643
209
122
218
95
DL 386
189
240
224
74
DL 1113
133
131
180
72
DL 1146
95
214
95
160
DL 402
86
183
248
97
DL 525
111
119
189
81
DL 1153
65
218
126
65
DL 1261
187
170
195
88
DL 1410
198
203
223
70
Tabela 9.
Liczba ziaren F1 otrzymanych w wyniku ręcznych krzyżowań męskosterylnej linii pszenicy z rodami,
2016
Forma ojcowska
Linia mateczna (cytoplazma)
cms Grana (CMS-T)
DL 325
150
DL 423
135
DL 237
125
DL 312
138
DL 375
143
Dyskusja (opisać jak w publikacji)
Szereg obcych gatunkowo cytoplazm może wywoływać męską sterylność u pszenżyta (Cauderon
i in. 1985; Nalepa 1990; Łapiński 2005; Góral 2013). Wśród nich przede wszystkim cytoplazmy T.
timopheevi (CMS-T) i Ae. sharonensis (CMS-A) były wymieniane przez Nalepę (1990) jako najbardziej
perspektywiczne w hodowli odmian mieszańcowych. Wprowadzenie do pszenżyta cytoplazmy Pampa
(Łapiński 2005) poszerzyło grupę potencjalnie użytecznych źródeł CMS, która została ostatnio (Góral
2013) uzupełniona przez cytoplazmę Ae. Ventricosa (CMS-V). Uzyskane wyniki potwierdzają
skuteczność wymienionych cytoplazm w utrzymywaniu męskiej sterylności u roślin pszenżyta.
Cytoplazma T. timopheevi jest też stabilnym źródłem CMS w hodowli pszenicy.
Wnioski (opisać jak w publikacji)
Cytoplazmy sterylizujące CMS-T, CMS-P, CMS-A i CMS-V mogą być wykorzystane do
tworzenia stabilnych fenotypowo linii męskosterylnych pszenżyta
Cytoplazma CMS-T (T. timopheevi) skutecznie utrzymuje męską sterylność roślin pszenicy
20
Opublikowane streszczenia:
Sobczyk M., Góralska M., Orłowska M., Góral H., Warzecha T., Simlat M., Stojałowski S. 2016.
Męska płodność mieszańców F2 pszenżyta z cytoplazmami sterylizującymi T. timopheevi i CMSPampa. „Nowe osiągnięcia polskich zespołów badawczych w dziedzinie genetyki, hodowli i
biotechnologii roślin” - Konferencja Naukowa z okazji 60-lecia Katedry Genetyki Hodowli i
Biotechnologii Roślin na Wydziale Kształtowania Środowiska i Rolnictwa Zachodniopomorskiego
Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie. Międzyzdroje, 8-10 czerwca 2016, Streszczenia:
66.
Sobczyk M., Góralska M., Orłowska M., Góral H., Warzecha T., Simlat M., Stojałowski S. 2016. The
use of GBS method for mapping the male RF genes in triticale with sterility-inducing cytoplasm of
T. timopheevi. V Kongres Genetyki, Łódź 19-22 września 2016, „Program i materiały
kongresowe” red. Andrzej K. Kononowicz, Lucjusz Jakubowski, Maciej Borowiec, Paweł Stączek,
Wydawnictwo Grupa Medica s.c., Łódź 2016, ISBN: 978-83-925769-4-5: 129
21