Przydatność technik przesiewowych SSCP i DGGE w identyFikacji

Przydatność technik przesiewowych SSCP i DGGE w identyFikacji

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
0RZYDATNOu¿TECHNIKPRZESIEWOWYCH33#0I$''%
WIDENTYFIKACJIMUTACJIWZESPOLELONG†14
5TILITYOFMOLECULARSCREENINGTECHNIQUES33#0AND$''%
INTHEDETECTIONOFLONG†14SYNDROMEMUTATIONS
%WA-ORIC†*ANISZEWSKA,UDMIŒA7ÃGLARZ'RA˜YNA-ARKIEWICZ†|OSKOT,ESŒAW3ZYDŒOWSKI
+ATEDRAI:AKŒAD"IOCHEMIIgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
)+ATEDRA+ARDIOLOGII$ZIECIÃCEJgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
Streszczenie
Abstract
Wrodzony zespół wydłużonego odstępu QT (LQTS) jest
heterogenną genetycznie chorobą dziedziczną, której cechami są: zmiany w zapisie EKG (wydłużenie odstępu QT,
nieprawidłowa morfologia załamka T) oraz predyspozycja do występowania zagrażających życiu arytmii komorowych („torsade de pointes”) prowadzących do omdleń,
zatrzymania akcji serca, oraz nagłej śmierci sercowej.
Najczęściej występujące typy zespołu są spowodowane
mutacjami w genach KCNQ1 (LQTS1), HERG (LQTS2)
i SCN5A (LQTS3), które kodują podjednostki kanałów
jonowych w mięśniu sercowym. Ważną rolę w diagnostyce LQTS odgrywają badania molekularne (SSCP, DGGE,
sekwencjonowanie), umożliwiające zidentyfikowanie
nosicieli „cichych mutacji”, u których nie występują objawy kliniczne, określenie podtypu molekularnego oraz
potwierdzenie diagnozy klinicznej. Metody przesiewowe
opierają się na założeniu, że prawidłowe i zmutowane fragmenty DNA wykazują różną ruchliwość elektroforetyczną
w żelu poliakrylamidowym w warunkach niedenaturujących (SSCP) lub w gradiencie czynnika denaturującego
(DGGE). Analiza mSSCP wykazuje wyższą czułość w stosunku do klasycznego SSCP, ze względu na zastosowanie
kilkukrotnej zmiany temperatury podczas rozdziału elektroforetycznego w miejsce przeprowadzania kilku rozdziałów w różnych, ale stałych temperaturach. Celem pracy
było porównanie technik przesiewowych mSSCP i DGGE
pod względem ich zdolności do wykrywania mutacji
i polimorfizmów w genach KCNQ1, HERG i SCN5A.
Badaniom poddano 35 pacjentów Kliniki Kardiologii
Dziecięcej SUM w Katowicach-Ligocie, których krew
pełna posłużyła do wyizolowania DNA genomowego stanowiącego matrycę do zamplifikowania fragmentów analizowanych genów. Na podstawie otrzymanych wyników
stwierdzono, że w przypadku genu KCNQ1 metodą lepiej
różnicującą zmiany polimorficzne i mutacje była DGGE,
natomiast w przypadku genów HERG i SCN5A – mSSCP.
Wyniki obu analiz powinny zostać potwierdzone poprzez
wykonanie bezpośredniej analizy sekwencyjnej.
Congenital long QT syndrome (LQTS) is a genetically
heterogeneous inherited disease characterized by ECG
changes (QT prolongation, abnormal T wave morphology) and predisposition to the occurrence of life-threatening ventricular arrhythmia (torsade de pointes) leading
to fainting , cardiac arrest and sudden cardiac death. The
most common types of syndrome are due to mutations in
the genes KCNQ1 (LQTS1), HERG (LQTS2) and SCN5A
(LQTS3) which encode subunits of ion channels in the
myocardium. An important role in the diagnosis of LQTS
molecular methods (SSCP, DGGE, sequencing) enabling
the identification of „silent mutation” carriers with no clinical symptoms, determination of molecular subtype of the
disease and confirmation of clinical diagnosis. Screening
methods are based on the assumption that the correct and
mutant DNA fragments have different electrophoretic mobility in a polyacrylamide gel under non-denaturing conditions (SSCP) or denaturing factor gradient (DGGE). The
mSSCP analysis shows higher sensitivity than the classical
SSCP due to the use of severalfold temperature changes
during the electrophoresis instead of several separations at
a different but constant temperatures. The aim of this study
was to compare mSSCP and DGGE screening techniques
in terms of their ability to detect mutations and polymorphisms in the KCNQ1, HERG, and SCN5A genes. The
study involved 35 patients of the Department of Pediatric
Cardiology in Katowice-SUM Ligota, whose whole blood
was used to isolate genomic DNA as a template for amplification of the fragments of analyzed genes. It was found
that of both methods used, DGGE was better to differentiate polymorphisms and mutations in KCNQ1 gene, whereas for genes HERG and SCN5A was preferable one. The
results of both analyses are recommended to be confirmed
by direct sequence analysis.
