IIIr. Biotechnologii prof. dr hab. inż. Jan Mazerski Podstawowe

Transkrypt

Część III: Termodynamika układów biologicznych
MATERIAŁY POMOCNICZE
DO WYKŁADÓW Z PODSTAW BIOFIZYKI
IIIr. Biotechnologii
prof. dr hab. inż. Jan Mazerski
TERMODYNAMIKA UKŁADÓW BIOLOGICZNYCH
Niezwykle cenną metodą badania zjawisk przyrodniczych, zupełnie niezależną od naszej
wiedzy o strukturze obiektu na poziomie cząsteczkowym, jest podejście termodynamiczne. Może
ono być stosowane do obiektów o różnej skali (od pojedynczego atomu do całego Wszechświata) i
różnym stopniu złożoności (od prostego układu kilku atomów do żywej komórki, a nawet całego
organizmu wielokomórkowego). Nazwa termodynamika mogłaby sugerować, że chodzi tu o
badanie przepływu ciepła. Takie były rzeczywiście początki tej dziedziny. Obecnie termodynamika
zajmuje się wszystkimi aspektami energetycznymi badanego układu.
Termodynamika jest konstrukcja logiczną o wielkiej elegancji. Trzy zwięzłe stwierdzenia,
trzy zasady termodynamiki stanowią podsumowanie naszej wiedzy o wszelkich postaciach energii i
prawach rządzących jej przemianami. Prawdziwość termodynamiki zależy jedynie od
prawdziwości tych 3 zasad oraz od logicznej poprawności wyciąganych wniosków. Dzięki temu
termodynamika jest niezależna od poziomu naszej wiedzy o strukturze wewnętrznej układu oraz od
koncepcji czy modeli opisujących tą strukturę. Jest to bardzo istotne w naukach biologicznych,
gdzie np. stopień wiedzy o strukturze wewnętrznej komórki zmienia się z roku na rok w miarę
postępu technik instrumentalnych i informatycznych. Nie ma to jednak wpływu na opis
termodynamiczny komórki.
Podstawowe definicje
Aby poprawnie posługiwać się podejściem termodynamicznym należy opanować
specyficzne słownictwo termodynamiki. Definiowanie pojęć rozpoczniemy od pojęcia układu. Jest
to w termodynamice pojęcie pierwotne, w zasadzie niedefiniowalne, tak jak punkt w geometrii. Dla
naszych potrzeb wystarczy, jeżeli będziemy pamiętać, że układ termodynamiczny, to zbiór
elementów, między którymi istnieją określone relacje. Jeżeli relacje te sprowadzają się do
oddziaływania jednych elementów na inne, to mamy do czynienia z układem dynamicznym.
Ponieważ z punktu widzenia termodynamiki nie jest istotna struktura elementów, a jedynie relacje
pomiędzy nimi, więc układy termodynamiczne mogą być tworzone w dowolnej skali. Jest przy tym
charakterystyczne, że obiekt rozpatrywany jako układ na jednym poziomie może być traktowany
jako element układu na wyższym poziomie. Możliwa jest również sytuacja odwrotna: element
układu na jednym poziomie może być traktowany jako cały układ na poziomie niższym. Ta
hierarchiczna natura układów termodynamicznych wymaga za każdym razem bardzo precyzyjnego
określenia, co dany układ zawiera. Elementy rzeczywistości nie wchodzące w skład układu noszą w
termodynamice nazwę otoczenia.
W zależności od relacji pomiędzy układem a otoczeniem wyróżnia się w termodynamice 4
podstawowe typy układów:
izolowane: nie wymieniają z otoczeniem masy ani żadnej formy energii
adiabatyczne: nie wymieniają masy i ciepła, mogą wymieniać pozostałe formy energii
izotermiczne: swobodnie wymieniają wszystkie formy energii, nie wymieniają masy
otwarte: wymieniają z otoczeniem masę i energię.
Układy izolowane, adiabatyczne i izotermiczne określa się wspólnym terminem układy zamknięte
(nie wymieniające masy z otoczeniem).
Stan układu i jego parametry
Stan układu można opisać za pomocą pewnej liczby zmiennych tzw. parametrów stanu.
Parametry mogą być intensywne i ekstensywne. Parametry intensywne nie zależą od wielkości
układu i przy łączeniu elementów w układ nie są addytywne. Typowymi parametrami
intensywnymi są: temperatura, stężenie, ciśnienie. Parametry ekstensywne zależą od wielkości
układu i są addytywne. Do parametrów tego typu należą np. objętość i masa.
Stan układu określony jest przez parametry stanu i zmienia się wraz z ich zmianą. Zależność stanu
układu od wartości parametrów określa tzw. równanie stanu. Np. dla układu termodynamicznego
takiego jak gaz doskonały mamy równanie stanu gazu doskonałego postaci:
pV = nRT
W równaniu tym występuje jedna stała (stała gazowa R) oraz 4 parametry: p - ciśnienie,
V - objętość, n - liczba moli i T - temperatura bezwzględna. Tylko 3 z tych parametrów mogą
przyjmować dowolne wartości - wartość czwartego wynika z równania stanu gazu doskonałego.
Jeżeli nasze rozważania ograniczymy do 1 mola gazu doskonałego, to równanie stanu sprowadzi się
do postaci:
pV = RT
Rozpatrując jaki wpływ na wartość jednego z parametrów stanu mają niewielkie zmiany
pozostałych parametrów wygodnie jest posługiwać się zapisem różniczkowym. Jeżeli
g = f(x,y,z)
to różniczkę funkcji g definiujemy jako:
dg = Ldx + Mdy +Ndz
2
gdzie L, M, N są pochodnymi cząstkowymi funkcji g odpowiednio po x, y i z:
L=
∂g
∂x
L=
∂g
∂x
L=
∂g
∂x
Ostatecznie różniczka parametru (zmiennej stanu) g przyjmuje postać:
∂g
∂g
∂g
dx + dy + dz
∂x
∂y
∂z
dg =
Funkcje stanu
Jeżeli wartość pewnego parametru nie zależy od drogi, po jakiej została osiągnięta, a
jedynie od stanu układu, to parametr taki nazywamy funkcją stanu. Opis stanu układu przy pomocy
funkcji stanu ma szereg zalet. Przede wszystkim:
wartości funkcji stanu w stanie równowagi termodynamicznej zależą tylko od parametrów
zewnętrznych, czyli dających się zmierzyć
wartości funkcji stanu w dowolnym stanie można obliczyć korzystając z różniczki tej funkcji.
Istnieje prosty sposób ustalenia, czy dany parametr jest funkcja stanu korzystając z równania stanu.
Można wykazać na gruncie rachunku różniczkowego, że w przypadku funkcji stanu jej różniczka
musi być tzw. różniczką zupełną. Różniczkę nazywamy zupełną, jeżeli dla każdej pary parametrów
x i y zachodzi równość:
⎛ ∂g ⎞
∂⎜ ⎟
⎝ ∂x ⎠ =
∂y
⎛ ∂g ⎞
∂⎜⎜ ⎟⎟
⎝ ∂y ⎠
∂x
Sprawdźmy, czy objętość jest funkcją stanu gazu doskonałego. Przekształćmy najpierw równanie
stanu gazu doskonałego tak, aby dla 1 mola gazu uzyskać zależność objętości od ciśnienia i
temperatury:
V=
RT
p
Wyznaczmy teraz różniczkę objętości:
dV =
∂V
R
RT
∂V
dT +
dp = dT − 2 dp
∂T
∂p
p
p
i sprawdźmy czy jest to różniczka zupełna:
⎛ ∂V ⎞
∂⎜
⎟
⎝ ∂T ⎠ =
∂p
⎛ ∂V ⎞
⎟⎟
∂⎜⎜
⎝ ∂p ⎠
∂T
⎛R⎞
∂⎜⎜ ⎟⎟
⎝p⎠=
∂p
⎛ RT ⎞
∂⎜⎜ − 2 ⎟⎟
⎝ p ⎠
∂T
−
R
R
=− 2
2
p
p
3
Tak więc objętość jest funkcją stanu gazu doskonałego. W analogiczny sposób można wykazać, że
temperatura i ciśnienie są również funkcjami stanu gazu doskonałego.
