Zależność pomiędzy BMI, stężeniem leptyny i jej rozpuszczalnego

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
Diagn Lab 2015; 51(4): 277-284
Praca oryginalna • Original Article
Zależność pomiędzy BMI, stężeniem leptyny
i jej rozpuszczalnego receptora oraz ekspresją FoxP3
w limfocytach Treg u kobiet chorych na astmę
The relationship between BMI, leptin, leptin receptors (LepR)
and Foxp3+ Tregs cells in women with asthma
Łukasz Kraszula1, Makandjou-Ola Eusebio1, Anna Jasińska1, Maciej Kupczyk2, Piotr Kuna2,
Mirosława Pietruczuk1
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, II Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Klinika Chorób Wewnętrznych, Astmy i Alergii, II Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
1
2
Streszczenie
Celem pracy była ocena zależności pomiędzy wskaźnikiem BMI, stężeniem leptyny, jej rozpuszczalnego receptora oraz ekspresją FoxP3
w limfocytach Treg CD4+ pochodzących z krwi obwodowej u kobiet chorych na astmę ciężką.
Materiał i metody. Do badania zakwalifikowano trzydzieści kobiet z rozpoznaną astmą, w tym 17 z ciężką i 13 z umiarkowaną-łagodną postacią choroby. Grupę kontrolną stanowiło 25 zdrowych kobiet. Diagnoza astmy została postawiona zgodnie z powszechnie
akceptowanymi zaleceniami – GINA 2014. Materiałem badanym była krew żylna. Ocenę immmunofenotypu CD4+CD25highCD127lowFoxp3+CD152+, subpopulacji limfocytów pTreg wykonano techniką wielokolorowej cytometrii przepływowej. Ocenę stężenia leptyny i jej
rozpuszczalnego receptora wykonano metodą ELISA.
Wyniki. Zaobserwowano, że w grupach kobiet chorych na astmę ciężką i umiarkowaną-łagodną stężenie leptyny jest znamiennie
podwyższone w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,05). Wykazano, że stężenie receptora leptyny w grupie kobiet chorych na astmę
ciężką było znamiennie podwyższone (p<0,05) w porównaniu do kobiet z grupy kontrolnej. Nie stwierdzono natomiast w hodowlach
in vitro znamiennej zmiany w odsetku limfocytów regulatorowych CD4+ z ekspresją FoxP3 po stymulacji leptyną zarówno u chorych
na astmę ciężką, umiarkowaną-łagodną i w grupie kontrolnej. Nie wykazano także znamiennego obniżenia odsetka limfocytów o immunofenotypie CD4+CD25highCD127lowFoxP3+CD152+, po stymulacji leptyną, w warunkach in vitro, u kobiet chorych na ciężką astmę
w porównaniu do grupy chorych na astmę umiarkowaną-łagodną i grupy kontrolnej.
Wnioski. W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono bezpośredniego wpływu leptyny, na populację regulatorowych limfocytów
T CD4+ oraz ekspresję czynnika transkrypcyjnego FoxP3 w tych komórkach, u kobiet chorych na astmę ciężką i umiarkowaną – łagodną.
Summary
The aim of this study was evaluation whether there is an association between BMI, leptin and its soluble receptor, the expression of
FoxP3 in CD4+ pTreg in women with severe asthma.
Materials and methods. The study included thirty women with asthma: 17 patients with severe and 13 with mild-moderate disease. The
control group comprised of 25 healthy women. Asthma was diagnosed in accordance with the Global Initiative For Asthma guidelines
(GINA 2014). The phenotype of CD4+CD25highCD127lowFoxp3+CD152+ cells was evaluated by multicolor flow cytometry. The concentration
of leptin and its soluble receptor were determined using an immunoenzymatic method (ELISA).
Results. It has been shown significantly increased leptin concentration in the group of women with severe asthma compared with
mild-moderate asthma and control group (p <0.05). The concentration of the leptin receptor significantly increased (p <0.05) in women
with severe asthma compared with control group. There were no differences in percentage of CD4+FoxP3+ and CD4+CD25highCD127lowFoxP3+CD152+ subsets after leptin stimulation in all tested groups.
Conclusions. Our results don’t confirm the direct effect of leptin on the CD4+ pTreg cells and the expression of FoxP3 in these cells, in
tested groups.