Key words: long-QT; SSCP, DGGE, genetic polymorphism, mutation, the potassium and sodium ion channels
Słowa kluczowe: zespół long-QT; SSCP, DGGE, polimorfizm
genetyczny, mutacje, potasowe i sodowe kanały jonowe
&ARM0RZEGL.AUK
Wstęp
Wrodzony zespół wydłużonego QT (ang. long QT syndrome, LQTS) jest rzadką, uwarunkowaną genetycznie
chorobą związaną z wysokim ryzykiem występowania zagrażających życiu arytmii komorowych. Cechami charakterystycznymi choroby są zmiany w zapisie elektrokardiograficznym (EKG), obejmujące wydłużenie czasu trwania
odstępu QT oraz nieprawidłową morfologię załamka T,
jak również występowanie polimorficznego częstoskurczu
komorowego typu „torsade de pointes”, który może być
przyczyną omdleń, zatrzymania akcji serca, a nawet nagłej
śmierci sercowej (ang. sudden cardiac death, SCD) u młodych, pozornie zdrowych osób [1, 2].
Odstęp QT odzwierciedla czas trwania depolaryzacji i repolaryzacji komórek mięśnia sercowego, a jego wydłużenie
świadczy o spowolnieniu procesu repolaryzacji (odstęp QT
skorygowany względem długości cyklu serca – QTc powyżej 450 ms u mężczyzn i powyżej 460 ms u kobiet) [2]. Za
prawidłową depolaryzację i repolaryzację kardiomiocytów
odpowiadają białka kanałów jonowych w mięśniu sercowym przewodzące prądy jonów sodu, potasu oraz wapnia.
U podstaw zespołu LQT leżą mutacje genów, których produkty białkowe wchodzą w skład prawidłowych kanałów
jonowych. Do dnia dzisiejszego opisano blisko 500 mutacji
związanych z występowaniem objawów LQTS. Są one zlokalizowane w jedenastu różnych genach na chromosomach
3, 4, 6, 7, 11, 17 i 21 [3, 4].
Mutacje w genach KCNQ1 oraz KCNE1 są odpowiedzialne za nieprawidłową budowę kanału przewodzącego
wolno aktywowany opóźniony prąd potasowy (IKs) i występowanie odpowiednio typu 1 oraz 5 zespołu wydłużonego
odstępu QT. Z kolei mutacje w genach HERG i KCNE2 są
związane z upośledzeniem funkcji kanału przewodzącego
szybko aktywowany opóźniony prąd potasowy (IKr) i występowanie LQTS2 oraz LQTS6. Typ 3 LQT jest spowodowany mutacją w genie SCN5A, co prowadzi do zwiększonej
aktywności kanału sodowego przewodzącego prąd depolaryzacji (INa) [4].
Zespół wydłużonego QT może występować w kilku
postaciach klinicznych. W zdecydowanej większości przypadków (99%) ujawnia się jako dziedziczony autosomalnie
dominująco zespół Romano-Warda (ang. Romano-Ward
syndrome, RWS). Spośród sześciu genotypów związanych
z RWS (LQTS1 – LQTS6), najczęściej występującymi postaciami są LQTS1, LQTS2 oraz LQTS3 [2, 4]. Postacią
autosomalną recesywną choroby odpowiadającą za pozostały 1% przypadków jest zespół Jervell i Lange-Nielsena (JLNS), spowodowany mutacjami homozygotycznymi
w genach KCNQ1 i KCNE1 [2, 5, 6].
Poszczególne podtypy LQTS, wyodrębnione na podstawie badań genetycznych, różnią się między sobą czynnikami
wyzwalającymi objawową arytmię komorową. U pacjentów
z LQTS1 stymulacja β-adrenergiczna powoduje wydłużenie
czasu trwania odstępu QT, stąd epizody sercowe u tych pacjentów są najczęściej wywoływane przez wysiłek fizyczny
(zwłaszcza pływanie) oraz stres emocjonalny (gniew, walka,
lęk). W LQTS2 typowym czynnikiem wywołującym arytmię jest głośny bodziec słuchowy taki jak alarm budzika,
dźwięk telefonu, dzwonka, syreny alarmowej czy też grzmot
w czasie burzy. Pacjenci z LQTS3 są szczególnie predysponowani do arytmii podczas snu i odpoczynku, co wiąże się
z wolniejszą akcją serca [5].