Sprawdźmy teraz czy praca mechaniczna wykonywana przez gaz doskonały jest funkcją
stanu tego gazu. Najpierw musimy znać różniczkę pracy gazu doskonałego. Z fizyki i chemii
fizycznej wiemy, że różniczka pracy równa jest:
⎛R
RT ⎞
RT
dW = − pdV = −p⎜⎜ dT − 2 dp ⎟⎟ = − RdT +
dp
p
p
⎝p
⎠
Sprawdźmy teraz czy jest to różniczka zupełna:
⎛ RT ⎞
⎟
∂⎜⎜
p ⎟⎠
∂ (− R )
⎝
=
∂T
∂p
0≠
R
p
Wniosek: praca mechaniczna nie jest funkcja stanu gazu doskonałego, chociaż jest parametrem
stanu.
I. zasada termodynamiki
Pierwsze sformułowanie tej zasady zawdzięczamy Juliuszowi Robertowi Mayerowi (1942).
Uzupełnił ja Helmholtz w roku 1947. Mówi ona, że suma wszystkich rodzajów energii w układzie
zamkniętym pozostaje stała. Po opublikowaniu teorii Einsteina Henri Poincare sformułował ja w
1908 roku w nieco przekorny sposób: „Istnieje coś, co jest stałe w układzie zamkniętym”.
Ale co to jest to „coś”? Jest ono stałe w układzie zamkniętym, tzn. nie wymieniającym materii z
otoczeniem. Jest funkcja stanu, bo jej różniczka w układzie zamkniętym jest równa 0. Nie jest to
praca, bo praca nie jest funkcja stanu, ale ma z pracą i energią coś wspólnego. Przyjęto nazywać to
„coś” energia wewnętrzną i oznaczać symbolem U.
Współcześnie I zasadę termodynamiki zapisujemy w postaci:
dU = dQ + dW,
a więc przyrost energii wewnętrznej jest sumą przyrostu ciepła i pracy wykonanej nad układem. W
tej postaci nie można jeszcze wykazać, że różniczka energii wewnętrznej jest różniczką zupełną,
ale wykażemy to w toku dalszego wykładu.
I. zasada termodynamiki była badana na gruncie biologii jeszcze przed jej precyzyjnym
sformułowaniem. Już w roku 1777 Lavoisier zastanawiał się nad związkiem ilości wydzielanego
przez zwierzą ciepła z ciepłem uzyskanym przy spalaniu pożywienia w trakcie oddychania. W kilka
lat później Lavoisier i Laplace przeprowadzili pierwsze ilościowe badania kalorymetryczne na
świnkach morskich. Potwierdziły one w pełni stosowalność zasady zachowania energii również w
4
układach biologicznych. Od tego czasu badania takie prowadzone są z zastosowaniem coraz
doskonalszej aparatury.
Samorzutność procesów
I. zasada termodynamiki nie określa kierunku przepływu energii. Dopuszcza więc możliwość
zajścia zarówno:
ogrzewania się ciała zimniejszego kosztem stygnięcia gorącego, jak i
ogrzewanie się ciała gorącego kosztem dalszego oziębiania się ciała zimnego
jeżeli tylko ilość energii pobranej równa jest ilości energii oddanej.
Z doświadczenia wynika jednak, że w praktyce procesy biec mogą tylko w jednym
kierunku. Proces w pełni odwracalny jest tylko modelem teoretycznym. Ale stopień
nieodwracalności procesu bywa różny. Np. dobre wahadło może wahać się bardzo długo po
każdym kolejnym wahnięciu wracając praktycznie do tego samego położenia. A jednak i ono
rozprasza energię i po pewnym czasie zatrzyma się.
Z obserwacji wiemy, że w nieodwracalność procesów „zaplątane” jest ciepło. Ale ciepło nie jest
funkcją stanu. Przepływ ciepła odbywa się zgodnie z gradientem temperatury. Można więc
przypuszczać że z nieodwracalnością procesu w jakiś sposób musi być związana temperatura
układu. Okazało się, że różniczka ciepła zredukowanego
dQ
≡ dS
T
zwana różniczką entropii jest tą poszukiwaną miarą odwracalności procesu.
II. zasada termodynamiki mówi, że różniczka entropii nie może być ujemna. Oznacza to, że
entropia nie może maleć. W procesach odwracalnych entropia nie ulega zmianie (dS = 0), a w
procesach nieodwracalnych entropia rośnie (dsS > 0).
Definicję różniczki entropii można tak przekształcić, aby wyznaczyć różniczkę ciepła
dQ = TdS .
Różniczkę tą można teraz wstawić do równania I. zasady termodynamiki:
dU = dQ + dW = TdS + dW
Pozostaje jeszcze problem różniczki pracy. Z I. zasady termodynamiki wynika, że musimy
uwzględnić wszystkie rodzaje pracy jakie może układ wykonywać lub jakie mogą być nad układem
wykonywane. W przypadku ogólnym różniczkę pracy można przedstawić jako:
dW = ∑ Fi dri
n
gdzie: F – współczynnik pracy
5
r – współrzędna pracy.
Należy teraz dla każdego rodzaju pracy określić współczynnik i współrzędną pracy. Z punktu
widzenia biofizyki interesować nas będzie:
dWV = −pdV , gdzie współczynnikiem pracy jest ciśnienie a
praca objętościowa:
współrzędną pracy objętość
dWl = Fdl , F – siła mechaniczna, l – długość mięśnia lub
praca mięśniowa:
włókna mięśniowego
praca chemiczna:
dWn = µdn , µ - potencjał chemiczny, n – liczba moli
praca jonowa:
dWq = ψdq , ψ - potencjał elektryczny, q - ładunek
Tak więc jeżeli transportowane jest m różnych substancji, to różniczkę pracy przedstawić można w
postaci:
dW = dWV + dWl + dWq + ∑ dWni = − pdV + Fdl + ψdq + ∑ µ i dn i
m
m
zwanej równaniem Gibbsa. Równanie to można rozszerzać lub skracać w zależności od
opisywanego układu.
Przykłła
ad:
Rozważmy quasiodwracalny proces kurczenia się włókna mięśniowego. Energia tego procesu
pochodzi z procesów transportu. Proces jest cykliczny.
Napiszmy równanie I. zasady termodynamiki w formie całkowej:
∫ dU = ∫ TdS − ∫ pdV + ∫ Fdl + ∫ ψdq + ∫ ∑ µ dn
i
i
m
Ponieważ w układzie nie ma zmiany objętości, dV = 0, ani ruchu ładunków, dq = 0, a ponadto proces ma być
odwracalny, dS = 0, więc 3 człony tego równania zerują się:
∫ dU = ∫ Fdl + ∫ ∑ µ dn
i
i
m
Ponieważ U jest funkcją stanu, więc całka po drodze zamkniętej jest równa 0:
Ostatecznie mamy więc:
∫ Fdl + ∫ ∑ µ dn
i
i
= 0 , czyli
i
= 0.
∫ dU = 0 .
m
∫ Fdl + ∫ ∑ µ dn
i
m
Z uzyskanej zależności widać wyraźnie, że aby mogła być wykonana jakakolwiek praca mięśniowa musi
ulec zmianie stężenie chociaż jednej substancji.
Inne użyteczne funkcje stanu
Poza energią wewnętrzną układu istnieje jeszcze kilka innych, bardzo użytecznych funkcji
stanu związanych z przemianami energetycznymi. Należą do nich:
entalpia (H) definiowana zależnościa: H = U + pV
6
energia swobodna (F) zwana także funkcja Helmholtza definiowana wzorem: F = U – TS
entalpia swobodna (G) zwana także funkcją Gibbsa: G = H – TS = U + pV - TS
Ich znaczenie dla opisu procesów chemicznych i biochemicznych poznamy szczegółowo w
następnych etapach wykładu.