Key words:
asthma, obesity, leptin, Treg
Słowa kluczowe: astma, otyłość, leptyna, Treg
277
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
Wstęp
W ostatnich latach astma oskrzelowa i otyłość stanowią poważny
problem zdrowotny, społeczny i ekonomiczny. Według danych
Światowej Organizacji Zdrowia (WHO; World Health Organization)
na astmę oskrzelową, na świecie choruje 300 mln osób. Prognozuje się, że w najbliższych latach liczba chorych wzrośnie do 400
mln (http://who.int). Jednocześnie dramatycznie zwiększa się
populacja osób z nadwagą lub otyłością. Według danych szacunkowych liczba osób otyłych na świecie wynosi 440 mln [1].
Wykazano, że otyłość jest czynnikiem ryzyka w astmie i ma wpływ
na jej odmienny przebieg. U osób otyłych częściej stwierdza się
cięższą postać choroby, chorzy słabiej reagują na standardową
terapię, częściej wykazują oporność na glikokortykosteroidy [2].
Wykazano także, że wśród chorych na astmę ciężką dominuje płeć
żeńska i stwierdzono również związek choroby z zwiększeniem
wskaźnika masy ciała (BMI; Body Mass Index) u kobiet [3].
Wiadomo, że w patogenezie astmy istotną rolę odgrywa zaburzenie równowagi między subpopulacjami limfocytów T, u podstaw,
której leży dysfunkcja limfocytów regulatorowych T pochodzących z krwi obwodowej (pTreg; Peripherally derived Treg cell) [4,
5]. Dowiedziono, że glikokortykosteroidy (GK), będące podstawą
leczenia przeciwzapalnego astmy, działają między innymi stymulując limfocyty regulatorowe T CD4+ poprzez mechanizm zależny
od indukcji ekspresji FoxP3 [6]. Dlatego poszukiwane są sposoby
na wykorzystanie potencjału terapeutycznego limfocytów Treg,
szczególnie w ciężkiej postaci astmy.
Istnieje również coraz więcej dowodów potwierdzających rolę adipocytokin – aktywnych mediatorów wydzielanych przez tkankę
tłuszczową w modulowaniu funkcji komórek Treg w astmie [7].
Stwierdzono, że otyłość zaostrza przebieg astmy. U chorych otyłych trudniejsze jest także uzyskanie kontroli przebiegu choroby
[8]. Jednak mechanizmy i zależności pomiędzy otyłością a przebiegiem astmy nie są do końca wyjaśnione. Uważa się jednak, że
zarówno adipocytokiny jak i limfocyty regulatorowe T (Treg) są
ważnym ogniwem tych powiązań.
Celem pracy było sprawdzenie czy istnieje zależność pomiędzy
stężeniem adipocytokiny – leptyny i jej rozpuszczalnego receptora, ekspresją FoxP3 w limfocytach regulatorowych pochodzących
z krwi obwodowej (pTreg) i BMI u kobiet z ciężką postacią astmy.
Materiał i Metody
Grupy badane:
Grupę badaną stanowiły kobiety z rozpoznaną astmą:
– 17 niepalących kobiet z ciężką postacią astmy,
– 13 niepalących kobiet z umiarkowaną-łagodną postacią astmy
Grupę kontrolną stanowiło 25 zdrowych, niepalących kobiet
w zbliżonym do grup badanych przedziale wiekowym i rozkładzie
płci. Ponadto żadna z kobiet zakwalifikowana do grupy kontrolnej
nie przechodziła zakażenia dróg oddechowych w ciągu czterech
tygodni poprzedzających pobranie próbek krwi do badania.
Diagnoza astmy oskrzelowej została potwierdzona na podstawie
wywiadu i zmienności obturacji dróg oddechowych, zgodnie
z powszechnie akceptowanymi zaleceniami – GINA 2014 (http://
ginasthma.org). Stopień ciężkości choroby oceniono zgodnie
z definicją użytą w badaniach grupy ENFUMOSA [9].
278
Pacjentki zakwalifikowane do grupy chorych na astmę ciężką
wymagały stałego leczenia wysokimi dawkami sterydów wziewnych, (co najmniej 1600 µg/dobę budezonidu lub beklometazonu, 800 µg/dobę flutikazonu lub równoważnika). W przypadku
przewlekłej doustnej sterydoterapii wymagane dawki leków
wynosiły 800 µg/dobę budezonidu lub beklometazonu, 400 µg/
dobę flutikazonu lub równoważnika. Ponadto kobiety chore na
astmę ciężką wymagały przewlekłej terapii długo działającym
β-agonistą (LABA; long acting β-agonist; formoterol w dawce 9
mcg/dawkę, dwa razy dziennie lub salmeterol 50 mcg/dawkę,
dwa razy dziennie) lub doustną teofiliną (200-300 mg jeden lub
dwa razy na dobę). Astma w tej grupie pacjentek nie była w pełni kontrolowana a w roku poprzedzającym włączenie do grupy
badanej pacjentki miały, co najmniej jedno zaostrzenie choroby.
