recenzja2 - Instytut Chemii Bioorganicznej

Prof. dr hab. Maria Koziołkiewicz,
Instytut Biochemii Technicznej
Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności
Politechnika Łódzka
ul. Stefanowskiego 4/10
90-924 Łódź
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Łódź, 20 grudnia 2014r.
RECENZJA
Rozprawy doktorskiej mgr Doroty Magner na temat:
”Wykorzystanie modyfikowanych antysensowych oligonukleotydów
do alleloselektywnej degradacji RNA”
Rozprawa doktorska mgr Doroty Magner została zrealizowana w Zakładzie Chemii i
Biologii Strukturalnej Kwasów Nukleinowych Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w
Poznaniu pod kierunkiem prof. dr hab. Ryszarda Kierzka. Wpisuje się ona w nurt poszukiwań
wysoce specyficznych, tzw. allelospecyficznych oligonukleotydów antysensowych zdolnych
do wywołania degradacji transkryptów powstających na matrycy zmutowanych form genów
przy zachowaniu mRNA powstającego na matrycy genów typu dzikiego.
Należy w tym miejscu przypomnieć, że historia badań nad antysensowymi
oligonukleotydami, ich syntezą, specyficznością i mechanizmem działania liczy sobie już
blisko czterdzieści lat. Pomimo pewnych wzlotów i upadków, tzw. strategia antysensowych
oligonukleotydów jest ciągle aktualnym obszarem badawczym w wielu laboratoriach chemii
medycznej i bioorganicznej. Co prawda, pod koniec lat 90-tych zidentyfikowano szereg
efektów ubocznych wywoływanych przez oligonukleotydy antysensowe i dlatego
zainteresowanie nimi w tym okresie nieco zmalało. Jednakże odkrycie zjawiska interferencji
RNA sprawiło, że problem specyficzności oddziaływań oligomerów RNA lub DNA z
docelowymi cząsteczkami kwasów nukleinowych ponownie stał się wyzwaniem dla wielu
chemików. Okazało się bowiem, że zarówno dotychczas stosowane jak i nowo opracowane
modyfikacje
struktury
nukleotydów
pozwalają
do
pewnego
stopnia
modulować
specyficzność oddziaływań RNA-RNA czy RNA-DNA. Uzyskanie wysoce specyficznych
oligonukleotydów antysensowych miałoby szczególne znaczenie dla hamowania ekspresji
zmutowanych form genów odpowiedzialnych za niektóre choroby neurodegeneracyjne.
Nowe odkrycia naukowe, które nastąpiły w ostatnich dwóch dekadach w chemii
bioorganicznej kwasów nukleinowych, jak również nowa technologicznie zaawansowana
aparatura badawcza, przyczyniły się ostatnio do znacznego postępu w projektowaniu i
badaniu właściwości oligonukleotydów antysensowych nie tylko drugiej ale i trzeciej
generacji.
Celem badań realizowanych przez mgr Dorotę Magner było zaprojektowanie, synteza
oraz wielokierunkowa charakterystyka odpowiednio zmodyfikowanych oligonukleotydów,
które z racji swej struktury byłyby zdolne do aktywacji RNazy H w warunkach in vitro.
Przystępując do realizacji projektu Doktorantka zastosowała dwie strategie projektowania
oligonukleotydów; pierwszym z nich było wykorzystanie tzw. oligomerów tandemowych, z
których jeden (tzw. inhibitor) nie aktywował RNazy H i wiązał się do transkryptu ”typu
dzikiego” a drugi (tzw. gapmer) wiązał się w sposób selektywny do transkryptu
odpowiadającego zmutowanej formie genu i aktywował RNazę H prowadząc do degradacji
tego transkryptu, a tym samym do zróżnicowanej ekspresji obu alleli.
Drugi sposób zastosowany przez Doktorantkę polegał na wykorzystaniu odpowiednio
zmodyfikowanych oligonukleotydów (ASO), które ze względu na rodzaj modyfikacji
chemicznej wykazywały się zaburzoną helikalnością i powodowały powstawanie termodynamicznie lub strukturalnie zróżnicowanych dupleksów RNA/ASO o zróżnicowanej
podatności na działanie RNazy H. Te dwie koncepcje alleloselektywnej hydrolizy RNA
zastosowano dla 6 przypadków substytucji nukleotydowych występujących w genach APP
(Amyloid-beta Precursor Protein) SNCA (ang. Synuclein-alpha) i SOD1 (Superoxide
Dysmutase 1) związanych z etiologią, odpowiednio, choroby Alzheimera, Parkinsona oraz
stwardnienia zanikowego bocznego.
Punktem wyjścia do pracy pani mgr Magner było zaprojektowanie i synteza blisko 150
oligonukleotydów antysensowych oraz przynajmniej 50 oligonukleotydów RNA niezbędnych
do eksperymentów in vitro. Pierwszy etap badań obejmował wyznaczenie parametrów
termodynamicznych (-ΔG oraz TM) dla dupleksów RNA/ASO, co pozwoliło określić ich
trwałość termodynamiczną. Z kolei elektroforeza w warunkach niedenaturujących oraz
metoda EMSA pozwoliły wyznaczyć stałe wiązania dupleksów RNA/ASO. Kolejny etap badań
polegał na określeniu wydajności katalizowanej przez RNazę H degradacji RNA związanego z
antysensowym oligonukleotydem. Wymienione wyżej metody pozwoliły wyselekcjonować
najbardziej efektywne pary inhibitor-gapmer lub gapmery z zaburzoną helikalnością. Dla
potwierdzenia ich efektywności w warunkach in vivo wykorzystano komórki nowotworowe
linii HeLa transfekowane wektorem ekspresyjnym zawierającym gen reporterowy białka
zielonej fluorescencji GFP oraz 100-nukleotydowy fragment genu APP (alternatywnie:
fragment genu SNCA albo genu SOD1 zawierający analizowane substytucje nukleotydowe).