Potencjał chemiczny
Omawiając pracę w układach termodynamicznych stwierdziliśmy, że jedną z jej rodzajów
jest praca chemiczna związana ze zmianą liczby moli poszczególnych substancji w układzie.
Współczynnikiem pracy chemicznej jest wielkość zwana potencjałem chemicznym, µ. Spróbujmy
teraz powiązać tą wielkość z poznanymi dotychczas funkcjami stanu.
Rozważmy układ termodynamiczny, w którym możliwe są tylko 2 rodzaje pracy: praca
objętościowa i praca chemiczna. Dla takiego układu I. zasada termodynamiki przyjmuje postać:
dU = TdS − pdV + µ i dn i + ∑ µ jdn j
j≠i
Jeżeli założymy, że w układzie nie zmienia się entropia, dS = 0, objętość, dV = 0, oraz liczba moli
substancji innych niż i to równanie uprości się do postaci:
dU = µ i dn i
A wiec w układzie takim zmiana liczby moli i-tej substancji, dni, związana jest bezpośrednio ze
zmianą energii wewnętrznej układu. Pozwala to zdefiniować potencjał chemiczny i-tej substancji
jako:
⎛ ∂U ⎞
⎟⎟
µ i = ⎜⎜
∂
n
⎝ i ⎠ S ,V ,n '
czyli jako pochodną energii wewnętrznej po zmianie liczby moli i-tej substancji przy stałej entropii,
objętości i liczbie moli pozostałych substancji obecnych w układzie.
Jeżeli do opisu układu chcemy użyć entalpii zamiast energii wewnętrznej, to musimy
najpierw obliczyć jej różniczkę zupełną:
dH = dU + pdV + Vdp
a następnie wyznaczyć różniczkę energii wewnętrznej:
dU = dH − pdV − Vdp
którą teraz można podstawić do równania I. zasady termodynamiki:
dH − pdV − Vdp = TdS − pdV + µ i dn i + ∑ µ jdn j
j≠i
Po uproszczeniu wyrazów podobnych otrzymujemy:
7
dH = TdS − Vdp + µ i dn i + ∑ µ jdn j
j≠i
Jeżeli założymy, że w układzie nie zmienia się entropia, dS = 0, ciśnienie, dp = 0, i liczba moli
substancji innych niż i, to otrzymamy:
dH = µ i dn i
Pozwala to zdefiniować potencjał chemiczny jako:
⎛ ∂H ⎞
⎟⎟
µ i = ⎜⎜
∂
n
⎝ i ⎠ S , p ,n '
A więc w układzie o stałej entropii i stałym ciśnieniu potencjał chemiczny substancji i jest
pochodną entalpii po liczbie moli tej substancji. Jest to przy tym ten sam potencjał chemiczny, co
we wzorze poprzednim, tylko dla układu w którym stałe są inne parametry.
W układach termodynamicznych spotykanych w praktyce chemicznej czy biofizycznej
utrzymanie stałości entropii jest praktycznie niemożliwe. Dlatego poszukiwano takich definicji
potencjału chemicznego, w których warunek ten nie musiałby być spełniony. Skupmy naszą uwagę
z kolei na energii swobodnej. Jej różniczka zupełna ma postać:
dF = dU − TdS − SdT
Stosując postępowanie analogiczne jak dla entalpii otrzymamy równanie:
dF = −SdT − pdV + µ i dn i + ∑ µ jdn j
j≠i
Jeżeli założymy, że w układzie nie zmienia się temperatura, dT = 0, objętość, dV = 0, i liczba moli
substancji innych niż i, to otrzymamy:
dF = µi dn i
Pozwala to zdefiniować potencjał chemiczny jako:
⎛ ∂F ⎞
⎟⎟
µ i = ⎜⎜
⎝ ∂n i ⎠ T ,V ,n '
Analogiczne postępowanie z entalpią swobodną prowadzi do definicji:
⎛ ∂G ⎞
⎟⎟
µ i = ⎜⎜
⎝ ∂n i ⎠T ,p ,n '
Tak więc w zależności od stanu układu różne funkcje stanu definiują potencjał chemiczny
układu. Ponieważ w układach biologicznych mamy najczęściej do czynienia ze stałą temperatura i
stałym ciśnieniem, więc korzystać będziemy z ostatniej z wyprowadzonych definicji.
Można wykazać, że potencjał chemiczny układu zależy od temperatury i stężenia (liczby
moli) substancji. Zależność ta ma postać:
8
µ i = µ i0 + RT ln n i
lub
µ i = µ i0 + RT ln ci
gdzie: µ0 – potencjał chemiczny przy jednostkowym stężeniu lub liczbie moli
Równowaga chemiczna
Układ znajduje się w stanie równowagi chemicznej, gdy przebiegają w nim tylko procesy
odwracalne, a liczba moli wszystkich substancji (lub ich stężenie) nie ulega zmianie w czasie. Jak
już wiemy, termodynamicznym warunkiem odwracalności procesu jest zerowa wartość różniczki
entropii, dS = 0.
Z warunku stałości składu w stanie równowagi wynika, że brak jest w nim sił napędowych
prowadzących do zmiany składu. Siłą napędową zmiany stężenia danej substancji jest jej potencjał
chemiczny. Wynika stąd wprost, że w stanie równowagi potencjały chemiczne wszystkich
substancji są równe zero. Pamiętając, że potencjał chemiczny i-tej substancji jest pochodną entalpii
swobodnej po stężeniu tej substancji dochodzimy do wniosku, że w stanie równowagi entalpia
swobodna układu osiąga minimum. Jeżeli entalpia jest większa niż to minimum, to układ znajduje
się poza stanem równowagi i będzie zmieniał swój skład dążąc do minimum entalpii swobodnej.
Wynika stąd ciekawy wniosek: reakcje chemiczne w warunkach izotermiczno-izobarycznych
przebiegają samorzutnie w kierunku obniżenia entalpii swobodnej. Rozważmy odwracalną reakcję
chemiczną:
A + B <==> C + D
Przebieg tej reakcji najwygodniej jest śledzić wprowadzając pojęcie współrzędnej reakcji, ξ. Gdy w
układzie znajdują się wyłącznie substraty ξ = 0, a gdy reakcja przebiegnie całkowicie i w układzie
będą wyłącznie produkty ξ = 1. Wprowadźmy jeszcze jedno pojęcie: zmiana entalpii swobodnej,
∆G równe z definicji:
⎛ ∂G ⎞
∆G ≡ ⎜⎜
⎟⎟
⎝ ∂ξ ⎠ T ,p
Należy zwrócić uwagę na nieco mylący symbol zmiany entalpii
swobodnej między dwoma stanami, ale pochodna, czyli szybkość
zmian entalpii swobodnej. Ta właśnie wielkość decyduje o
kierunku przebiegu reakcji:
∆G < 0 – przebieg spontaniczny: przybywa produktów
∆G = 0 – stan równowagi
entalpia swobodna, G
swobodnej. Wbrew formie zapisu nie jest to różnica entalpii
∆G < 0
∆G > 0
∆G = 0
0
współrzędna reakcji, ξ
1
9
∆G > 0 – reakcja przebiega spontanicznie, ale w odwrotnym kierunku
Przebieg reakcji można też przedstawić graficznie w formie wykresu wartości entalpii swobodnej
układu, G, w funkcji współrzędnej reakcji, ξ, jak na rysunku powyżej.
Na gruncie chemii fizycznej można wyprowadzić zależność zmian entalpii swobodnej od stężeń
substratów i produktów:
∆G = ∆G 0 + RT ln
cC ⋅ c D
cA ⋅ cB
gdzie: ∆G0 – standardowa zmiana entalpii swobodnej, czyli dla jednostkowych stężeń substratów i
produktów.