Czas od momentu zaostrzenia astmy do pobrania próbek krwi
był dłuższy niż 2 miesiące.
Przed postawieniem ostatecznego rozpoznania astmy ciężkiej, wykluczono potencjalne choroby współistniejące oraz niestosowanie
się pacjentek do zaleceń lekarskich, jako czynniki utrudniające
uzyskanie optymalnej kontroli choroby. Kobiety włączone do
grupy astmy umiarkowanej-łagodnej stosowali maksymalnie 800
µg/dobę budezonidu lub beklometazonu, 500 µg/dobę flutikazonu lub równoważnika.
Wszystkie pacjentki włączone do grup badanych nie otrzymywały, innych niż glikokortykosteroidy, leków immunosupresyjnych.
U każdej pacjentki wykonano badanie spirometryczne i punktowe testy skórne. Atopię zdefiniowano jako co najmniej jeden
dodatni wynik (> 3 mm) w punktowym teście skórnym z panelem
alergenów [10]. Charakterystykę badanych grup i grupy kontrolnej
przedstawiono w tabeli I.
Badania zostały przeprowadzone za zgodą Uczelnianej Komisji
Bioetyki Badań Naukowych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
(numer RNN/133/11/KE z 14 czerwca 2011r.)
Materiał badany.
Materiałem badanym była krew żylna pobrana do probówko-strzykawek z solą wersenianu-potasowego (K2EDTA) oraz z granulkami i aktywatorem krzepnięcia firmy (SARSTED). Probówki
z aktywatorem krzepnięcia wirowano przy 2000 g, przez 10 minut,
w celu uzyskania surowicy. Uzyskaną surowicę mrożono w temp.
-70oC, a następnie rozmrożono w celu wykonania oznaczeń stężenia leptyny i jej rozpuszczalnego receptora.
Metody badawcze
Badania antropometryczne
Grupę badaną kobiet i grupę kontrolną poddano analizie antropometrycznej. Dokonano pomiaru masy ciała (kg) i wzrostu (m)
w celu wyliczenia BMI.
Izolacja i sortowanie
Od każdego pacjenta pobierano 8 ml krwi żylnej, którą nawarstwiano na 12 ml podłoża Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich). Komórki jednojądrzaste (PBMCs) wyizolowano w gradiencie gęstości,
przez wirowanie – 400g, przez 30 minut. Bezwzględną liczbę i odsetek komórek jednojądrzastych oznaczano analizatorem pentra
Diagn Lab 2015; 51(4): 277-284
DX 120. Czystość komórkowa pozwalająca na przystąpienie do
etapu sortowania musiała być wyższa niż 80% limfocytów.
Sortowanie limfocytów przeprowadzono w procesie separacji
pozytywnej, przy użyciu zestawu przeciwciał i kuleczek magnetycznych zawartych w zestawie „CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, human” zgodnie z procedurą firmową (Miltenyi Biotec,
USA). Czystość wysortowanej populacji sprawdzano, znakując
komórki przeciwciałami anty-CD4, CD25 (93,5% ± 3,15) zgodnie
z procedurą firmową (BD Bioscience), analizę wykonano cytometrem przepływowym BD FACS CANTO II.
Oznaczenie ekspresji FoxP3 w limfocytach pTreg
100 μl stymulowanych leptyną limfocytów, wyznakowano przeciwciałami monoklonalnymi, skierowanymi przeciwko antygenom
powierzchniowym CD4, CD25, CD127, CD152 w stężeniu zgodnym z procedurą firmową (BD Bioscience). Wymieszaną zawiesinę
komórek inkubowano 20 minut, w ciemności, w temperaturze
pokojowej (od 20°C do 25°C). Następnie komórki utrwalano przez
10 minut, odczynnikiem Human FoxP3 Buffer A (BD Pharmingen).
W celu wyznakowania FoxP3, komórki permeabilizowano i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej (20°C do 25°C)
z buforem C (BD Pharmingen), Następnie do zawiesiny komórek
dodawano przeciwciało anty-FoxP3 w stężeniu zgodnym z procedurą firmową (BD Bioscience). Dobrze wymieszaną zawiesinę
wyznakowanych komórek inkubowano 30 minut w ciemności,
w temperaturze pokojowej (20°C do 25°C). Do analizy zbierano
od 10.000 – 15.000 limfocytów CD4+.
