Mechanizmy oporności na metale ciężkie u - Eko-DOk

mechanizmy oporności na metale ciężkie,
plazmid, horyzontalny transfer genów
Anna JAROSŁAWIECKA, Zofia PIOTROWSKA-SEGET *
MECHANIZMY OPORNOŚĆI NA METALE CIĘŻKIE
U MIKROORGANIZMÓW
Mikroorganizmy posiadają szereg mechanizmów pozwalającym im na uniknięcie toksycznego działania metali ciężkich. Do najbardziej znanych i opisanych zaliczamy ich wiązanie zewnątrz –
i wewnątrzkomórkowe, zmniejszenie przepuszczalności osłon komórkowych, transport jonów poza
komórkę – tzw. efflux system, zmniejszenie wrażliwości składników komórki na metale oraz enzymatyczną detoksyfikację metalu do formy mniej toksycznej. Duży udział w nabywaniu metalooporności
ma proces horyzontalnego transferu genów. Geny kodujące te systemy są zlokalizowane głównie na
plazmidach, przekazywanych pomiędzy szczepami, ale są również obecne na chromosomach, najczęściej na ruchomych elementach genetycznych - transpozonach. Bakterią szeroko wyspecjalizowaną
w unikaniu toksyczności metali jest Cupriavidus metallidurans CH34, u której potwierdzono oporność na ponad dwadzieścia pierwiastków. Większość z tych systemów jest zlokalizowana na plazmidach pMOL28 i pMOL30. Badania prowadzone nad metaloopornością mikroorganizmów mają praktyczne zastosowanie w biotechnologii środowiskowej, m.in. w konstruowaniu szczepów efektywnych
w procesach bioremediacji, biosensorów czy wspomaganiu procesów fitoremediacji.
Metale ciężkie to grupa metali i metaloidów o gęstości większej niż 5g/cm3, obejmująca pierwiastki o bardzo zróżnicowanych właściwościach chemicznych, fizycznych i biologicznych. W komórkach mikroorganizmów wiele metali (miedź, cynk,
molibden, żelazo) pełni ważne funkcje konieczne dla prowadzenia procesów życiowych, inne jak: kadm, rtęć, srebro, ołów nie mają żadnego znaczenia biologicznego
i są dla nich silnie toksyczne już w mikromolowych stężeniach [4]. Spośród nich
takie metale jak srebro, arsen, beryl, kadm, chrom, miedź, rtęć, nikiel, ołów, antymon,
selen, tal czy cynk są uważane za największe zanieczyszczenie i zagrożenie dla środowiska naturalnego [24]. Również mikroelementy, niezbędne z biologicznego punktu widzenia, w stężeniu przekraczającym zapotrzebowanie ze strony komórki, mogą
być toksyczne [4].
__________
*
Uniwersytet Śląski, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Mikrobiologii, ul. Jagiellońska 28, 40-032 Katowice.
232
A. JAROSŁAWIECKA, Z. PIOTROWSKA-SEGET
Mikroelementy pełnią szereg ważnych funkcji. Są kofaktorami reakcji biochemicznych, stabilizują strukturę białek i ściany komórkowej bakterii, uczestniczą również w utrzymywaniu równowagi osmotycznej w komórce i reakcjach redoks
[4].Toksyczność metali jest związana z zamianą niezbędnych mikroelementów
w miejscu ich wiązania, zmianach w strukturze kwasów nukleinowych i białek, zaburzeniach równowagi osmotycznej czy w hamowaniu procesów enzymatycznych [4].
Nie mniej jednak, w świetle ostatnich badań dogmat o bezwzględnej szkodliwości
niektórych metali został podważony. Pojawiają się doniesienia o ich możliwym biologicznym znaczeniu i wykorzystaniu. Przykładowo, u okrzemki morskiej Thalassiosira
weissflogii, żyjącej na powierzchni oceanów, kadm jest niezbędny dla biologicznej
aktywności anhydrazy węglanowej, enzymu aktywnego w jednym z pierwszych etapów w procesie fotosyntezy. Kadm prawdopodobnie pełni również podobną funkcję
komórkach innych mikroskopijnych glonów , a więc stanowi prawdopodobnie istotny
element w procesie fotosyntezy i obiegu węgla w przyrodzie [10].