Ponieważ w stanie równowagi ∆G = 0, więc:
∆G 0 = −RT ln
c 'C ⋅ c 'D
c 'A ⋅ c 'B
gdzie: ci’ – stężenie i-tej substancji w stanie równowagi. Jeżeli wprowadzimy teraz pojęcie stałej
równowagi, K, zdefiniowanej jako:
K=
c 'C ⋅ c 'D
c 'A ⋅ c 'B
to otrzymamy znane zależności:
∆G 0 = −RT ln K
i
∆G = RT ln
cC ⋅ c D
− RT ln K
cA ⋅ cB
Drugie z tych równań nosi nazwę izotermy van’t Hoffa i może być zastosowane do wyznaczania
wartości ∆G0 i K.
Należy bardzo wyraźnie zwrócić uwagę, że o kierunku przebiegu reakcji decyduje ∆G, a nie
∆G0, czyli zmiana entalpii swobodnej przy aktualnych stężeniach substratów i produktów. Jest to
szczególnie ważne w układach biologicznych, w których stężenia niektórych substratów lub
produktów mogą być utrzymywane na stałym poziomie zdecydowanie różnym niż innych
substancji biorących udział w reakcji.
Przykłła
ad:
Procesowi przemiany glukozy w 2 cząsteczki kwasu mlekowego (reakcja glikolizy)
C6H12O6 => 2C3H6O3
odpowiada standardowa zmiana entalpii swobodnej równa ∆G0 = -138 kJ/mol. W komórce stężenia glukozy i
kwasu mlekowego są dosyć ściśle regulowane i utrzymują się na poziomie 0,005 M dla glukozy i 0,001 M
dla kwasu mlekowego. Po prostych przeliczeniach wynika, że zmiana entalpii swobodnej tej reakcji w
warunkach wnętrza komórki wynosi ∆G = -159 kJ/mol. Tak więc reakcja ta przebiega w tych warunkach
spontanicznie i może być źródłem energii dla komórki.
Niektóre bakterie zdolne są do wiązania gazowego azotu i utleniania go do jonów azotanowych:
10
2N2 + 5O2 + 2H2O == 4H+ + 4NO3Standardowa zmiana entalpii swobodnej tej reakcji wynosi ∆G0 = +7,7 kJ/mol. Tak więc w warunkach
standardowych reakcja ta nie może zachodzić samorzutnie. Jednakże w komórce tych bakterii stężenie
jonów azotanowych wynosi ok. 10-4 M, pH ≈ 7, a ciśnienia parcjalne tlenu i azotu wynoszą odpowiednio 200
i 800 hP. W tych warunkach zmiana entalpii swobodnej wynosi ∆G = -32,6 kJ/mol. Tak więc reakcja może
przebiegać spontanicznie, o ile tylko obecne są odpowiednie katalizatory (enzymy).
Również w przypadku hydrolizy ATP do ADP i fosforanu będącej podstawowym źródłem energii w
komórce znaczenie warunków lokalnych jest kluczowe. Standardowa zmiana entalpii swobodnej tej reakcji
wynosi ∆G0 = -5,4, kJ/mol. Może więc ona przebiegać samorzutnie jednak nie może być źródłem energii. W
warunkach wnętrza komórki zmiana entalpii swobodnej jest prawie 10 razy większa, ∆G = -47,7 kJ/mol, co
uzasadnia znaczenie tej reakcji jako źródła energii.
Termodynamika procesów nieodwracalnych
Klasyczna termodynamika opisuje w pełni jedynie procesy odwracalne, a więc takie, w
których dS = 0. Badanie procesów nieodwracalnych, zwłaszcza w układach otwartych, ograniczało
się do niedawna do analizy występujących w nich stanów równowagi. Bowiem w stanach
równowagi dS = 0. Ponadto, w stanach równowagi nie dochodzi do zmian stężeń lub ilości
substancji, a więc w pewnym sensie stan równowagi tworzy układ „zamknięty”.
Układy biologiczne nie znajdują się w stanie równowagi termodynamicznej i są zawsze układami
otwartymi:
wymieniają materię z otoczeniem
produkują entropię
Do układów takich opis klasyczny jest nieprzydatny. Ale nie jest to cecha charakterystyczna
układów ożywionych. Również martwe układy znajdujące się z dala od stanu równowagi nie dają
się opisać na gruncie termodynamiki klasycznej.
Układy otwarte
Pierwszej udanej próby wyjścia poza opis stanów równowagowych dokonano dla układów
otwartych. Rozważmy zmiany entropii w układzie otwartym. Całkowitą szybkość zmian entropii
układu dS/dt można opisać równaniem:
dS dSe dSi
=
+
dt
dt
dt
gdzie: Se – entropia wymieniana z otoczeniem,
Si – entropia produkowana przez układ.
Drugi z członów powyższego równania, dSi/dt, opisujący szybkość produkcji entropii w układzie
oznacza się często symbolem σ. Wtedy równanie przyjmuje postać:
dS dSe
=
+σ
dt
dt
11
Do opisu wymiany entropii z otoczeniem wygodnie jest użyć pojęcia strumienia. W fizyce, chemii
fizycznej i biofizyce strumień J definiujemy jako:
ilość materii lub energii przechodząca w jednostce czasu przez jednostkę
powierzchni prostopadłą do kierunku strumienia.
Warunkiem istnienia strumienia jest występowanie w układzie różnicy jakiegoś potencjału
termodynamicznego, x. Wymianę entropii z otoczeniem można opisać jako strumień entropii:
dSe
∂J
=− S
dt
∂x
Ostatecznie równanie opisujące zmiany entropii w układzie otwartym przyjmie więc postać:
dS
∂J
= − S +σ
dt
∂x
Stan stacjonarny
Wielkością determinującą stan układu jest przy tym szybkość produkcji entropii σ. Z II. zasady
termodynamiki wynika, że σ nie może być mniejsze od 0. Jeżeli σ = 0, to mamy do czynienia z
równowagą termodynamiczną, stanem nieciekawym z punktu widzenia biofizyki. Gdy σ > 0 w
układzie biegnie samorzutnie jakiś proces i wytwarzana jest entropia. Z punktu widzenia biofizyki
interesujący jest pewien przypadek szczególny procesów samorzutnych w układach otwartych:
przypadek, gdy cała produkowana w układzie entropia σ opuszcza układ w postaci strumienia
entropii:
σ=
∂JS
∂x
Podstawiając ten warunek do powyższego równania dochodzimy do zależności: dS/dt = 0. Taki
stan układu nazywamy stanem stacjonarnym: układ produkuje entropię (biegnie proces
samorzutny), lecz jego entropia nie wzrasta.
Okazuje się, że wiele układów ożywionych można z dobrym przybliżeniem traktować jako układy
stacjonarne. Dla termodynamicznego opisu takich układów musimy jeszcze określić siłę
napędzającą strumień entropii, x, oraz zaproponować sposób wyznaczania szybkości produkcji
entropii w układzie, σ.
Entropia układu jest typowa funkcją wewnętrzną. Wartości funkcji tego typu określone są
przez zmienne zewnętrzne (dające się wyznaczyć z pomiaru) jedynie w stanie równowagi. Również
jedynie w stanie równowagi entropia jest funkcja stanu i tylko wtedy posiada różniczkę zupełną.
Jednakże my z definicji rozpatrujemy układ nie znajdujący się w stanie równowagi. Wygląda to na
ślepą uliczkę.
12
Przez dłuższy czas poszukiwano wyjścia z tego problemu. Udało się je znaleźć dzięki podziałowi
układu na podukłady tak małe, że każdy z nich można potraktować jako lokalnie znajdujący się w
stanie równowagi. Podejście takie jest możliwe, gdy układ jako całość znajduje się w pobliżu stanu
równowagi. Można wtedy wykazać, że produkcja entropii σ musi spełniać równanie:
n
T ⋅ σ = ∑ Ji xi
i =1
gdzie: Ji – i-ty strumień
xi – siła napędowa i-tego strumienia
Okazuje się więc, że podejście takie wyjaśnia od razu dwie sprawy: wielkość produkcji entropii w
stanie stacjonarnym i siły napędowe strumienia entropii wypływającego z układu: siłami tymi są
siły napędowe innych strumieni obecnych w układzie.