Technika hodowli regulatorowych limfocytów T, CD4+
Hodowle komórkowe z wysortowanych limfocytów CD4+CD25+
prowadzono na podłożu RPMI 1640 wzbogaconym w 2mM glutaminę, 5% surowicę płodową-wołową, 10mM HEPES, 100U/mL
penicyliny i streptomycyny. Hodowlę utrzymywano przez 72 godziny w sterylnych płytkach, w temp. 37°C i atmosferze 5% CO2.
Stymulację wysortowanych limfocytów CD4+CD25+ przeprowadzono z zastosowaniem ludzkiej rekombinowanej leptyny (Recombinant Human Leptin 1 mg/ml – R&D SYSTEMS), w końcowym
stężeniu 100 ng/mL.
Oznaczenie stężenia leptyny
Stężenie leptyny zostało oznaczone przy użyciu zestawu QUANTIKE human Leptin firmy R&D Systems zgodnie z instrukcją producenta zestawu odczynników.
Analiza statystyczna
Statystyczne opracowanie wyników przeprowadzono przy użyciu
programu STATISTICA wersja 10 PL. Zmienne ilościowe przedstawiono, jako medianę, kwartyle górny i dolny. Test Kruskala-Wallis’a używano w celu porównania wielu grup niezależnych. Do
porównania dwóch grup niezależnych użyto testu U Manna-Whitneya. Za istotne statystycznie uznawano wartości prawdopodobieństwa p<0,05. Do oceny korelacji wykorzystano współczynnik
rang Spearmana.
Oznaczenie stężenia rozpuszczalnego receptora leptyny (LepR)
Stężenie rozpuszczalnego receptora leptyny zostało oznaczone
przy użyciu zestawu QUANTIKE human leptin sR Immunoassay
firmy R&D Systems zgodnie z instrukcją producenta zestawu odczynników.
Wyniki
Przedstawione wyniki wykazały, że w grupie kobiet chorych na
astmę ciężką wartość BMI były znamiennie wyższe w porównaniu do grupy kobiet chorych na astmę umiarkowaną-łagodną
(p<0,05) (tab. II). Kobiety chore na astmę umiarkowaną-łagodną
Tabela I. Charakterystyka grup badanych
Parametr
Astma ciężka (SA)
Astma umiarkowana-łagodna (MA)
Grupa kontrolna (NC)
N
17
13
25
Wiek lata (średnia ± SD)
50 ± 15,5
43 ± 13,5
45 ± 11, 1
Czas trwania choroby – lata
(średnia ± SD)
15 ± 7,5
9 ± 5,1
-
Atopia (Tak/Nie)
14/3
11/2
0/25
FEV1 % (średnia ± SD)
67% ± 15,0
75 ± 16,5
92 ± 6,5
BMI (Body Mass Index) – wskaźnik masy ciała
FEV1 (Forced Expiratory Volume) – natężona pierwszosekundowa objętość wydechowa
Tabela II. Porównanie wartości BMI oraz stężenia leptyny, receptora leptyny, w surowicy, u kobiet chorych na astmę ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) i w grupie
kontrolnej (NC).
Grupa
Astma ciężka (SA)
Astma umiarkowana– łagodna
(MA)
Grupa kontrolna (NC)
Mediana
Dolny
kwartyl
Górny
kwartyl
Mediana
Dolny
kwartyl
Górny
kwartyl
Mediana
Dolny
kwartyl
Górny
Kwartyl
BMI
29,2
24,2
35,3
22,8
20,8
26,8
22,5
20,7
24,8
Leptyna [pg/ml]
252,8
116,7
362,6
136,1
107,1
201,2
52,6
31,9
102,4
Receptor leptyny [ng/ml]
1,44
0,74
2,64
0,99
0,33
1,79
0,71
0,49
1,04
279
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
Rycina 1. Stężenie leptyny u kobiet chorych na astmę ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) i w grupie kontrolnej (NC).
Rycina 2. Stężenie receptora dla leptyny u kobiet chorych na astmę ciężką (SA),
umiarkowaną-łagodną (MA) i w grupie kontrolnej (NC).
nie wykazywały nadwagi, a wartości BMI w badanej grupie były
zbliżone do wartości w grupie kontrolnej (tab. II).
Analiza korelacji badanych parametrów.