Hybrydyzacja badanych ASO do RNA odpowiadającego fragmentowi badanego genu i jego
degradacja powodowały uszkodzenie transkryptu genu GFP; wynikające stąd zmiany
poziomu mRNA genu GFP określano w sposób jakościowy (obserwacje mikroskopowe) oraz
ilościowy (metoda qPCR). Stosując opisane wyżej podejście określono alleloselektywność
zaprojektowanych oligonukleotydów zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Doktorantka
udowodniła, że w warunkach in vivo alleloselektywność jest niższa niż w warunkach in vitro,
a czynnikiem decydującym o poziomie selektywności jest na ogół stężenie oligonukleotydu.
W przypadku oligonukleotydów tandemowych ich allelospecyficzność była zazwyczaj o
połowę gorsza w komórkach HeLa niż w układzie izolowanym.
Badania realizowane przez mgr Dorotę Magner wymagały olbrzymiego nakładu pracy
i drobiazgowej analizy wyników. Przeprowadzona przez Nią kompleksowa analiza
specyficzności i efektywności antysensowych oligonukleotydów umożliwiła selekcję kilku
spośród ponad setki oligonukleotydów, które w warunkach in vivo dały zadowalające wyniki,
tzn. okazały się dość specyficzne dla RNA pochodzącego od zmutowanych genów. Co więcej,
przeprowadzone przez Nią badania pozwoliły sformułować wiele cennych wniosków na
temat
wpływu
określonych
modyfikacji
chemicznych
na
strukturę
badanych
oligonukleotydów oraz trwałość termodynamiczną kompleksów ASO/RNA. Co najważniejsze,
potwierdziło się przypuszczenie, że dla zdefiniowania aktywności biologicznej antysensowych
oliognukleotydów nie wystarczy wyznaczenie parametrów termodynamicznych czy
przeprowadzenie eksperymentu degradacji RNA katalizowanej przez RNazę H. Zastosowanie
modelu komórkowego okazało się koniecznym, choć dość trudnym i frustrującym etapem
badań: eksperymenty z wykorzystaniem komórek HeLa dość bezwzględnie zweryfikowały
rezultaty uzyskane w warunkach in vitro, w wielu wypadkach eliminując wcześniej
wyselekcjonowane oligonukleotydy jako niespełniające oczekiwań. Szkoda, że tak niewiele
oligonukleotydów przeszło zwycięsko testy komórkowe. Eksperymenty z udziałem komórek
HeLa potwierdziły, jak pisze Doktorantka, zdecydowanie nadrzędną rolę stężenia
testowanych oligonukleotydów (str. 167), chociaż w tym miejscu rodzi się pytanie, czy i do
jakiego stopnia opisane wyniki mogą być komórkowo-specyficzne? Czy wykorzystanie
komórek innych niż HeLa dałoby podobne rezultaty? Czy w ostatnich latach pojawiły się
publikacje potwierdzające lub przeczące istnieniu efektów komórkowo-specyficznych? Już w
latach 90-tych zaobserwowano, że różne linie komórkowe w różny sposób reagowały na te
same oligonukleotydy antysensowe. Przyczyny tego efekty nie zostały wyjaśnione, a autorzy
niżej cytowanej pracy tłumaczyli dość ogólnikowo, że w grę wchodzą nieznane efekty nieantysensowe (Smetsers i inni; British Journal of Haematology. 1997; 96: 377-81: An
antisense Bcr-Abl phosphodiester-tailed methylphosphonate oligonucleotide reduces the
growth of chronic myeloid leukaemia patient cells by a non-antisense mechanism).
Podsumowując, doceniam ogrom pracy i znaczenie wyników uzyskanych przez mgr
Dorotę Magner. Przechodząc od analiz termodynamicznych przez badania in vitro z
wykorzystaniem RNazy H aż do eksperymentów z użyciem komórek HeLa, Doktorantka
wykazała, jak bardzo wyniki uzyskane w warunkach in vivo mogą się różnić od tych
uzyskanych w powszechnie stosowanych modelach in vitro.
Na uznanie zasługuje także sposób prezentacji i zilustrowania uzyskanych wyników,
poczynając od bardzo dobrych technicznie analiz elektroforetycznych a kończąc na
przemyślanych i starannie wykonanych tabelach prezentujących nie tylko parametry
termodynamiczne, wydajności hydrolizy czy zróżnicowanie poziomu ekspresji, ale także
struktury dupleksów ASO/dziki RNA i ASO/zmutowany RNA. Ogromna ilość uzyskanych
wyników, ich staranne analizy oraz obszerne komentarze dotyczące właściwości praktycznie
każdego oligomeru czy dupleksu sprawiły, że dysertacja liczy blisko 250 stron, a bibliografia
231 pozycji.
Powyższa analiza pozwala mi stwierdzić z pełnym przekonaniem, iż rozprawa
doktorska mgr Doroty Magner odpowiada wymogom stawianym przez ustawę „O tytule
naukowym i stopniach naukowych” i przedstawiam Radzie Naukowej Instytutu Chemii
Bioorganicznej PAN w Poznaniu wniosek o dopuszczenie Pani mgr Doroty Magner do
dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ponadto, biorąc pod uwagę jakość i znaczenie
badań przeprowadzonych przez Panią Dorotę Magner, proszę Komisję ds. przewodów
doktorskich Rady Naukowej IChB PAN o rozważenie możliwości wyróżnienia Jej rozprawy.
Maria Koziołkiewicz