Wyrażenie Tσ zwane jest funkcją dyssypacji. Określa ona zużycie energii w układzie, czyli jak
szybko układ przekształca użyteczne formy energii w zdegenerowaną, bezużyteczną energię
cieplną i przekazuje ją (dyssypuje) do otoczenia.
Siły napędowe i strumienie
Ponieważ pojęcie strumienia obecnie jest kluczowe przy opisie układów nieodwracalnych,
poświęćmy trochę uwagi siłom napędowym typowych strumieni występujących w układach
biofizycznych. Tabela 0-1 zawiera zestaw takich sił napędowych i odpowiadających im strumieni.
Tabela 0-1
Strumienie i odpowiadające im siły napędowe
Siła napędowa
Strumień
różnica potencjału elektrycznego
prąd elektryczny
różnica ciśnień hydrostatycznych
przepływ cieczy
różnica potencjału chemicznego
dyfuzja cząsteczek obojętnych
różnica potencjału elektrochemicznego
ruch jonów
Dla izolowanych strumieni wielkość strumienia, J, jest proporcjonalna do wartości siły
napędowej x:
J = Lx
W takich strumieniach kierunek przepływu musi być zgodny z kierunkiem siły napędowej.
Okazuje się jednak, że w rzeczywistych układach mamy często do czynienia ze strumieniami
sprzężonymi, czyli takimi gdzie strumień zależy od kilku sił napędowych.
J i = f (x1 ,K, x i ,K, x n )
dla i od 1 do n
13
W przypadku strumieni sprzężonych niektóre strumienie mogą płynąć „pod prąd” odpowiadających
im sił napędowych o ile napędzają je inne strumienie.
Pojawia się teraz problem, jaka jest postać funkcji f(x1,..,xn) w powyższym równaniu. Jak
dotychczas przyjmuje się najczęściej, że jest to zależność liniowa:
J1 = L11x1 + L12 x 2 + L + L1n x n
J 2 = L 21x1 + L 22 x 2 + L + L 2 n x n
M
J n = L n1x1 + L n 2 x 2 + L + L nn x n
Taki układ równań można zapisać w zapisie macierzowym w dużo bardziej zwartej formie jako:
J = LX
gdzie: J – kolumnowa macierz strumieni
L – kwadratowa macierz współczynników
X – kolumnowa macierz sił napędowych
Ponadto, w 1931 roku Onsager wykazał, że Lij = Lji, czyli że macierz współczynników jest
macierzą symetryczną.
Siłę sprzężenia pomiędzy strumieniami opisuje wielkość:
q ij =
Lij
Lii L jj
zwana stopniem sprzężenia. Gdy qij = 0, czyli Lij = 0, mamy do czynienia z brakiem sprzężenia
strumieni i oraz j. Gdy qij = 1 mamy do czynienia ze sprzężeniem całkowitym.
Przykład 1.
Rozważmy układ składający się z dwóch roztworów tej samej substancji o
różnych, lecz niedużych stężeniach. Roztwory te znajdują się w dwóch różnych
częściach naczynia rozdzielonych błoną (rys. obok). W układzie występują dwie siły
napędowe: i) różnica potencjału chemicznego substancji rozpuszczonej wynikająca z
różnicy stężeń, oraz ii) różnica ciśnienia hydrostatycznego. Przy niskich stężeniach
roztworu potencjał chemiczny rozpuszczalnika jest praktycznie jednakowy w obu
częściach układu. Tak więc w układzie pojawić się powinny dwa strumienie:
JD - strumień dyfuzyjny substancji oraz JV - strumień objętościowy roztworu.
Potencjał chemiczny substancji rozpuszczonej wynosi: µ = RT ln c . Różnica
potencjału chemicznego, ∆µ, dana jest więc wzorem:
∆µ = RT ln c1 − RT ln c 2 = RT ln
Zakładając
zależności:
występowanie
sprzężenia
c1
c2
pomiędzy
strumieniami
otrzymujemy
JD
JV
c1 > c2
J D = L DD ∆µ + L DV ∆p
J V = L DV ∆µ + L VV ∆p
gdzie: LDD – współczynnik dyfuzji substancji w błonie
LVV – współczynnik filtracji błony (przepuszczalność hydrauliczna)
14
LDV – współczynnik ultrafiltracji lub osmozy
Z faktu występowania sprzężeń pomiędzy strumieniami wynika istnienie dwóch ciekawych zjawisk:
ultrafiltracji – przepływu substancji pod wpływem różnicy ciśnienia hydrostatycznego oraz osmozy –
przepływu rozpuszczalnika pod wpływem różnicy stężenia substancji rozpuszczonej.
Przykład 2.
Rozważmy układ otwarty, do którego może wnikać z otoczenia substancję M. Wewnątrz układu
substancja ta przekształcana jest z szybkością v w substancję N. Substancja N może dyfundować do
otoczenia. Ponadto przez granicę układu może dyfundować substancja O, z która nic się w układzie nie
dzieje. Strumienie poszczególnych substancji nie są ze sobą sprzężone i można je opisać zależnościami:
J M = L MM ∆µ M
J N = L NN ∆µ N
J O = L OO ∆µ O
JM
W stanie stacjonarnym ilość poszczególnych substancji w układzie nie
ulega zmianie, co możemy zapisać jako:
dn M
= JM − v = 0
dt
dn N
= JN + v = 0
dt
dn O
= JO = 0
dt
M
JN
N
JO
Z dwóch pierwszych równań wynika, że strumień substancji M wpływający do układu równy jest co do
wartości strumieniowi substancji N wypływającemu z układu, a oba te strumienie równe są liczbowo
szybkości powstawania substancji N. Z ostatniego równania wynika ponadto, że strumień substancji O jest
zerowy. Podstawiając wyrażenia na strumienie otrzymujemy:
L MM ∆µ M − v = 0
L NN ∆µ N + v = 0
L OO ∆µ O = 0
Można teraz wyznaczyć różnice potencjałów chemicznych poszczególnych substancji w stanie
stacjonarnym:
(∆µ M )s =
(∆µ N )s
(∆µO )s
v
L MM
v
=−
L NN
=0
Tak więc różnice potencjałów chemicznych substancji M i N zależą od szybkości przemiany i od
współczynników dyfuzji poszczególnych substancji. Potencjał chemiczny substancji O jest identyczny w
układzie i w otoczeniu.
Przykład 3.
Rozważmy teraz jak będzie wyglądał stan stacjonarny takiego samego układu, jeżeli pomiędzy
strumieniami substancji M i O występuje sprzężenie.
JM
J = L ∆µ + L ∆µ
M
MM
M
OM
O
J N = L NN ∆µ N
J O = L OM ∆µ M + L OO ∆µ O
W stanie stacjonarnym ilość poszczególnych substancji w układzie nie
ulega zmianie, co możemy zapisać jako:
M
JN
N
JO
15
dn M
= JM − v = 0
dt
dn N
= JN + v = 0
dt
dn O
= JO = 0
dt
Na uwagę zasługuje fakt, że występowanie sprzężenia nie ma wpływu na wartość i kierunek strumieni.
Wyznaczmy teraz różnice potencjałów chemicznych poszczególnych substancji w stanie stacjonarnym:
(∆µ M )s =
v
L MM −
L2OM
L OO
v
L NN
L OM
v
L OO
=−
L2OM
L MM −
L OO
(∆µ N )s = −
(∆µO )s
Rzuca się w oczy, że w układzie ze sprzężeniem strumieni występuje różnica potencjału chemicznego
substancji O i to pomimo zerowego strumienia tej substancji. Różnica potencjału chemicznego substancji N
nie uległa zmianie, a substancji M uległa zwiększeniu (mniejszy mianownik ułamka).