Oceniono korelacje w grupach badanych i grupie kontrolnej pomiędzy wartościami BMI, stężeniem leptyny i jej rozpuszczalnego
receptora, oraz ekspresją FoxP3 w limfocytach Treg CD4+. Wyniki
korelacji przestawiono w tabeli IV. Wykazano istotną korelację
Ocena średnich stężeń, leptyny
Zaobserwowano, że w grupach kobiet chorych na astmę ciężką
i umiarkowaną – łagodną stężenie leptyny było znamiennie podwyższone w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,05). Stężenie
leptyny u kobiet chorych na astmę ciężką było 5-krotnie wyższe
w porównaniu do grupy kontrolnej (tab. II, ryc.1).
Ocena średnich stężeń receptora leptyny
Wykazano, że stężenie receptora leptyny w grupie kobiet chorych
na astmę ciężką było znamiennie podwyższone (p<0,05) w porównaniu do kobiet z grupy kontrolnej (tab. II, ryc.2).
Wpływ leptyny na limfocyty regulatorowe pTreg
Nie stwierdzono w hodowlach in vitro, znamiennego wpływu
leptyny, na odsetek limfocytów regulatorowych CD4+ z ekspresją
FoxP3 zarówno u kobiet chorych na astmę ciężką jak i umiarkowaną – łagodną i w grupie kontrolnej (ryc. 3, tab. III). Nie wykazano,
znamiennego obniżenie odsetka limfocytów o immunofenotypie
CD4+CD25highCD127lowFoxP3+CD152+ po stymulacji leptyną, w warunkach in vitro, u kobiet chorych na ciężką astmę w porównaniu
do grupy chorych na astmę umiarkowaną-łagodną i grupy kontrolnej (ryc. 4, tab. III).
jedynie pomiędzy wartością wskaźnika BMI a stężeniem leptyny
w grupach pacjentek chorych na astmę ciężką (SA).
Dyskusja
Uważa się, że podstawową rolę w interakcjach między komórkami
infiltrującymi tkankę tłuszczową w procesie zapalnym odgrywają
limfocyty regulatorowe T CD4+, którym przypisuje się indukcję
sygnału przeciwzapalnego, hamującego inicjację tego procesu.
Wykazano również, że liczba limfocytów regulatorowych T CD4+,
w tkance tłuszczowej jest niższa u myszy otyłych w porównaniu do nie otyłych. Winer i wsp. w przeprowadzonych badaniach
wykazali korzystny wpływ podania limfocytów T CD4+ na zahamowanie rozwoju otyłości i insulinooporności u myszy z dietą
bogatotłuszczową [11].
W patogenezie astmy kluczową rolę odgrywa zaburzenie równowagi pomiędzy subpopulacjami limfocytów T, z dominacją odpowiedzi
zapalnej typu Th2. Uważa się, że jedną z przyczyn tych zaburzeń
jest dysfunkcja regulatorowych limfocytów T CD4+, co prowadzi
do zakłócenia tolerancji immunologicznej organizmu. W wyniku
tego procesu dochodzi do rozwoju chorób alergicznych i astmy.
Tabela III. Porównanie ekspresji FoxP3 w limfocytach regulatorowych CD4+ (pTreg) i odsetka limfocytów o immunofenotypie CD4+CD25highCD127lowFoxP3+CD152+ po
stymulacji leptyną u kobiet chorych na astmę ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) i w grupie kontrolnej (NC).
Grupa
280
Astma ciężka (SA)
Astma umiarkowana– łagodna
(MA)
Grupa kontrolna (NC)
Mediana
Dolny
kwartyl
Górny
kwartyl
Mediana
Dolny
kwartyl
Górny
kwartyl
Mediana
Dolny
kwartyl
Górny
kwartyl
Ekspresja FoxP3 w pTreg
po stymulacji
leptyną
76,4%
60,6%
81,4%
85,3%
83,8%
89,2%
87,3%
78,0%
88,3%
Odsetek limfocytów
o immunofenotypie
CD4+CD25high
CD127lowFoxP3+CD152+
71,3%
58.0%
87,5%
85,8%
82,0%
88,0%
77,0%
65,0%
81,2%
Diagn Lab 2015; 51(4): 277-284
Rycina 3. Ekspresja FoxP3 w limfocytach pTreg przed i po stymulacji leptyną
u kobiet chorych na astmę ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) i w grupie
kontrolnej (NC).
Rycina 4. Odsetek limfocytów regulatorowych o immunofenotypie CD4+CD25high
CD127low FoxP3+CD152+ po stymulacji leptyną u kobiet chorych na astmę
ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) i w grupie kontrolnej (NC).