Metale ciężkie były obecne w środowisku naturalnym od początku życia, stąd
uważa się, że mechanizmy obronne neutralizujące ich toksyczność rozwinęły się
w wyniku tak wczesnej ekspozycji mikroorganizmów na ich działanie [22]. Systemy
nadające oporność na metale ciężkie są obecne niemal we wszystkich mikroorganizmach [8]. Niewątpliwie działanie człowieka i postępujące zanieczyszczenie środowiska znacznie przyczyniło się do utrzymania presji selekcyjnej i faworyzowania
szczepów posiadających wyżej wymienione mechanizmy. Co ciekawe, niejednokrotnie oporność na metale jest również powiązana z opornością na antybiotyki, stąd postępujące zanieczyszczenie środowiska w świetle narastającego problemu antybiotykooporności wśród bakterii jest dość niepokojące [4].
Toksyczność metali jest powiązana z ich biodostępnością dla mikroorganizmów,
na co wpływa pH danego środowiska, obecność innych jonów i związków chelatujących czy inne czynniki środowiskowe (np. obecność próchnicy czy związków ilastych
w glebie ). Kwaśny odczyn środowiska sprzyja rozpuszczalności związków metali,
a co za tym idzie zwiększa stężenie ich biodostępnej frakcji dla mikroorganizmów
[11].
Mikroorganizmy wykształciły szereg mechanizmów obronnych umożliwiającym
im uniknięcie toksycznego działania tych pierwiastków. Wg Bruins’a wyróżnia się
sześć takich mechanizmów: (1) wewnątrz- i (2) zewnątrzkomórkowe wiązanie, (3)
zmniejszenie przepuszczalności osłon komórkowych dla jonów metali,(4) transport
metali poza komórkę – tzw. efflux system, (5) zmniejszenie wrażliwości składników
komórki na metale oraz (6) enzymatyczną detoksyfikację metalu do formy mniej toksycznej. Mikroorganizmy mogą posiadać jeden z mechanizmów lub ich kombinację
[4].
Oporność na metale ciężkie jest głównie kodowana przez operony obecne na dodatkowych elementach genetycznych, jakimi są plazmidy. Mogą również znajdować
się na chromosomach, często zlokalizowane są na transpozonach - mobilnych ele-
Mechanizmy oporności na metale ciężkie u mikroorganizmów
233
mentach genetycznych [4]. Ruchome elementy genetyczne biorą udział w przekazywaniu genów determinujących oporność na metale ciężkie w procesie horyzontalnego
transferu genów. Sprzyja to powstawaniu i rozprzestrzenianiu się populacji metaloopornych, które mogą obejmować prawie 100% mikroorganizmów w danym środowisku [23].
Pierwsze mechanizmy obronne mają za zadanie zatrzymanie szkodliwego metalu
przed wniknięciem do komórki [4]. Zewnątrzkomórkowe wiązanie ma na celu unieruchomienie jonów metali, co uniemożliwia im wnikanie do wnętrza komórki. Główną
rolę w tym mechanizmie obronnym pełnią egzopolisacharydy, których chemiczna
struktura pozwala na niespecyficzne wiązanie metali [4]. Przykładowo, w badaniach
przeprowadzonych przez Scott'a i in. (1998) wykazano, że egzopolisacharyd produkowany przez Pseudomonas putida immobilizował nawet 100 % kadmu dodanego do
hodowli bakterii [4]. Ochronne działanie egzopolisacharydów przed toksycznym działaniem jonów metali stwierdzono również u takich mikroorganizmów Klebsiella aerogenes czy Arthrobacter viscous [4]. Podobny efekt mikroorganizmy osiągają poprzez precypitację poza komórką nierozpuszczalnych form metali . Ta zdolność, poza
bakteriami została opisana również u drożdży i innych grzybów [9]. Szczep Citrobacter sp. wytrąca kadm w postaci nierozpuszczalnych fosforanów [12], a K. aerogenes
siarkę w postaci siarczku [1, 4]. Toksyczność metali bakterie ograniczają również
poprzez wydzielanie do środowiska glutationu. Ten tripeptyd, zawierający cysteinę
wiąże z dużym powinowactwem metale, tworząc kompleksy, które nie przedostają się
do wnętrza [4, 18]. To rozwiązanie obserwowano między innymi u S.cerevisiae, gdzie
jony niklu były absorbowane i zatrzymywane poza komórką przez cząsteczki glutationu [18].