Entropia w stanie stacjonarnym
Przypomnijmy: stan stacjonarny to stan układu niezmienny w czasie, w którym układ
produkuje entropię w tempie σ, ale entropia układu nie ulega zmianie: dS/dt = 0. Można wykazać,
że stan taki jest możliwy tylko wtedy, gdy strumienie i siły są stałe w czasie:
∂J i ∂x i
=
=0
∂t
∂t
Przy czym niektóre z nich mogą być równe 0, a reszta przyjmuje niezerowe, chociaż stałe wartości.
W zależności od liczby niezerowych strumieni mamy stany stacjonarne odpowiednich rzędów:
rząd 0 : wszystkie strumienie zanikają, σ = 0 czyli układ nie wytwarza entropii, równowaga
termodynamiczna,
rząd > 0: dodatnia szybkość produkcji entropii.
Na przełomie lat 50 i 60 XXw. Prigogine wykazał, że w stanie stacjonarnym układu
produkcja entropii osiąga minimum lokalne. Oznacza to m.in., że układ samorzutnie wraca do stanu
stacjonarnego po niewielkich odchyleniach.
Poprawność tego wniosku ograniczona jest tylko do najbliższego otoczenia minimum. Wynika to z
kilku istotnych powodów:
definicja funkcji dyssypacji w podanej powyżej formie jest poprawna jedynie dla stanów
niezbyt odległych od stanu równowagi. Jaka jest postać tej funkcji w znacznej odległości od
stanu równowagi nie zostało w przypadku ogólnym wykazane.
16
przyjęliśmy liniową definicję funkcji sprzęgającej strumienie. Jest to opis poprawny jedynie
w najbliższym otoczeniu stanu równowagi.
w skomplikowanych układach występować może wiele stanów stacjonarnych, w tym niektóre
blisko siebie. Znaczne wychylenie z jednego z takich stanów może doprowadzić do tego, że
układ znajdzie się w obszarze „przyciągania” innego stanu stacjonarnego.
Pozostaje jednak prawdą, że każdy stan stacjonarny posiada swego rodzaju strefę bezpieczeństwa.
Jeżeli na skutek oddziaływania zewnętrznych czynników zakłócających układ zostanie wytrącony
ze stanu stacjonarnego, ale nie przekroczy granic tej strefy, to będzie samorzutnie starał się
powrócić do stanu stacjonarnego. Im większa jest ta strefa, tym stabilniejszy (mniej wrażliwy na
zkłócenia) jest stan stacjonarny.
17
POMIARY KALORYMETRYCZNE
Wstęp
Pomiary kalorymetryczne to jedyna technika badawcza pozwalająca na bezpośrednie
wyznaczenie wielkości termodynamicznych. Wszystkie inne techniki, np. spektroskopowe, są
metodami pośrednimi: wyznaczanie wielkości termodynamicznych możliwe jest tylko dla układów
spełniających określone, czasami bardzo trudne do spełnienia, warunki. Pomiary kalorymetryczne
dokonywać można przy tym bezpośrednio w warunkach równowagi bez potrzeby izolacji
substratów lub produktów.
Dzięki rozwojowi technik instrumentalnych i komputeryzacji aparatury współczesne
kalorymetry są w stanie wyznaczyć ilość wydzielanego lub pobieranego ciepła z dokładnością do
1 µJ.
Izotermiczne miareczkowanie kalorymetryczne
Z punktu widzenia biofizyki najważniejszą techniką kalorymetryczną jest izotermiczne
miareczkowanie kalorymetryczne, ITC (ang. Isotermal Titration Calorymetry). Na podstawie
wyników uzyskanych w trakcie pojedynczej serii pomiarów można wyznaczyć:
-
∆H - zmianę entalpii molowej związanej z badanym oddziaływaniem
-
K – stałą tworzenia kompleksu
-
n – współczynnik opisujący stechiometrię oddziaływania
Pomiędzy wielkościami termodynamicznymi opisującymi badane oddziaływanie zachodzą przy
tym następujące zależności:
∆G = ∆H − T∆S = −RT ln K
Ponieważ wielkości ∆H i K wyznaczane są niezależnie z danych doświadczalnych, więc można
również obliczyć ∆G i ∆S.
Wykonując pomiary w dwóch różnych temperaturach można ponadto wyznaczyć
pojemność cieplną (molowe ciepło właściwe przy stałym ciśnieniu, ∆Cp):
∆C p =
∆H 2 − ∆H1 ∆S2 − ∆S1
=
T
T2 − T1
ln 2
T1
Budowa aparatu
Układ pomiarowy składa się z dwóch naczynek umieszczonych we wspólnej osłonie
cieplnej. Naczynka mają pojemność 0,5÷1,5 ml. Osłona termiczna jest chłodzona do temperatury
18
niższej niż zadana temperatura doświadczenia T0, więc dla
utrzymania zadanej temperatury naczynek należy je podgrzewać.
Podczas całego doświadczenia oba naczynka są utrzymywane w
równowadze termicznej, ∆T = 0, w zadanej temperaturze. Jedno z
naczynek spełnia przy tym rolę naczynka odniesienia, a drugie
naczynka pomiarowego. W obu naczynkach znajdują się
jednakowe objętości tego samego rozpuszczalnika. W naczynku
pomiarowym znajduje się ponadto jeden ze składników
oddziaływującego
układu
(składnik
A).
Do
naczynka
pomiarowego dodawany jest niewielkimi porcjami roztwór
T=T
0
∆T = 0
T = T0
drugiego składnika, B, w takim samym rozpuszczalniku.
Przebieg pomiaru
Podstawą metody jest pomiar ilości energii cieplnej w jednostce czasu (mocy) jaką należy
dostarczyć do naczyńka pomiarowego, aby zachować zerową różnicę temperatur pomiędzy obu
naczynkami. Moc tą wyraża się najczęściej w µW, chociaż µcal/s są również w użyciu.
Właściwy pomiar rozpoczyna się, gdy do naczynka pomiarowego dodajemy w postaci serii
wstrzyknięć niewielkie, 5 ÷ 25 µl, porcje roztworu drugiego składnika. Całkowita objętość
dodawanego roztworu wynosi zwykle 50 ÷ 250 µl.
Dodanie drugiego składnika powoduje zachodzenie analizowanego oddziaływania i zmianę entalpii
układu. Gdy oddziaływanie ma charakter egzotermiczny, to do naczynka pomiarowego dla
zachowania zadanej temperatury wystarczy dostarczyć mniej ciepła niż do naczynka
referencyjnego. W przypadku oddziaływań endotermicznych sytuacja jest odwrotna.
W obu naczyńkach znajdują się bardzo czułe termopary włączone w układ regulacyjny sprzężenia
zwrotnego. Taki układ potrafi wykryć różnice temperatury rzędu 10-4 deg i dostosować ilość ciepła
dostarczanego do obydwu naczyniek tak, aby tę różnicę wyeliminować. Energia dostarczana jest do
układu w postaci krótkich impulsów prądu, po ok. 20 µJ każdy. Moc dostarczana do każdego z
naczyniek regulowana jest częstością impulsów, a nie ich energią jednostkową.
Zawartość naczyńka pomiarowego jest mieszana dla przyśpieszenia oddziaływania obu
składników. Jako mieszadła używa się często igły strzykawki dozującej roztwór składnika B. W
przypadku typowych oddziaływań fizykochemicznych wystarcza zwykle ok. 10 s, aby układ
przeszedł do nowego stanu równowagi. W układach biofizycznych w których składnikami są
makrocząsteczki potrzeba na to ok. 1 min. Zwykle po kilku minutach wprowadzamy kolejną porcję
19
roztworu składnika B i proces się powtarza. W miarę jak zmienia się stopień przereagowania
(obsadzenia dla makrocząsteczek) zmianie ulega również efekt cieplny związany z pojedynczym
nastrzykiem roztworu.