W przedstawionych wynikach badań zaobserwowano, że odsetek
limfocytów pTreg, u kobiet chorych na astmę ciężką nie różnił się
znamiennie w porównaniu do grup z astmą umiarkowaną-łagodną i grupy kontrolnej. Uzyskane wyniki nie wykazały także innych
Wyniki badań grupy ENFUMOSA wskazują, że jedną z odmian
fenotypowych ciężkiej postaci astmy jest płeć żeńska [16]. Jednak w przedstawionych wynikach badań nie wykazano istotnej
różnicy w odsetku limfocytów regulatorowych T (Treg) u kobiet
chorych na astmę ciężką w porównaniu do grupy z astmą umiarkowaną-łagodną.
znamiennych różnic fenotypowych w subpopulacji limfocytów
regulatorowych T CD4+ we krwi obwodowej chorych na astmę
o różnym stopniu ciężkości. Podobnie jak w badaniach Zhanga
zaobserwowano, że u kobiet chorych na astmę, limfocyty regulatorowe Treg wykazują ekspresję FoxP3 i CD152. Nie stwierdzono
jednak istotnych statystycznie różnic w odsetku limfocytów Treg
FoxP3+ i ekspresji CD152 pomiędzy chorymi kobietami z ostrą
i stabilną postacią astmy a grupą kontrolną [12].
Jednak informacje dotyczące deficytu i dysfunkcji limfocytów
regulatorowych CD4+ w chorobach alergicznych i astmie są często niejednoznaczne. Według Shi i wsp. nie ma wyraźnej różnicy
w liczbie limfocytów Treg CD4+ u pacjentów z atopią lub astmą
w porównaniu do grupy kontrolnej. Wykazano natomiast wzrost
liczby regulatorowych limfocytów podczas zaostrzeń astmy [13].
Zmian tych nie stwierdzono u pacjentów ze stabilną postacią astmy. Natomiast Xue i wsp. oraz Węgrzyn A i wsp. w swoich badaniach wykazali obniżenie odsetka limfocytów Treg u chorych na
astmę, szczególnie w fazie zaostrzenia choroby [14, 15].
Prawidłowe działanie limfocytów Treg determinuje obecność
swoistego markera funkcjonalnego – czynnika transkrypcyjnego
FoxP3, kontrolowanego przez gen FOXP3 [17]. Należy podkreślić,
że dane literaturowe dotyczące ekspresji czynnika transkrypcyjnego FoxP3 u chorych na astmę są niejednoznaczne. Niektóre
doniesienia sugerują, że wiek pacjentów może odgrywać istotną
rolę w zaburzeniach funkcji limfocytów regulatorowych T CD4+.
U starszych pacjentów chorych na astmę zaobserwowano niższą
ekspresję mRNA dla genu FOXP3, co może tłumaczyć osłabienie
funkcji limfocytów Treg [18].
Istnieje coraz więcej dowodów potwierdzających wpływ leptyny
na funkcje limfocytów regulatorowych T CD4+. W wielu pracach
eksperymentalnych zaobserwowano, że leptyna wykazująca
strukturalne podobieństwo do IL-6 i jest czynnikiem modulującym funkcje limfocytów Treg [19]. Wykazano także, że leptyna w warunkach in vitro ma właściwości immunomodulacyjne,
Tabela IV. Korelacje pomiędzy BMI, stężeniem leptyny, receptorem leptyny oraz czynnikiem transkrypcyjnym FoxP3 u kobiet chorych na astmę ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) i w grupie kontrolnej (NC).
Grupa
Astma ciężka (SA)
Astma umiarkowana-łagodna
(MA)
Grupa kontrolna (NC)
BMI / leptyna [pg/ml]
R = 0,74
p < 0,001
R = 0,40
p = NS
R = 0,08
p = NS
BMI / rozpuszczalny receptor leptyny [ng/ml]
R = 0,28
p = NS
R = 0,36
p = NS
R = -0,17
p = NS
BMI / FoxP3 [%]
R = -0,13
p = NS
R = -0,03
p = NS
R = 0,06
p = NS
leptyna [pg/ml] / rozpuszczalny receptor
leptyny [ng/ml]
R = 0,19
p = NS
R = 0,17
p = NS
R = 0,33
p = NS
leptyna [pg/ml] / Foxp3 [%]
R = 0,11
p = NS
R = -0,15
p = NS
R = -0,13
p = NS
rozpuszczalny receptor leptyny [ng/ml] /
Foxp3 [%]
R = 0,06
p = NS
R = 0,40
p = NS
R = 0,23
p = NS
281
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
supresorowe w stosunku do limfocytów regulatorowych [19, 20, 21].