Mikroorganizmy unikają również toksycznego działania metali poprzez zmiany
w strukturze ściany i/lub błony komórkowej utrudniających ich wniknięcie do komórki [4]. Przykładowo u Escherichia coli jony miedzi (II) indukują zmiany w syntezie
białka wchodzącego w skład poryn, transportujących Cu(II) do komórki. W rezultacie
poobserwuje się zmiany w przepuszczalności błony komórkowej i zatrzymywanie
jonów miedzi poza komórką [26].
Metale mogą również być niespecyficznie wiązane przez osłony komórkowe aż do
punktu wysycenia miejsc ich wiązania [2,6]. Dużą rolę w tym niespecyficznym wiązaniu odgrywa peptydoglikan, polimer stanowiący podstawowy składnik ściany komórkowej u bakterii, jak i lipopolisacharyd, struktura charakterystyczna dla bakterii
Gram ujemnych, stanowiąca ponad 80% powierzchni błony zewnętrznej [4].
Jednym z najbardziej efektywnych i najlepiej zorganizowanych systemów biorących udział w usuwaniu metali poza komórkę jest efflux system. Efflux system może
być ATP zależny lub działać na zasadzie wymiany jonów na drodze chemioosmotycznego gradientu. Te mechanizmy charakteryzuje wysoka specyficzność w stosunku do
eksportowanych metali [4, 19]. Wśród metali, które mogą być eksportowane poza
komórkę są m.in. arsen (operon ars) , kadm (operon cad i czc), miedz (operon cop),
234
A. JAROSŁAWIECKA, Z. PIOTROWSKA-SEGET
ołów (operon pbr). W systemie efflux uczestniczą trzy rodzaje pomp: ATPazy typu P,
wykorzystujące do przenoszenia jonów energię z hydrolizy ATP [19], transportery
z rodziny białek CDF (cation diffusion facilitator) i transportery z rodziny białek
CBA, działające na zasadzie chemiosmotycznego antyportu z jonami wodoru [19].
ATPazy typu P i transportery CDF transportują jony jedynie do części peryplazmatycznej komórek i są obecne zarówno u bakterii Gram ujemnych i Gram dodatnich.
Natomiast pompy CBA są charakterystyczne tylko dla bakterii Gram dodatnich
i uczestniczą eksporcie metali poza komórkę (rys.1) [19].
Jedną z najlepiej scharakteryzowanych ATPaz typu P jest pompa CadA –biorąca
udział w translokacji jonów kadmu poza komórkę bakterii. System ten jest kodowany
przez operon cad i po raz pierwszy został opisany i zlokalizowany u bakterii S.aureus
na plazmidzie pI258 [20]. Operon ten składa się z dwóch genów cadA i cadC, które
odpowiednio kodują pompę CadA oraz białko regulujące jej funkcjonowanie – CadC.
W strukturze pompy CadA występuje osiem transbłonowych domen z N-terminalnym
motywem wiążącym metal (tzw. metal –binding domain) po stronie cytoplazmatycznej. Translokacja metalu do części peryplazmatycznej następuje przy wykorzystaniu
energii z hydrolizy ATP [28].
Obniżenie toksyczności metali metali może być przeprowadzana drogą ich enzymatycznej detoksyfikacji do formy mniej szkodliwej. Najbardziej znanym przypadkiem tego mechanizmu obronnego jest detoksyfikacja rtęci Hg (II). System ten kodowany przez operon mer jest obecny zarówno u bakterii Gram- ujemnych jak (E.coli,
P.aeruginosa) i gram-dodatnich (S.aureus, Bacillus sp.) [22]. Mikroorganizmy te
mogą redukować kationy rtęci (II) do postaci elementarnej Hg0, która jest lotną
i mniej toksyczną postacią tego pierwiastka. Proces ten jest związany z działaniem
skomplikowanego systemu transportu tego metalu do wnętrza komórki i jego redukcji
przy wykorzystaniu reduktazy rtęciowej [22]. Również srebro czy arsen mogą być
neutralizowane na drodze enzymatycznej detoksyfikacji [4,29].