Istotne znaczenie w procesie diagnostycznym mają
w chwili obecnej badania molekularne. Należy pamiętać,
że u osób będących nosicielami mutacji, u których przebieg
choroby jest bezobjawowy (nosiciele tzw. „cichych mutacji”) pod wpływem różnych czynników wydłużających odstęp QT, takich jak zaburzenia elektrolitowe czy niektóre
leki może dojść do zatrzymania krążenia. Dlatego też, ważne jest określenie genotypu zarówno u osób z podejrzeniem
LQTS lub zdiagnozowanym zespołem, jak również u członków ich rodzin. Co więcej, badania genetyczne są przydatne
w ocenie ryzyka występowania zdarzeń sercowych [2, 4,
11].
Założenia i cele pracy
Głównym celem pracy było porównanie technik przesiewowych mSSCP (ang. multitemperature single-strand conformation
polymorphism) i DGGE (ang. denaturing gradient gel electrophoresis) pod względem ich zdolności do wykrywania zmian
polimorficznych i mutacji w genach KCNQ1, KCNH2 (HERG)
oraz SCN5A, które są odpowiedzialne za występowanie odpowiednio typu 1, 2 oraz 3 zespołu long QT.
Przeprowadzone badania polegały na wytypowaniu materiału genetycznego z możliwym polimorfizmem lub mutacjami do
bezpośredniej analizy sekwencyjnej oraz wykazanie przydatności
wyżej wymienionych metod w diagnostyce, obejmującej zarówno potwierdzenie zespołu LQT u osób z podejrzeniem arytmii
oraz członków rodzin chorych ze zdiagnozowanym zespołem,
jak również określenie podtypu molekularnego LQTS.
Cel pracy realizowano w oparciu o metody biologii molekularnej obejmujące izolację genomowego DNA, amplifikację
(PCR) fragmentów genów kodujących kanały jonowe IKs, IKr, INa,
wykrywanie zmian polimorficznych i mutacji technikami przesiewowymi mSSCP i DGGE. Na przeprowadzenie badań molekularnych uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy Śląskim
Uniwersytecie Medycznym w Katowicach.
Materiał i metody
Izolacja DNA genomowego z krwi pełnej
Izolację DNA genomowego prowadzono z 5 ml krwi
pełnej 35 pacjentów Kliniki Kardiologii Dziecięcej SUM
w Katowicach- Ligocie używając zestawu Genomic DNA
Prep Plus, Blood DNA Prep Plus (A&A BIOTECHNOLOGY). Uzyskany w wyniku izolacji DNA poddano ocenie
jakościowej techniką elektroforezy agarozowej oraz ilościowej na podstawie spektrofotometrycznego pomiaru jego
stężenia.
Amplifikacja genów KCNQ1, HERG, SCN5A
techniką PCR
W celu przygotowania matrycy do przeprowadzenia
dalszej analizy genetycznej wykonano reakcję amplifikacji.
Wyboru primerów dokonano w oparciu o dane literaturowe.
Amplifikację eksonów 2-7 genu KCNQ1 prowadzono wykorzystując 6 oligonukleotydowych par primerów zaprojektowanych przez Wang i wsp. [8]; do amplifikacji eksonów
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
0%2#%.4
,%.'(4;MM=
Ryc. 1. Obraz krzywych densytometrycznych wraz z elektroforegramami, przedstawiającymi charakterystyczne wzory prążkowe uzyskane dla eksonu 3 genu KCNQ1 techniką
mSSCP.
1-15 genu HERG wykorzystano 24 pary primerów, zaprojektowanych przez Itoh i wsp. [9], natomiast amplifikacji
eksonów 1-28 genu SCN5A dokonano używając 41 par primerów, zaprojektowanych przez Wang i wsp. [8]. Primery
0%2#%.4
0%2#%.4
,%.'(4;MM=
,%.'(4;MM=
0%2#%.4
0%2#%.4
,%.'(4;MM=
,%.'(4;MM=
exon 6
exon 2 mSSCP HERG
Exon 3 mSSCP KCNQ1
zostały zsyntetyzowane przez IDT. Inc. Gdańsk. Reakcja
amplifikacji została przeprowadzona w całkowitej objętości
25 μl. Bufory reakcyjne, roztwory deoksyrybonukleotydów
(dNTP), primerów oraz enzymu przygotowywano według
standardowych procedur. Wszystkie reakcje amplifikacji
prowadzono przy użyciu amplifikatora Perkin Elmer Gene
Amp PCR System 9600.