Wei R i wsp. w swoich badaniach wykazali, że hamujący wpływ
leptyny na limfocyty regulatorowe manifestuje się obniżeniem
ekspresji TGF-β, IL-10, CTLA4, i GITR oraz osłabieniem właściwości Treg do hamowania proliferacji i produkcji mediatorów
zapalnych przez subpopulację limfocytów T CD8+ [21]. Natomiast w eksperymencie grupy De Rosa wykazano, że leptyna
moduluje procesy czynnościowe – hyporeaktywność i proliferację komórek regulatorowych T (Treg) zarówno w warunkach in
vivo jak i in vitro. Leptyna wywiera negatywny wpływ na proces
proliferacji ludzkich komórek regulatorowych CD4+CD25+Foxp3+
(Treg), wprowadzając je w stan anergii. Zaobserwowano, także,
że limfocyty Treg mają zdolność syntezy leptyny oraz wykazują
wysoką ekspresję receptora leptynowego (LepR), co z kolei na
drodze autokrynnej wpływa na zahamowanie ich proliferacji.
Blokowanie (neutralizacja) leptyny monoklonalnymi przeciwciałami (mAb) w obecności cząsteczek kostymulujących (anty-CD3, anty-CD28) przywraca zdolności proliferacyjne limfocytom
regulatorowym [22]. Przedstawione wyniki badań potwierdziły
ekspresję receptora leptyny u chorych na astmę, w surowicy niezależnie od jej ciężkości. Jednak najwyższą ekspresję receptora
leptyny wykazano u kobiet chorych na astmę ciężką. Otrzymane
wyniki badań sugerują, że leptyna nie wpływa bezpośrednio na
ekspresję czynnika transkrypcyjnego FoxP3, a raczej może działać
poprzez stymulacje innych ścieżek sygnałowych. Przypuszcza się,
że limfocyty Treg CD4+ z ekspresją receptora leptyny (LepR) mogą
migrować do tkanki tłuszczowej przez mechanizm zależny od stymulacji leptyną wydzielaną z adipocytów. Dodatkowo uważa się,
że leptyna może kontrolować ekspansję i proliferację limfocytów
regulatorowych CD4+ także przez stymulacje antygenową. Obserwowane w otyłości wysokie stężenia tej adipocytokiny zaburzają
homeostazę limfocytów Treg CD4+, co skutkuje zmniejszoną ich
liczbą i osłabieniem funkcji supresyjnych. W efekcie zmiany te prowadzą do zaostrzenia procesu zapalnego charakteryzującego się
napływem komórek o właściwościach prozapalnych; limfocytów
CD8+, limfocytów o profilu cytokinowym Th1, makrofagów i mastocytów [23].
Doświadczenia Taleba i wsp. wykazały, że zaburzony signaling
leptyny prowadzi do wzrostu liczby i aktywności limfocytów regulatorowych T CD4+. Proces ten związany jest także z redukcją
zmian o charakterze aterogennym.
Wiele badań przeprowadzonych na modelach eksperymentalnych
potwierdza, że brak leptyny bądź hamowanie jej lub receptora leptyny chroni przed rozwojem wielu schorzeń o podłożu zapalnym
(zapalenie jelit, zapalenie mózgu, cukrzyca) [24].
W przeprowadzonych badaniach nie zaobserwowano hamującego wpływu leptyny, na odsetek regulatorowych limfocytów T
CD4+ u kobiet chorych na astmę w zależności od ciężkości choroby, oraz nie wykazano wzrostu ekspresji czynnika transkrypcyjnego FoxP3 po stymulacji leptyną. Tym samym w przeprowadzonym eksperymencie nie potwierdzono bezpośredniego
immunomodulującego wpływu leptyny w warunkach in vitro
na badaną subpopulację limfocytów regulatorowych u kobiet
chorych na astmę.
282
Wnioski
W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono bezpośredniego
wpływu leptyny, na populację regulatorowych limfocytów T CD4+
i ekspresję czynnika transkrypcyjnego FoxP3 w tych komórkach,
u kobiet chorych na astmę ciężką i umiarkowaną-łagodną, co
nie wyklucza możliwości wpływu tej adipocytokiny przez inne
ścieżki sygnałowe.
Praca finansowana z programu finansowania badań młodych
pracowników nauki i studentów studiów doktoranckich nr: 50203/1-095-05/502-14-206.
Piśmiennictwo
1.
Ziora D, Sitek P, Machura E, et al. i wsp. [Bronchial asthma in obesity--a distinct
phenotype of asthma?]. Pneumonol Alergol Pol 2012; 80: 454-462.
2.
Zammit C, Liddicoat H, Moonsie I, et al. Obesity and respiratory diseases. Int
3.