Metale ciężkie mogą być również wiązane w komórce przez grupę związków tiolowych w czym uczestniczy wspomniany wyżej glutation (głownie u proteobakterii,
cyjanobakterii, i S.cerevisiae) [5] a także metalotioneiny. W ich strukturze możemy
zauważyć obecność tzw. grup tiolowych (-SH), które reagują z metalami, chroniąc
w ten sposób wrażliwe komponenty komórki. Metalotioneiny mogą m.in. wiązać takie
metale jak kadm, miedz, cynk , rtęć czy srebro [3].
Najbardziej znany i opisany operon smt , kodujący wytwarzanie metalotionein został znaleziony u cyjanobakterii Synechococcus sp. Białka bogate w cysteinę pełniące
podobną funkcję i wiążące kadm zostały odkryte również u P.putida [27].
Komórki mogą bronić się również przed toksycznością metali poprzez zmianę
wrażliwości komponentów komórki na metale czy alternatywne szlaki metaboliczne
omijających wrażliwe komponenty. Taki typ adaptacji został znaleziony m.in. u E.coli
[4, 26].
Mechanizmy oporności na metale ciężkie u mikroorganizmów
ATPaza typu P
CBA transporter
235
CDF transporter
OM
H+
H+
peryplazma
IM
metal
cytoplazma
ATP
ADP
metal
metal
metal
Rys. 1. Rodzaje pomp zaangażowanych w eksport jonów metali poza komórki bakterii
(OM – błona zewnętrzna, IM- błona wewnętrzna, opis działania w tekście) [8, zmodyfikowany]
Mówiąc o metalooporności wśród mikroorganizmów, niewątpliwie trzeba wspomnieć Cupriavidus metallidurans CH34, który uważany jest za modelową bakterię
w dziedzinie badania mechanizmów obronnych wobec metali ciężkich. Ta Gramujemna beta-proteobakteria została wyizolowana z silnie skażonego metalami zbiornika w fabryce przetwarzającej metale [13]. Sekwencjonowanie genomu tej bakterii
wykazało obecność chromosomu (3,9Mb), megaplazmidu (2,6Mb) i dwóch dużych
plazmidów pMOL28 (171kb) i pMOL30 (234kb). Bakteria ta wykazuje oporność na
dwadzieścia różnych metali (Cu, Ni, Zn, Co, Cd, Pb, Ag, Au, As, Hg, Cs, Bi, Tl, Se,
Sr, Cr ) w stężeniach milimolowych. Większość genów kodujących te mechanizmy
znajduje się na dwóch metaplazmidach pMOL28 (171 kb) i pMOL30 (230kb). Eliminacja tych plazmidów prowadzi do zmniejszenia tolerancji tej bakterii na metale ciężkie, co potwierdza udział genów zlokalizowanych na tych plazmidach w tworzeniu
systemów umożliwiających wzrost bakterii w obecności wielu metali [16]. Plazmid
pMOL28 warunkuje oporność na nikiel, kobalt, chrom i rtęć, z kolei pMOL30 na
srebro, kadm, kobalt, miedź, rtęć, ołów i cynk. Geny uczestniczące w funkcjonowaniu tych systemów są najczęściej zlokalizowane pomiędzy ruchomymi elementami
genetycznymi, jakimi są transpozony [15,16] Sugeruje to czynny udział horyzontalnego transferu genów w kształtowaniu tego niezwykłego genomu [17]. Oporność na te
metale jest głównie warunkowana przez systemy pomp efflux, kompleksowanie metali lub ich redukcję [17].
Uzyskana w trakcie badań nad zagadnieniem metalooporności wiedza ma praktyczne zastosowanie w konstrukcji szczepów bardziej efektywnych w procesie biore-
236
A. JAROSŁAWIECKA, Z. PIOTROWSKA-SEGET
mediacji skażonych gleb, biosensorów do monitorowania stężeń metali ciężkich oraz
we wspomaganiu fitoremediacji [11].