Dla genu KCNQ1 reakcja amplifikacji przebiegała w następującym profilu termicznym: denaturacja w temperaturze
94°C przez 1 min; 5 cykli amplifikacji o profilu: 94°C – 20 s,
64°C – 20 s, 72°C – 30 s; 25 cykli z temperaturą annealingu
62°C; końcowe wydłużanie w temperaturze 72°C przez 10
min.
Gen HERG amplifikowano w następującym profilu termicznym: denaturacja w temperaturze 94°C przez 3 min
– 1 cykl; 35 cykli amplifikacji o profilu: 94°C – 1 min, 58°C
– 1 min, 72°C – 1 min; końcowe wydłużanie w temperaturze
72°C przez 10 min Dla eksonów 1 i 2 oraz 6 i 7 temperatura
annealingu wynosiła 60°C.
Reakcję amplifikacji dla genu SCN5A prowadzono
w trzech profilach termicznych: A) denaturacja w temperaturze 94°C przez 3 min – 1 cykl; 35 cykli amplifikacji o profilu: 94°C – 1 min, 64°C – 1 min, 72°C – 1 min; końcowe
wydłużanie w temperaturze 72°C przez 10 min B) denaturacja w temperaturze 94°C przez 3 min; 11 cykli amplifikacji
Ryc. 2. Obraz elektroforegramów i krzywych densytometrycznych przedstawiających różne typy wzorów prążkowych
otrzymanych, w wyniku analizy mSSCP, dla eksonów 2, 6 genu HERG.
&ARM0RZEGL.AUK
3 min; 13 cykli amplifikacji o profilu: 94°C – 1 min, zmienna temperatura annealingu w zakresie 70°C-58°C – 1 min
(spadek temperatury annealingu o 1°C/cykl), 72°C – 1 min;
30 cykli z temperaturą annealingu 60°C; końcowe wydłużanie w temperaturze 72°C przez 10 min.
0%2#%.4
,%.'(4;MM=
exon 13 mSSCP SCN5A
0%2#%.4
Detekcja mutacji techniką mSSCP w natywnym żelu
poliakrylamidowym
10 μl próbki zmieszano z 10 μl mieszaniny denaturującej. Całość denaturowano w 95°C przez 10 min, po czym
natychmiast umieszczono w lodzie, aby zapobiec renaturacji. Przygotowane próbki nanoszono do studzienek w 8%
żelu poliakrylamidowym (akrylamid:bisakrylamid 37,5:1)
z dodatkiem buforu TBE (0,89 M Tris-base, 0,89 M kwas
borowy, 20 mM EDTA pH = 8,0), zawierającym 5% glicerol. Poziomą elektroforezę prowadzono w buforze Tris-boranowym stosując prąd o stałym napięciu wynoszącym 200
V, w temperaturze 4°C, 10°C i 25°C przez 2,5 godziny. Po
rozdziale elektroforetycznym żel barwiono solami srebra,
a otrzymane wyniki analizowano przy pomocy systemu dokumentacji żelowej BASSYS1D firmy Biotec-Fischer oraz
GelScan v.1.45 firmy Kucharczyk.
,%.'(4;MM=
Wyniki i ich omówienie
0%2#%.4
,%.'(4;MM=
Ryc. 3. Obraz krzywych densytometrycznych wraz z oryginalnymi elektroforegramami, przedstawiającymi różne
wzory prążkowe uzyskane w wyniku analizy mSSCP dla 13
eksonu genu SCN5A.
o profilu: 94°C – 1 min, zmienna temperatura annealingu
w zakresie 70°C-60°C – 1 min (spadek temperatury annealingu o 1°C/cykl), 72°C – 1 min; 30 cykli z temperaturą annealingu 60°C; końcowe wydłużanie w temperaturze 72°C
przez 10 min C) denaturacja w temperaturze 94°C przez
Detekcja mutacji techniką DGGE
10 μl badanej próbki po zmieszaniu z 10 μl buforu obciążającego nanoszono na żel denaturujący z gradientem
stężenia mocznika w zakresie 60-90%. Rozdział elektroforetyczny prowadzono w aparacie D-Code firmy Bio-Rad
przy 170 V, w temperaturze 56°C przez 3,5 godziny.
Spośród 35 osób poddanych badaniom molekularnym
u 9 osób zdiagnozowano klinicznie, między innymi przy
pomocy EKG, pierwszy typ zespołu wydłużonego odstępu QT, u 6 osób stwierdzono typ drugi zespołu, natomiast
u żadnej z badanych osób nie zdiagnozowano LQTS3.