Busse WW, Banks-Schlegel S, Wenzel SE. Pathophysiology of severe asthma.
J Gen Med 2010; 3: 335-343.
J Allergy Clin Immunol 2000; 106: 1033-1042.
4.
Akdis CA ,Akdis M. Mechanisms of allergen-specific immunotherapy and immune tolerance to allergens. World Allergy Organ J 2015; 8: 17.
5.
Palomares O, Yaman G, Azkur AK, et al. Role of Treg in immune regulation of
allergic diseases. Eur J Immunol 2010; 40: 1232-1240.
6.
Karagiannidis C, Akdis M, Holopainen P, et al. Glucocorticoids upregulate FOXP3
expression and regulatory T cells in asthma. J Allergy Clin Immunol 2004; 114:
1425-1433.
7.
Mosen DM, Schatz M, Magid DJ, et al. The relationship between obesity and
asthma severity and control in adults. J Allergy Clin Immunol 2008; 122: 507-511.
8.
Pakhale S, Doucette S, Vandemheen K, et al. A comparison of obese and nonobese people with asthma: exploring an asthma-obesity interaction. Chest
2010; 137: 1316-1323.
9.
The ENFUMOSA cross-sectional European multicentre study of the clinical
phenotype of chronic severe asthma. European Network for Understanding
Mechanisms of Severe Asthma. Eur Respir J 2003; 22: 470-477.
10. Kuprys-Lipinska I, Elgalal A, Kuna P. [Skin prick test with inhaled allergens in the
general population of Lodz province]. Pneumonol Alergol Pol 2009; 77: 229-234.
11. Winer S, Chan Y, Paltser G, et al. Normalization of obesity-associated insulin
resistance through immunotherapy. Nat Med 2009; 15: 921-929.
12. Zhang Q, Qian FH, Liu H, et al. Expression of surface markers on peripheral
CD4+CD25high T cells in patients with atopic asthma: role of inhaled corticosteroid. Chin Med J (Engl ) 2008; 121: 205-212.
13. Shi HZ,Qin XJ. CD4CD25 regulatory T lymphocytes in allergy and asthma. Allergy
2005; 60: 986-995.
14. Xue K, Zhou Y, Xiong S, et al. Analysis of CD4+ CD25+ regulatory T cells and
Foxp3 mRNA in the peripheral blood of patients with asthma. J Huazhong Univ
Sci Technolog Med Sci 2007; 27: 31-33.
15. Wegrzyn AS, Jakiela B, Ruckert B, et al. T-cell regulation during viral and nonviral
asthma exacerbations. J Allergy Clin Immunol 2015; 136: 194-197.
16. Holgate ST, Holloway J, Wilson S, et al. Understanding the pathophysiology
of severe asthma to generate new therapeutic opportunities. J Allergy Clin
Immunol 2006; 117: 496-506.
17. Yagi H, Nomura T, Nakamura K, et al. Crucial role of FOXP3 in the development
and function of human CD25+CD4+ regulatory T cells. Int Immunol 2004; 16:
1643-1656.
18. Vale-Pereira S, Todo-Bom A, Geraldes L, et al. FoxP3, GATA-3 and T-bet expression
in elderly asthma. Clin Exp Allergy 2011; 41: 490-496.
19. La CA,Matarese G. The weight of leptin in immunity. Nat Rev Immunol 2004;
4: 371-379.
20. Procaccini C, De R, V, Galgani M, et al. An oscillatory switch in mTOR kinase
activity sets regulatory T cell responsiveness. Immunity 2010; 33: 929-941.
21. Wei R, Hu Y, Dong F, et al. Hepatoma cell-derived leptin down-regulates the
immunosuppressive function of regulatory T cells to enhance the anti-tumor
activity of CD8+ T cells. Immunol Cell Biol 2015.
Diagn Lab 2015; 51(4): 277-284
22. De R, V, Procaccini C, Cali G, et al. A key role of leptin in the control of regulatory
T cell proliferation. Immunity 2007; 26: 241-255.
23. Matarese G, Procaccini C, et al. Regulatory T cells in obesity: the leptin connection. Trends Mol Med 2010; 16: 247-256.
24. Taleb S, Herbin O, Ait-Oufella H, et al. Defective leptin/leptin receptor signaling
improves regulatory T cell immune response and protects mice from atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007; 27: 2691-2698.
Adres do korespondencji:
dr n. med. Łukasz Kraszula
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej
II Katedra Chorób Wewnętrznych
90-153 Łódź, Kopcińskiego 22
tel. +48 42 6776981
e-mail: [email protected]
Zaakceptowano do druku: 30.12.2015
283