Typowe doświadczenie ITC trwa zwykle od 1 do 2 godzin. W tym czasie dokonuje się od
kilkunastu do dwudziestu kilku nastrzyków i związanych z nimi pomiarów ciepła oddziaływania.
Surowe wyniki pomiarów przedstawia się w postaci zależności różnicy mocy dostarczonej do
obydwu naczynek w funkcji czasu. Ilość ciepła niezbędnego dla zrównoważenia układu po każdym
kolejnym nastrzyku oblicza się całkując powierzchnię pod pikiem.
5
0
Moc P(t) [µ W]
-5
0
5
10
15
20
25
-10
-15
-20
-25
-30
-35
Czas [min]
Pomiary kontrolne
Współczesne kalorymetry izotermiczne są na tyle czułe, że dla uzyskania poprawnych
wyników należy uwzględnić efekty cieplne związane ze zmianą stężeń reagentów podczas
miareczkowania. Aby wyznaczyć te tzw. ciepła rozcieńczania należy wykonać dwie dodatkowe
serie pomiarów.
Dla wyznaczenia ciepła rozcieńczania składnika A do naczyńka pomiarowego dodajemy
rozpuszczalnik bez składnika B w takich samych porcjach jak podczas właściwego
miareczkowania. Ponieważ stopień rozcieńczania składnika A jest niewielki (rzędu 1,01) zdarza się
często, że ciepło rozcieńczania jest praktycznie takie samo we wszystkich etatach miareczkowania.
Można wtedy obliczyć średnie ciepło rozcieńczania składnika A.
Stopień rozcieńczania składnika B jest z reguły duży i wynosi ok. 100 na początku miareczkowania
spadając do ok. 10 w końcowych etapach. Powoduje to, że ciepło rozcieńczania tego składnika jest
20
zwykle znaczne i zmienia się systematycznie podczas miareczkowania. Dlatego też wyznaczamy to
ciepło dla każdego etapu miareczkowania podczas serii pomiarów w której dodajemy roztwór
składnika B do naczyńka pomiarowego zawierającego tylko rozpuszczalnik (bez składnika A).
Porcje dodawanego roztworu jak i objętość rozpuszczalnika na początku pomiaru powinny być
identyczne jak podczas właściwego miareczkowania.
Opracowanie wyników
Po zgromadzeniu wszystkich danych surowe wyniki przelicza się na wielkości molowe:
molową zmianę entalpii i stosunek moli obydwu składników. Dane te wystarczają do wyznaczenia
∆H, K oraz n.
Załóżmy, że składniki oddziałują ze sobą zgodnie z równaniem:
A + nB == C
Roztwór składnika A o stężeniu [A] moli/litr i objętości V znajduje się w naczyńku pomiarowym, a
składnik B dodawany jest jako roztwór w tym samym rozpuszczalniku w porcjach o jednakowej
objętości v. Wprowadźmy ponadto pojęcie stopnia obsadzenia cząsteczek substancji A
definiowanego wzorem:
f≡
[A]b
[A]
Stopień obsadzenia mówi jaka część cząsteczek A zaangażowana jest w danych warunkach w
oddziaływanie z cząsteczkami B. Wartość stopnia obsadzenia waha się od 0 (cały składnik A w
formie wolnej) do 1 (cały składnik A obsadzony cząsteczkami składnika B). Korzystając z tej
wielkości można obliczyć stężenie formy związanej [A]b i wolnej [A]f:
[A]b = f [A]
[A]f = (1 − f )[A]
Przyjmując, że z jedną cząsteczką A oddziaływać może n cząsteczek B można wyznaczyć stężenie
formy związanej i wolnej składnika B:
[B]b = n[A]b = nf [A]
Bf = [Bi ] − nf[A]
gdzie: [Bi] - ogólne stężenie składnika B po i-tym nastrzyku.
W badaniach biofizycznych stosuje się zwykle zamiast termodynamicznej stałej równowagi tzw.
stałą tworzenia kompleksu. Jest ona równa:
K=
[ A ]b
f[A]
=
[ A ]f [ B]f (1 − f ) [ A ] ([ Bi ] − nf [ A ])
Po kilku prostych przekształceniach otrzymujemy:
K [ Bi ] − fK [ Bi ] − nfK [ A ] + nf 2 K [ A ] = f
21
Porządkując człony równania i dzieląc je przez nK[A] otrzymujemy:
⎧⎪ [ B ]
[ Bi ] = 0
1 ⎫⎪
f 2 − ⎨1 + i +
⎬f +
n [A]
⎪⎩ n [ A ] nK [ A ] ⎪⎭
czyli równanie kwadratowe ze względu na f. Jeden z jego pierwiastków jest zawsze większy od 1 i
nie ma sensu fizycznego, ale drugi pozwala na obliczenie współczynnika obsadzenia:
f = X − X2 −
gdzie: X = 1 +
4 [ Bi ]
n [A]
[ Bi ] + 1
n [ A ] nK [ A ]
Ilość energii cieplnej produkowana lub pobierana przez układ podczas pojedynczego aktu
miareczkowania, Qi, zależy od różnicy entalpii produktów i substratów, ∆H, oraz przyrostu liczby
moli substancji B która związała się z substancją A, (∆nB)b:
Q i = ∆H(∆n B )b
Ten przyrost liczby moli można wyznaczyć zgodnie ze wzorem:
(∆n B )b = ∆[B]b V = n∆f [A]V
gdzie: ∆f – przyrost stopnia obsadzenia po i-tym miareczkowaniu,
czyli ostatecznie:
Q i = n∆f [A ]V ⋅ ∆H
Podstawiając do tego wzoru wartości fi i fi-1 z równania kwadratowego otrzymujemy:
Qi =
n[A ]∆HV
(f i − f i−1 )
2
Teraz można wyznaczyć ∆Hi, czyli zmianę entalpii molowej w i-tym miareczkowaniu. Jest ona
równa ilości ciepła Qi podzielonego przez ogólny przyrost liczby moli składnika B:
(*)
Qi
Qi
=
∆n B v[B]0
∆H i =
gdzie: v – objętość roztworu składnika B dodawana podczas jednego miareczkowania
[B]0 – stężenie dodawanego roztworu
Z drugiej strony wartość Qi dla i-tego miareczkowania wyznaczyć można z danych
doświadczalnych:
t + ∆t
Qi =
∫ P(t )dt − q
i
t
gdzie: qi – aktualne ciepło rozcieńczania.
22
Doświadczalne wartości Qi można również przeliczyć na zmiany entalpii molowej:
∆H i =
Qi
Qi
=
∆n B v[B]0
Dla każdego aktu miareczkowania można obliczyć stosunek di liczby moli składnika B do liczby
moli składnika A:
di =
n B [B]
=
n A [A ]
i wykonać wykres zależności ∆Hi od di:
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
-5
∆ H0 [kJ/mol]
-10
-15
-20
-25
-30
-35
d = nB/nA
Otrzymamy charakterystyczny wykres sigmoidalny. Punkty tego wykresu leżą na krzywej opisanej
równaniem (*). Należy teraz tak dobrać wartości parametrów n, K i ∆H aby krzywa była jak
najlepiej dopasowana do punktów doświadczalnych.
Praktyka pokazała, że najbardziej wiarygodne oszacowanie wartości parametrów n, K i ∆H
uzyskuje się, gdy iloczyn K×[A] znajduje się w przedziale od 10 do 100. Np. gdy spodziewamy się,
że stała tworzenia kompleksu będzie miała wartość ok. 1×106 M-1 powinniśmy stosować stężenie
składnika A w przedziale od 10 do 100 µM.
Stężenie roztworu składnika B, objętość tego roztworu dodawaną w pojedynczym miareczkowaniu
oraz liczbę etapów miareczkowania dobiera się tak, aby pod koniec serii pomiarów di wynosił ok.