Pozostałe 20 osób to osoby zdrowe, bez potwierdzonych
klinicznie objawów LQTS, pochodzące z rodzin, u których
potwierdzono zespół wydłużonego odstępu QT. Badanie
molekularne polegało na wyizolowaniu z krwi obwodowej
pacjentów DNA genomowego, zamplifikowaniu wybranych fragmentów genów KCNQ1, HERG oraz SCN5A,
a następnie poddaniu produktów PCR analizie technikami
przesiewowymi – SSCP i DGGE.
Analizę jakościową wyizolowanych ekstraktów DNA
prowadzono techniką elektroforezy agarozowej. Obecność
w elektroforegramie pojedynczych prążków świadczyła
o braku zanieczyszczeń innymi rodzajami kwasów nukleinowych i produktów degradacji. Analizę ilościową DNA
przeprowadzono używając kalkulatora DNA/RNA Gene-Quant (Pharmacia Biotech) do pomiaru absorbancji
przy długości fali 260 nm. Średnie stężenie DNA wynosiło 0,041 ± 0,021 μg/μl. Średnia wartość współczynnika
oczyszczenia dla wszystkich badanych próbek wynosiła
1,834 ± 0,162 wskazując na dobry stopień odbiałczenia
preparatów DNA.
Otrzymane ekstrakty DNA genomowego poddano reakcji amplifikacji. Amplifikowano 6 eksonów genu KCNQ1,
15 eksonów genu HERG (KCNH2) oraz 28 eksonów genu
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Tab. I. Wynik komputerowej analizy elektroforegramu DGGE przedstawiającego rozdział 6 eksonu genu KCNQ1. Uwzględniono pozycję prążków wyrażoną w mm oraz typy polimorficzne wzorów prążkowych
DGGE - KCNQ1 ekson 6 (pozycja prążka [mm])
Nr prążka → Nr
ścieżki ↓
1
2
3
4
6
5
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
1
10
8,27
8,96
7,24
8,62
7,58
2
3
4
5
6
31,72
14,8
22,41
24,82
30
13,79
14,82
14,48
14,13
14,13
14,48
13,77
4,79
4,19
34,82
39,65
34,82
28,96
30
32,06
28,14
27,54
27,54
27,24
27,54
20,35
4,79
58,27
57,93
56,88
31,43
31,13
55,98
31,13
7
8
Typ DGGE
59,31
60
60
60,68
62,41
61,03
63,1
63,44
63,79
63,79
63,1
65,26
64,97
65,26
64,37
64,37
68,62
67,58
68
67,93
68,96
67,93
69,65
69,65
69,65
70
70,34
I
II
III
IV
IV
V
VI
VI
VI
VII
VII
VIII
IX
X
XI
XII
Tab. II. Wynik komputerowej analizy elektroforegramu DGGE przedstawiającego rozdział 9 eksonu genu SCN5A. Uwzględniono pozycję prążków wyrażoną w mm oraz typy polimorficzne wzorów prążkowych
DGGE - SCN5A ekson 9 (pozycja prążka [mm])
nr prążka →
nr ścieżki ↓
1
1
2
3
4
5
14
15
6
12
16
7
9
10
13
8
11
3,53
4,98
4,71
4,71
4,88
4,71
4,72
6,06
6,9
6,03
5,21
6,39
5,72
6,19
6,22
6,9
2
15,99
16,16
3
4
5
28,61
29,12
28,95
28,78
29,12
28,95
29,12
29,12
29,12
30,97
30,63
30,63
30,47
30,47
30,45
30,4
30,63
30,8
30,63
30,63
30,97
30,8
30,63
30,8
30,8
18,18
16,49
16,33
16,39
SCN5A. Oceny wielkości otrzymanych produktów reakcji
amplifikacji dokonano techniką elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, który po wybarwieniu poddano analizie
w systemie dokumentacji żelowej BASSYS1D firmy Biotec
Fischer. O wielkości danego produktu PCR wnioskowano
porównując jego ruchliwość elektroforetyczną do rozdzielonych składowych wzorca, którymi były fragmenty restrykcyjne plazmidu pBR322 trawionego endonukleazą HaeIII.
6
32,65
32,65
32,65
32,65
32,63
32,6
32,82
32,65
32,65
32,65
33,16
32,96
32,65
Typ DGGE
I
II
III
IV
IV
IV
IV
V
V
V
VI
VI
VI
VI
VII
VII
Dla wszystkich amplimerów przeprowadzono analizę statystyczną w celu weryfikacji hipotezy o jednakowej wartości
średniej prążka i wyznaczenia błędu kalkulacji w systemie
dokumentacji żelowej (wyniki Katedry Biochemii SUM).
Na podstawie położenia prążków potwierdzono specyficzność reakcji amplifikacji dla wszystkich uzyskanych amplimerów, a także określono wielkość każdego produktu PCR
wyrażoną w ilości par zasad (pz).