Bakterie te mogą być wykorzystywane również w procesach odzyskiwania lub
usuwania metali z odpadów przemysłowych. Szczególne znaczenie ma tutaj proces
immobilizacji metali i ich zagęszczanie, w którym wykorzystywane są biosorpcja,
wewnątrzkomórkowa akumulacja, precypitacja czy wiązanie przez różne polimery
[4,11].
Mikroorganizmy izolowane z środowisk silnie skażonych metalami ciężkimi są
również wykorzystywane w odzyskiwaniu szczególnie wartościowych metali np. złota
czy srebra. Proces ten nazywany bioługowaniem ma również zastosowanie w przypadku miedzi czy uranu z wykorzystaniem bakterii Thiobacillus thiooxidans czy
T.ferrooxidans [4, 14].
Dalsze badania i zrozumienie tych mechanizmów w szerszym aspekcie pozwoli na
efektywniejsze wykorzystanie tych bakterii w różnych aspektach biotechnologii środowiskowej.
LITERATURA
[1]
AIKING H., KOK K., HEERIKHUIZEN H.V.,WAN’T R.J., Adaptation to cadmium by Klebsiella
aerogenes growing in continuous culture proceeds mainly via formation of cadmium sulfide, Appl
Environ Microbiol, 1982, Vol. 44, 938–944.
[2] BEVERIDGE T.J., MURRAY G.E., Uptake and retention of metals by cell walls of Bacillus subtilis,
J Bacteriol, 1976, Vol. 127, 1502–1518.
[3] BLINDAUER C.A., HARRISON M.D., ROBINSON A.K., PARKINSON J.A., BOWNESS P.W.,
SADLER P.J., ROBINSON N.J., Multiple bacteria encode metallothioneins and SmtA-like zinc fingers, Mol Microbiol, 2002, Vol. 45, 1421–1432.
[4] BRUINS M.R., KAPIL S, OEHME F.W., Microbial resistance to metals in the environment, Ecotoxicol Environ Saf, 1999, Vol. 45, 198–207.
[5] FAHEY R.B., Novel thiols of prokaryotes, Annu Rev Microbiol, 2001, Vol. 55, 333–356.
[6] HOYLE B, BEVERIDGE T.S., Binding of metallic ions to the outer membrane of Escherichia coli,
Appl Environ Microbiol, 1983, Vol. 46, 749–752.
[7] HYNNINEN A., Zinc, cadmium and lead resistance mechanisms in bacteria and their contribution
to biosensing, Academic Dissertation in Microbiology, Department of Food and Environmental
Sciences Faculty of Agriculture and Forestry, 2010, University of Helsinki Helsinki, Finland.
[8] JI G.,SILVER S., Bacterial resistance mechanisms for heavy metals of environmental concern,
J Ind Microbiol, 1995, Vol. 14, 61–75.
[9] JOHO M., INOUHE M., TOHOYAMA H., MURAYAMA T., Nickel resistance in yeast and other
fungi. J Ind MICROBIOL, 1995, Vol. 14, 164–168.
[10] LANE T.W., SAITO M.A., GEORGE G.N., PICKERING I. J., PRINCE R.C., MOREL F.M.M.,
A cadmium enzyme from a marine diatom, Nature, 2005, Vol. 435, 42.
[11] LIBUDZISZ Z., KOWAL K., ŻAKOWSKA Z., Mikrobiologia techniczna T.2 Mikrooorganizmy
w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcji żywności, PWN, Warszawa 2009, 518–526.
[12] MCENTEE J.D., WOODROW J.R.,QUIRK A.V., Investigation of cadmium resistance in Alcaligenes sp., Appl Environ Microbiol, 1986, Vol. 51, 515–520.
Mechanizmy oporności na metale ciężkie u mikroorganizmów
237
[13] MERGEAY M., HOUBA C., GERITS J., Extrachromosomal inheritance controlling resistance to
cadmium, cobalt, copper and zinc ions: evidence from curing in a Pseudomonas, Arch Int Physiol
Biochim, 1978, Vol. 86, 440–442.
[14] MERGEAY M., Towards an understanding of the genetics of bacterial metal resistance, Trends
Biotechnol, 1991, Vol. 9, 17–24.