2.
Kalorymetria skaningowa
Drugą istotną z punktu widzenia biofizyki techniką kalorymetryczną jest różnicowa
kalorymetria skaningowa znana pod skrótem DSC (ang. Differential Scanning Calorimetry). W
metodzie tej dokonuje się pomiaru ilości ciepła niezbędnego dla ogrzania próbki. Pozwala ona
23
zmierzyć zmiany molowego ciepła właściwego przy stałym ciśnieniu, Cp, w funkcji temperatury.
Jeżeli w układzie w określonym przedziale temperatury zachodzi proces przemiany fazowej
wydzielający lub pobierający ciepło, to wartość Cp ulegnie gwałtownej zmianie. Technika DSC
pozwala ustalić temperaturę tego przejścia fazowego, Tm, oraz ocenić związane z nim parametry
termodynamiczne: ∆H i Cp. Na gruncie biofizyki interesują nas przede wszystkim przemiany
pseudofazowe związane ze zmianami w strukturze biopolimerów (białka i kwasy nukleinowe) lub
układów supramolekularnych (błony lipidowe).
Budowa aparatu
Układ pomiarowy składa się z dwóch naczynek
umieszczonych we wspólnej osłonie termicznej. Do obydwu
naczynek doprowadzane jest ciepło ze wspólnego grzejnika
(czerwony) powodującego powolny wzrost temperatury obu
naczynek w czasie. Podczas całego doświadczenia oba naczyńka
są utrzymywane w równowadze termicznej dzięki pracy
T = f(t)
∆T = 0
T = f(t)
dodatkowych grzejników (brązowe). Temperatura obu naczyniek
jest kontrolowana przez czułe termometry, a praca grzejników sterowana jest przez elektroniczny
układ kontrolny.
Jedno z naczynek spełnia rolę naczynka odniesienia, a drugie naczynka pomiarowego. W obu
naczynkach znajdują się jednakowe objętości tego samego roztworu (buforu). W naczynku
pomiarowym znajduje się ponadto badana substancja lub mieszanina oddziałujących z sobą
substancji.
Przebieg pomiaru
Po napełnieniu naczynek odpowiednimi roztworami doprowadza się je do równowagi
termicznej w zadanej temperaturze początkowej. Właściwy pomiar odbywa się podczas powolnego
ogrzewania układu z zadaną z góry szybkością τ (zwykle ok. 1°/min). Jeżeli w naczynku
pomiarowym nie zachodzą żadne przemiany fazowe ani zmiany konformacyjne, to i tak należy do
niego dostarczać nieco większą moc cieplną (ilość ciepła w jednostce czasu), gdyż znajduje się w
nim rozpuszczona substancja badana i potrzeba dodatkowej energii, aby doprowadzić ją do żądanej
temperatury. Ta dodatkowa ilość energii pozwala wyznaczyć ciepło molowe badanej substancji, Cp,
zgodnie ze wzorem:
Cp =
∆P
τn
24
gdzie: ∆P – różnica pomiędzy mocą dostarczaną do naczynka pomiarowego i naczynka odniesienia
τ - szybkość zmian temperatury w stopniach na jednostkę czasu
n- liczba moli badanej substancji w naczynku pomiarowym
Zwykle wraz ze wzrostem temperatury wartość Cp nieznacznie wzrasta (czarna linia na rysunku
poniżej).
18
16
Cp [kJ/mol/deg]
14
12
10
8
6
4
2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Temperatura [C]
Jeżeli w określonej temperaturze rozpoczyna się jakiś proces pochłaniający lub
wydzielający ciepło, to wartość Cp zmienia się gwałtownie. W przypadku procesów
endotermicznych takich jak denaturacja białka lub „topnienie” DNA do dalszego ogrzewania
układu potrzeba będzie więcej ciepła, więc wartość Cp zacznie gwałtownie wzrastać wraz ze
wzrostem temperatury. Wzrost ten osiągnie maksymalną wartość w temperaturze, w której
przemianie ulega najwięcej cząsteczek. Przy dalszym wzroście temperatury ilość cząsteczek
ulegająca przemianie maleje i wartość Cp wraca prawie do początkowej wartości (linia niebieska).
Entalpia przemiany równa jest przy tym polu pomiędzy krzywą a aproksymowaną linią zmiany Cp.
Przy pomocy techniki DSC badać można nie tylko stabilność termiczną biopolimeru, np.
białka, ale również wpływ na nią liganda tworzącego kompleks z badanym biopolimerem. Można
również wyznaczyć entalpię kompleksowania ligandu. W tym celu należy wykonać dwa niezależne
pomiary: jeden dla samego biopolimeru i drugi dla kompleksu (linia czerwona na rysunku
powyżej). Ponieważ wiązanie ligandu z biopolimerem zachodzi jedynie wtedy, gdy procesowi temu
towarzyszy obniżenie entalpii swobodnej, więc stabilność termiczna kompleksu jest zwykle
większa niż samego biopolimeru (Tmc > Tm). Entalpię wiązania można wyznaczyć z porównania
entalpii przemiany kompleksu z entalpią przemiany samego biopolimeru.
25
Wymagania i ograniczenia
Aby otrzymać wiarygodne wyniki pomiarów wielkości termodynamicznych układ badany
techniką DSC musi spełniać szereg wymagań:
i)
przemiana musi mieć charakter odwracalny. Występowanie jakichkolwiek procesów
nieodwracalnych komplikuje analizę wyników. Niestety, procesy całkowicie odwracalne są
w biofizyce rzadkością. Problem ten można rozwiązać lub ominąć dobierając odpowiednio
szybki wzrost temperatury układu tak, aby zwykle powolne procesy nieodwracalne nie
zdążyły zajść w znaczącym stopniu.
ii)
z drugiej strony szybkość wzrostu temperatury musi być na tyle powolna, aby układ
zawsze znajdował się w stanie równowagi termodynamicznej
iii)
proces przemiany powinien być czystym procesem jednoetapowym. Jeżeli przemiana
jest kilkuetapowa i występują stany pośrednie, to analiza wyników jest dużo bardziej
skomplikowana i wymaga dodatkowych założeń.
Jeżeli chcemy wyznaczyć techniką DSC entalpię wiązania ligandu, to pojawiają się jeszcze
dodatkowe wymagania:
iv)
stężenie ligandu musi być na tyle duże, aby praktycznie wszystkie cząsteczki
biopolimeru występowały w formie kompleksu
v)
ligand nie powinien tworzyć kompleksu z biopolimerem po przemianie (denaturacji).
Jeżeli takie zjawisko zachodzi, to wyznaczona entalpia wiązania jest zaniżona.
Nawet jeżeli wszystkie powyższe wymagania są spełnione pojawić się mogą jeszcze dodatkowe
ograniczenia wiarygodnego stosowania techniki DSC do wyznaczania entalpii wiązania. Ma to
miejsce w szczególności, gdy porównujemy powinowactwo różnych ligandów do biopolimeru i
ligandy te w różnym stopniu stabilizują biopolimer (duże różnice w wartościach Tmc). Wtedy każda
entalpia wiązania wyznaczana jest w innej temperaturze. Aby móc porównać wyniki uzyskane dla
różnych ligandów należy je ekstrapolować do stałej temperatury, zwykle 25°C. Taka odległa
ekstrapolacja może być źródłem znacznych niedokładności.
26

IIIr. Biotechnologii prof. dr hab. inż. Jan Mazerski Podstawowe

Transkrypt

Podobne dokumenty

Bez większej przesady można powiedzieć, że wszystkie prawa i

Żeby zrozumieć dogłębnie istotę stałych równowagi trzeba zacząć

analiza ilościowa przekaźników lipidowych, zwłaszcza

regulamin - Wydział Inżynierii Chemicznej i Procesowej

Biologia

Wyznaczanie entalpii układu