&ARM0RZEGL.AUK
0%2#%.4
0%2#%.4
,%.'(4;MM=
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
0%2#%.4
0/3)4)/.;MM=
0%2#%.4
exon 2 DGGE KCNQ1
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
0%2#%.4
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
Ryc. 4. Obraz elektroforegramów oraz krzywych densytometrycznych przedstawiających pięć typów polimorficznych wzorów prążkowych uzyskanych techniką DGGE dla
eksonu 2 genu KCNQ1.
W celu określenia polimorfizmu bądź też wykrycia mutacji, poszczególne eksony (2, 3, 4, 5, 6, 7) genu KCNQ1
poddano analizie mSSCP. We wszystkich ścieżkach żelu
stwierdzono obecność wyraźnych prążków, co wskazywało
na prawidłową denaturację próbek oraz właściwe dobranie
warunków rozdziału elektroforetycznego. Każda ścież-
ka zawierała prążki odpowiadające fragmentom ssDNA
oraz dsDNA, co świadczyło o niecałkowitej denaturacji
amplimerów. Fragmenty ssDNA migrowały w żelu wolniej, w porównaniu do fragmentów dsDNA. Oprócz próbek zdenaturowanych amplimerów w żelu umieszczono
kontrolnie niezdenaturowany produkt PCR, a także marker wielkości. Położenie dwóch prążków ssDNA na jednakowej wysokości sugerowało brak polimorfizmu czy
mutacji w badanym materiale. Dla każdego z przebadanych eksonów genu KCNQ1 uzyskano jeden charakterystyczny specyficzny wzór prążkowy, na który składały
się dwa prążki ssDNA oraz jeden odpowiadający dsDNA.
Wyjątek stanowił ekson 3, gdzie oprócz prążka dsDNA zaobserwowano cztery wolno migrujące prążki ssDNA (Ryc.
1). Obecność czterech prążków jednoniciowego DNA może
świadczyć o heterozygotyczności danego fragmentu DNA
lub wskazywać na istnienie w jego obrębie mutacji. Zweryfikowanie tych obserwacji wymaga jednak przeprowadzenia
sekwencjonowania tego fragmentu genu.
W przypadku genu KCNH2 (HERG) z uwagi na dużą
ilość analizowanych eksonów (1-15), przedstawiono wyniki badania dwóch eksonów tj. eksonu 2 i 6, w których
wykazano obecność wariantów konformacyjnych ssDNA.
W obu eksonach zaobserwowano po dwa wzory prążków
ssDNA (Ryc. 2.). Dla pierwszego z wymienionych były
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Tab. III. Porównanie technik mSSCP i DGGE
Gen
Ilość badanych
eksonów
KCNQ1
6
HERG
15
SCN5A
28
Razem
49
0%2#%.4
typ I
,%.'(4;MM=
typ III
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
Ryc. 5. Obraz krzywych densytometrycznych wraz z elektroforegramami ilustrującymi wyniki typowania polimorfizmu eksonu 5 genu HERG techniką DGGE.
to następujące układy prążków: 1248 pz + 1123 pz oraz 1441
pz + 1248 pz + 1149 pz + 1026 pz, natomiast dla eksonu 6:
1258 pz + 1149 pz + 1034 pz oraz 1432 pz + 1212 pz + 1135
pz +1010 pz. Pojawienie się zarówno w jednym, jak i drugim
przypadku układu 4 prążków ssDNA może świadczyć bądź
o heterozygotyczności danej sekwencji bądź też o mutacji.
mSSCP
DGGE
1
17
12
5
21
12
34
34
0/3)4)/.;MM=
0%2#%.4
Liczba amplimerów wytypowana
do analizy sekwencyjnej
typ II
0%2#%.4
exon 5 DGGE HERG
Liczba amplimerów, dla których ujawniono
istnienie różnych
wzorów prążkowych
mSSCP
DGGE
2
1
(eksony
2, 6)
(ekson 3)
8
2
(eksony 2, 6, 7, 8,
(eksony 4, 5)
10, 11, 12, 14)
12
(eksony 5, 12[I, II],
2
13, 14, 15, 18, 19,
(eksony 6, 9)
20, 21, 23, 26, 27)
21
6
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
Elektroforegramy uzyskane dla eksonów 6, 7, 8, 10 i 14
ujawniły obecność 3 prążków jednoniciowego DNA, dwa
różne wzory prążków ssDNA wykazano jedynie w przypadku eksonu 7. Dla eksonów 11 i 12 potwierdzono występowanie dwóch wariantów położenia pary prążków ssDNA.