[15] MERGEAY M., MONCHY S., JANSSEN P., VAN HOUDT R., LEYS N., Megaplasmids in Cupriavidus Genus and Metal Resistance Microbial Megaplasmids, Springer-Verlag, Berlin 2009,
209–238.
[16] MONCHY S., BENOTMANE M.A., JANSSEN P., VALLAEYS T., TAGHAVI S., Plasmids
pMOL28 and pMOL30 of Cupriavidus metallidurans are specialized in the maximal viable response to heavy metals, J Bacteriol, 2007, Vol. 189, 7417–7425.
[17] JANSSEN ET AL., The Complete Genome Sequence of Cupriavidus metallidurans Strain CH34,
a Master Survivalist in Harsh and Anthropogenic Environments, PLoS One, 2010.
[18] MURATA K., FUKUDA Y., SHIMOSAKA M., WANTANABE K., SAIKUSA T., KIMURA A.,
Phenotypic character of the methylglycoxal resisance gene in Saccharomyces cerevisae: expression
in Escherichia coli and application to breeding wild-type yeast strains, Appl Environ Microbiol,
1985, Vol. 50, 1200–1207.
[19] NIES D.H., Efflux-mediated heavy metal resistance in prokaryotes, FEMS Microbiol Rev, 2003,
Vol. 27, 313–339.
[20] NUCIFORA G, CHU L, MISRA T.K., SILVER S., Cadmium resistance from Staphylococcus
aureus plasmid pI258 cadA gene results from a cadmium-efflux ATPase, Proc Natl Acad Sci USA,
1989, Vol. 86, 3544–3548.
[21] SILVER S, PHUNG L.T., Bacterial heavy metal resistance: new suprises, Annu Rev Microbiol,
1996, Vol. 50, 7537–7589.
[22] SILVER S.,PHUNG L.T., A bacterial view of the periodic table: genes and proteins for toxic inorganic ions, J Ind Microbiol Biotechnol, 2005, Vol. 32, 587–605.
[23] SILVER S. PHUNG L.T., Heavy metals, bacterial resistance,[w:] Encyclopedia of Microbiology,
Oxford: Elsevier, 2009, 220–227.
[24] SPARKS D.L., Toxic metals in the environment: the role of surfaces, Elements, 2005, Vol. 1,
193–196.
[25] RENSING C., GHOSH M., ROSEN B.P., Families of soft-metal-ion-transporting ATPases,
J Bacteriol, 1999, Vol. 181, 5891–5897.
[26] ROUCH D., LEE B.T.D., MORBY A.P., Understanding cellular responses to toxic agents:
A model for mechanism choice in bacterial metal resistance, J Ind Microbiol, 1995, Vol. 14,
132–141.
[27] TREVORS J.T, STRATTON G.W, GADD G.M., Cadmium transport, resistance and toxicity in
bacteria, algae and fungi, Can J Microbiol, 1986, Vol. 32, 447–464.
[28] TSAI K.J., LIN Y.F., WONG M.D., YANG H.H.CH., FU H.L., ROSEN B.P., Membrane Topology
of the pI258 CadA Cd (II)/ Pb (II)/Zn (II) – Translocating P-type ATPase, J Bioenerg Biomembr,
2002, Vol. 34, 147–156.
HEAVY METAL RESISTANCE IN MICROORGANISMS
Microorganisms possess several mechanisms allowing them to avoid the toxicity of heavy metals. The
most well-known and described are: intra- and extracellular sequestration, exclusion by permeability
barrier, transport outside the cell through efflux pumps, reduction in the sensitivity of cellular targets to
metal ions or enzymatic detoxification to less toxic form. Horizontal gene transfer participates in a great
238
A. JAROSŁAWIECKA, Z. PIOTROWSKA-SEGET
deal in spreading heavy metal resistance. Genes encoding these systems are localized mainly on plasmids,
transferred among strains, but are present as well on chromosomes, usually among metal mobilized elements - transposons. Cupriavidus metallidurans CH34 is a bacterium highly specialized in the neutralization of above twenty heavy metals. Most of these systems are localized on plasmids pMOL28and
pMOl30. The research conducted on these mechanisms has practical application in constructing strains
highly effective in bioremediation processes, biosensors or in supporting phytoremediation.