Odwrotna transkrypcja in vitro, czyli reakcja łamiąca centralny

Odwrotna transkrypcja in vitro,
czyli reakcja łamiąca centralny
dogmat biochemii
Główny dogmat biochemii komórki opiera się na założeniu, że informacja
genetyczna przekazywana jest w kierunku: DNA -> RNA -> białko. Całe
szczęście nawet natura lubi czasem łamać schematy i pozwalać na
niekonwencjonalne procesy. Takim przykładem jest odwrotna
transkrypcja, czyli „przepisanie” informacji w kierunku odwrotnym, z RNA
na DNA.
Mechanizm ten zachodzi w naturze (np. w cyklu życiowym wirusa HIV, czy w
wydłużaniu telomerów) i został odkryty w latach siedemdziesiątych ubiegłego
wieku
przez
onkologa
Howarda
Martina
Temina
(http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1975/temin-autobio.h
tml). W laboratorium natomiast wykorzystywane są enzymy rekombinowane,
ulepszone pod względem działania (szybsze i bardziej stabilne), będące
najczęściej pochodnymi rewertazy wirusów białaczkowych, takich jak: mysi
(Murine Leukemia Virus, MuLV, MLV) lub ptasi (Avian Myeloblastsis Virus, AMV),
jak również ludzkiego wirusa HIV.
In vitro reakcja łańcuchowej reakcji polimeryzacji polegająca na odwrotnej
transkrypcji (Reverse Transcription PCR, RT-PCR), potocznie zwana „odwrotką”
to również synteza DNA na matrycy RNA. Odbywa się ona za pomocą odwrotnej
transkryptazy (zwanej także rewertazą) — enzymu, który syntetyzuje nić DNA
zgodnie z zasadą komplementarności nukleotydów, wraz z wbudowywaniem
tymidylanu (dTTP), zamiast obecnego w RNA urydylanu (UTP). Powstały w reakcji
komplementarny DNA (ang. complementary DNA, cDNA) może być dalej
namnażany za pomocą zwykłej reakcji PCR.
RNA do reakcji RT-PCR musi być wolny od zanieczyszczeń, dlatego też warto
zwrócić uwagę na metodę uzyskiwania i oczyszczania tego kwasu nukleinowego.
Obecnie na rynku istnieje wiele dostępnych zestawów umożliwiających wydajną
izolację RNA z takich materiałów, jak krew, tkanki stałe, płyny ustrojowe czy
nadsącz komórkowy (w przypadku analizy replikacji RNA-wirusów). Większość z
nich opiera się na zmodyfikowanej metodzie Chomczyńskiego, w której RNA
wiązany jest do złoży krzemionkowych w obecności soli chaotropowych, a do
elucji stosuje się wodę wolną od RNaz (np. wodę traktowaną DEPC). Do izolacji
RNA komórkowego (np. przy analizie mRNA, a więc ekspresji genów) stosuje się
także Trizol. Niezależne jednak od rodzaju metody użytej przy izolacji, warto
sprawdzić ilość otrzymanego RNA, np. poprzez pomiar absorbancji prz 260 nm
lub elektroforezę żelową.
Do reakcji RT-PCR potrzebny jest zestaw odczynników, do których oprócz
odwrotnej transkryptazy należą: bufor z odpowiednimi jonami, mieszanina
heksamerów lub oligo(dT), mieszanina deoksynukleotydów (dNTPs) oraz ultra
czysta woda (wolna od RNaz). Heksamery to nic innego, jak 6-cio nukleotydowe
6
odcinki jednoniciowego DNA o każdej możliwej sekwencji (4 możliwych
kombinacji, a więc 4096 różnych oligomerów), które możemy wykorzystać do
„przepisania” całej puli RNA obecnego w komórce (a więc rRNA, tRNA oraz
mRNA). Natomiast mieszanina oligo(dT) zawiera oligomery tymidylanu, przez co
jest wykorzystywana do wybiórczego „przepisania” jedynie mRNA —
posiadającego na jedynym z końców powtórzenia deoksyadenylanu, czyli tak
zwany ogonek poli (A). W obu przypadkach jednak warto zwrócić uwagę na
obecność w zestawie inhibitora RNaz, dzięki czemu matrycowe RNA będzie
chronione przez tymi enzymami (szczególnie, gdy reakcję przygotowujemy na
powietrzu, a nie w komorach z laminarnym przepływem powietrza i filtrami
HEPA).
Reakcja odwrotnej transkrypcji in vitro trwa w zależności od rodzaju enzymu od
1-3 godzin. Dla rekombinanowej rewertazy MuLV reakcja trwa ponad 2 godziny
(10 minut w 25°C, 120 minut reakcji właściwej w 37°C oraz 5 minut w 85°C,
podczas których enzym jest inaktywowany). Warto pamiętać o tym, że RNA często
tworzy struktury drugorzędowe (na przykład o charakterze tak zwanej spinki do
włosów), które nie zostaną rozdzielone przez odwrotną transkryptazę (gdyż nie
posiada ona właściwości helikazy), dlatego też przed rozpoczęciem rekcji warto
wykonać denaturację próbki zawierającej RNA (5 minut w 70°C). Po tym czasie
oraz schłodzeniu próbki (na lodzie) można dodać mieszaniny reakcyjnej i wykonać
reakcję.
Powstałe w reakcji cDNA jest bardziej stabilne niż RNA, lecz zdecydowanie mniej
niż dwuniciowe DNA (na przykład plazmidowe), dlatego też zaleca się jego
przechowywanie w -20°C (trwałość około kilku miesięcy). Otrzymane cDNA może
być dalej wykorzystane w reakcjach PCR, czy PCR w czasie rzeczywistym (real
time PCR) na przykład do analizy ekspresji genów, czy produkcji danego typu
RNA.
AM
Główny dogmat biochemii stanowi o przekazywaniu informacji genetycznej
z DNA, poprzez RNA na białko. W naturze zachodzi jednak także reakcja
odwrotna
Data publikacji: 26.04.2013r.