W przypadku genu SCN5A spośród 22 analizowanych amplimerów, w 13 przypadkach ujawniono występowanie wariantów konformacyjnych badanych sekwencji. Różne wzory prążków ssDNA zaobserwowano
dla eksonów 5, 12 (badany jako dwa amplimery: I i II),
13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 26, 27, co może wskazywać na istnienie mutacji lub polimorfizmu w ich obrębie.
Przykładowe obrazy krzywych densytometrycznych wraz
z oryginalnymi elektroforegramami, dla różnych wzorów
prążkowych uzyskanych w wyniku analizy mSSCP dla 13
eksonu genu SCN5A przedstawiono na rycinie 3. Stwierdzono występowanie w tym eksonie charakterystycznego
układu dwóch wzorów prążkowych. Jeden składał się z 2,
a drugi z 4 prążków jednoniciowego DNA. Określono ich
wielkość: 919 pz + 713 pz oraz 888 pz + 823 pz + 707 pz +
650 pz. Ponadto dla eksonu 13 zaobserwowano dodatkowo
trzeci typ wzoru prążków: 561 pz + 507 pz (Ryc. 3). Wynik
taki nasuwa podejrzenie istnienia wariantu homo- i heterozygotycznego danej sekwencji, niemniej jednak może
także świadczyć o mutacji lub polimorfizmie w obrębie danego fragmentu genu SCN5A.
&ARM0RZEGL.AUK
0%2#%.4
typ I
,%.'(4;MM=
0%2#%.4
typ III
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
typ IV
0/3)4)/.;MM=
0%2#%.4
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
typ V
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
Ryc. 6. Elektroforegramy oraz krzywe densytometryczne
przedstawiające pięć typów polimorficznych wzorów prążkowych uzyskanych w wyniku typowania polimorfizmu
eksonu 6 genu SCN5A techniką DGGE.
Wyniki analizy DGGE dla 2 i 6 eksonu genu KCNQ1
przedstawiono odpowiednio na rycinie 4 i w tabeli I.
Pierwszy etap tej analizy polegał na przeprowadzeniu
elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z poziomym
gradientem stężenia czynnika denaturującego (0-100%),
,%.'(4;MM=
0/3)4)/.;MM=
0%2#%.4
typ II
exon 6-DGGE SCN5A
0%2#%.4
której celem było wyznaczenie profilu (krzywej) denaturacji, tj. zakresu stężeń czynnika denaturującego,
w którym zachodzi denaturacja badanego DNA. Celem
dalszego zróżnicowania analizowanych fragmentów
DNA prowadzono rozdział elektroforetyczny w żelu
z pionowym gradientem czynnika denaturującego
w zakresie 60-90%.
Otrzymane elektroforegramy poddano analizie w komputerowym programie do obróbki żeli. Porównując ruchliwość elektroforetyczną uzyskanych produktów DGGE
w mm, wykazano istnienie różnych wzorów prążków dla
obydwu analizowanych eksonów. W grupie amplimerów
eksonu 2 wyróżniono 5 typów polimorficznych DGGE.
Pozycje prążków charakterystyczne dla poszczególnych
typów DGGE były następujące: typ I: 9,35 + 80,51, typ
II: 12,2 + 42,59 + 79,74, typ III: 79,74, typ IV: 13,5, typ
V: 11,26 + 40,65 + 45,6 + 78,57 (Ryc. 4). W przypadku
eksonu 6 wyznaczono dwanaście typów polimorficznych
DGGE. Pozycje prążków specyficzne dla każdego z typów przedstawiono w tabeli I.
Wyróżnienie wielu typów wzorów prążkowych wskazuje na znaczne zróżnicowanie amplimerów analizowanych eksonów, co może świadczyć o występowaniu w ich
obrębie polimorfizmu lub mutacji. W celu sprawdzenia
ich obecności w badanych fragmentach genu zaleca się
wykonanie analizy sekwencyjnej.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
W przypadku genu HERG, zanalizowano ekson 5. Elektroforezę z pionowym gradientem czynnika denaturującego prowadzono w zakresie stężeń 60-90%. Po porównaniu
ruchliwości elektroforetycznej otrzymanych produktów
DGGE, wyodrębniono trzy typy polimorficzne wzorów
prążkowych dla eksonu 5. Ich pozycje wynosiły typ I: 4,47
+ 85,04, typ II: 83,58, typ III: 4,56 (Ryc. 5). Potwierdzenie
istnienia mutacji lub polimorfizmu w analizowanych fragmentach genu KCNH2 wymaga ustalenia w nich sekwencji
nukleotydów.
Rezultat analizy DGGE dla 6 oraz 9 eksonu genu SCN5A
przedstawiono odpowiednio na rycinie 6 i tabeli II. W przypadku eksonu 6 zidentyfikowano pięć typów polimorficznych DGGE z następującymi pozycjami prążków: typ I:
1,79 + 27,54 + 30,83 + 64,37, typ II: 4,19 + 64,67, typ III:
27,84 + 31,13 + 63,77, typ IV: 4,19 + 27,25 + 64,37, typ V:
4,19 + 27,54 mm + 31,13 + 55,98 + 65,26 (Ryc. 6). W grupie amplimerów eksonu 9 wyróżniono siedem typów polimorficznych DGGE. Charakterystyczne dla nich pozycje
prążków przedstawiono w tabeli II. Wyodrębnienie mnogiej
liczby wzorów prążkowych może dowodzić istnienia polimorfizmu bądź mutacji w analizowanych eksonach podobnie jak w przypadku genów KCNQ1 i HERG potwierdzenie
zmian w sekwencji wymaga wykonania analizy sekwencyjnej podejrzanych fragmentów genu.
W tabeli III przedstawiono porównanie technik mSSCP
oraz DGGE z uwzględnieniem liczby amplimerów wytypowanych do analizy sekwencyjnej oraz liczby eksonów poszczególnych genów, w których na podstawie otrzymanych
wzorów prążkowych podejrzewa się zmiany polimorficzne
lub mutacje.
Podsumowanie
Reasumując, analiza genów KCNQ1, HERG, SCN5A
technikami mSSCP i DGGE przedstawiona w niniejszej
pracy pozwoliła wyznaczyć różne wzory prążkowe w trzech
eksonach genu KCNQ1, dziesięciu eksonach genu HERG
oraz w czternastu eksonach genu SCN5A. Wyniki analizy
z zastosowaniem obu metod pozwoliły wnioskować o możliwym polimorfizmie lub mutacji w różnych eksonach poszczególnych genów. Stosując technikę mSSCP, stwierdzono zmiany w sekwencji 21 spośród 49 analizowanych eks-
onów, natomiast z wykorzystaniem techniki DGGE stwierdzono występowanie takich zmian w 6 eksonach.
Do analizy sekwencyjnej wytypowano łącznie 68 amplimerów, w których na podstawie otrzymanych wyników podejrzewa się istnienie mutacji lub polimorfizmu. Porównanie wyników sekwencjonowania z wynikami mSSCP oraz
DGGE umożliwi określenie skuteczności prezentowanych
metod w wykrywaniu mutacji. Wykazano, że w przypadku
genu KCNQ1, odpowiedzialnego za występowanie typu 1
LQTS, techniką lepiej różnicującą sekwencje podejrzane
o zmiany polimorficzne lub mutacje była DGGE. Natomiast
dla genów HERG i SCN5A, związanych odpowiednio z typem 2 i 3 zespołu, metodą taką była technika mSSCP.
Piśmiennictwo
1. Crotti A i wsp. Congenital long QT syndrome. Orphanet J Rare Dis 2008; 3: 18.
2. Zienciuk A, Lubiński A. Zespół wydłużonego QT –
diagnostyka i leczenie. Choroby serca i naczyń 2006;
3 (1): 41-46.
3. Herbert E i wsp. KCNQ1 gene mutations and the respective genotype-phenotype correlations in the long QT syndrome. Med Sci Monit 2002; 8 (10): RA240-248.
4. Markiewicz-Łoskot G, Moric-Janiszewska E, Mazurek
U. The risk of cardiac events and genotype-based management of LQTS patients. Ann Noninvasive Electrocardiol 2009; 14 (1): 86-92.
5. Markiewicz-Łoskot G i wsp. Wrodzony zespół wydłużonego QT – aspekty diagnostyczne. Folia Cardiol
2005; 12 (6): 403-411.
6. Bieganowska K i wsp. Wrodzony zespół wydłużonego
QT z głuchotą – zespół Jervella i Lange-Nielsena. Folia Cardiol 2005; 12 (7): 520-526.
7. Schwartz PJ. The congenital long QT syndromes from
genotype to phenotype: clinical implications. J Intern
Med 2006; 259 (1): 39-47.
8. Wang Q i wsp. Positional cloning of a novel potassium
channel gene: KVLQT1 mutations cause cardiac arrhythmias. Nat Genet. 1996; 12 (1): 17-23.
9. Itoh T i wsp. Genomic organization and mutational analysis of KVLQT1, a gene responsible for familial long
QT syndrome. Hum Genet. 1998; 103 (3): 290-294.
data otrzymania pracy: 09.07.2010 r.
data akceptacji do druku: 23.09.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr Ewa Moric-Janiszewska
Katedra i Zakład Biochemii
Śląski Uniwersytet Medyczny
41-200 Sosnowiec
ul. Narcyzów 1
tel. +48 32 364 10 06
e-mail: [email protected]